Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir
Bu makalede
Özet
Özet
Tüberküloz dışı mikobakterilere (NTM) bağlı akciğer hastalığı prevalansı tüm dünyada giderek artmaktadır. NTM'nin neden olduğu pulmoner hastalık sıklıkla bronşektazi, akciğer nodülleri ve kaviter hastalık ile ortaya çıksa da, bu farklı pulmoner yaralanma paternleri ile ilişkili konak yanıtı in situ olarak iyi karakterize edilmemiştir. NTM hastalığı olan bireylerden alınan akciğer dokusundaki immün hücre popülasyonlarının derin fenotipik analizini yaparak, granülomatöz (TB) akciğer hastalığının altın standardı olan granülomatöz (TB) akciğer hastalığı ile karşılaştırmalı olarak NTM'nin neden olduğu patolojinin mekanizmalarını değerlendirmeye çalıştık.
Dissemine NTM, pulmoner NTM veya pulmoner TB hastalığı olan hastalardan formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) akciğer blokları, Yinelemeli Beyazlatma Çoklu PleXity (IBEX) görüntüleme yönteminin modifiye edilmiş bir versiyonunu takiben kesitlere ayrıldı ve boyandı. IBEX yönteminin optimizasyonu ilk olarak, FFPE koruması ve FFPE bloklarının yaşı ile kötüleşen pulmoner dokuya özgü yüksek kollajen, elastin ve eritrosit yoğunluğu nedeniyle akciğer bölümlerinin önemli endojen floresansını ele almak için gerekliydi. Bu protokolde, klinik olarak arşivlenmiş örneklerin otofloresansını azaltan bir foto ışınlama protokolü ve modifiye antijen elde etme yöntemini detaylandırıyoruz.
Ayrıca, çapraz reaktivite, foto ışınlamayı takiben epitop kaybı, bitişik floroforlar arasında spektral örtüşme ve belirli hedefler için düşük sinyal-gürültü gibi yaygın zorluklar dahil olmak üzere antikor paneli tasarımı hakkında rehberlik sağlıyoruz. Tüm akciğer dokusu kesitlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesini kolaylaştırmak için, slaytlar geniş alan mikroskobu ile görüntülendi ve görüntü kalitesini artırmak için açık kaynaklı yazılımla son işleme tabi tutuldu. Birlikte, bu iş akışı, yaygın olarak bulunan enstrümantasyon ve reaktifleri kullanarak zorlu örneklerden yüksek oranda çoklanmış, yüksek çözünürlüklü, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini belgeleyerek kritik bir ihtiyacı karşılar. Klinik numunelerin kantitatif görüntülemesinin ötesinde, bu teknikler hem endojen hem de eksojen floresan kaynaklarının üstesinden gelmek için çeşitli numune tiplerine uygulanabilir.
Giriş
Tüberküloz (TB), her yıl yaklaşık 1,3 milyon insanın tüberküloz enfeksiyonundan ölmesiyle önde gelen ölüm nedenlerinden biridir1. Tüberküloz kadar öldürücü olmasa da son yıllarda tüberküloz dışı mikobakterilerin (NTM) neden olduğu akciğer enfeksiyonlarında ve buna bağlı hastalıklarda önemli bir artış olmuştur2. Doku düzeyinde, pulmoner Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı konak immün yanıtı iyi çalışılmıştır ve granülomların, lenfositlerin heterojen agregatlarının, dendritik hücrelerin, makrofajların ve nötrofillerin oluşumunu içerir3. Granülomatöz inflamasyon aynı zamanda NTM enfeksiyonuna karşı konak bağışıklığının temel bir özelliği olsa da, immün hücre popülasyonları ve bu yanıtın mekansal özellikleri yeterince çalışılmamıştır. İmmünopatolojinin yara iyileşmesine karşı doku bileşenlerinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, tedavilerin (örneğin, konakçıya yönelik tedaviler) ve önleyici (yani aşılar) terapötik stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
Bu çalışmada ekibimiz, Mtb veya NTM enfeksiyonu olan hastalardan akciğer rezeksiyonları veya otopsiler sırasında elde edilen nadir, arşivlenmiş klinik örneklere erişebildi. Bu örneklerin çoğu 10 yaşın üzerindeydi ve formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) örnekler olarak korundu ve kullanımlarını histolojik testlerle sınırladı. Geleneksel immünohistokimya (IHC) ve immünofloresan (IF) görüntülemenin belirteç sınırlamalarının üstesinden gelmek için, açık kaynaklı, yüksek oranda çoğullanmış bir görüntüleme yöntemi olan Yinelemeli Beyazlatma Çoklu PleXity (IBEX) yöntemini kullandık 4,5. IBEX yönteminin insan akciğer FFPE örneklerini kapsayacak şekilde genişletilmesi, çoğullanmış antikor tabanlı görüntüleme için iyi tanımlanmış bir engel olan yüksek endojen floresan seviyeleri nedeniyle önemli bir optimizasyon gerektirmiştir6.
Burada, akciğer FFPE dokusu bölümleri 7,8 için optimize edilmiş bir foto ışınlama yöntemi kullanarak otofloresanı azaltmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, burada açıklanan yöntem, yüksek otofloresanslı diğer numune preparatlarına genişletilebilen ucuz, yaygın olarak bulunan bir ışık kutusu kullanır. Görüntü elde edilmeden önce otofloresanı azaltmanın yanı sıra, düşük bolluktaki belirteçleri parlak florofor etiketleriyle eşleştirme, foto ışınlamanın antikor etiketlemesi üzerindeki etkisini değerlendirme ve yüksek endojen floresansa sahip kanallarda ikincil antikorlarla amplifikasyon gibi antikor paneli tasarımı hakkında rehberlik sağlıyoruz. Ortalama olarak, her biri 37 ila 114 mm2 arasında değişen bir doku bölümüne karşılık gelen beş slaytı işledik. Son olarak, geniş alan aracı kullanarak tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini gösteriyoruz. Özetle, bu protokol IBEX'in arşivlenmiş klinik örneklere uyarlanmasını açıklar ve ayrıca yüksek oranda otofloresan örneklerin görüntülenmesinde yaygın olarak karşılaşılan sorunların nasıl giderileceği konusunda rehberlik sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Arşivlenmiş otopsi ve cerrahi rezeksiyon akciğer dokusu kesitleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Klinik Merkezi Patoloji Laboratuvarı'nda 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiectasis) protokolü altında toplandı. Bu protokol IRB tarafından onaylandı ve katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdiler.
