Yöntem makalesi

Kemirgenlerde Laminer Politrodlar ve Optogenetiğin Mikro Elektrokortikografi ile Entegre Edilmesi ile Kortikal İşlemenin Çok Ölçekli Araştırılması

DOI:

10.3791/67983

⸱

23 Mayıs 2025

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UC Berkeley, 2Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Lab, 3Helen Wills Neuroscience Institute, UC Berkeley, 4Redwood Center for Theoretical Neuroscience, UC Berkeley, 5Scientific Data Division, Lawrence Berkeley National Lab

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sıçanlarda ve farelerde yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μEcoG) kaydı için cerrahi, implantasyon ve kayıt yöntemleri dahil olmak üzere iki protokol sunuyoruz. μECoG kayıtları, sıçan işitsel korteksinde laminer politrod kaydı veya fare somatosensoriyel korteksindeki nöral aktivitenin optogenetik manipülasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrokortikografi (ECoG), temel sinirbilim ile sağlık ve hastalıkta insan beyninin işlevini anlamak arasında metodolojik bir köprüdür. ECoG, nörofizyolojik sinyalleri doğrudan kortikal yüzeyden milisaniye zamansal çözünürlükte ve aynı anda kortikal dokunun geniş bölgeleri üzerinde sütunlu uzamsal çözünürlükte kaydeder ve hem yerel hem de dağıtılmış kortikal hesaplamaları incelemek için benzersiz bir konuma getirir. Burada, özel, yüksek yoğunluklu mikro-ECoG (μECoG) cihazların tasarımını ve bunların kullanımını iki prosedürde açıklıyoruz. Bu ızgaralar, elektrotlar arasında delikler bulunan berrak bir polimer substrat üzerinde imal edilmiş 200 μm aralıklı 128 düşük empedanslı elektrota sahiptir; bu özellikler, laminer politrode kayıtlar ve optogenetik manipülasyonlarla eşzamanlı μECoG kaydını mümkün kılar. İlk olarak, spesifik genetik olarak tanımlanmış kortikal hücre tiplerinin optogenetik manipülasyonu ile farelerin bıyık somatosensoriyel korteksi üzerinden kombine epidural μECoG kaydı için bir protokol sunuyoruz. Bu, farklı nöronal popülasyonların duyusal işlemeye farklı katkılarının nedensel diseksiyonuna izin verirken, aynı zamanda μECoG sinyallerindeki spesifik imzalarını da izler. İkinci olarak, μECoG ızgaraları ve laminer politrodlar kullanarak sıçan işitsel korteksinden nöral aktiviteyi kaydetmek için akut deneyler için bir protokol sunuyoruz. Bu, kortikal derinlik boyunca dağıtılan çoklu nöral birimlerden gelen kayıtlarla aynı anda kortikal yüzey boyunca duyusal olarak uyarılmış nöral tepkilerin ayrıntılı topografik haritalanmasına izin verir. Bu protokoller, dağıtılmış kortikal aktiviteyi karakterize eden deneyleri mümkün kılar ve çeşitli nörolojik bozukluklar için anlama ve nihai müdahalelere katkıda bulunabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duyum, biliş ve eylemin altında yatan beyin işlevleri, tek nöronların sivri uçlarından kortikal bir sütundaki nöron popülasyonları tarafından üretilen elektrik alanlarına, beyin alanlarındaki sütunların topografik organizasyonuna (örneğin, somatosensoriyel kortekste somatotopi, birincil işitsel kortekste tonotopi) kadar geniş uzamsal ve zamansal ölçeklerde düzenlenir ve dağıtılır. Beyin fonksiyonlarını anlamak, bu uzamsal ölçeklerde elektrik sinyallerini algılamayı gerektirir1. Sinirbilim şu anda beynin aktivitesini izlemek için yaygın olarak kullanılan birçok yönteme sahiptir. Elektrofizyolojik olarak, laminer politrodlar (Nöropikseller gibi), tipik olarak bir avuç uzak aralıklı sütun içinde, yüksek (≥1 kHz) zamansal çözünürlüğe sahip, mütevazı sayıda (~ 300) tek nöronun izlenmesini sağlar. Ca2+ görüntüleme, daha düşük (~ 10 Hz) zamansal çözünürlükte ~ 1-2 mm uzamsal genişlik içinde mütevazı ila çok sayıda genetik ve anatomik olarak tanımlanmış tek nöronların izlenmesini sağlar2. fMRI, tüm beyindeki çok sayıda nöronun (36 mm3 hacimde ~1 M nöron) metabolik durumunun çok düşük (~0.2 Hz) zamansal çözünürlükte izlenmesini sağlar. EEG/MEG, tüm kortikal yüzeyden/beyinden gelen elektriksel aktivitenin mütevazı zamansal çözünürlükte (<100 Hz) ve çok düşük uzamsal çözünürlükte (santimetre)3 izlenmesini sağlar. Bu metodolojilerin her biri beyin fonksiyonuna temel, sinerjik içgörüler sağlamış olsa da, korteksin geniş uzamsal bölgeleri boyunca kesin anatomik konumlardan yüksek zamansal çözünürlükte elektrofizyolojik sinyallerin doğrudan algılanmasını sağlayan yöntemler yenidir. Geniş mekansal kapsama ihtiyacı, beyinde nöronal fonksiyonun derinliğe kıyasla yüzey boyunca çok daha dramatik bir şekilde değişmesi gerçeğiyle vurgulanmaktadır4.

