Yöntem makalesi

FEN1 Nükleaz Aktivitesinin Floresan Bazlı Tespiti ve Küçük Moleküllü İnhibitörlerin Taranması

DOI:

10.3791/67968

⸱

27 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, FEN1 (Flap Endonükleaz 1) aktivitesini ve inhibitör gelişimini ölçmek için bir jel kayması biyokimyasal testini tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonükleaz 1), DNA replikasyonu ve hasar onarımında yer alan ve genomik stabilitenin korunmasında çok önemli bir rol oynayan önemli bir DNA nükleazıdır. Yüksek FEN1 aktivitesi seviyeleri, çeşitli kanserlerin gelişimi ile yakından ilişkilidir ve FEN1'i akciğer, meme ve prostat kanserleri için tanınmış bir biyobelirteç ve ilaç hedefi haline getirir. FEN1 nükleaz aktivitesini tespit etmek için geleneksel radyoizotop etiketleme yöntemleri, kolaylık ve güvenlik açısından zorluklar sunar. Bu çalışmada, flep yapısına sahip bir DNA fragmanı substratı in vitro olarak sentezlendi. Bu substrat, kanadın 5' ucunda bir florofor ile etiketlenmiştir, bu da FEN1 nükleazının belirlenen bölgeyi spesifik olarak tanımasına ve parçalamasına izin verir. FEN1 aktivitesi daha sonra jel elektroforezinden sonra florofor sinyalinin tespit edilmesiyle belirlendi. Bu yöntem, FEN1 nükleaz aktivitesinin hızlı ve etkili bir şekilde değerlendirilmesini ve inhibitörlerinin taranmasını sağlar. FEN1 aktivitesini analiz etmek ve küçük moleküllü inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için hassas ve spesifik bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, DNA hasarı onarımı ve kanser gelişimi ile ilgili araştırmalara önemli ölçüde katkıda bulunur ve hastalık mekanizmaları ve genotoksik maddelerin tespiti üzerine klinik araştırmalar için yeni bir strateji sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA replikasyonu her zaman kusursuz değildir ve hem iç hem de dış faktörler tarafından bozulabilir. Sonuç olarak, DNA replikasyonu ve hasar onarımı mekanizmaları, hücre sağkalımı ve genom stabilitesi için hayati önem taşır. Bu süreçte, bir çekirdek DNA nükleazı olan insan dallanma yapısına özgü endonükleaz FEN1 (Flap Endonükleaz 1) çok önemli bir rol oynar 1,2,3.

FEN1 esas olarak DNA replikasyonunda rol oynar ve gecikmeli iplik 4,5 üzerindeki Okazaki fragmanlarının olgunlaşması için vazgeçilmezdir. Bu, DNA replikasyonunun verimli bir şekilde ilerlemesini ve hasarlı DNA'nın doğru bir şekilde onarılmasını sağlar. Bununla birlikte, FEN1 seviyelerindeki anormal artışlar, akciğer ve meme kanseri7 gibi çeşitli kanserlerin 6,7 gelişimi ile yakından bağlantılıdır. Bu nedenle, FEN1 sadece DNA replikasyonu ve onarımı için gerekli olmakla kalmaz, aynı zamanda kanser teşhisi için bir biyobelirteç ve potansiyel bir terapötik hedefolarak da önemli ilgi görmüştür 8,9. FEN1 aktivitesinin saptanması, kanserlerin erken teşhisi ve hedefe yönelik tedavilerle ilgili araştırmaların ilerletilmesi için gereklidir.

FEN1'in önemi ve erken kanser teşhisi ve hedefe yönelik tedavi geliştirme için aktivitesini inceleme ihtiyacı göz önüne alındığında, bu deneyde geliştirilen yöntemin birincil amacı, FEN1 nükleaz aktivitesini doğru ve verimli bir şekilde ölçmekti. Bu yöntem, FEN1'i hedefleyen küçük moleküllü inhibitörlerin taranması için güvenilir bir platform sağlamayı amaçlamaktadır. Bu hedeflere ulaşarak, çalışma FEN1'in kanserdeki rolünün daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmayı ve yeni terapötik stratejilerin keşfedilmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