1. Otomatik antijen alımı
NOT: Deparafinizasyon ve antijen alımı, otomatik bir araştırma boyama platformu kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1). Önceki çalışmalar, sitrat bazlı pH 6 epitop geri alma solüsyonu (ER1) ile 30 dakika ve ardından EDTA bazlı pH 9 epitop geri alma solüsyonu (ER2) ile 30 dakikadan oluşan ikili antijen alma yaklaşımının, FFPE dokuları için en iyi immünoetiketleme sonuçlarını verdiğini belirledi9. IBEX Görüntüleme Topluluğu10,11 tarafından sağlanan diğer açıklanan yöntemler ve destek kullanılarak manuel mum alma ve ikili antijen alımı kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilebilir.
- Slaytları ve otomatik antijen alma malzemelerini toplayın (slayt kapakları, araştırma tespit sistemi, sitrat bazlı pH 6 epitop alma solüsyonu (ER1), EDTA bazlı pH 9 epitop alma solüsyonu (ER2), vb.).
- Cihazı açın, 20 dakika boyunca başlatılmasına izin verin, araştırma algılama kolunu cihaza yerleştirin ve reaktif kaplarını makinenin altına yerleştirin.
- Yazılımı açın, slayt kurulumuna tıklayın ve çalışma ekle'yi seçin ve çalışma için yeni bir ad oluşturun.
- Slayt ekle'yi seçin ve slaytları istediğiniz gibi etiketleyin.
- Bu protokolü takip etmek için, 30 dakika ER1 ve 30 dakika ER2'den oluşan bir HIER protokolü ile bir Pişirme ve Mum Giderme protokolü gerçekleştirin.
- Etiketleri yazdırın ve slaytların üzerine yerleştirin. Siyah slayt rafını cihazdan çıkarın ve ilgilendiğiniz slaytları rafa yerleştirin. Her slayta şeffaf sürgülü kapaklar yerleştirin, sürgülü rafı cihaza geri koyun ve cihazdan slaytların barkod taramasını gerçekleştirmesini istemek için rafın altındaki düğmeye basın.
- Oynat | tamam'ı seçin ve otomatik antijen alımının yaklaşık 3 saatlik bir süre ile başlamasına izin verin.
2. Fotoışınlamadan önce antikor etiketlemesi
- Antijen alımı tamamlandıktan sonra, slaytları PBS'ye daldırın.
NOT: Bazı epitoplar foto ışınlamaya duyarlıdır ve gece boyunca LED'e maruz kaldıktan sonra bozulur. Hassas epitoplar ampirik olarak belirlenmeli ve keşfedildiğinde bu epitopların immüno-etiketlenmesi bu aşamada gerçekleşmelidir. Antijen alımını takiben lamın her zaman ıslak kaldığından emin olun. - PBS'den bir slaytı çıkarın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak slayttaki tüm fazla PBS'yi kurulayın; Dokuya dokunmamaya dikkat edin. Hidrofobik bir kalemle dokunun etrafına bir kenarlık çizin. Kalan tüm slaytlar için işlemi tekrarlayın. Hidrofobik bariyeri 10 dakika kurumaya bırakın.
- Her kuyucuğun dibine az miktarda su koyarak bir Slayt Nem Odası hazırlayın. Slaytları Slayt Nem Odasına yerleştirin. Doku örneğine doğrudan dokunmadan PBS'yi dokudan uzaklaştırın.
- Her slayta 200 μL engelleme tamponu (Malzeme Tablosu) ekleyin. Slayt Nem Odasını, sabit bir sıcaklığı korumak için bir mekanizmaya sahip, ısıtılmayan bilimsel bir mikrodalgaya yerleştirin.
- Daha önce oluşturulan aşağıdaki programı uygulayarak spesifik olmayan antikor etiketlemesini engelleyin4: 2-1-2-1-2-1-2-1-2 programı, burada "2" 100 W'ta 2 dakika ve "1" 0 W'da 1 dakika anlamına gelir. Engellemek için yukarıdaki programı bir kez çalıştırın. Bu alet mevcut değilse, daha önce tarif edildiği gibi 37 ° C'de 1 saat boyunca doku bölümlerini (5-10 μm) bloke edin5.
- Tampon inkübasyonunu bloke ederken Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #1 (Döngü 1) (Malzeme Tablosu) oluşturun. Antikor karışımlarını Malzeme Tablosuna göre hazırlayın. Antikor kokteylini nazikçe karıştırın ve antikor karışımını 30 saniye boyunca 2.680 × g'da bir mini santrifüj ile döndürün.
NOT: Bu boyama çözeltisi, iki döngülü deney süresince yeterli olması gereken 1:5000 Hoechst seyreltmesini içerir. Kullanıcıların, dokuları ve görüntüleme konfigürasyonları için en uygun sonuçları elde etmek için Hoechst ve diğer antikorları titre etmeleri gerekebilir. - Döngü tamamlandığında Slide Nem Odasını mikrodalgadan çıkarın ve her dokudan bloke edici tampon solüsyonunu fitilleyin. Her slayta 200 μL Primer Antikor Boyama Çözeltisi #1 (Döngü 1) (Malzeme Tablosu) ekleyin. Slaytlı odayı tekrar mikrodalgaya yerleştirin ve birincil antikor programını yaklaşık 30 dakika çalıştırın: birincil antikor etiketlemesi için 2-1-2-1-2-1-2-1-2 programını iki kez uygulayın.