Elektrokortikografi (ECoG), düşük empedanslı elektrot ızgaralarının beynin yüzeyine implante edildiği ve korteksinkaydedilmesine veya uyarılmasına izin verdiği bir yöntemdir 1,5. ECoG tipik olarak, farmakolojik olarak inatçı epilepsiyi tedavi etmek için klinik çalışmanın bir parçası olarak insan beyin cerrahisi ortamlarında kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda insanlarda konuşma ve duyusal topografik haritalama gibi dağıtılmış kortikal işleme hakkında benzersiz bilgiler sağlar 6,7. Bu yetenekler, maymunlar, sıçanlar ve fareler dahil olmak üzere hayvan modellerinde kullanımını motive etmiştir 5,8,9,10,11. Kemirgenlerde, son zamanlarda mikro-ECoG'nin (μECoG), sütunlu uzamsal çözünürlük (~ 200 μm) ve geniş uzamsal kapsama alanı (birçok milimetre) ile nöronal popülasyonların yüksek zamansal çözünürlüklü (~ 100 Hz) doğrudan elektriksel izlenmesini sağladığı gösterilmiştir. μECoG, araştırmacıların hayvan modellerinde karmaşık duyusal işleme, bilişsel işlevler ve motor davranışlarla ilişkili dağıtılmış nöral dinamikleri araştırmalarını sağlar12,13. Son gelişmeler, μECoG'yi optogenetik ve laminer politrod kayıtları 14,15,16,17,18,19,20 ile entegre ederek kortikal ağların çok ölçekli araştırmalarına olanak tanımakta ve mikro ölçekli nöronal aktivite ile makro ölçekli kortikal dinamikler arasındaki boşluğu doldurmaktadır 21,22. Kritik olarak, μECoG sinyali insanlarda ve insan olmayan hayvan modellerinde çok benzer olduğu için, μECoG kullanımı, sonuçların ve bulguların hayvan modellerinden insanlara çok daha doğrudan çevrilmesini sağlar23. Bu nedenle, bütünleştirici yaklaşımlar, nöral devre anlayışımızı ilerletmek için çok önemlidir ve nörolojik bozukluklar için yeni terapötik müdahaleler geliştirmek için umut vaat etmektedir 5,24,25.

Sonuç olarak, kortikal işlemenin kapsamlı çok ölçekli araştırmalarını mümkün kılmak için yüksek yoğunluklu μECoG dizilerini laminer kayıtlar ve optogenetik araçlarla entegre eden protokollere yönelik ortaya çıkan bir ihtiyaç vardır 8,26. Bu boşluğu doldurmak için, elektrotlar arasında delikler bulunan esnek, şeffaf bir polimer substrat (parilen-C ve poliimid) üzerinde 40 μm elektrot çapına ve 20 μm elektrotlar arası mesafeye sahip 128 düşük empedanslı elektrot içeren özel olarak tasarlanmış μECoG cihazları geliştirdik ve optogenetik manipülasyonlarla eşzamanlı μECoG ve laminer politrod kayıtlarını mümkün kıldık13,22. Bu deneysel protokolün temel yönleri şunları içerir: (i) sütunlu uzamsal çözünürlük ve yüksek yoğunluklu μECoG dizileri aracılığıyla kortikal aktivitenin geniş ölçekli kapsamı; (ii) μECoG ızgarasından sokulan laminer politrodları kullanarak çoklu kortikal katmanlardan kayıt yapma yeteneği; ve (iii) belirli nöronal popülasyonları seçici olarak aktive etmek veya inhibe etmek için optogenetik tekniklerin dahil edilmesi, böylece nöral devrelerinnedensel diseksiyonunu mümkün kılar 27,28,29. Yüksek yoğunluklu konfigürasyon, yüksek uzamsal çözünürlüklü kayıtlara izin vererek, kortikal aktivitenin "sütunlu bir görünümünü" etkili bir şekilde sağlar, çünkü önceki çalışmalar μECoG sinyallerinin kemirgen kortikal kolonunun çapıyla (~ 20 μm) karşılaştırılabilir bir uzamsal ölçekte aktiviteyi çözebileceğini göstermiştir11. Bu entegre metodoloji, nöral aktivitenin eşzamanlı çok ölçekli izlenmesine ve manipüle edilmesine izin vererek, potansiyel olarak μECoG sinyallerinin nöronal kaynaklarını ve dağıtılmış kortikal işlemeyi belirlemek için nedensel deneylere olanak tanır. Bu hedeflere ulaşmak için bu el yazması, yüksek yoğunluklu μECoG dizilerinin iki kombinasyonda kullanımı için ayrıntılı protokoller sağlar.

İlk olarak, fare primer somatosensoriyel korteksindeki (S1) katman 5 (L5) piramidal hücrelerin manipülasyonu ile birlikte μECoG'yi tarif ediyoruz. Farede, μECoG dizisi epidural olarak yerleştirilir (farelerde durotominin cerrahi inatçılığı nedeniyle). Bir optik fiber, optogenetik ışığı kortikal yüzeyin küçük bir hedef alanına odaklamak için ızgara üzerine yerleştirilir veya bir lens ile birleştirilir. Optogenetik strateji, katman 5 uyarıcı nöronların inhibisyonu için burada açıklanmıştır, ancak karşılık gelen, popülasyona özgü, Cre eksprese eden fare hattı ile sağlanan herhangi bir nöron popülasyonuna kolayca uyarlanabilir. İkinci olarak, sıçan işitsel korteksinden (A1) kortikal katmanlar boyunca birden fazla nörondan kortikal yüzey elektrik potansiyellerini (CSEP'ler) ve tek birimli sivri aktivite kaydetmek için μECoG'nin silikon laminer politrodlarla birlikte kullanımını açıklıyoruz. Dizi, elektrotlar arasında deliklere sahiptir ve farklı kortikal katmanlar boyunca nöronal aktiviteyi kaydetmek için çok kanallı laminer politrodların ızgara boyunca yerleştirilmesini sağlar. Kraniotomi prosedürü sırasında, μECoG dizisi işitsel korteks üzerine subdural olarak yerleştirilir ve laminer politrod deliklerden sokulur. μECoG ve laminer probdan gelen nöral sinyaller, bir dijital sinyal işlemcisine optik olarak bağlı bir amplifikatör sistemi kullanılarak sırasıyla 6 kHz ve 24 kHz'de örneklenerek aynı anda kaydedilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her iki protokol de aynı temel adımları (anestezi, fiksasyon, kraniyotomi, μECoG kaydı) takip eder, ancak dikkate değer farklılıklara sahiptir. Aşağıdaki açıklamada, paylaşılan adımlar birleştirilirken, her protokolün özellikleri açıklanır. Aşağıdaki adımlar, optogenetik (Fare) ile μECoG kaydına veya laminer prob (Sıçan) ile μECoG kaydına karşılık gelir. Burada açıklanan tüm prosedürler yerel etik veya yasal otoritelere (IACUC veya Etik Kurullar) uygun olarak yürütülmüştür. Kullanılan ilaçlar onaylanmış etik protokole göre değişiklik gösterebilir.

