Yöntem makalesi

Yinhuo Tang tarafından podosit hasarının düzenlenmesi ve diyabetik böbrek hastalığının tedavisinin öngörülmesi ve doğrulanması

807 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67939

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulamayı kullanan bu protokol, diyabetik böbrek hastalığının (DKD) tedavisinde Yinhuo Tang'ın (YHT) etki mekanizmasını ve YHT'nin PI3K / AKT / NF-κB sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla DKD farelerinde podosit hasarını nasıl azalttığını ortaya koymaktadır.

Özet

Diyabetik böbrek hastalığı (DKH), masif proteinüri ve azalmış glomerüler filtrasyon hızı ile karakterize kronik bir böbrek hastalığıdır. DKH'nin ana patolojik özelliği renal mikroanjiyopatidir ve diyabetik hastaların ~% 40'ında DKD gelişecektir. Podosit ile ilişkili proteinler CD2AP ve WT-1, podositlerin normal fonksiyonunun ve glomerüler filtrasyon bariyerinin bütünlüğünün korunmasında çok önemli bir rol oynar. Enflamasyon, oksidatif stres veya diğer patolojik hakaretler nedeniyle podosit yapısı veya işlevi bozulduğunda, yarık diyafram ve aktin hücre iskeleti hasar görür, bu da glomerüler filtrasyon bariyerinin geçirgenliğinin artmasına ve proteinüriye neden olur. Yinhuo Tang (YHT), proteinüriyi azaltma ve böbrek fonksiyonunun bozulmasını geciktirme işlevine sahip geleneksel bir Çin tıbbı reçetesidir; ancak YHT'nin DKD tedavisindeki mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Bu yazıda, ağ farmakolojisi ve hayvan deneylerine dayanarak, 8 hafta boyunca YHT uygulamasından sonra db/db farelerde kan şekeri, karaciğer fonksiyonu, böbrek fonksiyonu, kan lipidleri, böbrek patolojisi, podosit belirteç proteinleri CD2AP ve WT-1'in ekspresyon seviyeleri ve ayrıca PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolağı incelendi. Sonuçlarımız, YHT'nin PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek inflamatuar faktörlerin ekspresyon seviyelerini azalttığını, böylece DKD'nin ilerlemesini geciktirmede rol oynayan podosit hasarını azalttığını göstermektedir.

Giriş

Diyabetik böbrek hastalığı (DKH), diyabetin yaygın ve ciddi bir komplikasyonudur ve tüm dünyada son dönem böbrek yetmezliğinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1. Hastalık, glomerüler genişleme, mezanjiyal genişleme, tubulointerstisyel fibroz ve hücre dışı matris bileşenlerinin aşırı birikimi gibi bir dizi karmaşık patolojik süreçle ilerler 2,3. Diyabet yönetimindeki gelişmelere rağmen, mevcut tedaviler esas olarak kan şekeri düzeylerini ve kan basıncını kontrol etmeyi amaçlamaktadır, bu da altta yatan patolojik değişiklikleri tersine çevirmek yerine sadece DKH'nin ilerlemesini yavaşlatmaktadır. Bu, daha kapsamlı ve etkili tedavi seçeneklerine olan acil ihtiyacın altını çizmektedir 4,5.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), DKD 6,7,8 gibi kronik hastalıkların tedavisinde umut verici bir alternatif tedavi olarak ortaya çıkmıştır. TCM, DKD'nin karmaşık, çok hedefli doğasını ele alabilen bütünsel bir tedavi yaklaşımını vurgular. Çeşitli TCM formülasyonları arasında, Yinhuo Tang'ın (YHT) yin'i beslemek (kan hacmini desteklemek için), böbreği tonlamak (böbrek fonksiyonunu geliştirmek için), ısıyı temizlemek (iltihabı bastırmak için) ve yang'ı bastırmak (kan basıncını düşürmek için) gibi birçok fizyolojik fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir9,10,11. Bununla birlikte, YHT'nin DKD'yi hafifletme mekanizmalarına ilişkin kapsamlı bir anlayış hala eksiktir.

Podosit ile ilişkili protein CD2AP, filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü korumak için çok önemli olan podositte anahtar bir proteindir, WT-1 ise böbrek gelişimi ve fibrozda kritik bir rol oynar 12,13,14,15,16. Bu nedenle, bu iki proteinin normal işlevi, normal glomerüler filtrasyon işlevi için hayati önem taşır. Mevcut literatür, bu hedeflerin DKD'nin ilerlemesinde rol oynadığını göstermektedir ve YHT'nin aktif bileşenlerinin terapötik etkiler göstermek için bu hedeflerle etkileşime girebileceğini varsayıyoruz. Bu çalışma, bu etkileşimleri doğrulamayı ve YHT'nin DKD'nin hastalık yollarını nasıl modüle ettiğine dair daha derin bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır.

Bu çalışmada, DKD'de YHT'nin terapötik mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi ve hayvan deneylerinin bir kombinasyonunu kullanıyoruz. Aktif bileşikler ve biyolojik hedefler arasındaki karmaşık etkileşimleri analiz etmek için biyoinformatik araçlarını entegre eden ağ farmakolojisi, YHT'nin eyleminin çok hedefli, çok doğasını keşfetmemize olanak tanır 17,18,19. Geleneksel ilaç keşif yöntemleri genellikle tek hedefli müdahaleleri vurgular. Buna karşılık, ağ farmakolojisi, potansiyel yolakları ve moleküler hedefleri tanımlamaya yardımcı olan ve karmaşık tedavilerin olası etki mekanizmaları hakkında ön bilgiler sunan öngörücü bir araç olarak hizmet eder. İlaç geliştirme için gerekli olan titiz deneysel ve düzenleyici adımların yerini almasa da, ağ farmakolojisi hipotez üretimine rehberlik edebilir ve erken aşama araştırmaları kolaylaştırabilir20.

Sonuç olarak, bu çalışma, TCM'nin DKD tedavisine entegrasyonu için bilimsel kanıtlar sağlayarak geleneksel ve modern tıp arasındaki boşluğu doldurmayı amaçlamaktadır. Bu araştırmanın sonuçları, DKD için daha etkili ve daha güvenli tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir ve genellikle yan etkilerle sınırlı olan standart bakıma bir alternatif sunabilir. YHT'nin moleküler mekanizmalarını açıklığa kavuşturarak ve terapötik potansiyelini doğrulayarak, TCM'nin DKD tedavisinde geniş uygulanabilirliğini göstermeyi umuyoruz.

Protokol

Bu çalışma için toplam otuz erkek 6 haftalık spontan tip II diyabetik (C57BL / Ksj db / db) faresi ve aynı genetik geçmişe sahip altı erkek diyabetik olmayan kontrol faresi (db / m) seçildi. Fareler, Changchun Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nde steril SPF dereceli bir ortamda 2 hafta boyunca barındırıldı (lisans numarası: SYXK (JI) 2023-0014). Bu süre zarfında düzenli idame diyeti ve steril su sağlandı. Açlık kan şekeri, 2 haftalık sürenin başında ve sonunda db / db farelerde ölçüldü ve sadece her iki testte de 11.1 mmol / L'yi aşan sonuçlar deneye dahil edildi. Çalışma, Changchun Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (kimlik numarası: 2024147).