NOT: Burada, 200 μL primer antikor çözeltisi bir tahmindir. Doku bölümünün tüm yüzeyini kaplamak için yeterli miktarda çözelti kullanın. - Birincil antikor etiketleme adımı tamamlandıktan sonra, slaytı dikey olarak eğerek, PBS'yi dokuya pipetleyerek ve PBS'nin akmasına izin vererek her slaytı 1.000 μL PBS ile yıkayın. Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın.
- Fazla PBS'yi fitilleyin ve slaytları %1 paraformaldehit (PFA) ile nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
NOT: PFA fiksasyonu, epitopları maskeleyerek antikorların amaçlanan hedeflerine bağlanmasını önleyebilir. İlk kez bir antikor paneli oluştururken, immünoetiketlemeden önce fiksatif ile veya fiksatif olmadan tedavi edilen doku bölümlerinin etiketleme modelini karşılaştırarak hafif bir fiksasyonun (10 dakika boyunca% 1 PFA) etkisini değerlendirmenizi öneririz. Bir antikor %1 PFA fiksasyonuna duyarlıysa, bu antikoru postfiksasyon adımından önce hareket ettirin. - Slaytları 1.000 μL PBS 3-5x ile yoğun bir şekilde yıkayın. Fotoirışınlama adımına kadar PBS'yi doku üzerinde bırakın.
3. Doku fotoışınlaması
- Fotoışınlama kutusunu hazırlamak için (Şekil 2), 150 W'lık bir LED lamba, 40 W'lık bir RGBW projektör, büyük bir plastik kap (20 galon [75.71 L] hacim veya daha fazla), taze 1x PBS ve bir Petri kabı edinin.
- Petri kabını 150 W lambanın ortasına yerleştirin ve 1x PBS ile doldurun. Slaytları PBS'ye daldırmak için yeterli ses kullanın. Lambalardan kaynaklanan ısı oluşumunu en aza indirmek için foto ışınlama işlemini soğuk odada gerçekleştirin.
- Slaytları Slayt Nem Odasından çıkarın ve tüm slaytların PBS'ye daldırıldığından emin olarak bir Petri kabına yerleştirin.
- 40 W lambayı, ışık kaynağı slaytlara bakacak şekilde doğrudan Petri kabının üzerine yerleştirin. Yerleştirmeden önce 40 W lambanın kırmızı ışık ayarına ayarlandığından emin olun.
- Hem 150 W hem de 40 W lambaları açın. Fotoışınlama kurulumunu plastik kap kapağıyla kapatın. 40 W lambayı 2 saat boyunca kırmızı ışık ayarında tutun, ardından kalan 16 saat boyunca birlikte verilen uzaktan kumanda ile yeşil ışık ayarına geçin.
NOT: Slayt dokusunun istenmeyen ısı bozulmasını önlemek için yaklaşık 4 °C'de foto ışınlama yapılması zorunludur. Duraklama noktası: foto ışınlama gece boyunca gerçekleştirilebilir ve protokole ertesi sabah devam edilebilir.
4. Fotoışınlama sonrası antikor etiketleme
- Slaytları Petri kabından çıkarın ve bir Coplin kavanozuna, 50 mL konik tüpe veya slayt boyama sisteminden bir kovaya 1x PBS'ye daldırın. Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #2'yi (Döngü 1) (Malzeme Tablosu) önerilen seyreltmelerde hazırlayın (Tablo 1). Her slayt için 200 μL çözelti kullanın.
- Tüy bırakmayan bir mendille her bir slayttaki fazla PBS'yi fitilleyin ve dokunun etrafındaki alanı dokunun kendisine dokunmadan kurutduğunuzdan emin olun. Slaytları Slayt Nem Odasına yerleştirin.
- Primer Antikor Boyama Solüsyonu #2'yi (Döngü 1) nazikçe girdaplayın ve tüm dokunun kaplandığından emin olarak her slayta 200 μL ekleyin.
- Slayt Nem Odasını slaytlarla birlikte tekrar mikrodalgaya yerleştirin ve adım 2.7'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birincil antikor programını yaklaşık 30 dakika boyunca çalıştırın
- Birincil antikor etiketlemesi sırasında, İkincil Antikor Boyama Çözeltisi #1 (Döngü 1) çözeltisini (Malzeme Tablosu) yapın.
- Mikrodalga programı tamamlandıktan sonra, Slayt Nem Odasını çıkarın ve her bir slaytı 3-5x 1,000 μL 1x PBS ile yıkayın.
- Tüy bırakmayan mendille her bir slayttan fazla PBS'yi fitilleyin, ikincil antikor boyama solüsyonunu girdaplayın ve her slayta 200 μL ekleyin.
- Slayt Nem Odasını mikrodalgaya yerleştirin ve ikincil antikor programını çalıştırın: 2-1-2-1-2-1-2-1-2-1-2 programı, burada " 2" 100 W'ta 2 dakika ve " 1" 0 W'ta 1 dakika anlamına gelir. İkincil antikor etiketlemesi için yukarıdaki programı bir kez çalıştırın.
- Slaytları 1 mL 1x PBS ile 3-5x yoğun bir şekilde yıkayın ve her slayttan fazla PBS'yi fitilleyin.
- Her slayta doğrudan konjuge antikorlar içeren Primer Antikor Boyama Çözeltisi #3 (Döngü 1) ekleyin. Adım 2.7'de belirtildiği gibi mikrodalga veya alternatif (37 ° C'de 1 saat) kullanarak antikor boyaması yapın.
- Slaytları 1 mL 1x PBS ile tekrar 3-5 kez yıkayın ve her slayttan fazla PBS'yi dikkatlice sıkın.