1. Fare ve sıçan prosedürleri için hazırlık ve protokol

  1. Fare ve sıçan protokolleri arasındaki önemli farklar
    1. Elektrofizyolojik kayıtlara karşı cerrahi kurulumlar
      1. Bir sıçan için, hem ameliyat hem de elektrofizyolojik kayıtlar sırasında aynı kurulumu kullanın.
      2. Bir fare için, ilk kurulumda ameliyatı ve ikinci kurulumda elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirin.
    2. Kafa fiksasyonu
      1. Bir sıçan için, ameliyat ve elektrofizyolojik kayıt için aynı burun kelepçesini kullanın.
      2. Bir fare için, ameliyat için bir burun kelepçesi ve hafif izofluran anestezisi altında fiksasyona izin vermek için elektrofizyoloji kurulumunda harici bir metal başlık kullanın. Kafa çubuğunu kafatasına diş çimentosu ile implante edin.
    3. Kayıt kurulumu: İki tür için farklı edinme elektroniği, kayıt yazılımı ve duyusal stimülasyon yazılımı kullanın.
      1. Fare protokolü için, veri toplama için SpikeGadgets sistemini (https://spikegadgets.com) ve açık kaynaklı Trodes yazılımını (https://spikegadgets.com/trodes/) kullanın.
      2. Sıçan protokolü için, veri toplama için kayıt yazılımı Synapse - Neurophysiology Suite'i (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) kullanın.
    4. Enjeksiyonla (Sıçan) veya inhalasyon (Fare) ile anesteziyi indükleyin.
    5. Kayıt konumu
      1. Bir fare için somatosensoriyel kortekste (S1) kayıtlar yapın.
      2. Bir sıçan için birincil işitsel kortekste (A1) kayıtlar yapın.
        NOT: Anatomik lokalizasyondaki bu farklılık, her tür için farklı kraniyotomi bölgeleri gerektirir.
  2. Şebekenin hazırlanması ve test edilmesi
    1. Izgarayı (bağlantı kartı hariç) seyreltilmiş bir enzimatik deterjanda (%50 deterjan, %50 damıtılmış su) en az 1 saat bekletin.
    2. Saf damıtılmış su banyosuna aktarın ve güvenli, temiz bir yerde kurumaya bırakın.
    3. Her kayıt oturumundan önce değil, μECoG cihazının ilk hazırlığının bir parçası olarak platin siyahı elektrodepozisyon gerçekleştirin.
      NOT: Bir kez biriktirildikten sonra, Platin Siyah kaplama, birden fazla kayıt için etkili kalan kararlı bir katman oluşturur, ancak performansı düzenli empedans testi ile izlenmelidir. Platin Siyahı elektrodepozisyon (1 kHz'de 10-20 kΩ hedef aralığı), nöral kayıtlarda elektrot empedansını azaltır ve sinyal-gürültü oranını iyileştirir.
    4. Elektrodepozisyonu gerçekleştirmek için, biriktirme değiştirici olarak az miktarda kurşun asetat (yaklaşık% 1) içeren bir kloroplatinik asit çözeltisi (tipik olarak %3-2 Kloroplatinik asit [H0.005]) hazırlayın. μECoG elektrotlarını, üç elektrotlu bir elektrokimyasal hücrede çalışma elektrotu olarak görev yapacak şekilde bir platin karşı elektrot ve Ag/AgCl referans elektrotu ile bağlayın.
    5. Empedans değerlerini izlerken 10-30 s boyunca yaklaşık -0,5--2 mA/cm² sabit akım yoğunluğu uygulayın.
    6. Izgara elektrotlarının empedansını test edin ve kaydedin (örneğin, bir Nano-Z ile).
    7. Izgarayı bir ışık kaynağı üzerinden kontrol edin ve ızgarayı ameliyat sonrası kayıtta kullanmak üzere hazırlayın.
  3. Referans kablo lehimleme
    1. Bir fare için, kayıt sisteminin referans kablosuna bağlanmak için gümüş bir telin (10 mm uzunluğunda, 30 G) ucunu altın bir pime lehimleyin.

