Çekirdek Miktarını Kolaylaştırmak için Bilgisayarla Görme Kitaplıklarını Kullanma

Summary

Bu makalede, bir dizi hücre yoğunluğunda doğrulanmış açık kaynaklı bir yürütülebilir program kullanarak görüntü tabanlı çekirdek nicelemeyi otomatikleştirmek için adım adım yöntemler açıklanmaktadır. Bu program, maliyetle ilgili engelleri, sınırlı teknolojik becerilere sahip kullanıcılar için erişilebilirliği ve mevcut teknolojilerin kullanımını sınırlayabilecek uygulamaya özel doğrulamayı ele alan bir alternatif sunar.

Abstract

Canlı hücre tahlilleri ve görüntü tabanlı hücre analizleri, doğru yorumlama için veri normalizasyonu gerektirir. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, çekirdekleri boyamak ve nicelleştirmek, ardından çekirdek sayısına veri normalizasyonudur. Bu çekirdek sayısı genellikle tek çekirdekli hücreler için hücre sayısı olarak ifade edilir. Manuel niceleme zahmetli ve zaman alıcı olabilse de, mevcut otomatik yöntemler tüm kullanıcılar tarafından tercih edilmeyebilir, bu özel uygulama için doğrulama olmayabilir veya maliyet açısından engelleyici olabilir. Burada, floresan DNA lekeleriyle boyanmış çekirdeklerin ölçülebilir görüntülerini yakalamak ve ardından Python bilgisayarla görme kitaplıkları kullanılarak geliştirilen otomatik bir nesne sayma yazılım programı kullanarak çekirdekleri ölçmek için adım adım talimatlar sunuyoruz. Ayrıca bu programı bir dizi hücre yoğunluğunda doğruluyoruz. Programın yürütülmesi için tam süre, görüntü sayısına ve bilgisayar donanımına bağlı olarak değişse de, bu program, programın çalışması için çekirdekleri sayma saatlerini saniyelere birleştirir. Bu protokol sabit, lekeli hücrelerin görüntüleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, canlı hücrelerdeki lekeli çekirdeklerin görüntüleri ve immünofloresan uygulamaları da bu program kullanılarak ölçülebilir. Sonuç olarak, bu program, yüksek derecede teknolojik beceri gerektirmeyen bir seçenek sunar ve hücre ve moleküler biyologların iş akışlarını düzene sokmalarına, sıkıcı ve zaman alıcı çekirdek niceleme görevini otomatikleştirmelerine yardımcı olmak için doğrulanmış, açık kaynaklı bir alternatiftir.

Introduction

Fonksiyonel ve görüntü tabanlı deneyler, deneysel tedavilerin tüm hücre biyokimyası ve fizyolojisi üzerindeki etkilerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Hücre biyolojisi deneylerinden elde edilen verilerin geçerli bir şekilde yorumlanması, veri normalizasyonu da dahil olmak üzere deneysel protokolün doğruluğuna ve tekrarlanabilirliğine bağlıdır. Örneğin, başlangıçta ve spesifik ilaçlarla tedaviden sonra canlı hücrelerde oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranlarının analizleri, enerji metabolizmasının çeşitli yönlerinin değerlendirilmesine izin verir ^1,2. Hücre kültü....

Protocol

NOT: Ek dosyalar aşağıdaki bağlantıda bulunabilir https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalama ve kaydetme

1. İstenilen DNA boyası ile boyama da dahil olmak üzere görüntülenecek hücre veya doku örneklerini hazırlayın. Burada kullanılan görüntüleri elde etmek için, C2C12 miyoblastları (CRL-1772, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu), standart kültür koşulları altında (% 5 CO₂, 37 ° C, nemlendirilmiş), 50 mM EtOH 6 ile veya 50 mM EtOH⁶ olmadan 48-72 saat boyunca 6 oyuklu plakalarda büyütüldü ve daha önce tarif edildiği gibi buz g....

Results

Her toplu görüntü çalıştırması şunları üretir: 1) tanımlanan çekirdeklerin ana hatlarını gösteren konturların uygulandığı bir dizi görüntü dosyası (Şekil 5) ve 2) görüntü dosyası adlarını ve ilişkili sayıları birbirine bağlayan bir .csv dosyası (elektronik tablo). Konturları görüntülemek, kullanıcının sayım kalitesini görsel olarak değerlendirmesine olanak tanır. Spesifik olarak, bölüm 1'e göre elde edilen görüntüler, çekirdeğin program tarafından sayıldığını.......

Discussion

Çekirdek niceleme programımızın mevcut seçeneklere göre çeşitli avantajları vardır: yalnızca minimum teknolojik beceri gerektirir, çekirdek nicelemesinin özel görevi için doğrulanmıştır ve açık kaynaklıdır; ikincisi, maliyetle ilgili engellerin üstesinden gelir. Sonuç olarak, bu program, hücre ve moleküler biyologlara, floresan mikroskobu kullanılarak yakalanan görüntülerdeki çekirdekleri hızlı ve doğru bir şekilde ölçmek için ek bir seçenek sunar. Şu anda mevcut olan otomatik çekirdek v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yöntem 2 veya 3'ten sonuç dosyasına erişimi olan bilgisayar	-	-	Bkz. adım 2.6 (Yöntem 2 için) veya adım 3.3.9 veya 3.4.9 (Yöntem 3 için)
İnternet erişimi olan bilgisayar, modern tarayıcı-örneğin			, Google Chrome
İnternet erişimi olan bilgisayar, modern tarayıcı ve Windows işletim sistemi	Değişir		Mac, Linux veya diğer işletim sistemleri için Yöntem 3'ü kullanın
yakalama yazılımı olan bilgisayar	Zeiss	AxioVision	Diğer yazılımlar kabul edilebilir; floresan mikroskobu ile uyumlu olmalıdır
Çıktı için dosya konumu (sonuç elektronik tablosu ve görüntü konturları)	-	-	Yeni, boş bir klasör olabilir
Floresan mikroskobu	Zeiss	Axiovert 200M	Diğer floresan mikroskopları kabul edilebilir; uygun filtre küpleri, istenen objektif ve kamera ile donatılmalıdır.
Ölçülecek tüm görüntüleri içeren klasör	-	-	Adım 1.12'ye bakın
Python sürüm 3.10 veya üstü			Python-https://www.python.org/downloads/ 'da ücretsiz indirilebilir ve kurulabilir;
Görüntülenecek örnekler	-		Sabit veya canlı, floresan DNA boyaları ile boyanmış veya karşı boyanmış
Elektronik tablo yazılımı	Microsoft	Excel	Benzer elektronik tablo yazılımı da kabul edilebilir