- Her doku bölümüne doğrudan 30 μL montaj ortamı ekleyin ve doku bölümünün tamamını kaplayan bir lamel yerleştirin. Sürgüyü hava kabarcıkları açısından inceleyin ve hava kabarcıklarını hafif bir basınçla sürgünün çevresine itin. Kalan slaytlar için işlemi tekrarlayın.
- Fazla montaj ortamını tüy bırakmayan bir bezle çıkarın ve lamel yüzeyinde kalan kalıntıları temizlemek için optik lens temizleyici kullanın. Mikroskopta görüntü almadan önce tüm slaytların oda sıcaklığında 10-15 dakika sertleşmesine izin verin.
5. Mikroskopi kurulumu ve görüntü elde etme
- Geniş alan mikroskobunu ve LED8 ışık kaynağını açın; Yazılımı başlatın. Hedefi seçin (burada, 20x/0,8 kuru hedef). Yapılandırma sekmesinde kamerayı 16 bit moduna getirin. Antikor panellerinde bulunan floroforlara göre gerekli kanalları seçin (daha fazla rehberlik için Tablo 1'e bakınız).
NOT: Referans alınan mikroskop için aşağıdaki adımlar belirtilmiştir. Karşılaştırılabilir bir ışık kaynağına ve birkaç floroforun uyarılması ve emisyonu için filtre küplerine sahip eşdeğer bir geniş alan mikroskobu ve hassas bir aşama kullanılabilir. - Görüntülemeden hemen önce lameli lens temizleyici ve lens kağıdı ile temizleyin. Lameli görsel olarak inceleyin ve görüntülemeden önce yüzeydeki toz veya tüyleri temizleyin. Slaytı, sahne alanı ekinin sol üst köşesine (veya eşdeğerine) sıkıca yerleştirin, böylece doku tutarlı bir şekilde XY düzleminde konumlandırılacaktır (döngüsel görüntülerin hizalanması için kritik öneme sahiptir).
- Antikor panelinde bulunan her bir florofora karşılık gelen bir kanal oluşturarak alım ayarlarını yapın. Her florofor için ilgili filtre küpünü ve LED'i seçin. Her LED'in yoğunluğunu ve her kanal için pozlama sürelerini ayarlayın. Burada kullanılan görüntü ayarlarının listesi için Tablo 1'e bakın.
- Görüntü alımından önce Hoechst kanalını seçin ve Bağlantılı Gölgelendirme'yi açın. Seçilen hedef için bunu ayarlamak üzere Bağlantılı Gölgelendirme sihirbazını kullanın.
NOT: Bu protokol, büyük döşeme taramalarının alınması yoluyla tüm slayt görüntülerinin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar. Bağlantılı Gölgelendirme veya gölgelendirme düzeltmesi, döşenmiş görüntülerdeki eşit olmayan aydınlatmanın üstesinden gelmek için gereklidir. - Yazılımda, tıklayın Canlı Hoechst kanalını görselleştirmek için düğmesine basın. Doku bölümünü odağa getirmek için kaba odak düğmesini kullanın.
- Her floresan kanalını seçin ve döngüdeki tüm floresan etiketli antikorlar için beklenen boyama paterni için doku bölümünü değerlendirin.
- Yazılımda Navigator'ı seçin. Navigator'daki Hoechst kanalını ve spiral fonksiyonunu kullanarak, görüntülenecek tüm doku bölümünü veya ilgilenilen bölgeyi haritalayın. Slayt başına birden fazla doku kesiti görüntülenecekse, Navigator'ı kullanarak dokunun bir haritasını oluşturmak için bu adımı tekrarlayın.
- Navigator'daki çokgen, sihirli değnek veya diğer yatırım getirisi seçim araçlarını kullanarak görüntülenecek yatırım getirilerini belirleyin. İstenen ROI(ler)i karşılamak için gereken en az sayıda döşemeyi yakalamak için doku taslağını dikkatlice çizin. Toplam edinme süresini azaltmak için fazla kutucukları silin.
- ROI'ler oluşturulduktan sonra, doygun pikselleri en aza indirmek ve sinyal-gürültüyü optimize etmek için kanal ayarlarını gözden geçirin ve ayarlayın. Görüntü görüntüleme penceresinde ısı haritası arama tablosunu seçin. Renkler piksellerin doluluk seviyesini gösterirken, kırmızılar, turuncular, sarılar ve beyazlar yoğunlukta daha kolay görülebilen değişimleri gösterir; Mavi pikseller doymuş pikselleri gösterir. Bilgi kaybını ve görüntü kalitesinden ödün vermemek için, doygun (mavi) piksellerin sayısını en aza indirmek için pozlama süresini azaltın.
- Navigator'da, dokunun topografik haritasını oluşturmak için Odak Haritası aracını kullanın. Büyük döşemeler veya düzensiz örnekler için her 3-4 FOV'da bir Odak Haritası noktası ayarlayın.
NOT: Bu adım, tüm slayt görüntüleme için gereken büyük döşeme taramaları için kritik öneme sahiptir. Genel olarak, görüntünün kalitesi seçilen Odak Haritası Noktalarının sayısına göre ölçeklenir; Ancak bu işlem, özellikle büyük döşeme taramaları için oldukça zaman alıcı olabilir.- Mikroskop tarafından taranacakları sırayla Odak Haritası Noktaları oluşturun. Başvurulan mikroskobun döşeme tarama sırasını eşleştirmek için, mikroskop tarafından kullanılan yolla eşleşen serpantin bir yol boyunca Odak Haritası Noktaları'nı seçin.
