Method Article

Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir

DOI:

10.3791/67980

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüberküloz dışı mikobakterilere (NTM) bağlı akciğer hastalığı prevalansı tüm dünyada giderek artmaktadır. NTM'nin neden olduğu pulmoner hastalık sıklıkla bronşektazi, akciğer nodülleri ve kaviter hastalık ile ortaya çıksa da, bu farklı pulmoner yaralanma paternleri ile ilişkili konak yanıtı in situ olarak iyi karakterize edilmemiştir. NTM hastalığı olan bireylerden alınan akciğer dokusundaki immün hücre popülasyonlarının derin fenotipik analizini yaparak, granülomatöz (TB) akciğer hastalığının altın standardı olan granülomatöz (TB) akciğer hastalığı ile karşılaştırmalı olarak NTM'nin neden olduğu patolojinin mekanizmalarını değerlendirmeye çalıştık.

Dissemine NTM, pulmoner NTM veya pulmoner TB hastalığı olan hastalardan formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) akciğer blokları, Yinelemeli Beyazlatma Çoklu PleXity (IBEX) görüntüleme yönteminin modifiye edilmiş bir versiyonunu takiben kesitlere ayrıldı ve boyandı. IBEX yönteminin optimizasyonu ilk olarak, FFPE koruması ve FFPE bloklarının yaşı ile kötüleşen pulmoner dokuya özgü yüksek kollajen, elastin ve eritrosit yoğunluğu nedeniyle akciğer bölümlerinin önemli endojen floresansını ele almak için gerekliydi. Bu protokolde, klinik olarak arşivlenmiş örneklerin otofloresansını azaltan bir foto ışınlama protokolü ve modifiye antijen elde etme yöntemini detaylandırıyoruz.

Ayrıca, çapraz reaktivite, foto ışınlamayı takiben epitop kaybı, bitişik floroforlar arasında spektral örtüşme ve belirli hedefler için düşük sinyal-gürültü gibi yaygın zorluklar dahil olmak üzere antikor paneli tasarımı hakkında rehberlik sağlıyoruz. Tüm akciğer dokusu kesitlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesini kolaylaştırmak için, slaytlar geniş alan mikroskobu ile görüntülendi ve görüntü kalitesini artırmak için açık kaynaklı yazılımla son işleme tabi tutuldu. Birlikte, bu iş akışı, yaygın olarak bulunan enstrümantasyon ve reaktifleri kullanarak zorlu örneklerden yüksek oranda çoklanmış, yüksek çözünürlüklü, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini belgeleyerek kritik bir ihtiyacı karşılar. Klinik numunelerin kantitatif görüntülemesinin ötesinde, bu teknikler hem endojen hem de eksojen floresan kaynaklarının üstesinden gelmek için çeşitli numune tiplerine uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüberküloz (TB), her yıl yaklaşık 1,3 milyon insanın tüberküloz enfeksiyonundan ölmesiyle önde gelen ölüm nedenlerinden biridir1. Tüberküloz kadar öldürücü olmasa da son yıllarda tüberküloz dışı mikobakterilerin (NTM) neden olduğu akciğer enfeksiyonlarında ve buna bağlı hastalıklarda önemli bir artış olmuştur2. Doku düzeyinde, pulmoner Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı konak immün yanıtı iyi çalışılmıştır ve granülomların, lenfositlerin heterojen agregatlarının, dendritik hücrelerin, makrofajların ve nötrofillerin oluşumunu içerir3. Gra....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arşivlenmiş otopsi ve cerrahi rezeksiyon akciğer dokusu kesitleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Klinik Merkezi Patoloji Laboratuvarı'nda 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiectasis) protokolü altında toplandı. Bu protokol IRB tarafından onaylandı ve katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdiler.