FEN1 nükleaz aktivitesini tespit etmek için her biri farklı özelliklere, ilkelere, avantajlara, sınırlamalara ve uygulanabilir senaryolara sahip çok sayıda teknik mevcuttur. Örneğin, jel elektroforezi ve HPLC bazlı substrat ayırma yöntemleri sezgisel sonuçlar sağlar, ancak hantal prosedürler ve düşük verim içerir10,11. Floresan polarizasyon (FP) deneyleri, FP sinyallerini etkileyen bileşik otofloresan veya ışık saçılımından kaynaklanan girişim nedeniyle FEN1 aktivitesini değerlendirmede zorluklarla karşı karşıyadır. Karşı tarama stratejileri yanlış pozitifleri kısmen dışlayabilse de, birincil aktif bileşiklerin yaklaşık% 15'i teknik girişim nedeniyle hala yanlış tanımlanmıştır12. Floresan verici/söndürücü çiftlerinin (örneğin, TAMRA/BHQ-2) ve AlphaScreen kemilüminesansının birlikte kullanımı, karmaşık üçlü kanatlı floresan substratların yüksek sentez maliyeti gibi dezavantajlar sunar ve özellikle büyük ölçekli taramada faydalarını sınırlar. Ayrıca, alt tabakaların çift kanatlı yapısı, FEN1 ile optimum bağlanmayı engelleyerek enzimatik bölünme verimliliğini azaltabilir ve algılama hassasiyetinden ödün verebilir. Ek olarak, bu yaklaşım büyük ölçüde özel araçlara (örneğin, ViewLux, EnVision) dayanır ve kaynak sınırlı laboratuvarlarda benimsenmesini kısıtlar 13,14,15. Gümüş nanokümeler (DNA-AgNC'ler) ile işlevselleştirilmiş çift kanatlı dambıl şeklindeki DNA nanoproblarına dayanan floresan algılama yöntemleri, hassas tavlama ve yerinde çekirdeklenme adımlarına bağlı olmaları nedeniyle partiden partiye değişkenlikten muzdariptir, bu da tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği engeller. Yüksek maliyetler ve uzun prosedürler, pratik uygulamalarını daha da sınırlamaktadır16.

Bu makalede, mevcut teknik sınırlamaları ele almak ve FEN1 aktivitesini incelemek için daha güvenli, kullanıcı tarafından erişilebilir yöntemlere yönelik artan talebi karşılamak için floresan etiketleme tabanlı bir test geliştirilmiştir. Bu teknik, floresan tespitinin özgüllüğü ve yüksek hassasiyetinin yanı sıra, FEN1 tarafından tanınabilen ve parçalanabilen tanımlanmış yapılara sahip DNA substratlarını tasarlama yeteneğinden yararlanır (Şekil 1). Bu yöntem, FEN1 nükleaz aktivitesinin değerlendirilmesinde yüksek doğruluğu korurken deneysel prosedürleri kolaylaştırır. Geleneksel jel elektroforezi ve HPLC bazlı tekniklerle karşılaştırıldığında, basitleştirilmiş çalışma ve daha hızlı geri dönüş sunar. Floresan polarizasyon deneylerinden farklı olarak, bu yaklaşım, bileşiklerin hızlı kalitatif taramasını sağlayarak ön enzimatik değerlendirme için etkili bir strateji oluşturur.

Bu yöntem, radyoaktif maddelere erişimin sınırlı olduğu laboratuvar ortamlarında FEN1 nükleaz aktivitesini incelemek için uygundur. Ayrıca, özellikle yüksek duyarlılık ve özgüllük gerektiğinde, nispeten kısa sürede çok sayıda küçük moleküllü inhibitörün taranması için çok uygundur. Bununla birlikte, çok yüksek hassasiyetle mutlak miktar tayini gerektiren çalışmalar veya temel floresan algılama ekipmanı ve floresan sinyal analizinde uzmanlığa sahip olmayan laboratuvarlar için ideal değildir. FEN1 davranışının mevcut in vitro tahlil tasarımlarında tekrarlanmayan karmaşık biyolojik faktörlerden etkilenebileceği in vivo uygulamalara odaklanan çalışmalar için daha fazla iyileştirme veya alternatif yöntemler gerekli olabilir.