- Manuel netlemeyi kullanarak ilk Netleme Haritası Noktasını ayarlayın. Kalan Netleme Haritası Noktaları için otomatik netlemeyi kullanın. Her Odak Haritası Noktası için en uygun odağın seçildiğinden emin olmak için oturun ve izleyin. Netleme Haritası Noktalarını gerektiği gibi manuel olarak ayarlayın. Düzensiz ve/veya büyük dokular için her bir Odak Haritası Noktasını bulmak için kullanılan aralığı artırın.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak işlemeyi ayarlayın: Montaj ortamına uyacak şekilde ayarlanmış bir Kırılma İndeksi (RI) ile Küçük Hacimli Hesaplamalı Temizleme (SVCC) (burada, 1.4); mukavemet %98'e ayarlandı ve özellik boyutu membran belirteçleri için 2.000 nm veya nükleer belirteçler için 3.000 nm olarak ayarlandı. Görüntü alımı sırasında hesaplamalı temizleme protokolünü çalıştırın.
- Döşeme taramasını başlatın. Döşeme numarasını yazın ve yatırım getirilerini tüm döngüler boyunca sabit tutun.
- Görüntü alımından sonra, hesaplamalı olarak temizlenmiş görüntüleri, Düzgünleştir seçeneği işaretliyken İşlem sekmesinde bulunan Mozaik Birleştirme ile birleştirin. Her görüntüyü dikiş hataları açısından görsel olarak inceleyin ve döşeme hataları varsa Mozaik Birleştirme'yi yeni parametrelerle tekrarlayın.
NOT: Kötü hizalanmış görüntüler, yinelemeli olarak alınan görüntülerin kaydedilmesini engeller. - Gerekirse, daha önce açıklandığı gibi kanallar arasındaki spektral yayılmayı telafi etmek için Boya Ayırma modülünü kullanın5.
6. Boya inaktivasyonu, antikor etiketleme ve görüntü elde etme döngüleri
- Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, lameller düşene kadar slaytları 50 mL'lik konik bir steril 1x PBS tüpüne daldırın. Lamel düşmezse, PBS'yi doğrudan sürgünün üzerinden geçirin veya lamel nazikçe çıkarmak için cımbız kullanın.
- Plastik bir tartı teknesine 3-5 mg toz ölçerek lityum borhidrür (LiBH4) çözeltisini hazırlayın. diH2O'yu 1: 1 oranında doğrudan toza ekleyin (ör., 3.2 mg LiBH4 ve 3.2 mL diH2O) ve çözeltiyi bir pipetle homojenize edin. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik bir konik tüpe geçirmek için bir şırınga kullanın ve çözeltinin oluşturulduğu konsantrasyonu ve tam zamanı kaydedin. Çözelti boyunca büyük kabarcıklar görülene kadar çözeltinin oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edilmesine izin verin.
NOT: Boya inaktivasyon solüsyonunu hazırlandıktan sonraki 4 saat içinde kullanmanızı öneririz. DİKKAT: Kimyasal çeker ocakta aşağıdaki adımları gerçekleştirin ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Bu reaksiyon, oldukça yanıcı olan hidrojen gazı üretebilir. Her zaman az miktarda LiBH4 (<10 mg) ile çalışmak önemlidir. Daha fazla rehberlik için, IBEX Bilgi Bankası10,11'de LiBH4'ün güvenli bir şekilde nasıl hazırlanacağına ilişkin eğitim videolarını izleyin.
Tekrar tekrar havaya maruz kaldıktan sonra ağartma etkinliğinin azalması nedeniyle LiBH4 şişesini 4 haftalık kullanımdan sonra değiştirin. LiBH4'ün (1 gram) küçük kısımlarını satın almanızı öneririz. - Her bir slaytı 1x PBS ıslatından çıkarın, tüy bırakmayan mendille fazla PBS'yi fitilleyin ve slayt nem odasına yerleştirin.
- Lamel olmayan her bir slaytı LiBH4 ile 30 dakika boyunca, solüsyonu dokuyu kaplamak için yeterli hacimde doğrudan lam üzerine pipetleyerek tedavi edin. Her slayttan eski LiBH4 solüsyonunu çıkarın ve aynı LiBH4 stok solüsyonundan 10 dakika ve 20 dakikada yeni bir LiBH4 alikotu ile yenileyin.
- Slaytları 1x PBS ile 3-5x yoğun bir şekilde yıkayın. Slaytları yıkama başına 1 dakika bekleterek hızlı PBS değişimlerini kullanın.
- Arka plan çıkarma işlemi için bir görüntü elde etmek için, 4.12-4.13 adımlarında açıklandığı gibi her slayta yeni bir lamel yerleştirin ve boya sonrası inaktivasyon dokusunun görüntülerini alın. Arka plan çıkarma görüntüsü için yeni bir proje oluşturun ve görüntüyü elde etmek için 5.2-5.14 adımlarını tekrarlayın. Döngü 1 görüntüsü için oluşturulan aynı sayıda döşeme, kanal, kanal ayarı ve FOV'u kullanan görüntü. Odak Haritası noktalarını aynı FOV'larda tutun, ancak bu yeni görüntü için her bir Odak Haritası noktasını ayarlamak için otomatik netlemeyi kullanın.
NOT: 'Canlı' görüntüde (örneğin arka plan çıkarma görüntüsü) ve önceki görüntüde (döngü 1) bulunan benzersiz yapıları (nükleer şekiller) tanımlamak için tekrarlanan referans işaretleyicisini (Hoechst) içeren kanalı kullanın. - İkinci antikor döngüsünde biyotinile antikorlardan gelen spesifik olmayan floresan sinyalleri en aza indirmek için avidin ve biotin blokajı gerçekleştirin.
- Fazla PBS'yi fitilleyin ve her slayta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca avidin engelleme solüsyonu uygulayın.
- Slaytları 3-5x 1x PBS ile yıkayın ve yıkama tamamlandığında fazla PBS'yi fitilleyin.
- Her slayta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca biotin bloke edici solüsyon uygulayın ve slaytları adım 6.7.2'deki gibi 3-5x 1x PBS ile yıkayın.
- Yeni BSA içermeyen Engelleme Tamponu (Döngü 2) (Malzeme Tablosu) hazırlayın.
Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #4 (Döngü 2) ve İkincil Antikor Boyama Çözeltisi #2 (Döngü 2).
NOT: Bu çözeltiler sığır serum albümini gerektirmez çünkü BSA avidin/biotin bloke etme adımını tehlikeye atabilir. - Primer Antikorları, Primer Antikor Boyama Çözeltisi #4'te (Döngü 2) üretici tarafından önerilen konsantrasyonlarda seyreltin. Bu solüsyonu nazikçe girdap haline getirin ve nem odası içindeki her slayta ekleyin, dokunun tamamen birincil antikor solüsyonu ile kaplandığından emin olun. Slaytlarla birlikte slayt nem odasını mikrodalgaya yerleştirin ve adım 2.7-2.8'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birincil antikor programını yaklaşık 30 dakika boyunca çalıştırın.
- İkincil Antikor Boyama Çözeltisi #2 (Döngü 2) ile ikincil antikor etiketlemesini adım 4.6-4.9'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gerçekleştirin. Boyama tamamlandıktan sonra, daha önce 4.12-4.13 adımlarında açıklandığı gibi her slayta yeni bir lamel yerleştirin. Slaytı tekrar mikroskop tablasına yerleştirin ve slaytı önceki görüntüler için aynı XY düzleminde olacak şekilde yeniden konumlandırın.
NOT: 'Canlı' görüntüde (örneğin döngü 2) ve önceki görüntüde (döngü 1) bulunan benzersiz yapıları (nükleer şekiller) tanımlamak için tekrarlanan referans işaretleyicisini (Hoechst) içeren kanalı kullanın. - Döngü 2 görüntüsü için yeni bir proje oluşturun ve döngü 2 görüntüsünü elde etmek için 5.2-5.14 arasındaki adımları tekrarlayın. Döngü 1 görüntüsü için oluşturulan aynı sayıda döşeme, kanal, kanal ayarı ve FOV'u kullanan görüntü. Odak Haritası noktalarını aynı FOV'larda tutun, ancak bu yeni görüntü için her bir Odak Haritası noktasını ayarlamak için otomatik netlemeyi kullanın. Döngü 2 görüntüsü elde edildikten sonra, doğrudan konjuge antikorlarla ek döngüler için görüntü hizalamasına geçin veya bölüm 6'daki adımları tekrarlayın. NOT: 'Canlı' görüntüde (örneğin döngü 2 görüntüsü) ve önceki görüntüde (döngü 1) bulunan benzersiz yapıları (nükleer şekiller) tanımlamak için tekrarlanan referans işaretleyicisini (Hoechst) içeren kanalı kullanın. Ek döngüler doğrudan konjuge antikorlar gerektirir çünkü IBEX antikorları ayırmaz.
7. Görüntü hizalama
- Mikroskop çıktısı .lif dosyalarından ham görüntüleri ücretsiz Dosya Dönüştürücü ile .ims dosyalarına dönüştürün ve daha önceaçıklandığı gibi açık kaynaklı yazılımla görüntü işleme 5 ve IBEX Bilgi Bankası10,11'deki videolarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Her görüntüleme döngüsü için dosyayı düzenleyin ve istenen işleme adımlarını uygulayın (örn. kanal adlandırma, kanal sözde renklendirme).
- Otofloresan sinyalini (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) azaltmak için SimpleITK için oluşturulan kanal aritmetik işlevlerini kullanarak arka plan çıkarma ve kanal eşikleme gerçekleştirin.
NOT: Bu adımları, tek bir bileşik görüntüye hizalamadan önce her görüntüde (örneğin, Döngü 1, Döngü 2) gerçekleştiririz. Bunun nedeni, daha küçük, tek tek görüntüler üzerinde çalışmanın daha büyük birleşik görüntüden daha kolay olmasıdır.
- Otofloresan sinyalini (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) azaltmak için SimpleITK için oluşturulan kanal aritmetik işlevlerini kullanarak arka plan çıkarma ve kanal eşikleme gerçekleştirin.
- Kayıt yazılımını kullanmak için tutarlı bir adlandırma stratejisi geliştirin. Kanalları, ilk döngüde anti-CD8 AF647 antikorunun kullanıldığı kanalı belirtmek için ayırıcı karakter olarak bir boşlukla önek-ayırıcı karakter soneki (ör. 'Cycle1 CD8_AF647') ile adlandırın.
NOT: Daha fazla ayrıntı için yardım dosyası uzantısına bakın: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html. - Tüm kanallar uygun şekilde adlandırıldıktan sonra, kayıt yazılımını başlatın, Imaris Uzantıları | BasitITK | Afin.
- Dosya adları'nın yanındaki gözat düğmesini kullanarak her döngü için .ims dosyasını karşıya yükleyin. Kanal adı önek ayırıcı karakterini girin. Yukarıdaki örneği izleyerek, tek bir boşluk yazın ve İleri'ye tıklayın.
- Döngüler arasında ortak referans işaretçisi olarak kullanılan kayıt kanalını seçin (örn. Hoechst).
- Diğer görüntülerin kaydedileceği görüntü olan Sabit Görüntü'yü seçin.
NOT: Yinelemeli görüntülerin Döngü 2'sine kaydolmanızı öneririz. - 'Çıktı Dosyası' için istediğiniz dizini seçin. Kaydı çözünürlükte başlat seçeneği, mümkün olan en iyi kayda izin vermek için varsayılan olarak maksimum çözünürlüğe ayarlanacaktır. Bilgi işlem gücü sınırlıysa, bu parametreyi azaltın.
NOT: Burada açıklanan veriler için (görüntü başına 12-15 GB) maksimum 5 çözünürlük kullandık. - Başlamak için Kaydol'a tıklayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, Yeniden Örnekle ve Birleşik Görüntüyü Kaydet düğmesinin görünmesini bekleyin, üzerine tıklayın ve ilerleme çubuğunun tamamlanmasını bekleyin.