2. Ameliyat

  1. Materyallerin hazırlanması ve genel izleme (Hayvan bakımı ve kayıt altına alınması)
    1. Hazırlık: Cerrahi alanı uygun bir dezenfektan ile iyice temizleyin ve dezenfekte edin. Tüm cerrahi aletlerin tipik olarak bir otoklav kullanılarak sterilize edildiğinden emin olun.
    2. Cerrahi alet yerleştirme: Cerrahi aletleri steril cerrahi ped üzerine yerleştirin. Cerrahi alanı pamuk uçlu aplikatörler ve emici pamuklu cerrahi üçgenlerle doldurun. Biyolojik olarak tehlikeli atıkları özel bir bertaraf torbasına atın.
    3. Sıcaklık regülasyonu: Cerrahi ve elektrofizyolojik kayıt alanı içindeki ısıtma yastığını açın. Ameliyat ve kayıt boyunca ısıtma yastığının sıcaklığını kontrol edin.
    4. Cerrahi ped: Sıcaklık düzenleme yatağının üzerine mavi bir cerrahi ped veya battaniye yerleştirin.
      NOT: Bu ped, yukarı bakması gereken yumuşak, pamuklu beyaz bir tabana sahip olmalıdır.
    5. Mikroskop konumlandırma: Mikroskobu ve takılı aydınlatıcıyı (örn. LED halkası) cerrahi alanın bir tarafına hazırlayın. Düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
    6. Cerrahi matkap: Kraniotomi prosedürü için cerrahi matkabı hazırlayın.
    7. Oksijen kaynağı: Oksijen tankı akış hızını 1.0 L/dk (Sıçan) veya 0.5 L/dk (Fare) olarak ayarlayın ve oksijen maskesini regülasyon pedinin yanına yerleştirin. Anesteziyi takiben hayvanın sürekli oksijene ihtiyacı olacaktır.
    8. Sıvı replasmanı: Ameliyat boyunca, hayvanın vücut ağırlığının en az% 1.5'inin (Fare) veya saatte 1 mL'nin (Sıçan) değiştirilmesini amaçlayan herhangi bir sıvı kaybını değiştirin. Buna göre izotonik çözeltiler hazırlayın.
    9. Hayvan: Hayvanı, onaylanmış prosedürlere göre hayvan tesisinden ameliyathaneye getirin. C57Bl6 arka planına sahip erkek veya dişi 8 ila 16 haftalık fareleri kullanın; aynı şekilde, Sprague Dawley suşunun 7 haftalık farelerini, erkeklerini kullanın.
    10. İlaçların hazırlanması: Hayvanı 0,1 g hassasiyetle bir ölçek kullanarak tartın. Gerekirse önceden seyreltilmiş solüsyonlar kullanarak ameliyat için yeterli ilaç miktarlarını hazırlayın.
  2. Anestezi indüksiyonu
    1. Bir fare için anestezi indüksiyonu
      1. Hayvanı izofluran indüksiyon odasına yerleştirin (0,5 L / dak O2'de% 3-5 İzofluran).
      2. Derin anestezi onaylandıktan sonra (kuyruk / ayak parmağı sıkışmasında refleks yok), hayvanı ameliyat ısıtma yastığına yerleştirin ve kafasını sabitleyin.
      3. Genel analjezi için deri altı ilaçlar enjekte edin: Meloksikam: 5 mg / kg ve Buprenorfin: 0.1 mg / kg.
      4. 2.2.1.5-2.2.1.6 adımlarını izleyerek farenin başlığını düzeltin.
      5. Burnu anestezi maskesine ve başı gevşek bir şekilde baş montajına yerleştirin. Fareyi ısırma çubuğuna yerleştirmek için önce dilin çubuk ile ağzın çatısı arasında değil, çubuğun altında olduğundan emin olun. Gerekirse dili hareket ettirmek için forseps kullanın.
      6. Hayvanın kesici dişlerini ısırma çubuğunun çubuğundaki deliğe yerleştirin. Sabitleme vidasını hafifçe sıkarak fare anestezi maskesini (0,5 L/dak O2'de% 1,5-2 İzofluran) sabitleyin. Ameliyat sırasında baş stabilizasyonu sadece ısırma çubuğu ile sağlanır.
      7. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerini petrol bazlı bir göz merhemi veya kayganlaştırıcı ile koruyun.
      8. Maske boyunca sürekli bir izofluran akışı ile prosedür boyunca anesteziyi koruyun.
    2. Bir sıçan için anestezi indüksiyonu
      1. İndüksiyon anestezisinin enjeksiyonunu kolaylaştırmak için başlangıçta hayvanı sakinleştirmek için izofluran kullanın.
      2. Anestezi ve analjezi için ilaçları uygulayın:
        Meloksikam: 5 mg / kg dozaj, konsantrasyon 10 mg / mL, 0.4 mL / kg
        Ketamin: 90 mg / kg dozaj, konsantrasyon 100 mg / mL, 0.9 mL / kg
        Ksilazin: 10 mg / kg dozaj, konsantrasyon 100 mg / mL, 0.1 mL / kg
      3. Hayvanın kilosuna ve yaşına bağlı olarak 15-30 dakika içinde derin anesteziye ulaşmasına izin verin.
    3. Anestezi monitörizasyonu
      1. Prosedür boyunca hayvanın hayati değerlerini (solunum hızı) sürekli olarak izleyin. Solunum hızını, anestezi durumundaki erken değişikliklerin özellikle yararlı bir işareti olarak kontrol edin ve solunum hızı değişirse anestezi seviyesini ayarlayın.
      2. Pençe çekme refleksi, anestezi durumunun kritik bir işaretidir. Bu refleksi periyodik olarak test edin, çünkü toplam yokluğu ameliyat için yeterli anestezi seviyelerini sağlar.
  3. Baş fiksasyonu ve yaşamsal belirtilerin izlenmesi
    1. Hayvan hayati değerlerinin izlenmesi
      1. Hayvanın yaşamsal belirtilerini bir deney kağıdına kontrol edin ve kaydedin. Hayvanın refleksleri (örneğin, pençe çekilmesi) tamamen sönmemişse, ek bir yarım doz ek ketamin (Sıçan) uygulayın veya izofluran konsantrasyonunu% 0,5'lik artışlarla artırın (Fare).
    2. Bir sıçan için kafa fiksasyonu
      1. Sıçan tamamen uyuşturulduktan sonra (pençe veya kuyruk refleksi yok), hayvanın kesici dişlerini kafa montajının çubuğundaki deliğe yerleştirin.
      2. Ameliyat sırasında başı sabitlemek için montaj kollarının uçlarını dikkatlice burun sırtına yerleştirin ve gözlerle temas etmediğinden emin olun.
      3. Hayvanın ağzının çatısı çubuğa sıkıca bastırılana kadar kolların açısını ayarlayın. Kafatasının basınç altında hareketsiz kaldığından emin olun.
      4. Vidaları altıgen bir anahtarla sıkarak montajın her iki kolunu da sabitleyin.
    3. Bir sıçan için oksijen kurulumu
      1. Oksijen tankındaki plastik boruyu hayvanın ağzına ve burnuna sabitleyin ve cerrahi bantla sabitleyin. Boruda hava akışını engelleyebilecek kırışıklıklardan kaçının. Oksijen tankını 1 L/dk'lık bir akış hızına ayarlayın.