Bu floresan testi oldukça hassas ve spesifiktir ve FEN1 aktivitesini incelemek ve inhibitörlerini geliştirmek için güvenli, kullanışlı ve etkili bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. FEN1 protein ekspresyonu saflaştırması

  1. Protein saflaştırma
    1. Hedef plazmidi içeren bakteri stoğunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) -80 °C'den çıkarın. Oda sıcaklığında çözdürün ve donmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinden 200 μL'yi 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 50 μg/mL kanamisin içeren 20 mL LB ortamına aşılayın.
      NOT: Suuş E. coli BL21 (DE3) -FEN1'dir.
    2. 37 °C'de 160 rpm'de 12 saat çalkalayarak inkübe edin.
    3. Bakteriyel süspansiyonu, 50 μg/mL kanamisin ile desteklenmiş LB ortamı içeren 200 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın. 37 °C'de 160 rpm'de 2-3 saat çalkalanarak inkübasyona devam edin.
    4. Kültürün OD600'ü yaklaşık 0.6'ya ulaştığında, 2 mL IPTG ekleyin (son konsantrasyon: 1 mM). 25 °C'de, 160 rpm'de 10 saat inkübasyona devam edin.
    5. İndüklenen kültürü önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 4 °C ve 2500 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Pelet içeren tüpü tartın ve pelet kütlesini hesaplamak için boş tüpün ağırlığını çıkarın.
    6. Her bir gram ıslak hücre peleti için 7 mL lizis tamponu ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti iyice yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.
      NOT: Lizis tamponu (toplam 10 mL) 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, %2 Triton X-100 ve ddH2O içerir. Kimyasal reaktiflerin güvenli bir şekilde kullanılmasını sağlamak için bu adımı bir çeker ocakta gerçekleştirin.
    7. Lizis tamponundaki bakteri süspansiyonunu -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın ve gece boyunca dondurun. Ertesi gün, lizis verimliliğini artırmak için süspansiyonu 4 ° C'lik bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca çözdürün.
    8. 45 dakika boyunca% 75 güçte ultrason kullanarak hücreleri parçalayın. Süpernatanı peletten ayırmak için lizatı 12.000 × g'da 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Lizat bulanık kalırsa, lizis tamponunun hacmini artırın veya donma-çözülme döngülerini tekrarlayın. Protein bütünlüğünü korumak ve bozulmayı önlemek için bir nükleaz inhibitörü de eklenebilir.
    9. Arıtılmış süpernatanı, hazırlanmış protein saflaştırma reçinesi içeren bir tüpün duvarı boyunca uygulayın. Spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak için 10 mL elüsyon tamponu ile yıkayın.
      NOT: Elüsyon tamponu 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, %2 Triton X-100, 200 mM imidazol ve damıtılmış su içerir.
    10. Tüpün iç duvarı boyunca 5 mL elüsyon tamponu ekleyerek FEN1 proteinini elute edin.
  2. Hızlı coomassie parlak mavi boyama ile hedef proteinlerin tanımlanması
    1. SDS-PAGE jellerini beklenen FEN1 boyutuna göre %12 ayırma jeli ve %5 istifleme jeli kullanarak hazırlayın.
    2. Hedef protein örneğini ve BSA standardını 1: 4 oranında 5 × örnek tamponu ile karıştırın. Proteinleri tamamen denatüre etmek için karışımı 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
    3. BSA standart ve denatüre protein numunelerinin her biri 20 μL'yi SDS-PAGE jelinin ayrı kuyucuklarına yükleyin.
    4. Elektroforez aparatını bağlayın. Voltajı 90 V'a ayarlayın ve 1 saat 40 dakika çalıştırın.
    5. Elektroforezden sonra jeli bir boyama kabına aktarın. Deiyonize su ile durulayın, ardından 30 mL protein boyama solüsyonu ekleyin ve 25 dakika boyayın. Boyama solüsyonunu geri kazanın, jeli 20 mL deiyonize su ile durulayın ve gece boyunca yatay bir çalkalayıcı üzerinde rengi giderin.
    6. Renk gideriminden sonra jeli şeffaf plastik bir tabağa koyun ve beyaz ışık altında protein bantlarını gözlemleyin.
      NOT: Bantlar zayıfsa veya protein konsantrasyonu düşükse, numuneyi ultrafiltrasyon tüpleri kullanarak konsantre edin. Bu adım, fazla çözücüyü ve küçük molekülleri uzaklaştırır, protein konsantrasyonunu iyileştirir ve sonraki deneylerde doğru analiz sağlar.