1. İlaç hazırlama

  1. YHT'nin Hazırlanması (Tablo 1)
    1. Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) ve Schisandra chinensis (6 g) seçin ve yüzeydeki kirleri ve tozu temizlemek için bitkileri suyla durulayın. Daha sonra 71 g çiğ otu 710 mL damıtılmış su ile karıştırın ve 60 dakika seramik kaplarda bekletin
    2. 100 ° C'de kaynattıktan sonra, kaynatma sıcaklığını 60 dakika boyunca 80 ° C'ye düşürün ve ardından tortuları iki kat tıbbi gazlı bezden süzün. Sıvıyı buzdolabında 4 °C'de saklayın.
    3. Yukarıdaki tortulara 710 mL damıtılmış su ekleyin ve adım 1.1.1 ve adım 1.1.2'den itibaren ıslatmayı bir kez tekrarlayın; Sıvıyı buzdolabında 4 °C'de saklayın.
    4. Yukarıdaki iki tıbbi sıvıyı 1.1.2 ve 1.1.3 adımlarından karıştırın ve bunları vakumlu liyofilizatörün malzeme tepsisine yerleştirin. Dondurarak kurutma odasındaki havayı çıkarmak için vakum pompasını çalıştırın, sıcaklığı -40 °C'ye ayarlayın ve ilaç solüsyonundaki suyu katı hale getirmek için 6 saat koruyun. Ardından, buz kristalleri halinde gaza dönüşen suyu süblimleştirmek için sıcaklığı 36 saat boyunca -20 °C'ye ayarlayın. Son olarak, sıcaklığı 40 °C'ye ayarlayın, ilaç solüsyonundan kalan nemi gidermek için 24 saat koruyun, ısıtma ve vakum pompasını kapatın ve dondurularak kurutulmuş tozu (YHT tozu) çıkarın.
    5. 0.4615 g, 0.923 g ve 1.846 g liyofilize YHT tozunu tartın, 1 mL salin içinde süspanse edin ve sırasıyla 0.4615 g / mL, 0.923 g / mL ve 1.846 g / mL konsantrasyonlarında YHT süspansiyonunu yapın.
  2. Valsartan'ın Hazırlanması
    1. 50 mL PEG300 içine valsartan (10.29 mg) ekleyin ve tamamen çözünene kadar iyice çalkalayın.
    2. Adım 1.2.1'den itibaren çözeltiye 50 mL salin ekleyin ve homojenize etmek için iyice çalkalayın ve 10.29 mg / mL konsantrasyonda bir valsartan çözeltisi elde edin.

2. İlaç tedavileri

NOT: Deney altı gruba ayrıldı: normal kontrol grubu (CON), model grubu (MOD), valsartan Pozitif kontrol grubu (POS), YHT'nin düşük doz grubu (YH-L), YHT'nin orta doz grubu (YH-M) ve YHT'nin yüksek doz grubu (YH-H). Yetişkin insanların günde 71 g YHT'ye ihtiyacı vardır. Deneysel fare ve insan ilaç dozunun dönüşüm formülüne göre, fare için günlük doz ~ 9.23 g / kg idi:

Fare için eşdeğer deneysel doz (g / kg) = insan dozu (g) / vücut ağırlığı (70 kg) × 9.1

  1. Farelerin sırtını, baskın olmayan elinizle sıkıca kavrayın, böylece başları, boyunları ve vücutları düz bir çizgide olacak şekilde (mücadele etmekten kaçınmak için) ve 1 mL gavaj iğnesini farelerin yemek borusunun fizyolojik eğriliğine benzer bir açıyla uygun şekilde konumlandırın. Gavaj iğnesini farelerin ağzının köşesinden itin, dilin üzerine bastırın, damağa doğru bastırın ve yavaşça mideye doğru itin.
  2. Baskın elin işaret parmağını kullanarak ilacı yavaşça içeri itin ve gavaj işlemini tamamlamak için iğneyi dikey olarak geri çekin.
    NOT: İlacın dozu toplam 4 hafta boyunca 10 mL / kg idi.
    1. CON ve MOD farelerine gavaj yoluyla 10 ml∙kg-1∙day-1 salin uygulayın.
    2. POS grubu farelere gavaj yoluyla 10.29 mg∙kg-1∙gün-1 valsartan süspansiyonu uygulayın.
    3. Bu gruplara aşağıdaki YHT dozlarını gavaj yoluyla uygulayın: YH-L grubuna 4.615 g∙kg-1∙day-1 ; YH-M grubuna 9.23 g∙kg-1∙gün-1 ; YH-H grubuna 18.46 g∙kg-1∙day-1 .