- Tamamlanan çıktı dosyasını işleme yazılımında açın. Tüm döngüler ve kanal bilgileri ile kayıtlı görüntü mevcut olacak ve analiz veya yayın için hazır olacaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çoğullanmış antikor tabanlı bir görüntüleme paneli tasarlamak önemli ölçüde zaman, çaba ve kaynak gerektirir12. Bu zorluklar, burada açıklandığı gibi yüksek derecede otofloresan dokulardan arşivlenmiş FFPE örnekleri için bir panel tasarlanırken özellikle belirgindir (Şekil 1). Bu zorlukların üstesinden gelmek için önce boya inaktivasyon protokolümüzle uyumlu en parlak floroforları belirledik (Tablo 1). Örneğin, Alexa Fluor Plus ikincil antikorlarının,...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Akciğer tüberkülozundan kaynaklanan klinik akciğer patolojisi nekrotizan granülomatöz inflamasyon ile karakterizedir. NTM pulmoner patolojisi esas olarak iki ayrı patolojik paterne sahip iki farklı hasta popülasyonunda ortaya çıkar: immün yetmezliği olan bireylerde bronşioler obliterasyon ve kavite oluşumu ile birlikte granülomatöz inflamasyon ile işaretlenmiş izole akciğer hasarı veya immün yetmezliği olan bireylerde akciğerleri ve diğer organları etkileyen yaygın nodüler hastalık 13,14...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
A.J.R., Leica Microsystems, Inc.'de bir çalışandır. Diğer yazarlar herhangi bir rekabet çıkarı beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu çalışma DIR/NIAID, NCI ve NHLBI'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , NIH ile yapılan bir kurumsal lisans sözleşmesi kapsamında BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0,3 Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Tamponu engellemek için çözüm |
| %1 BSA | Sigma-Aldrich | A4503 Serisi | Tamponu engellemek için çözüm |
| %1 İnsan BD Fc Bloğu | BD Biyolojik Bilimler | 564220 | Engelleme arabelleği için Fc Bloğu gereklidir |
| 150 W LED lamba | Amazon | B07VH3CVSF | Doku fotoirradyasyonu için LED ışık kaynağı |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Tampon ve yıkama adımlarını bloke etmek için çözüm |
| 20 Galonluk Depolama Kabı | Amazon | B001B1C4G0 | Fotoışınlama işlemi için konteyner |
| 40 W RGBW sel LED lamba | Amazon | B08QFPJSMD | Doku fotoirışınlaması için RGB ışık kaynağı |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Alfa-düz kas aktini DyLight 755 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-345221R/NA | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Avidin/Biotin Engelleme Kiti | Abcam | ab64212 | Avidin ve biotin bloke edici solüsyon |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biyolojik Bilimler | 554714 | Sabitleme çözümü |
| BOND Balmum Çözücü Solüsyon | Leica Biyosistemleri | NC0221076 | Deparafinizasyon çözümü |
| BOND Epitop Alma Çözümü 1 | Leica Biyosistemleri | NC0235529 | Sitrat bazlı pH 6 epitop geri alma çözeltisi (ER1) |
| BOND Epitop Alma Çözümü 2 | Leica Biyosistemleri | NC0235530 | EDTA bazlı pH 9 epitop geri alma çözeltisi (ER2) |
| BOND Araştırma Tespit Sistemi | Leica Biyosistemleri | NC0396648 | Otomatik araştırma boyama reaktifi |
| BOND RX Araştırma Boyası | Leica Biyosistemleri | NA | Otomatik araştırma boyama platformu |
| BOND Yıkama Solüsyonu | Leica Biyosistemleri | NC0221077 | Yıkama tamponu |
| CD15 | BD Biyolojik Bilimler | 347420/AB_400298 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| CD20 eFlor 660 | Thermo Fisher Bilimsel | 50-0202-82/AB_11150959 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| CD4 Alexa Flor 488 | R& D Sistemleri | FAB8165G/AB_2728839 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| CD45 Fikoeritrin (PE) | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-34528PE/NA | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| CD68 iFlor 594 | Caprico Biyoteknoloji | 1064135/AB_2892745 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Bilimsel | A32814/AB_2762838 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Bilimsel | A32787/ AB_2762830 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488 | Jackson İmmünoAraştırma | 715-545-020/AB_2340844 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Bilimsel | A32794/AB_2762834 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| EasyDip Boyama Sistemi | Yeni Gelen Arzı | 5300 KITLIK | Slayt boyama sistemi |
| Flor Montajı-G | Thermo Fisher Bilimsel | 00-4958-02 | Montaj ortamı |
| Hoechst | Biyotyum | 40046 | IBEX görüntüleme için nükleer boya. Tablo 1'e bakınız. |
| Imaris Dosya Dönüştürücü x64 10.2.0 | Imaris Oxford Enstrümanları | Ücretsiz dosya dönüştürücü | |
| ImarisViewer yazılımı x64 10.2.0 | Imaris Oxford Enstrümanları | Ücretsiz görüntü işleme yazılımı | |
| ImmEdge Kalemi | Vektör Laboratuvarları | H-4000 Serisi | Hidrofobik bariyer kalemi |
| Lityum Borohidrür (1 gram) | STREM Kimyasallar | 93-0397 | Boya inaktivasyonu için kimyasal, bu kimyasalın küçük kısımlarını satın alın (1 gram) |
| Lumikan Biyotini | R& D Sistemleri | BAF2846 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| Mikro Kapaklı Camlar | VWR | 48393-241 | Cam sürgülü kapaklar |
| Pan-sitokeratin Alexa Flor 750 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakınız. |
| PELCO BioWave Pro Mikrodalga Sistemi | Ted Pella A.Ş. | 36500-230 | Isıtmasız bilimsel mikrodalga |
| PELCO Sabit Sıcaklık Pro | Ted Pella A.Ş. | 50062 | Bilimsel mikrodalga için tam otomatik sıcaklık kontrolü |
| Basit ITK | Açık kaynaklı yazılım | Kayıt ve kanal işleme yazılımı | |
| Streptavidin Alexa Flor 594 | Thermo Fisher Bilimsel | S11227 | IBEX görüntüleme için etiketleme reaktifi. Tablo 1'e bakınız. |