2. FEN1 TAMRA etiketli DNA substrat hazırlığı

  1. TAMRA etiketli DNA substrat hazırlığı
    1. Yayınlanmış yöntemlere17 atıfta bulunarak, FEN1'in spesifik bölünme aktivitesine dayalı olarak DNA oligonükleotid iplikleri tasarlayın (bkz. Tablo 1). D5 dizisinin 1' ucu, bir floresan TAMRA etiketi ile modifiye edilmiştir.
    2. Aşağıdaki hacimlerde 10 μL tavlama tamponuna karışık tek sarmallı DNA oligonükleotidleri ekleyin: 5 μL D1 (10 pmol/μL), 10 μL T1 (10 pmol/μL) ve 7.5 μL U2 (10 pmol/μL). Toplam hacmi 50 μL'ye getirmek için deiyonize su ekleyin.
      NOT: Tavlama tamponu 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 10 mMMgCl2 içerir.
    3. Reaksiyon karışımını metal bir banyoda 100 °C'de 1 dakika ısıtın, ardından hemen 10 dakika boyunca 72 °C'ye aktarın18.
      NOT: Son DNA substratı 80 nükleotid uzunluğundadır. Yüksek başlangıç sıcaklığı (100 °C) denatürasyonu sağlarken, tavlama sıcaklığı (72 °C) doğru iplik eşleşmesini destekler.
    4. Isı kaynağını kapatın ve çözeltinin kademeli olarak oda sıcaklığına soğumasına izin verin, bu da tam çift sarmallı DNA substratını oluşturur.
  2. TAMRA etiketli DNA substrat testi
    1. 4.8 mL %30 akrilamid (29:1), 4.32 mL 6 M üre, 2.4 mL 5× TBE, 50 μL %10 APS, 5 μL TEMED ve 0.48 mL deiyonize suyu karıştırarak %12 denatüre edici bir poliakrilamid jel hazırlayın. Jeli hazırlamak için iyice karıştırın.
    2. Jeli katılaşması için 37 °C fırına 30 dakika koyun.
    3. Tespit için, sentezlenmiş DNA substratının 2 μL'sini 18 μL damıtılmış suya pipetleyin ve 7.7 μL Durdurma Tamponu ekleyin.
    4. Referans olarak, 2 μL TAMRA etiketli D1'i 18 μL damıtılmış suya pipetleyin ve 7,7 μL Durdurma Tamponu ekleyin.
    5. Hazırlanan her numuneden 20 μL'yi jel üzerine yükleyin ve DNA substrat oluşumunu analiz etmek için SDS-PAGE elektroforezi gerçekleştirin.

3. FEN1 nükleaz aktivite deneyi

  1. FEN1 enzim aktivitesi deneyi
    1. Reaksiyon tamponunda 2 μL DNA substratını FEN1 nükleaz ile birleştirerek 20 μL reaksiyon karışımı hazırlayın.
      NOT: Reaksiyon tamponu 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.2 mg/mL BSA ve deiyonize sudan oluşur.
    2. Reaksiyon karışımını 37 °C'de metal bir banyoda 15 dakika inkübe edin.
    3. 20 μL 2× sonlandırma tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
    4. Reaksiyona giren numunenin 20 μL'sini önceden hazırlanmış %12 denatüre edici bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve 60 dakika boyunca 100 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
    5. Elektroforezden sonra, sonuçları bir floresan görüntüleme sistemi (600 yol) kullanarak görselleştirin.

4. FEN1 nükleazın küçük moleküllü inhibitörlerinin taranması

  1. Küçük molekül inhibitörü taraması
    1. 2 μL dimetil sülfoksiti (DMSO) 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın.
    2. Tüpe 2 μL FEN1 nükleaz ve 10 μL 2× reaksiyon tamponu ekleyin.
    3. İyice karıştırın ve karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
    4. 2 μL DNA substratı ve 4 μL deiyonize su ekleyin, toplam reaksiyon hacmini 20 μL'ye getirmek için iyice karıştırın.
    5. DMSO'da 1 M'lik bir stok çözeltisinin iki kat seri seyreltmesini gerçekleştirerek FEN1 nükleaz inhibitörü FEN1-IN-4'ün çalışan bir seyreltmesini hazırlayın.
    6. 2 μL FEN1 nükleaz (0.03 μg/μL) ve 2 μL seyreltilmiş FEN1-IN-4 inhibitörünü yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. 10 μL 2× reaksiyon tamponu ve 4 μL deiyonize su ekleyin. Nazikçe karıştırın ve inhibitör ile enzim arasında yeterli etkileşimi sağlamak için 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    7. Son 20 μL'lik bir reaksiyon karışımı oluşturmak için tüpe 2 μL DNA substratı ekleyin.
    8. Reaksiyonu 37 ° C'de metal bir banyoda 15 dakika inkübe edin.
    9. 20 μL 2× sonlandırma tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.