3. YHT etkinliğinin değerlendirilmesi

  1. Kan ve idrar biyokimyasal indekslerinin tespiti
    1. 8 haftalık sürekli ilaç uygulamasından sonra, metabolik bir kafes kullanarak farelerden 24 saat idrar toplayın, toplanan idrarı 10 dakika boyunca 7.992 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve idrar protein test kitini kullanarak idrar protein seviyesini ölçün.
    2. Fareyi sabitlemek için baskın olmayan elinizle farenin arkasını kavrayın ve farenin kuyruğunu sabitlemek için aynı baskın olmayan elin küçük parmağını ve yüzük parmağını kullanın. Farenin kuyruğunun ucunu iyot buharlı pamuk topları ile sterilize edin. Baskın eliyle, farenin kuyruğunun ucunu hızlı bir şekilde delmek için bir kan alma iğnesi tutun, farenin kuyruğunun kökünden kuyruğun ucuna kadar sıkın ve kanı kan şekeri test kağıdına bırakın.
    3. Baskın olmayan elinizi kullanarak, farenin kuyruğunu kavrayın, kürek kemiği bölgesini başparmak ve işaret parmağıyla sabitleyin ve farenin karnının yukarı bakmasını sağlayın. Baskın el ile fenobarbital sodyum ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga tutun. İğneyi (3-5 mm derinliğinde) karın boşluğuna 30-45°'lik bir açıyla sokun, göbek ile arka ayaklar arasındaki bölgeyi hedefleyin ve iğne başa doğru yönlendirilsin. Kan olup olmadığını kontrol etmek için şırınga pistonunu yavaşça geri çekin; Kan aspire edilirse, iğneyi buna göre yeniden konumlandırın.
    4. Eşit uygulamayı sağlamak için pentobarbital sodyum çözeltisini yavaşça enjekte edin ve enjeksiyon tamamlandıktan sonra şırıngayı geri çekin. 10 dakika bekleyin, ardından baskın elinizde forseps ile, bir yanıt olup olmadığını kontrol etmek için farenin arka bacak ayak parmaklarını hafifçe sıkıştırın. Hala bir yanıt gözlenirse, gerektiği gibi küçük bir ek doz (10 mg / kg) uygulayın.
      NOT: Bir farenin 60 g ağırlığında olduğunu ve fenobarbital çözeltinin %1 w/v olduğunu varsayarsak, herhangi bir yanıt durumunda uygulanacak ek doz 0.06 mL'dir.
    5. Farelerin göz çevresindeki bıyıkları ve kılları kesmek için makas kullanın, baskın olmayan elinizi kullanarak, göz kürelerinin dışarı çıkması için göz kürelerinin çıkarılacağı göz çevresindeki cilde bastırın. Göz kürelerinin etrafındaki cildi etanol ile sterilize edin, göz kürelerini hızlı bir şekilde çıkarmak için cımbız kullanın, böylece kan mikrosantrifüj tüplerine (1.5-2 mL) damlar, tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, tüpleri 10 dakika boyunca 7.992 × g'da santrifüjleyin ve süpernatan çözeltiyi çıkarın.
    6. Kitin talimatlarına göre serumdaki Serum Kreatinin (Scr), Kan Üre Azotu (BUN), Albümin (ALB), Alanin Aminotransferaz (ALT), Aspartat Aminotransferaz (AST), Trigliseritler (TG) ve Toplam Kolesterol (TC) ekspresyon seviyelerini ölçün.
  2. Böbrek dokularının ayrılması
    1. Kan örneklemesinden sonra, fareleri sırtüstü pozisyonda cerrahi plakaya sabitleyin, farelerin ön torasik bölgesinin kıllarını kırpın, ön torasik bölgeyi etanol kullanarak sterilize edin, karın derisini makasla kesin ve böbrekleri açığa çıkarmak için ince ve kalın bağırsakları bir kenara itin.
    2. Fare böbrek dokusunu çıkarın, periosteuumu künt bir şekilde ayırmak için hemostatik forseps kullanın ve sol böbreği saklamak için -80 ° C'lik bir dondurucuya ve sağ böbreği böbreği sabitlemek için% 4 paraformaldehit çözeltisi içeren 20 mL'lik bir tüpe koyun.
    3. 24 saat sonra sağ böbrekleri formaldehitten çıkarın, 5 dakika boyunca damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın, susuz etanol gradyanı kullanarak dehidre edin (%100 → %95 → %85 → her biri 5 dakika), gradyan ksilen (2 x 10 dakika) kullanarak şeffaflaştırın, parafin mumuna gömün ve balmumu bloklarının oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin21. Ardından bir gece boyunca -20 °C dondurucuya koyun.
    4. Balmumu bloğunu çıkarın, 3 μm kalınlığında dilimleyin, açmak için suya koyun, ardından bir slaytla çıkarın ve 30 dakika pişirmek için 40 °C'de sabit sıcaklıktaki bir fırına koyun ve ardından sonraki analizler için saklayın
  3. Renal histopatolojik analiz
    1. Sağ böbreği çıkarın, yukarıdaki gibi gradyan ksilen mum giderme ve susuz etanol dehidrasyonu gerçekleştirin (adım 3.2.3) ve damıtılmış su ile yıkayın.
    2. Hematoksilen ve Eozin boyası (H & E), Periyodik Asit-Schiff boyası (PAS) ve Masson boyama kitlerinin talimatlarına göre boyama yapın.
    3. Adım 3.2.3'teki gibi gradyan susuz etanol dehidrasyonu ve ksilen şeffaflığını tekrar gerçekleştirin.
    4. Oda sıcaklığında kuruduktan sonra, doku bölümlerini montaj ortamı olarak nötr sakız kullanarak bir lamel ile slaytların üzerine monte edin. Slaytları gözlemleyin ve 400x büyütmede ışık mikroskobu altında görüntüleyin.
  4. Böbrek dokusunun immünohistokimyasal analizi
    1. Sağ böbreği çıkarın, mumdan arındırın ve bölümleri adım 3.2.3'te anlatıldığı gibi kurutun, antijen onarımı için 10 mM sodyum sitrat tampon çözeltisine (pH 6.0) yerleştirin ve 5 dakika ısıtın (125 ° C, 103 kPa). 10 dakika sonra bölümleri çıkarın, oda sıcaklığına soğutun ve 3 x 5 dakika 1x PBS'de yıkayın.
    2. Endojen peroksidazı bloke etmek için bölümleri 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit çözeltisine yerleştirin ve PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
    3. Bölümlere damla damla %10 keçi serumu ekleyin, keçi serumunun tüm bölümü eşit şekilde kapladığından emin olun. Bölümleri ıslak bir kutuya koyun, 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    4. Birincil antikorlar COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) damla damla ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca buzdolabında 4 ° C'de ıslak bir kutuda inkübe edin.
    5. Kesiti çıkarın, PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın, ikincil antikor (1:3.000) damla damla ekleyin, 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    6. 10 dakika boyunca 3,3'-diaminobenzidin (DAB) renk geliştirme solüsyonu ekleyin, renk geliştirme solüsyonunu damıtılmış su ile yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 μL hematoksilen ile inkübe edin ve 5 dakika boyunca damıtılmış su ile durulayın.
    7. Adım 3.2.3'te açıklandığı gibi kurutun, şeffaflaştırın ve kapatın ve görüntüleri optik bir mikroskop kullanarak toplayın.
  5. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tahlil analizi
    1. 10 mL'lik bir homojenizatör tüpünde ~ 100 mg donmuş böbrek dokusu alın, belirgin bir doku kütlesi kalmayana kadar bir havaneli ile iyice öğütün ve ardından homojenizasyon için 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin.
    2. 250 μL kloroform ekleyin, bir vorteks karıştırıcıda 10 saniye çalkalayın, 5 dakika buz üzerinde inkübe edin, 15.984 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve üst sulu fazı yeni bir tüpe pipetleyin.
    3. Sulu faza 500 μL izopropanol ekleyin, 10 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın ve karışımı 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Bunu takiben, 10 dakika boyunca 15.984 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve RNA peletini 1 mL %75 etanol ile yıkayın. Kısa bir girdaptan sonra, 10 dakika boyunca 15.984 × g'da tekrar santrifüjleyin. Etanolü atın ve RNA peletinin oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    4. RNA'yı çözmek için 30 μL dietil pirokarbonat su ekleyin ve RNA konsantrasyonunu hesaplamak için bir spektrofotometre kullanarak RNA çözeltisinin absorpsiyonunu 260 nm ve 280 nm'de ölçün.
      NOT: RNA saflığı, A260/A280 oranı ile değerlendirilir. İdeal bir A260/A280 oranı, iyi bir RNA saflığını gösteren 1.8 ile 2.0 arasında olmalıdır. Oran 1.8'in altındaysa, protein veya fenol kontaminasyonunun varlığını gösterebilir ve kirleticileri uzaklaştırmak için ek bir fenol-kloroform ekstraksiyonu veya etanol çökeltmesi gibi daha fazla saflaştırma gereklidir.
    5. 3 μg toplam RNA, 4 μL 4 gDNA Silecek Karışımı ve RNaz içermeyen ddH2O'yu 16 μL'lik bir nihai hacme karıştırın, 10 saniye boyunca 1.250 × g'da santrifüjleyin ve 42 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Yukarıdaki çözeltinin 16 μL'sine 4 μL 5x ters transkriptaz ekleyin, 10 saniye boyunca 1.250 × g'da santrifüjleyin. Ters transkripsiyon programını 50 °C (15 dk) → 85 °C (5 sn) → 4 °C'de (10 dk) gerçekleştirin. Sentezlenen cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
    6. cDNA çözeltisini dondurucudan çıkarın ve 90 °C'de (10 dakika) ön denatürasyon yapın, ardından 94 °C (30 sn) → 60 °C (30 sn) → 72 °C (24 sn) arasında 40 döngü yapın ve son olarak 95 °C (15 sn) → 60 °C (60 sn) → 95 °C (350 sn, 60 °C kademeli olarak 0,1 °C/s hızında 95 °C'ye yükselir) sırasına göre parçalayın.
    7. WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB ve IL-1β'nin nispi ekspresyonunu, dahili referans olarak Gapdh ile her bir numunenin Ct değerine dayalı 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak hesaplayın (ΔΔCt = hedef genin Ct değeri - dahili referans geninin Ct değeri) (bkz. Tablo 2).
  6. Western blot (WB) tahlil analizi
    1. 10 mL'lik bir homojenizatör tüpünde ~ 100 mg donmuş böbrek dokusu alın, ardından 500 μL lizis çözeltisi (proteaz inhibitörü: fosfataz inhibitörü: RIPA = 1: 1: 100) ve belirgin bir doku kütlesi kalmayana kadar bir havaneli ile yeterince öğütün.
    2. Tüpü buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, 15.984 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
    3. BCA testini kullanarak her bir numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin. Ölçülen konsantrasyonlara bağlı olarak, her gruptan eşit miktarda toplam protein (örn. 30 μg) yeni tüplere pipetleyin ve tutarlılığı sağlamak için PBS kullanarak nihai hacmi ayarlayın. Daha sonra 5x protein yükleme tamponu ekleyin, 100 °C'de 10 dakika kaynatın ve ardından çıkarın ve oda sıcaklığına soğutun.
    4. Proteinleri ayırmak için% 12.5 SDS-PAGE jel elektroforezi kullanın. İlk olarak, numunenin konsantrasyon jelinden yavaşça geçmesini sağlamak için 80 V kullanın, ardından numune ayırma jelinin dibine gelene kadar voltajı 120 V'a ayarlayın ve üniteyi kapatın.
    5. Filtre kağıdını membran transfer tamponuna batırın, PVDF membranının bir köşesini tutmak için cımbız kullanın ve etkinleştirmek için metanole batırın. Jeli çıkarın, konsantre jeli ve ayırma jelinin altını kesmek için plastik bir plaka kullanın ve ardından membran transfer cihazını kurmak için filtre kağıdının/jelin/PVDF membranın/filtre kağıdının sandviç yapısına göre (negatif kutup olarak jel, pozitif kutup olarak PVDF membranı), kurulumu önceden soğutulmuş transfer tamponu ile doldurulmuş bir membran transfer tankına yerleştirin, Düşük bir sıcaklığı korumak için buz küpleri ile çevreleyin ve aktarımı 200 mA'lık sabit bir akımda gerçekleştirin.
      NOT: Proteinin moleküler ağırlığına göre transfer süresine karar verin (moleküler ağırlık ne kadar büyükse, transfer süresi o kadar uzun olur).
    6. PVDF membranını blokaj tamponuna yerleştirin, blokaj tamponunu oda sıcaklığında 90 dakika çalkalayın ve TBST (50 mL 20x TBS ve L TBST başına 0.5 mL Tween-20) ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    7. Primer antikor seyreltik primer antikor kullanarak: WT-1 (1:1,000), CD2AP (1:1,000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) ve IL-1β (1:1.000), PVDF membranına primer antikor ekleyin ve gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında ıslak bir kutuda inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    8. PVDF membranını 4 °C buzdolabından çıkarın, TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın, İkincil antikor seyreltici kullanarak ikincil antikoru (1:10000) seyreltin, ikincil antikor inkübatını oda sıcaklığında 60 dakika ekleyin, TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın, PVDF membranını kemilüminesans görüntüleyiciye yerleştirin ve eşit şekilde ECL ışıldayan sıvıyı damla damla ekleyin (A: B = 1:1).