        NOT: Kalp atış hızı ve solunum hızı da dahil olmak üzere hayvansal hayati değerler, prosedür boyunca 15-30 dakikalık aralıklarla kontrol edilmelidir.
  4. Kafa derisi insizyonu
    1. Tıraş ve hazırlık
      1. Üst burundan başın arkasına kadar, bir gözden diğerine uzanan ve kulakların etrafındaki alanı tıraş edin. Kürkün büyük kısmını makas veya elektrikli kesme makinesi ile çıkarın ve ardından tüy dökücü krem uygulayın.
    2. Dezenfeksiyon
      1. Betadine batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak alanı dezenfekte edin, ardından %70 etanole batırılmış bir pamuklu çubukla durulayın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın ve bölgenin steril olduğundan emin olmak için son bir Betadine uygulaması ile bitirin.
    3. Lokal anestezik enjeksiyon
      1. Lokal anestezik Lidokaini (% 1, fare için 0.1 mL / sıçan için kg başına 0.4 mL) deri altından hayvanın kafa derisinin orta hattına enjekte edin. Lidokaini yaymak için kafa derisine hafifçe masaj yapın ve anestezinin etkili olması için 5 dakika bekleyin.
    4. Kesi
      1. Bir fare için, cımbızla cilt üzerindeki bir noktayı kaldırın ve cerrahi makas kullanarak cildin küçük bir bölümünü (yaklaşık 1 cm çapında) rezeke edin.
      2. Bir sıçan için, kafa derisinin ön tarafında, burnun hemen üstünde, neşter kullanarak orta hatta hassas bir kesi yapın. Gözlerin arasından kafatasının tabanına doğru düz bir kesi oluşturarak cildi nazikçe geri çekin. Kafa derisini dikkatlice kaldırın, bağ dokusunu kesin ve kafatasını tamamen ortaya çıkarın.
      3. 2.4.4.4-2.4.4.5 adımlarını izleyerek kraniyotomi bölgesini ortaya çıkarın.
      4. Bir kazıyıcı ile kafatasının üst kısmındaki bağ dokusunu ve periosteuumu temizleyin. Tuzlu su yıkayın ve bölgeyi temizlemek için aspirasyon veya cerrahi sünger kullanın.
      5. Kraniotominin yapılacağı kafatası bölgesinin net bir şekilde ortaya çıkmasını kolaylaştırmak için cilt kenarlarında cerrahi klipsler kullanın.
  5. Kraniyotomi
    1. Genel delme prosedürü
      1. Deneyimli cerrahlar için cerrahi matkap hızını 5000 rpm veya 7000 rpm gibi düşük bir ayara ayarlayın. Mikroskopta görselleştirirken tüm delme işlemlerini yapın.
      2. Matkabı kafatasının yüzeyine paralel tutun ve yüzeye nazikçe yaslayın.
      3. Pedala hafifçe bastırarak tek bir yerde delmeye başlayın. Kemik rengindeki değişiklikleri sık sık kontrol ederek kısa aralıklarla (5-10 sn) delme işlemi yapın.
        NOT: Kemik opak bir beyaza başlayacak ve delik derinleştikçe daha yarı saydam hale gelecek ve pembe bir renk tonu ortaya çıkacaktır.
      4. Delme beyne yaklaştığında, yavaşlayın ve deliğe nem sızdığına dair işaretler arayın. Delik koyu pembe olduğunda ve hafif bir parlaklığa sahip olduğunda, delmeyi durdurun. 30 G'lik kısa bir iğne kullanarak, kalan kemik tabakasını nazikçe delin. Berrak sıvı yeni delikten iyi bir şekilde çıkmalıdır.
    2. Bir fare için delme prosedürü
      1. Fizyolojik kayıtlar için bir referans elektrot yerleştirmek için, kaydedilen alanın ipsilateralinde yarım kürenin ön kısmında bir çapak deliği açın.
      2. Çevresine sığ bir hendek açarak kraniyotominin konturunu tanımlayın. Medio-lateral eksende, referans olarak lateral kemik sırtından başlayın ve 4 mm'lik bir pencere çizin.
      3. Antero-arka eksende, arka kemik sırtının ~ 1 mm önünden başlayarak 3 mm'lik bir pencere açın. Son açık kraniotomi boyutu yaklaşık 4 x 3 mm'lik bir penceredir.
    3. Bir sıçan için delme prosedürü
      1. İki delik açın: biri sol arka kadranda, diğeri sağ ön kadranda.
      2. Masseter kasına ikinci bir doz lidokain (10 mg / mL'de 0.4 mL / kg) enjekte edin ve kesimin yapılacağı yere eşit olarak dağıtın.
      3. Kraniotomi alanını ortaya çıkarmak için gereken minimum kas setini rezeke edin.
      4. Yeni bir # 10 neşter bıçağı kullanarak, hayvanın çenesinin üzerindeki kas demetinde (sağ taraf) enine bir dorsal-ventral kesim oluşturun. Kesiğin arka kenarını kavrama forsepsleriyle tutun ve elmacık kemiğinin kemikli sırtı boyunca keserken kafatasından soyun. Bu sayede minimum kanama ile kas kemikten ayrılabilir.
      5. Kafatasındaki bir fissür çizgisi ortaya çıkana kadar ön kası benzer şekilde rezeke edin. Bu çizgi kraniyotomi penceresinin ön sınırı olacaktır.
      6. Yüksek derecede vaskülarize bölgeleri kesmekten kaçınmak için güçlü bir ışık kaynağı kullanarak neşter ve forseps ile arka sırtın etrafındaki kasları temizleyin.
      7. Matkabı kullanarak arka çıkıntıyı, kafatasının yüzeyinin üzerine artık kaldırılmayana kadar zımparalayın.
        NOT: Bu adım, kortikal yüzeyle doğrudan temas sağlamak için μECoG ızgarasını ayarlamak için gereklidir.
      8. Pencerenin sırt kenarını, rezeke edilen kasın bağlandığı sırtın hemen üzerinde delin. Arka kenarı ön kısımdan delinmiş arka çıkıntıya yerleştirin. Ön kenarı, göz yuvasının yakınına doğru uzanan fissür çizgisinin arkasına yerleştirin.
        NOT: Ön kası temizlerken, gözden kaçınmak için özen gösterilmelidir.
  6. Kraniyotomi pencere sondajı
    1. Kraniyotomi penceresinin delinmesi (İpuçları)
      1. Delme sırasında, matkap ucunun kafatası yüzeyine paralel tutulduğundan emin olun. Amaçlanan kraniyotomi hattı boyunca kısa, tekrarlayan hareketler kullanırken matkabın kafatası ile hafif temas etmesine izin vererek matkabı bir fırça gibi kullanarak mümkün olduğunca az kuvvet uygulayın.
        NOT: Sıçanlarda, pencerenin arka kenarı en kalın kemiğe sahiptir. Çok geriye doğru delinirse, kemik, delme işleminin ölçülmesini zorlaştıran lapa lapa, "gevrek" bir kalite sergileyebilir. Yanlış yerleştirilirse, bu kemik alanı beyne yakınlık konusunda yanlış bir izlenim veren damarlı kırmızı renklenme ortaya çıkarabilir.