| Geniş Alan Mikroskobu | Leica Mikrosistemleri | NA | LED8 ışık kaynağına ve LAS X yazılımına sahip Leica Microsystems THUNDER görüntüleyici (3.7.1.21655). Floresan görüntüleme için, geçiş başına yedi boya kanalını görüntülemek için iki ek tek bantlı filtre (PN: 8118215) ile harici filtre tekerleğine (PN: 11536075) sahip özel bir dört bantlı filtre kullanıldı. Filtre uyarma, dikroik ve emisyon çizgileri şunlardır: (1) Dört Bantlı küp: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31'de dikroik, uyarma veya emisyon filtresi yok; (2) harici filtre çarkı konumu 1: 434/32, konum 2: 520/40, konum 3: 585/20, konum 4: 720/60, konum 5: geçiş; (3) tek bantlı 1— 585/22 uyarma, 594 dikroik, 625/30 emisyon; (4) tek bantlı 2— 635/20 uyarma, 647 dikroik, 667/30 emisyon. |
| Zeiss Optik Lens Temizleyici | Amazon | B00GPVQVCO | Mikroskop objektif lens temizleyici |
| Antikorlar | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | Poliklonal Tavşan IgG, döngü 1 |
| Alfa-düz kas aktini DyLight 755 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-345221R Serisi | 1A4/asm-1, döngü 1 |
| CD4 Alexa Flor 488 | R& D Sistemleri | FAB8165G | Poliklonal Keçi IgG, döngü 1 |
| CD8 Alexa Flor 647 | Biyolojik Efsane | 372906 | C8/144B, döngü 1 |
| CD68 iFlor 594 | Caprico Biyoteknoloji | 1064135 | KP1, döngü 1 |
| Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Bilimsel | A32814 Serisi | Poliklonal Eşek, döngü 1 |
| Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Bilimsel | A32787 Serisi | Poliklonal Eşek, döngü 1 |
| Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Bilimsel | A32794 Serisi | Poliklonal Eşek, döngü 1 |
| Hoechst | Biyotyum | 40046 | Nükleer etiket, döngü 1 |
| CD15 | BD Biyolojik Bilimler | 347420 | MMA, döngü 2 |
| CD20 eFlor 660 | Thermo Fisher Bilimsel | 50-0202-82 | L26, döngü 2 |
| CD45 Fikoeritrin (PE) | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-34528PE Serisi | 2B11 + PD7/26, döngü 2 |
| Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488 | Jackson İmmünoAraştırma | 715-545-020 | Poliklonal Eşek, döngü 2 |
| Lumikan Biyotini | R& D Sistemleri | BAF2846 | Poliklonal Keçi IgG, döngü 2 |
| Pan-sitokeratin Alexa Flor 750 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-33200AF750 Serisi | AE-1/AE-3, döngü 2 |
| Streptavidin Alexa Flor 594 | Thermo Fisher Bilimsel | S11227 | Yok, döngü 2 |
| Hoechst | Biyotyum | 40046 | Döngü 2 |
| Çözümler | |||
| Engelleme Tamponu (Döngü 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Hacimce %0,3 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 Serisi | Hacimce %1 |
| İnsan BD Fc Bloğu | BD Biyolojik Bilimler | 564220 | Hacimce %1 |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Hacimce %97,7 |
| Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #1 (Döngü 1) | |||
| Engelleme Arabelleği (Döngü 1) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| Hoechst | Biyotyum | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | Biyolojik Efsane | 372906 | 1:10 |
| Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #2 (Döngü 1) | |||
| Engelleme Arabelleği (Döngü 1) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| CD4 AF488 | R& D Sistemleri | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| İkincil Antikor Boyama Solüsyonu #1 (Döngü 1) | |||
| Engelleme Arabelleği (Döngü 1) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| Eşek Keçi Karşıtı AF Plus 488 | Thermo Fisher Bilimsel | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Eşek anti-Tavşan AF Plus 555 | Thermo Fisher Bilimsel | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Eşek anti-Fare AF Plus 647 | Thermo Fisher Bilimsel | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Birincil Antikor Boyama Solüsyonu #3 (Döngü 1) | |||
| Engelleme Arabelleği (Döngü 1) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| CD68 iF594 | Caprico Biyoteknoloji | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| BSA içermeyen Engelleme Tamponu (Döngü 2) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Hacimce %0,3 |
| İnsan BD Fc Bloğu | BD Biyolojik Bilimler | 564220 | Hacimce %1 |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Hacimce %98,7 |
| Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #4 (Döngü 2) | |||
| BSA içermeyen Engelleme Arabelleği (Döngü 2) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| CD15 | BD Biyolojik Bilimler | 347420 | 1:30 |
| Lumikan Biyotini | R& D Sistemleri | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-34528PE Serisi | 1:20 |
| CD20 eFlor 660 | Thermo Fisher Bilimsel | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-Sitokeratin AF750 | Novus Biyolojik Ürünler | NBP2-33200AF750 Serisi | 1:10 |
| İkincil Antikor Boyama Solüsyonu #2 (Döngü 2) | |||
| BSA içermeyen Engelleme Arabelleği (Döngü 2) | Yukarıyı görmek | Antikor ekledikten sonra hacme kadar doldurun | |
| Eşek anti-Fare IgM AF488 | Jackson İmmünoAraştırma | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepavidin AF594 | Thermo Fisher Bilimsel | S11227 | 1:200 |
Kaynaklar
- Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
- Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
- Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
- Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
- Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
- Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
- Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
- Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
- Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
- Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
- Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
- Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
- Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
- Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
- Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
- Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
- Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
- Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
- Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