5. FEN1 - IN-4 küçük molekül inhibitörünün inhibitör gücünün değerlendirilmesi

  1. 10 μL 2× reaksiyon tamponu almak için bir mikropipet kullanın ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
  2. 0.03 μg / μL konsantrasyonda 2 μL FEN1 nükleaz ve farklı konsantrasyonda 2 μL FEN1 inhibitörü FEN1-IN-4 ekleyin.
    NOT: Deneysel gereksinimlere göre çoklu konsantrasyon gradyanları oluşturulmalıdır.
  3. 4 μL deiyonize su ekleyin ve çözeltiyi iyice karıştırın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin ve 10 dakika inkübe edin.
  4. 20 μL'lik bir reaksiyon sistemi oluşturmak için tüpe 2 μL çift sarmallı DNA substratı ekleyin.
  5. EP tüpünü 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir metal banyoya yerleştirin.
  6. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, reaksiyonu sonlandırmak için reaksiyon karışımına 20 μL 2× durdurma tamponu ekleyin.
  7. Bir floresan görüntüleme cihazı kullanarak sonuçları gözlemleyin ve IC50 eğrisini19 çizin.
    NOT: Floresan yoğunluğu ölçümü Fiji/ImageJ20 kullanılarak gerçekleştirildi, ardından grafik ve analiz yazılımı21 ile istatistiksel analiz ve görselleştirme yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, boyama reaktifi proteine bağlanır ve proteinin jel üzerinde mavi bir bant olarak görünmesine neden olur. İlk şerit, BSA standart protein bandının 70 kDa'lık bir moleküler ağırlığa karşılık geldiği ve FEN1 nükleik asit protein bandının 45 kDa'lık bir moleküler ağırlığa karşılık geldiği moleküler ağırlık referansı olarak kullanılan etiketli proteini içerir. Deneysel sonuçlar, FEN1 nükleazının yaklaşık 45 kDa'da berrak bir bant olarak ortaya çıktığını gösterdi ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 nükleaz aktivite testi ve küçük molekül inhibitörü taraması, DNA hasarı onarımı ve kanser gelişimi üzerine yapılan araştırmaların merkezinde yer alır. Geleneksel radyo etiketleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, mevcut yöntem uygun maliyetli, verimli, kullanımı kolay ve daha güvenli bir alternatif sunmaktadır. Ek olarak, floresan patlama tabanlı FEN1 testlerinden farklı olarak, bu yaklaşım substrat bölünmesinin daha sezgisel bir görselleştirmesini sağlar, böylece enzim aktivitesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumu Bilim ve Teknoloji için Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021), Jiangsu Meslek Yüksekokulu Mühendislik Teknolojisi Araştırma Merkezi Programı (2023), Suzhou Halkının Geçim Teknolojisi Projeleri Anahtar Teknoloji Programı (SYWD2024099), Devlet Radyasyon Tıbbı ve Koruma Anahtar Laboratuvarı Projesi, Soochow Üniversitesi (GZK12023013), Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Programları (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) ve Çin'deki Jiangsu Eyaletinin Qing-Lan Projesi (2021, 2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M Tris-HCLBeyotimeST774 Serisi
%30 Acr-Bis (29:1)BeyotimeST003-500ml
5 milyon NaclBeyotimeST347 Serisi
BeyoBlue ArtıBeyotimeP0003S
BL21(DE3)-FEN1VazymeC504-F1 Serisi
BSABeyotimeP0007
Renk giderici çalkalayıcıKylin-ÇanTS-100 Uçağı
DL-DitiyotreitolBeyotimeST041 Serisi
Kuru Banyo İnkübatörüRUICHENGDH200 Serisi
Elektroforez aparatıBei jing Liuyi BiyoteknolojiDDY-6D
FEN1'İ 4 ARADAHedef MOLT8545 Serisi
IPTGTakaba9030
Kanamisin SlufateBiyokeskinBS152 Serisi
Laboratuvar SantrifüjüTermoSL 16R Serisi
LB Et SuyuGüneş EnerjisiL8291 Serisi
Ni-NTA His Bind Reçine7SE biyoteknolojiPANF001-001C
Odyssey FCODYSSEYLI-COR
SDS-SAYFABeyotimeP0015L
Trition-x-100Shyuanye HakkındaS15022

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fluorescence DetectionDNA Damage RepairGel ElectrophoresisDNA Substrate CleavageCancer BiomarkerHigh Throughput ScreeningDouble Stranded DNAInhibitor Screening

İlgili makaleler