1. Otomatik antijen alımı

NOT: Deparafinizasyon ve antijen alımı, otomatik bir araştırma boyama platformu kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1). Önceki çalışmalar, sitrat bazlı pH 6 epitop geri alma solüsyonu (ER1) ile 30 dakika ve ardından EDTA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğullanmış antikor tabanlı bir görüntüleme paneli tasarlamak önemli ölçüde zaman, çaba ve kaynak gerektirir12. Bu zorluklar, burada açıklandığı gibi yüksek derecede otofloresan dokulardan arşivlenmiş FFPE örnekleri için bir panel tasarlanırken özellikle belirgindir (Şekil 1). Bu zorlukların üstesinden gelmek için önce boya inaktivasyon protokolümüzle uyumlu en parlak floroforları belirledik (Tablo 1). Örneğin, Alexa Fluor Plus ikincil antikorlarının,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer tüberkülozundan kaynaklanan klinik akciğer patolojisi nekrotizan granülomatöz inflamasyon ile karakterizedir. NTM pulmoner patolojisi esas olarak iki ayrı patolojik paterne sahip iki farklı hasta popülasyonunda ortaya çıkar: immün yetmezliği olan bireylerde bronşioler obliterasyon ve kavite oluşumu ile birlikte granülomatöz inflamasyon ile işaretlenmiş izole akciğer hasarı veya immün yetmezliği olan bireylerde akciğerleri ve diğer organları etkileyen yaygın nodüler hastalık 13,14.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R., Leica Microsystems, Inc.'de bir çalışandır. Diğer yazarlar herhangi bir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma DIR/NIAID, NCI ve NHLBI'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , NIH ile yapılan bir kurumsal lisans sözleşmesi kapsamında BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%0,3 Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Tamponu engellemek için çözüm
%1 BSASigma-AldrichA4503 SerisiTamponu engellemek için çözüm
%1 İnsan BD Fc BloğuBD Biyolojik Bilimler564220Engelleme arabelleği için Fc Bloğu gereklidir
150 W LED lambaAmazonB07VH3CVSFDoku fotoirradyasyonu için LED ışık kaynağı
1x PBS Gibco10010-023Tampon ve yıkama adımlarını bloke etmek için çözüm
20 Galonluk Depolama KabıAmazonB001B1C4G0Fotoışınlama işlemi için konteyner
40 W RGBW sel LED lamba AmazonB08QFPJSMDDoku fotoirışınlaması için RGB ışık kaynağı
Ag85BAbcamab43019/NAIBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Alfa-düz kas aktini DyLight 755Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-345221R/NAIBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Avidin/Biotin Engelleme KitiAbcamab64212Avidin ve biotin bloke edici solüsyon
BD Cytofix/CytopermBD Biyolojik Bilimler554714Sabitleme çözümü
BOND Balmum Çözücü SolüsyonLeica BiyosistemleriNC0221076Deparafinizasyon çözümü
BOND Epitop Alma Çözümü 1Leica BiyosistemleriNC0235529Sitrat bazlı pH 6 epitop geri alma çözeltisi (ER1)
BOND Epitop Alma Çözümü 2Leica BiyosistemleriNC0235530EDTA bazlı pH 9 epitop geri alma çözeltisi (ER2)
BOND Araştırma Tespit SistemiLeica BiyosistemleriNC0396648Otomatik araştırma boyama reaktifi
BOND RX Araştırma BoyasıLeica BiyosistemleriNAOtomatik araştırma boyama platformu
BOND Yıkama SolüsyonuLeica BiyosistemleriNC0221077Yıkama tamponu
CD15BD Biyolojik Bilimler347420/AB_400298IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
CD20 eFlor 660Thermo Fisher Bilimsel50-0202-82/AB_11150959IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
CD4 Alexa Flor 488R& D SistemleriFAB8165G/AB_2728839IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
CD45 Fikoeritrin (PE)Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-34528PE/NAIBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
CD68 iFlor 594Caprico Biyoteknoloji1064135/AB_2892745IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher BilimselA32814/AB_2762838IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher BilimselA32787/ AB_2762830IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488Jackson İmmünoAraştırma715-545-020/AB_2340844IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher BilimselA32794/AB_2762834IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
EasyDip Boyama SistemiYeni Gelen Arzı5300 KITLIKSlayt boyama sistemi
Flor Montajı-GThermo Fisher Bilimsel00-4958-02Montaj ortamı
HoechstBiyotyum40046IBEX görüntüleme için nükleer boya. Tablo 1'e bakınız.
Imaris Dosya Dönüştürücü x64 10.2.0Imaris Oxford EnstrümanlarıÜcretsiz dosya dönüştürücü
ImarisViewer yazılımı x64 10.2.0Imaris Oxford EnstrümanlarıÜcretsiz görüntü işleme yazılımı
ImmEdge KalemiVektör LaboratuvarlarıH-4000 SerisiHidrofobik bariyer kalemi
Lityum Borohidrür (1 gram)STREM Kimyasallar93-0397Boya inaktivasyonu için kimyasal, bu kimyasalın küçük kısımlarını satın alın (1 gram)
Lumikan BiyotiniR& D SistemleriBAF2846IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
Mikro Kapaklı CamlarVWR48393-241Cam sürgülü kapaklar
Pan-sitokeratin Alexa Flor 750Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız.
PELCO BioWave Pro Mikrodalga SistemiTed Pella A.Ş.36500-230Isıtmasız bilimsel mikrodalga