4. DKD tedavisi için YHT'nin ağ farmakolojisi analizi

  1. YHT'nin etken maddelerinin ve hedeflerinin taranması
    1. TCMSP veritabanını (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) kullanarak Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis, Radix, Poria ve Schisandra Chinensis'in aktif bileşenlerini ve BATMAN-TCM veritabanından (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm) Maitake'yi belirleyin. Aktif bileşenleri tanımlamak için tarama kriterleri olarak oral biyoyararlanımı (OB) %30 ve ilaç benzerliğini (DL) ≥ 0.18'e ≥ ayarlayın.
    2. Yukarıdaki TCM'lerden aktif bileşenlerin eylem hedefleri için TCMSP veritabanında (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) arama yapın.
    3. Yukarıdaki aktif bileşenlerin hedeflerini vurgulayın ve daha fazla analiz için bunları bir listeye entegre edin. Uniprot protein veritabanını (https://www.uniprot.org) kullanarak hedeflerin adlarını standartlaştırın.
  2. YHT'nin aktif bileşenlerinin hedef ağının oluşturulması
    1. Aktif bileşenleri ve bunlara karşılık gelen hedefleri theoftware'e aktarın: Dosya | İthalat | Ağ ve ilgili verilerin yüklenmesi.
    2. Araçlar | Ağ Analizi | İlaçlar, aktif bileşenler, hedefler ve hastalıklar arasındaki ilişkileri görselleştirmek için Ağı Analiz Edin. Ağ görselleştirmesinde, düğümler aktif bileşenleri temsil eder ve kenarlar aktif bileşenler ve hedefler arasındaki etkileşimleri temsil eder.
  3. DKD ile ilgili hedeflerin taranması
    1. Arama terimi olarak Diyabetik Böbrek Hastalığı'nı kullanarak ve türü İnsan olarak ayarlayarak, aşağıdaki veritabanlarından DKD ile ilgili hedefleri tarayın: GeneCards veritabanı (https://www.genecards.org); OMIM veritabanı (http://www.omim.org); TTD veritabanı (https://www.ttd.cn); DrugBank veritabanı (http://www.drugbank.ca); DisGeNET veritabanı (http://www.disgenet.org).
    2. Beş veritabanından sonuçları aldıktan sonra, bunları bir elektronik tabloda birleştirin ve Veri menüsü altındaki Yinelenenleri Kaldır işlevini kullanarak kopyaları kaldırın ve yalnızca DKD ile ilgili hedeflerin benzersiz adlarının korunduğundan emin olun.
  4. PPI (protein-protein etkileşimi) oluşturulması ve temel hedeflerin taranması
    1. Bir sütuna YHT hedefleri listesini, diğerine ise DKD hedefleri listesini girerek YHT ve DKD'nin kesişim hedeflerini belirlemek için elektronik tablo yazılımını kullanın. Her iki sütundaki ortak girişleri vurgulamak için koşullu biçimlendirme uygulayın, böylece kesişim hedeflerini belirleyin.
    2. Dize veritabanı web sitesini (https://cn.string-db.org/) açın, Giriş | Verileri toplu olarak içe aktarmak için Yapıştır/Yükle ve ağdaki boş hedefleri (etkileşimsiz hedefler) filtrelemek için Derece ≥ eşiği ayarlayın .
    3. Dosya Seç | İthalat | Ağ kurun ve son görselleştirmeyi oluşturmak için filtrelenmiş kesişim hedeflerini yazılıma aktarın.
    4. Ağ Analizine Git | Ağı analiz edin ve Derece değerine göre YHT-DKD'nin temel hedeflerini filtreleyin.
  5. Gen ontolojisi (GO) fonksiyonel analizi ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) yolağı zenginleştirme analizi
    1. http://metascape.org/gp/index.html ziyaret ederek Metascape platformunu açın, başlamak için Analizi Başlat'ı seçin, YHT ve DKD için hedef listesini Özel Analiz bölümündeki giriş kutusuna yapıştırın, açılır menüden türü Homo sapiens olarak ayarlayın, Özel Analiz'i seçin ve P değeri eşiğini <0,01 olarak ayarlayın ve analizi çalıştırmak için Gönder'e tıklayın.
    2. Sonuçlar Metascape'ten döndürüldükten sonra, http://www.bioinformatics.com.cn/'a gidin, Araçlar | zenginleştirme GO terimi'ni seçin, sonuçlardan GO terimlerini yapıştırın ve kabarcık grafikleri oluşturmak için Gönder'e tıklayın. En iyi 10 GO terimini P değerine göre sıralayarak görselleştirin.
    3. KEGG yollarını, Metascape analiz sonuçlarından elde edilen P değerine göre sıralayın. Aynı Mikrobiyoloji web sitesine (http://www.bioinformatics.com.cn/) gidin, kegg yolu zenginleştirmeyi seçin, seçilen ilk 10 KEGG yolunu yapıştırın ve KEGG kabarcık diyagramlarını görselleştirmek için Gönder'e tıklayın.