      2. Kraniyotomi penceresinin her iki tarafını, uzunluğu boyunca uzanan ince beyaz bir çatlak veya çatlak ile kemik soluk pembe görünene kadar delin. Hafif basınç uygulayın; Kemik, tamamen delindiğinde belirgin bir "kıpırdanma" üretmelidir. Çatlak ayrık görünüyorsa, sürekli bir çizgi elde edene kadar hafifçe delmeye devam edin.
    2. Kraniyotomi penceresi içindeki incelmiş kafatasının çıkarılması
      1. Kafatası, aşırı hafif basınç tüm pencerenin gözle görülür şekilde kıpırdamasına neden olacak kadar inceldiğinde, inceltilmiş kafatasını çıkarın.
      2. Kraniyotomi bölgesini bir damla tuzlu su ile yıkayın ve en az 1 dakika bekleyin. Bu, incelmiş kemiği zayıflatır ve kemiğin duradan ayrılmasına yardımcı olur. Fazla tuzlu suyu emici bir pamuklu üçgen veya vakumla boşaltın.
      3. İnceltilmiş kafatasını forseps kullanarak dikkatlice kaldırın ve alttaki dokuya zarar vermekten kaçının.
      4. Beyni nemli tutmak için hemostatik bir sünger kullanın.
      5. Pencereyi dorsal ve ventral taraflardan dişli forseps ile sıkıca kavrayın ve doğrudan kafatasından çekin. Pencereyi sahadan çekmekte herhangi bir zorluk varsa, kemik yeterince zayıflayana kadar hafif delme işlemini durdurun ve devam ettirin.
      6. Fare μECoG kayıtları için dura'yı olduğu gibi bırakın.
  7. Bir fare için çimento ve kafa direği implantı
    1. Referans kablosunu takın ve sabitleyin.
      1. Gümüş tel ucunu ~ 1 mm çapak deliğine, beynin yüzeyine temas edecek kadar ancak kanamaya neden olmayacak şekilde yerleştirin.
      2. İlk katı uygularken diş çimentosunu yerine uygulayın.
    2. Diş çimentosunun hazırlanması
      1. Diş çimentosu karışımını hazırlamak için soğutulmuş bir seramik karıştırma kabı kullanın. Bu çimento hızla kalınlaşır ve yeni bir karışımın düzenli olarak hazırlanmasını gerektirir. Yeni bir karışım hazırlamadan önce karıştırma kabını silerek temizleyin.
        NOT: Çimento asla beyinle doğrudan temas halinde olmamalıdır.
    3. İlk katın uygulanması
      1. Mikro aplikatörler kullanarak ilk çimento tabakasını kraniotominin etrafına ve tüm kafatasına uygulayın. Bu katman, kafatası ile metal başlık arasında elektriksel yalıtım görevi görür.
      2. Açık kraniyotomi ve μECoG ızgarası için yeterli koruma sağlamak için kraniyotomiyi yanal kaplama da dahil olmak üzere çimento ile tamamen çevreleyin.
    4. Metal başlığın konumlandırılması
      1. Kafa çubuğunun büyük bölümünü tam olarak sıkmadan tutucusuna takın.
      2. Kafa çubuğunu istediğiniz gibi konumlandırın, ince bölümü kafatası orta hattı boyunca çimento yüzeyiyle temas edecek şekilde yerleştirin.
    5. İmplantın sabitlenmesi
      1. Baş çubuğunu diş çimentosu ile örtün ve çimento yüzeyine bağlayın.
    6. Tutucunun çıkarılması
      1. Diş çimentosunun güçlenmesi için birkaç dakika bekleyin.
      2. Başlık tamamen sabitlendikten sonra, önce vidayı tutucudan çıkararak çıkarın. Ardından, kafa çubuğuna herhangi bir kuvvet uygulanmadığından emin olarak tutucuyu geriye doğru geri çekin.
  8. Sıçan cerrahisi için durotomi
    NOT: Bu zorlu bir cerrahi adımdır.
    1. Dura'yı kaldırmak
      1. Beynin yüzeyine mümkün olduğunca paralel tutulan 5 numaralı forseps kullanarak, duranın küçük bir kısmını beyinden uzaklaştırın.
      2. Kaldırılan durayı dikkatlice yırtmak için 30 G'lik yeni bir iğne (mümkün olduğunca kısa) kullanın.
        NOT: Dura mater, doğrudan beynin üzerinde bulunan ince, şeffaf bir doku tabakasıdır. Sıçanlarda μECoG kayıtları için çıkarılır. Durotominin beyin yüzeyindeki damar sistemini bozmadan yapılması çok önemlidir. Durotomiyi gerçekleştirmek için önerilen yöntemler arasında, durayı geri çekmeden önce delmek için forseps ve bir şırınga iğnesi kullanmak veya durayı dikkatlice geri çekmek için kafatasının yanına sabitlenmiş bir duratom aleti kullanmak yer alır.
    2. Dura rezeksiyonu
      1. Durayı forseps ile kavramaya ve beyinden kaldırmaya devam edin. Kaldırırken iğne ile çapraz bir yırtılma oluşturun.
      2. Durayı kraniyotomi penceresinin kenarlarına doğru dikkatlice soymak için forsepsleri kullanın ve beyin yüzeyinin bozulmamasını sağlayın.
  9. Farenin elektrofizyolojik kayıt için kuruluma aktarılması
    1. Burnunu ve kesici dişleri kesici çubuktan nazikçe kaldırarak ve ardından hayvanı geri çekerek hayvanı ameliyat kurulumundan çıkarın. Daha düşük bir İzofluran konsantrasyonu kullanılarak sürekli anestezinin sürdürülmesini sağlayan bir yatıştırıcı olan Klorprotiksen (1 mg / kg, intraperitoneal [IP]) enjekte edin.
    2. Fareyi elektrofizyolojik kayıt kurulumuna yerleştirin.
      1. Isıtma yastığının yerinde olduğundan ve düzgün çalıştığından emin olun.
      2. Elektrofizyolojik kurulumda tutucu üzerindeki baş çubuğunu kullanarak hayvanı sabitleyin.
      3. Hayvanın burnunu tamamen kaplayacak şekilde izofluran maskesini yaklaştırın.
    3. Anestezi ayarı
      1. Anestezi seviyelerini kademeli olarak% 0.7-1 Isoflurane'e düşürün (her 5 dakikada bir% 0.5'lik artışlarla).
      2. Hayvanın solunum hızını ve hareketlerini izleyin.
        NOT: Solunum hızı cerrahi duruma göre biraz artmalı, ancak hayvan hareket etmemelidir.
      3. Hayvan hareket ediyorsa,% 0,5'lik artışlarla yavaşça daha düşük bir seviyeye geri döndürmeden önce izofluran konsantrasyonunu% 2'ye yükseltin.
    4. Duyusal stimülasyon için bıyık yerleştirme
      1. Farenin titreşimini bıyık stimülasyon cihazına takın. Bu protokolde, titreşimin hızlı sapmasını sağlayan piezoelektrik aktüatörlere bağlı 10 μL'lik kısa pipet uçlarına dokuz titreşim yerleştirin.