PELCO Sabit Sıcaklık ProTed Pella A.Ş.50062Bilimsel mikrodalga için tam otomatik sıcaklık kontrolü
Basit ITKAçık kaynaklı yazılımKayıt ve kanal işleme yazılımı
Streptavidin Alexa Flor 594Thermo Fisher BilimselS11227IBEX görüntüleme için etiketleme reaktifi. Tablo 1'e bakınız.
Geniş Alan MikroskobuLeica MikrosistemleriNALED8 ışık kaynağına ve LAS X yazılımına sahip Leica Microsystems THUNDER görüntüleyici (3.7.1.21655). Floresan görüntüleme için, geçiş başına yedi boya kanalını görüntülemek için iki ek tek bantlı filtre (PN: 8118215) ile harici filtre tekerleğine (PN: 11536075) sahip özel bir dört bantlı filtre kullanıldı. Filtre uyarma, dikroik ve emisyon çizgileri şunlardır: (1) Dört Bantlı küp: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31'de dikroik, uyarma veya emisyon filtresi yok; (2) harici filtre çarkı konumu 1: 434/32, konum 2: 520/40, konum 3: 585/20, konum 4: 720/60, konum 5: geçiş; (3) tek bantlı 1— 585/22 uyarma, 594 dikroik, 625/30 emisyon; (4) tek bantlı 2— 635/20 uyarma, 647 dikroik, 667/30 emisyon.
Zeiss Optik Lens TemizleyiciAmazonB00GPVQVCOMikroskop objektif lens temizleyici
Antikorlar
Ag85BAbcamab43019Poliklonal Tavşan IgG, döngü 1
Alfa-düz kas aktini DyLight 755Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-345221R Serisi1A4/asm-1, döngü 1
CD4 Alexa Flor 488R& D SistemleriFAB8165GPoliklonal Keçi IgG, döngü 1
CD8 Alexa Flor 647Biyolojik Efsane372906C8/144B, döngü 1
CD68 iFlor 594Caprico Biyoteknoloji1064135KP1, döngü 1
Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher BilimselA32814 SerisiPoliklonal Eşek, döngü 1
Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher BilimselA32787 SerisiPoliklonal Eşek, döngü 1
Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher BilimselA32794 SerisiPoliklonal Eşek, döngü 1
HoechstBiyotyum40046Nükleer etiket, döngü 1
CD15BD Biyolojik Bilimler347420MMA, döngü 2
CD20 eFlor 660Thermo Fisher Bilimsel50-0202-82L26, döngü 2
CD45 Fikoeritrin (PE)Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-34528PE Serisi2B11 + PD7/26, döngü 2
Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488Jackson İmmünoAraştırma715-545-020Poliklonal Eşek, döngü 2
Lumikan BiyotiniR& D SistemleriBAF2846Poliklonal Keçi IgG, döngü 2
Pan-sitokeratin Alexa Flor 750Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-33200AF750 SerisiAE-1/AE-3, döngü 2
Streptavidin Alexa Flor 594Thermo Fisher BilimselS11227Yok, döngü 2
HoechstBiyotyum40046Döngü 2
Çözümler
Engelleme Tamponu (Döngü 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Hacimce %0,3
BSASigma-AldrichA4503 SerisiHacimce %1
İnsan BD Fc BloğuBD Biyolojik Bilimler564220Hacimce %1
1x PBS Gibco10010-023Hacimce %97,7
Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #1 (Döngü 1)
Engelleme Arabelleği (Döngü 1)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
HoechstBiyotyum400461:5000
CD8 AF647Biyolojik Efsane3729061:10
Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #2 (Döngü 1)
Engelleme Arabelleği (Döngü 1)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
CD4  AF488R& D SistemleriFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
İkincil Antikor Boyama Solüsyonu #1 (Döngü 1)
Engelleme Arabelleği (Döngü 1)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
Eşek Keçi Karşıtı AF Plus 488Thermo Fisher BilimselA32814/AB_27628381:100
Eşek anti-Tavşan AF Plus 555Thermo Fisher BilimselA32794/AB_27628341:100
Eşek anti-Fare AF Plus 647Thermo Fisher BilimselA32787/AB_27628301:50
Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #3 (Döngü 1)
Engelleme Arabelleği (Döngü 1)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
CD68 iF594Caprico Biyoteknoloji10641351:10
a-SMA DL755Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-345221R/NA1:30
BSA içermeyen Engelleme Tamponu (Döngü 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Hacimce %0,3
İnsan BD Fc BloğuBD Biyolojik Bilimler564220Hacimce %1
1x PBS Gibco10010-023Hacimce %98,7
Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #4 (Döngü 2)
BSA içermeyen Engelleme Arabelleği (Döngü 2)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
CD15BD Biyolojik Bilimler3474201:30
Lumikan BiyotiniR& D SistemleriBAF28461:100
CD45 PENovus Biyolojik ÜrünlerNBP2-34528PE Serisi1:20
CD20 eFlor 660Thermo Fisher Bilimsel50-0202-821:10
Pan-Sitokeratin AF750Novus Biyolojik ÜrünlerNBP2-33200AF750 Serisi1:10
İkincil Antikor Boyama Solüsyonu #2 (Döngü 2)
BSA içermeyen Engelleme Arabelleği (Döngü 2)Yukarıyı görmekAntikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun
Eşek anti-Fare IgM AF488Jackson İmmünoAraştırma715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher BilimselS112271:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Iterative BleachingMultiplex ImagingAutofluorescent SamplesSpatial ProteomicsFFPE Lung TissuePhotoirradiation ProtocolAntibody Panel DesignWhole Slide ImagingGranulomatous InflammationImmune Cell Mapping

Related Articles