5. İstatistiksel analiz

  1. Veriler normal bir dağılım izliyorsa ve varyanslar homojense, tek yönlü ANOVA kullanın. Varyanslar homojen değilse, Dunnett'in T3 testini veya bağımsız bir örneklem t-testini kullanın.
  2. Normal bir dağılım izlemeyen veriler için, parametrik olmayan yöntemlerden sıralama toplamı testini kullanın.
  3. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

Sonuçlar

DKD farelerinde kan şekeri, karaciğer ve böbrek fonksiyonlarında iyileşme ve lipid metabolizması bozuklukları
8 haftalık uygulamadan sonra, farklı YHT dozları rastgele kan şekeri, 24 saat UTP, Scr ve BUN düzeylerini önemli ölçüde azalttı, böbrek fonksiyonlarını iyileştirdi (Şekil 1A-D); ALB seviyesini arttırdı; ALT ve AST seviyelerini azalttı; gelişmiş karaciğer fonksiyonu (Şekil 1E-G); TC ve TG seviyelerini düşürdü; ve lipid metabolizmasının düzenlenmesini geliştirdi (Şekil 1H, I). Yukarıdaki sonuçlar, YHT'nin kan şekeri, karaciğer ve böbrek fonksiyonu ve lipid regülasyonu üzerinde koruyucu etkileri olduğunu göstermiştir.

DKD farelerinde renal histopatolojik hasarın iyileştirilmesi
YHT'nin DKD farelerinde böbrek hasarını iyileştirip iyileştiremeyeceğini test etmek için, böbrek dokularındaki patolojik hasarın derecesi H&E, PAS ve Masson boyamanın yanı sıra IHC kullanılarak incelendi. H&E ve PAS boyamalarında glomerüler atrofi, tunika albuginea bölgesinde genişleme, tübüler epitel hücrelerinde şişme ve ayrılma, interstisyel inflamatuar hücre infiltrasyonu ve belirgin glomerüler glikojen birikimi saptandı (Şekil 2A,B). Masson boyama, MOD grubunun böbreklerinde CON grubuna kıyasla mavi kollajen liflerinde önemli bir artış gösterdi (Şekil 2C,D). IHC, COI-I ve α-SMA için pozitif alanların yüzdelerinin MOD grubunda CON grubuna göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2E-G). Buna karşılık, YHT ve POS kullanımından sonra, glomerüler atrofi, bağlı bölgenin genişlemesi, tübüler epitel hücrelerinin şişmesi ve dökülmesi, interstisyel inflamatuar hücre infiltrasyonunun derecesi ve glomerüler glikojen birikimi önemli ölçüde hafifletildi; mavi kollajen liflerinin alanı önemli ölçüde azaldı; ve COI-I ve α-SMA için pozitif alanların yüzdeleri önemli ölçüde azaldı. Yukarıdaki sonuçlar, YHT'nin DKD farelerinde renal patolojik hasarı ve renal fibrozu azaltabileceğini göstermiştir.

DKD farelerinde podosit hasarının azaltılması
DKD farelerinde ayak hücresi hasarı IHC, PCR ve WB ile gözlendi. IHC sonuçları, ayak hücresi fonksiyonel belirteç proteinleri CD2AP ve WT-1'in ekspresyon seviyelerinin MOD grubunda CON grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldığını gösterdi ve bu da renal ayak hücrelerinin hasar gördüğünü gösterdi. YHT tedavisi CD2AP ve WT-1 ekspresyon düzeylerini arttırmış ve ayak hücrelerindeki hasarı azaltmıştır (Şekil 3A-C). PCR ve WB sonuçları, ayak hücresi fonksiyonel belirteç proteinleri CD2AP ve WT-1'in nispi mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin MOD grubunda CON grubuna göre anlamlı olarak azaldığını ve CD2AP ve WT-1'in nispi mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin YHT tedavisi sonrası önemli ölçüde arttığını gösterdi (Şekil 3D-H). Yukarıdaki sonuçlar, YHT'nin DKD farelerinde podosit hasarını azaltabileceğini göstermiştir.

YHT'nin DKD üzerindeki etkilerine bağlı potansiyel hedeflerin ve sinyal yolaklarının ağ farmakolojisi ile aydınlatılması
YHT'nin (291) aktif bileşenleri TCMSP ve BATMAN-TCM veri tabanları aracılığıyla taranmış, bunlardan 39 aktif bileşen OB ≥ 0 ve DL ≥ 0.18 kriterlerini karşılamıştır. Aktif bileşenler, hedeflerini belirlemek için veri tabanında aranmış ve mükerrer değerlerin birleştirilmesi ve silinmesinden sonra toplam 303 hedef elde edilmiştir (Şekil 4A). GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank ve DisGeNET dahil olmak üzere beş veritabanının sonuçlarının birleştirilmesinden ve yinelenen değerlerin kaldırılmasından sonra, nihayet 1.867 DKD ile ilgili hedef elde edildi. Daha sonra, taranan YHT aktif bileşenlerini DKD hedefleriyle kesiştirmek için http://www.bioinformatics.com.cn/ kullanıldı ve 84 kesişen hedef elde edildi (Şekil 4B). Bu 84 hedef, bir PPI ağ diyagramı çizmek için Cytoscape yazılımına aktarıldı ve AKT, IL-1 β, CASP3, APOE ve JUN dahil olmak üzere DKB'nin YHT tedavisi için potansiyel anahtar hedefler belirlendi (Şekil 4C). GO fonksiyonel zenginleştirme analizi, YHT'nin hormona yanıt gibi biyolojik süreçleri ve protein homodimerizasyon aktivitesi ve oksidoredüktaz aktivitesi dahil moleküler fonksiyonları ve ayrıca membran salları ve membran mikrodomainleri gibi hücresel bileşenleri düzenleyerek DKD üzerinde terapötik etkiler gösterebileceğini gösteren toplam 1.246 madde vermiştir (Şekil 4D). Esas olarak diyabetik komplekslerde AGE-RAGE sinyal yolağı, alkolik karaciğer hastalığı, lipid ve ateroskleroz yolunu içeren toplam 263 KEGG zenginleştirme sonucu elde edildi. P değerine bağlı olarak, ilk 10 sonuç bir KEGG görselleştirme balon grafiği çizmek için seçildi (Şekil 4E). AGE-RAGE sinyal yolu, diyabetik kompleksler açısından oldukça zenginleştirilmiştir ve PPI'daki PI3K, AKT ve IL-1β gibi çoklu çekirdek hedefler bu yolda zenginleştirilmiştir. Bu nedenle, bu sinyal yolu sonraki doğrulama için seçildi.

PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek podosit hasarının azaltılması
PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolu ile ilgili gen ve proteinlerin ekspresyon seviyeleri PCR ve WB ile daha fazla incelendi. PCR sonuçları, MOD grubundaki Pi3k, Akt, Nf-κb ve Il-1β'nin nispi mRNA ekspresyon seviyelerinin CON grubuna göre önemli ölçüde yüksek olduğunu ve YHT uygulamasından sonra önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 5A-D). WB sonuçları, P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB ve IL-1β'nın nispi protein düzeylerinin de MOD grubunda CON grubuna göre anlamlı olarak yükseldiğini, buna karşın YHT uygulamasından sonra anlamlı olarak azaldığını göstermiştir (Şekil 5E-I). Bu sonuçlar ayrıca YHT'nin DKD farelerinde podosit hasarını hafifleterek PI3K / AKT / NF-κB sinyal yolunu inhibe edebileceğini düşündürdü.

figure-results-1
Şekil 1: DKD farelerinde kan şekeri, karaciğer ve böbrek fonksiyonlarında iyileşme ve lipid metabolizması bozuklukları. YHT'nin (A) rastgele kan şekeri üzerindeki etkileri; 24 saat idrar proteini, kan kreatinin ve üre azotu dahil olmak üzere (BD) böbrek fonksiyonu; (EG) serum albümini, alanin aminotransferaz ve aspartat aminotransferaz dahil olmak üzere karaciğer fonksiyonu; ve (H,I) toplam kolesterol ve trigliseritler dahil olmak üzere lipid metabolizması regülasyonu. Veriler, boş grupla karşılaştırıldığında, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ile karşılaştırıldığında, altı bağımsız örneğin ortalamaları ± standart sapmaları olarak ifade edilir ve model grubuyla karşılaştırıldığında, #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, bu istatistiksel gösterimler tüm şekillerde tutarlı bir şekilde kullanılır. Kısaltmalar: YHT = yinhuo Tang; DKD = diyabetik böbrek hastalığı; ALB = albümin; ALT = alanin aminotransferaz; AST = aspartat aminotransferaz; TC = toplam kolesterol; TG = trigliseritler; CON = kontrol grubu; MOD = model grubu; POS = valsartan Pozitif kontrol grubu; YH-L = YHT'nin düşük doz grubu; YH-M = YHT'nin orta doz grubu; YH-H = YHT'nin yüksek doz grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: DKD farelerinde böbreklerin histopatolojik hasarının iyileştirilmesi. (A,B) H&E ve PAS boyama ile renal histoloji (ölçek çubuğu = 20 μm); (C) renal fibrozun derecesini gözlemlemek için Masson boyama ve (D) ImageJ yazılımı kullanılarak yarı kantitatif analiz; (E-G) IHC ve ImageJ yazılımı kullanılarak böbrek dokularında COI-I ve α-SMA'nın nispi ekspresyon seviyelerinin yarı kantitatif analizi (ölçek çubuğu = 20 μm). Kısaltmalar: YHT = yinhuo Tang; DKD = diyabetik böbrek hastalığı; H&E = Hematoksilen ve Eozin boyası; PAS = Periyodik Asit-Schiff boyası; COI-I = Kollajen tip I; α-SMA = α-düz kas aktini; CON = kontrol grubu; MOD = model grubu; POS = valsartan Pozitif kontrol grubu; YH-L = YHT'nin düşük doz grubu; YH-M = YHT'nin orta doz grubu; YH-H = YHT'nin yüksek doz grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: DKD farelerinde podosit hasarının zayıflaması. (AC) IHC, böbrek dokularında CD2AP ve WT-1'in nispi ekspresyon seviyelerini tespit etti (ölçek çubuğu = 20 μm); (D,E) PCR, böbrek dokularında CD2AP ve WT-1'in nispi mRNA ekspresyonunu tespit etti ve Image J yazılımı kullanılarak yarı kantitatif analiz yapıldı; (F-H) WB, böbrek dokularında CD2AP ve WT-1'in nispi protein ekspresyon seviyelerini tespit etti ve ImageJ yazılımı kullanılarak yarı kantitatif analiz yapıldı. Image J yazılımı kullanılarak kantitatif analiz. Kısaltmalar: YHT = yinhuo Tang; DKD = diyabetik böbrek hastalığı; IHC = immünohistokimya; WB = Batı lekeleme; CD2AP = CD2 ile ilişkili protein; WT-1 = Wilms tümörü 1; CON = kontrol grubu; MOD = model grubu; POS = valsartan Pozitif kontrol grubu; YH-L = YHT'nin düşük doz grubu; YH-M = YHT'nin orta doz grubu; YH-H = YHT'nin yüksek doz grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: DKD tedavisi için YHT'nin ağ farmakolojik analizi. (A) DKD tedavisi için YHT'nin aktif bileşen-hastalık hedef grafiği. (B) YHT ve DKD'nin kesişen hedeflerinin venn şeması. Turuncu renk, DKD için ilgili hedeflerin sayısını temsil eder; yeşil renk, YHT aktif bileşenlerinin terapötik hedeflerinin sayısını temsil eder; kesişen kısım ise kesişen hedeflerin sayısını (YHT'nin DKD için hedef sayısı) temsil eder. (C) YHT ve DKD'nin kesişen hedeflerine ait ÜFE ağ diyagramı. (D) DKD tedavisi için YHT'nin en önemli 10 hedefinin GO zenginleştirme analizi. (E) DKD'nin YHT tedavisi için en önemli 10 hedefin KEGG zenginleştirme analizi. Kısaltmalar: YHT = yinhuo Tang; DKD = diyabetik böbrek hastalığı; PPI = Protein-protein etkileşimi; GO = Gen Ontolojisi; KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; CON = kontrol grubu; MOD = model grubu; POS = valsartan Pozitif kontrol grubu; YH-L = YHT'nin düşük doz grubu; YH-M = YHT'nin orta doz grubu; YH-H = YHT'nin yüksek doz grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek podosit hasarının zayıflatılması. (M.S.) Böbrek dokularında Pi3k, Akt, Nf-κb ve Il-1β'nin nispi mRNA ekspresyonunu tespit etmek için PCR. (E-I) Böbrek dokularında P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB ve IL-1β'nin nispi protein ekspresyon seviyelerini tespit etmek için WB ve ImageJ yazılımı kullanılarak yarı kantitatif analiz yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yinhuo Tang'ın Bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: qRT-PCR primerlerinin detayları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokoldeki kritik adımlardan biri, YHT'nin aktif bileşenlerini tanımlamak ve bunların DKD ile ilgili hedeflerle etkileşimlerini tahmin etmek için ağ farmakolojisinin kullanılmasıdır. Bu adım, YHT'den etkilenen moleküler yolları ve potansiyel biyolojik ağları haritalamak için veritabanları (örneğin, TCMSP, DrugBank ve GeneCards) gibi biyoinformatik araçları kullanarak büyük ölçekli biyolojik verilerin analiz edilmesini içerir. Bu tahmini, YHT'nin bu yollar üzerindeki varsayımsal etkilerinin test edildiği DKD'nin hayvan modelleri aracılığıyla deneysel doğrulama izledi. Hesaplamalı tahminlerin verilerle entegrasyonu, bulgularımızın güvenilirliğini artırdığı ve teorik tahminler ile pratik sonuçlar arasındaki boşluğu doldurduğu için yaklaşımımızın çok önemli bir yönüdür. Ek olarak, hayvan modellerinin kullanılması, YHT'nin terapötik etkilerini doğrulamada bir başka kritik adımdır. Hayvanlarda DKB, insan hastalığının ilerlemesini yakından taklit eder ve YHT'nin hem glomerüler hasar hem de renal fibroz üzerindeki etkisinin etkili bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Histopatolojik değerlendirmelerin yanı sıra Scr, BUN ve proteinüri gibi böbrek fonksiyon belirteçlerinin titiz bir şekilde izlenmesi, YHT'nin terapötik etkinliğini değerlendirmek için esastır.