3. Kayıt

  1. Şebekenin kurulması
    1. Ön adımlar
      1. Kayıt sistemini ve amplifikatörü açın.
      2. Hayvanın yaşamsal belirtilerini kontrol edin.
    2. Prosedür
      1. Hayvanı ve aletleri konumlandırmak için 3.1.2.2-3.1.2.4 adımlarını izleyin.
      2. Hayvanı kayıt kurulumuna yerleştirin ve düzenli olarak bir tuzlu su çözeltisi uygulayarak kraniyotominin nemli kalmasını sağlayın.
      3. Bir sıçan için, paraziti önlemek için mikromanipülatörü kraniyotomi bölgesinin hemen arkasında bulunan teçhizatın korkuluğuna yerleştirin.
      4. Bir fare için, mikromanipülatörü hayvanın yanındaki kraniyotomi bölgesine yanal olarak yerleştirin.
      5. Izgarayı bir fareye takmak ve yerleştirmek için 3.1.2.6-3.1.2.12 adımlarını izleyin.
      6. μECoG ızgarasını başlığa takıntage ZIF-klips konektörlerini (headstage konektörü) kullanarak. Headstage'in elektronik kartını bir mikromanipülatöre sabitlenmiş mekanik bir çubuk aracılığıyla yerinde tutun.
      7. Anteroposterior eksen boyunca kraniotomi üzerinde düz bir şekilde hizalamak için μECoG ızgarasını yatay olarak indirin.
        NOT: Lateral-medial eksen boyunca, ızgaranın kenarı kraniyotominin medial sınırına yakın olmalıdır.
      8. Izgara beynin yakınına yerleştirildiğinde, ancak onunla temas etmediğinde, ızgaranın referans telini implante edilmiş gümüş tel-altın pime takın. Gerekirse, elektriksel gürültüyü azaltmak için topraklama kablosunu hayvana (örn. üstü açık bir kas) takın.
      9. Ayrıca, beyinle temas etmek için ızgarayı indirin.
      10. Nemli dura yüzeyi üzerinde "kaymak" için ızgarayı yanal olarak hareket ettirin. Izgara mediolateral eksen boyunca ortalanana kadar ayarlamaya devam edin.
      11. Fazla tuzlu su solüsyonunu çıkarmak için kraniyotominin kenarlarında aspirasyon veya cerrahi sünger kullanın.
      12. Hazırlık biraz daha kuru olduğunda, ızgaranın duraya daha sıkı yapıştığından ve yüzeyi üzerinde kaymadığından emin olun. Daha kuru olduğunda, en yanal elektrotlarla teması sağlayarak esnek ızgaraya yanal ila medial hareket uygulayın. Şebekenin esnek kablosu, beynin konturuna uyacak şekilde doğal olarak bükülecektir.
      13. Izgarayı bir sıçan üzerine yerleştirmek için 3.1.2.14-3.1.2.18 adımlarını izleyin.
      14. Tutma çatalının gövdesini mikromanipülatöre sabitleyin ve ızgaranın konektör kartının indirildiğinde kraniyotomi penceresinin arka tarafına doğru durmasını sağlayın.
      15. Mikromanipülatörün korkuluk üzerindeki konumunu, ızgara kabaca kraniyotomi bölgesinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Izgarayı beyin yüzeyinin üzerine yakın bir şekilde durana kadar indirin. Beyin yüzeyini küçük bir damla tuzlu su ile nemlendirin.
      16. Bu adımları mikroskobu kullanarak gerçekleştirin. Mikromanipülatörün kadranlarını kullanarak, ızgara konumunu kraniyotominin merkezindeki beyin yüzeyine düz bir şekilde oturana kadar ayarlayın.
      17. Izgaranın kendisine dokunmadan emici bir pamuklu üçgen kullanarak nemi dikkatlice uzaklaştırın. Izgaranın her sırasının beyin yüzeyi ile temas halinde olduğundan emin olun.
        NOT: Nemin uzaklaştırılması, elektrik sinyalinin kortikal yüzey ile ızgara arasındaki sıvı yoluyla pasif yayılmasını önler, bu da elektrotta algılanan sinyali uzamsal olarak dağıtır.
      18. 2 numaralı veya 5 numaralı forseps kullanarak, ızgara topraklama telini aynı çapak deliğine yerleştirin veya referans telini bir çapak deliğine ve topraklama telini yakındaki kas dokusuna yerleştirin.
        NOT: Teller sadece ~ 1 mm yerleştirilmelidir, beyne temas edecek kadar, ancak beyinde kanama veya travmaya neden olmayacak kadar.
  2. Şebekenin konumunu kontrol etme
    1. Elektrofizyolojik aktivitenin izlenmesi
      1. Kayıt yazılımını kullanarak elektrofizyolojik aktiviteyi gözlemleyin. Işık anestezisi altında, beyin sinyalleri değişkendir ve çeşitli desenler sergileyebilir.
      2. Şebekenin, referansın ve topraklama kablolarının uygun şekilde bağlanması, mV aralığında sinyal genlikleri ile yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlamalıdır. Trodes (örn. 100-6000 Hz) ile bant geçiren filtrelemeyi kullanarak yüksek frekans aralığındaki gürültüyü izleyin ve birkaç on mikrovoltu (μV) aşmadığından emin olun.
    2. Görünür olayla ilgili kortikal yüzey elektrik potansiyellerini (CSEP'ler) indüklemek için gürültüyü (örneğin, alkışlamak veya parmakları şıklatmak) kullanarak duyusal duyarlılığı değerlendirin.
      NOT: Tek bir bıyık stimülasyonu, yalnızca birkaç kanalda (Fare) net, keskin bir olayla ilgili CSEP uyandırmalıdır.
    3. Şebeke konumu doğrulaması
      1. Bir sıçan için, ızgaranın işitsel korteks üzerinde doğru şekilde konumlandırıldığını onaylayın. Kaydedilen ilk blok, şebekenin beyinden uygun bir yanıt kaydettiğini doğrulamak için tipik olarak 60 saniyelik bir beyaz gürültü uyaranı seti olmalıdır. Izgaranın doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini ve bir sinyal yanıtı olup olmadığını belirlemeye yardımcı olmak için yalnızca politrode yerleştirmeden önce ızgara ile beyaz gürültü ve ton tanılama kayıtları yapın.