Protokolümüz güçlü hesaplama ve deneysel yöntemleri birleştirse de, çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, ağ farmakolojisi yaklaşımı büyük ölçüde kamuya açık veri tabanlarındaki mevcut verilere dayanır ve YHT veya DKD ile ilgili yolların belirli bileşenleriyle ilgili önyargılar veya eksik bilgiler olabilir. Bu sorunu azaltmak için birden çok veritabanına çapraz referans vermiş olsak da, bazı ilgili etkileşimler yine de göz ardı edilebilir. İkincisi, bu çalışma sadece deney hayvanı düzeyinde podosit hasarını azaltmada YHT'nin mekanizmasını araştırdı ve deneysel sonuçları doğrulamak için hücresel deneylere ve klinik büyük örneklem çalışmalarına ihtiyaç var. Son olarak, ağ farmakolojisi, DKH'nin YHT ile tedavisinin alkolik karaciğer hastalığı, lipid metabolizması ve ateroskleroz ve adipositlerde lipolizin düzenlenmesi ile de ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu çalışma sadece PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolunun YHT tarafından modülasyonunun DKD'nin ilerlemesini geciktirip geciktiremeyeceğini doğruladı; Sonuçların daha fazla araştırılması gerekiyor.

PI3K/AKT/NF-κB sinyal yolu, hücre büyümesi, proliferasyon, sağkalım ve inflamatuar yanıtlar gibi çeşitli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol oynayan önemli bir hücre içi sinyal yoludur22. Yapılan çalışmalar pedikülosit hasarının ilerlemesinde önemli rol oynadığını göstermiştir23,24. NF-κB, PI3K/Akt yolunun önemli bir aşağı akış bileşenidir ve çeşitli hücre içi sinyallerin iletimine ve çoklu genlerin ekspresyonuna katılır. PI3K / AKT sinyal yolunun inhibisyonu, NF-κB inhibitör proteini IκB'nin bozulmasına yol açar, bu da NF-κB'nin fosforilasyonuna ve çekirdeğe girmesine ve çeşitli kemokinlerin ve enflamatuar faktörlerin üretilmesine yol açar, bu da podosit hasarına ve renal interstisyel fibroziseyol açar 25. Bazı çalışmalar, PI3K / AKT / NF-κB sinyal yolunun aktivasyonunun inhibisyonunun, inflamatuar yanıtları ve renal fibrozu etkili bir şekilde baskılayabildiğini ve böylece DKD26'nın ilerlemesini geciktirdiğini göstermiştir.

Çalışmalar, lipid metabolizması bozukluklarının DKH'nin başlangıcında ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir27,28. DKD hastaları sıklıkla yüksek LDL, TG seviyeleri ve yağ asidi birikimi dahil olmak üzere anormal lipid metabolizması gösterir. Bu anormallikler glomerüloskleroz ve tubulointerstisyel fibrozis gibi patolojik değişikliklerle yakından ilişkilidir29,30. Araştırmalar, lipid metabolizması bozukluklarının çoklu sinyal yolları yoluyla DKD ilerlemesini destekleyebileceğini göstermektedir31,32. İlk olarak, mTOR sinyal yolu, lipid metabolizmasının düzenlenmesinde anahtar bir yoldur; Aşırı aktivasyonu podosit hasarına ve proteinüriye yol açar33,34. Yüksek yağlı bir ortam, PI3K/AKT/mTOR ekseni yoluyla lipid birikimini teşvik edebilir, podosit apoptozunu indükleyebilir ve nihayetinde böbrek fonksiyonlarındaki bozulmayı şiddetlendirebilir 35,36,37. İkincisi, hücresel enerji metabolizmasının kritik bir düzenleyicisi olan AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK), yağ asidi oksidasyonunu teşvik ederek, lipid sentezini inhibe ederek ve lipotoksisiteyi azaltarak böbreği metabolik bozukluklardan korur 38,39,40. AMPK inaktivasyonu, DKD progresyonunda önemli bir mekanizma olarak kabul edilir. Metformin gibi AMPK aktivatörleri, önemli renoprotektif etkiler göstermiştir ve DKD41 için umut verici bir terapötik hedefi temsil etmektedir.

Son olarak, çalışmalar peroksizom proliferatörle aktive olan reseptörlerin α/γ (PPARα/γ) lipid metabolizmasının düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını ve DKD42,43'ü göstermiştir. PPARα aktivasyonu, yağ asidi oksidasyonunu teşvik eder ve böbrekte lipit birikimini azaltırken, PPARγ insülin duyarlılığını artırır ve anti-inflamatuar etkiler gösterir44,45. Fibratlar gibi PPAR agonistleri, DKD hastalarında proteinüriyi azaltmada potansiyel klinik faydalar göstermiştir46. Sonuç olarak, lipid metabolizması bozuklukları DKH'nın patolojik progresyonunu çoklu sinyal yolakları ile etkilemektedir. Bu yolaklar arasındaki etkileşimler karmaşık bir patolojik ağ oluşturur. Lipid metabolizmasının hedeflenmesi DKD için yeni terapötik stratejiler sağlayabilir.

Sisteine özgü proteazların bir ailesi olan kaspaz (CASP) ailesi, hücrelerde yaygın olarak bulunan ve esas olarak apoptoz ve inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde rol oynayan bir proteaz grubudur47,48. CASP ailesinin üyeleri yapısal benzerlikleri paylaşır ve genellikle bir dizi reaksiyon yoluyla aktive edilen ve böylece apoptoz, piroptoz ve diğer programlanmış hücre ölümü süreçlerini tetikleyen zimojenler olarak bulunur49. Bunlar arasında, tipik olarak bir zimojen olarak bulunan korunmuş bir yapıya sahip kaspaz (CASP) ailesinin bir üyesi olan CASP3, apoptozun yürütme aşamasında, spesifik hücresel proteinlerin bölünmesini katalize eden ve böylece normal hücre büyümesinin düzenlenmesinde ve iç homeostazın sürdürülmesinde kritik bir rol oynayan anahtar bir proteazdır50,51. Kaspaz-8, apoptotik kaskadların başlatıcısı olarak işlev görür ve hücresel büyümenin düzenlenmesinde önemli bir faktör olan NPK'nın aktivasyonu yoluyla inflamatuar yanıtların modülasyonuna katılır. Kaspaz-8, apoptotik kaskadının bir başlatıcısı olarak işlev görür ve ayrıca NLRP1 ve NLRP3 gibi enflamatuar vezikülleri aktive ederek inflamatuar yanıtın düzenlenmesine katılır, böylece hücresel piroptozu52 tetikler. CASP sinyal yolunun saplı hücrelerde apoptoz ve piroptoza aracılık etmedeki önemli rolüne dayanarak, gelecekte YHT, CASP3/8, saplı hücreler ve DKD arasındaki ilişkiye ilişkin daha derinlemesine araştırmalar yapılması gerekmektedir.

Düzenleyici netlik ve öngörülebilirlik için tipik olarak iyi tanımlanmış tek hedefli mekanizmaları vurgulayan geleneksel ilaç keşif yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, ağ farmakolojisine dayalı stratejimiz, YHT gibi TCM formülasyonlarında bulunan çok hedefli etkileşimlerin sistematik bir şekilde araştırılmasına olanak tanır. Bu karmaşıklık, TCM'nin bütünsel doğasını ve potansiyel terapötik genişliğini yansıtırken, aynı zamanda dikkatli bir doğrulama ve yorumlama gerektiren istenmeyen hedef dışı etkilerin zorluğunun da altını çizmektedir. YHT'nin eyleminin çok hedefli ve çok doğasını göz önünde bulundurarak, DKH'nin tedavisinde terapötik etkilerinin daha bütünsel bir şekilde anlaşılmasını sağlıyoruz. Ayrıca, ağ farmakolojisi, çok bileşenli tedavilerin güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için çok önemli olan potansiyel ilaç etkileşimlerinin ve yan etkilerin tahmin edilmesine izin verir. Mevcut DKD tedavileri, altta yatan hastalık mekanizmalarını ele almaktan ziyade büyük ölçüde semptomları yönetmeye veya ilerlemeyi yavaşlatmaya odaklanmaktadır. Modern biyoinformatik araçlarını deneysel doğrulama ile entegre eden bu çalışma, özellikle DKD gibi kronik hastalıklarda TCM'nin etkinliğini arttırmada sistem biyolojisinin önemini vurgulamaktadır.

İleriye dönük olarak, bu teknik, özellikle DKD gibi karmaşık hastalıkların tedavisinde, TCM araştırmalarında ağ farmakolojisinin kapsamını genişletmek için önemli bir umut vaat etmektedir. Yaklaşımımız, böbrek hastalıkları, kardiyovasküler hastalıklar ve metabolik bozuklukların tedavisinde terapötik potansiyelleri için diğer TCM formüllerini veya bireysel bitkileri keşfetmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu metodoloji, DKD tedavisinde mevcut ilaçlar için yeni kullanımları belirleyerek ilacın yeniden kullanımını araştırmak için genişletilebilir. Yaklaşımımızın bir başka potansiyel uygulaması da kişiselleştirilmiş tıpta yatmaktadır. Hastaya özgü verileri birleştirerek, ağ farmakolojisi, TCM tedavi stratejilerini bireysel moleküler profillere dayalı olarak uyarlamak, tedavi etkinliğini artırmak ve yan etkileri en aza indirmek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Jilin İl Doğa Bilimleri Vakfı (No.20210101201JC) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Susuz etanolÇin Ulusal İlaç Grubu Kimyasal Reaktif Co, Ltd10009218
Hayvan Deney MerkeziChangchun Geleneksel Çin Tıbbı ÜniversitesiSYXK (JI) 2023-0014
BATMAN-TCM veritabanıhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm-
-BCA Protein Test KitiSolarbioPC0020
Engelleme TamponuBeyotimeP0023B
Seramik kaplarMideaMD-DG30E103
Kemilüminesans görüntüleme sistemiHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
KloroformÇin Ulusal İlaç Grubu Kimyasal Reaktif Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 yazılımı----
DAB reaktif kitiServicebioG1212-200T
db/db farelerNanjing Junke Biyolojik limited şirketiSCXK (Su) 2020-009
ECL substrat çözeltisiafinitesiKF8003
Elektrikli sabit sıcaklık su banyosu tenceresiFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Elektroforez enstrüman güç kaynağıPekin Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Cam HomojenizatörSolarbioYA0852
Cam slaytNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Keçi Anti-Tavşan IgG HRP (ikincil antikor)AfinityS0001IHC için 1:3000, WB için 1:10000
HematoksilenWuhan Lingsi Biyoteknoloji Co., LtdG1140
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj &Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix qPCR için (+gDNA sileceği)VAZYMER223-01
Yatay çalkalayıcıJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Görüntüleme sistemiNikonNikon DS-U3
Akıllı dijital manyetik ısıtma karıştırıcıHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
İzopropanolÇin Ulusal İlaç Grubu Kimyasal Reaktif Co, Ltd80109218
işaretleyici (20-120KD)GenScriptM00521
Masson boyama kitiBASOBA4079B
Tıbbi gazlı bezJianerkang Medical-
Metascape platformuhttp://metascape.org/gp/index.html
MetanolTermo67-56-1
Mikrobiyoloji web sitesihttp://www.bioinformatics.com.cn/-
mikroskopNikonECLIPSE Ci
mikrodalga fırınGalanz Mikrodalga Fırın Elektrikli Aletler Co, LtdP70D20TL-P4
Çok örnekli doku öğütücüŞangay Jingxin Endüstriyel Development Co., LtdTissuelyser-24L
Çok fonksiyonlu analitik elektronik teraziChangzhou Şanslı Elektronik Ekipman Oyun ŞirketiFA1204
Nötr reçineWuhan Lingsi Biyoteknoloji Co, LtdG8590
Normal Keçi SerumuSolarbioSL038
fırınŞangay Huitai Enstrüman İmalat A.Ş., LtdDHG-9140A
Palmiye santrifüjüWuhan Lingsi Biyoteknoloji Co, LtdD1008E
PAS boyama kitiBASOBA4114B
Patolojik dilimleyiciŞangay Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR cihazıHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pipet tabancasıDragonKE0003087/KA0056573
Primer Antikor Seyreltme TamponuBeyotimeP0023A
Protein fosfataz inhibitör kompleksiMeilunbioMB12707-1
PVDF membranı (0.22 & mu; m)SolarbioISEQ00010
Hızlı primer/ikincil antikor seyrelticiSolarbioA1811
Tavşan anti-CD2APAfinitesiDF2298IHC için 1:200, WB
Tavşan anti-COI-IAfinitesiDF12149IHC için 1:200, WB
Tavşan anti-IL-1 ve betaWB TavşanAF51031:1000
Tavşan anti-P-NFAF00161:1000
; bAfiniteAF32191:1000 WB
Tavşan anti-P-PI3KAfiniteAF3242için 1:1000
AfinitesiDF6331IHC için 1:200, WB Tavşan anti-&alfa için 1:1000
;-SMAAfinitesiAF1032IHC için 1:200, WB Tavşan anti-&beta için 1:1000
;-AktinAfinitesiAF7018WB için 1:1000
Gerçek Zamanlı PCR SistemiABIQuantStudio 6
RIPA Lizis TamponuMeilunbioMA0151
RNaz içermeyen ddH2OSolarbioR1600
İkincil Antikor Seyreltme TamponuBeyotimeP0023D
Kaydırın ve camı kapatınJiangsu Shitai Deneysel Equipment Co, Ltd10212432C
SPSS 26.0 yazılım---String
veritabanı web sitesi https://cn.string-db.org/-
Süper saf su aletiZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolimerazTIANGENET105-02
TCMSP veritabanı https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php-
Doku öğütücüGüzel DuvarMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20Çin Ulusal İlaç Grubu Kimyasal Reaktif Co, Ltd30189328
Ultra mikro UV görünür spektrofotometreHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Uniprot protein veritabanıhttps://www.uniprot.org-
Dik optik mikroskopNikonNikon Eclipse CI
Üriner Protein Test KitiNanjing Jiancheng Biyomühendislik Araştırma EnstitüsüC035-2
vakumlu liyofilizatörNingbo Xinzhi Biyoteknoloji A.Ş.A01-1-NA0959
Dikey elektroforez tankıPekin 61 Enstrüman FabrikasıDYCZ-24DN
Vorteks karıştırıcıWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Batı Engelleme TamponuSolarbioSW3010
ksilenÇin Ulusal İlaç Grubu Kimyasal Reaktif Co, Ltd10023418
YihongWuhan Lingsi Biyoteknoloji Co, LtdE8090
- için 1:1000 için 1:1000; anti-P-AKT için İlgi Alanı WB -&Kappa için İlgi Alanı için WB Tavşan anti-WT-1

Kaynaklar

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein rinin Azalt lmasGlomer ler FiltrasyonPodosit Mark r ProteinleriCD2AP EkspresyonuWT 1 EkspresyonuPI3K AKT NF BRenal Mikroanjiyopati
Video yakında

İlgili makaleler