      2. Bir fare için, ızgara konumunu doğrulamak için, 350 ms aralıklı 20-30 yatay çizgi sapması ile hızlı bir eşleme oturumu gerçekleştirin. Trodes kullanarak yerel alan potansiyeli (LFP) bandındaki aktiviteyi kaydedin ve bıyıkla uyarılan aktivitenin uzamsal kapsamını görselleştirmek için özel bir MATLAB koduyla çevrimdışı olarak analiz edin.
    4. Yeni -den konumlandırma
      1. Izgara ayarlama gerektiriyorsa, kortikal yüzeyi ızgara üzerine tuzlu su damlaları ile nemlendirin.
      2. Izgarayı kaldırmaya çalışmadan önce tuzlu suyu 30 saniye ila 1 dakika arasında bırakın.
      3. Izgarayı dikkatlice ve yavaşça kaldırın.
      4. Adım 3.1'de açıklanan adımları kullanarak yeniden konumlandırın.
  3. Bir sıçan için laminer politrodlar
    1. Polytrode kurulumu
      1. İlk olarak, headstage adaptörünü polytrode'un arka tarafına bağlayın. Konektörü, adaptörün kartına takılan üçüncü kanal kümesine klipsleyin. Klips üzerindeki siyah işaretin, polytrode'un iş ucunun sağ tarafına baktığından emin olun.
    2. Politrode Yerleştirme
      1. En son (en üst) elektrotlar kortikal yüzeyin üzerinde görünene kadar politrodu beyne yerleştirin. Yavaş iniş (1 μm/s'ye kadar) sinyal kalitesini artırır. Beynin politrodun varlığına uyum sağlamasına izin vererek 15 dakika bekleyin.
      2. 15 dakika sonra, son elektrotların kortikal yüzeye girip girmediğini kontrol edin. Değilse, polytrodu biraz daha indirin ve devam etmeden önce 10 dakika daha bekleyin.
  4. Optogenetik ışık kaynağını bir fare üzerine yerleştirme
    1. Fiber optik tutucuyu monte etmek için mafsallı bir kol üzerine monte edilmiş üç boyutlu bir ince ayar vidası sistemi veya bir mikro manipülatör kullanın.
    2. Işık kaynağını yönlendirmek ve fiberin konumlandırılmasına yardımcı olmak için optogenetik ışığı düşük yoğunlukta açın. Optogenetik ışığı hedef alana doğru kaba bir şekilde konumlandırmak için mafsallı kolu kullanın.
    3. Bir mikromanipülatör veya ince ayar vidaları kullanarak fiberin konumuna odaklanın ve ince ayar yapın.
  5. Sinyallerin kaydedilmesi
    1. Hazırlık
      1. Elektriksel paraziti azaltmak için cerrahi teçhizattaki tüm gereksiz ışıkları, uzatma kablolarını ve aşırı gerilim koruyucuları çıkarın. Teçhizattaki tepe ışıklarını kapatın.
      2. Deneye başlamadan önce izole edilmiş kayıt alanının kapısını ve ameliyathanenin kapısını kapatın.
    2. Satın almaya başlama
      1. Bir sıçan için, kayıt platformunda/bilgisayarda Synapse'i başlatın ve sinyalleri önizleyerek ve kontrol ederek alımın işlevsel olduğunu onaylayın. Hayvanın yakınında uyaranlar sunarak, yani alkışlayarak μECoG sinyalinde büyük, keskin voltaj geçişleri ortaya çıkarın.
      2. Fare için, Trodes'ta Kayıt Oturumunu başlatın.
    3. Hidrasyon
      1. Dehidrasyonu önlemek için kayıt sırasında her 1-2 saatte bir sıçana veya fareye deri altına sırasıyla 1 mL veya 0.1 mL salin enjekte edin. Bir sıçan için, yeni bir kayıt bloğunu çalıştırmadan önce salin uyguladıktan sonra 5-10 dakika bekleyin.
    4. Uyaran setleri
      1. Bir sıçan için, kayıt yeri onaylandıktan sonra, gerekli uyaran setlerini kaydetmeye devam edin. Örnek bir küme şunları içerebilir
        Beyaz Gürültü (60 sn)
        Ton Teşhisi (5 dk)
        Saf Ton (23 dk)
        Dinamik Hareketli Dalgalanma
        Ton 150 (15 dk)
        TİMİT (38 dk)
      2. Bir sıçan için, ızgara yeniden konumlandırıldığında beyaz gürültüyü ve ton teşhisini yeniden sunun.
      3. Bir fare için dokunsal uyaranlar: Her denemede her 350 ms'de bir rastgele bıyık sapmaları dizisi içeren bir deneme yapısında dokunsal uyaranlar sağlayın. Sağlanan örnekte, her deneme 4500 ms'nin üzerinde sunulan 14 sapma içerir.
      4. Bir fare için optogenetik uyaranlar: Bazı denemelerde, tüm deneme süresi (5 sn) boyunca bir optogenetik ışık kare darbesi uygulayın. Kullanılan opsine ve ışık penetrasyonu (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php) tahminlerini kullanarak ulaşılacak doku derinliğine göre gerekli ışık seviyesini belirleyin
  6. Temizleme
    1. Izgaranın kaldırılması ve temizlenmesi
      1. Kayıt bittiğinde, kayıt yazılımını kapatın ve teçhizattaki ışık kaynaklarını yeniden takın.
      2. Beyin kuruysa, bir şırınga kullanarak beyin yüzeyine küçük bir damla salin uygulayın. Izgarayı kaldırmaya çalışmadan önce tuzlu suyu 30 saniye ila 1 dakika arasında bırakın.
      3. Mikroskop altında çalışarak, mikromanipülatörler kullanarak ızgarayı beyin yüzeyinden nazikçe kaldırın.
      4. Izgarayı kaldırırken ek kuvvete ihtiyaç duyulursa, ızgarayı beyinden nazikçe kaldırmak için karbon uçlu forseps (kapalı) kullanın. Izgarayı beyin yüzeyinden nazikçe soymak için mikromanipülatörün hareketinin biraz önde olduğundan emin olun.
      5. Izgara tamamen çıkarıldıktan sonra, kavrama çatalından ayırın ve 3.6.1.6-3.6.1.7 adımlarını izleyerek temizleyin.
      6. Izgarayı (konektör kartı hariç) seyreltilmiş bir enzimatik deterjanda (%50 Enzol, %50 damıtılmış su) en az 1 saat bekletin. Daha sonra, saf damıtılmış su içeren ikinci bir banyoya aktarın ve güvenli, temiz bir yerde kurumaya bırakın.
      7. Izgaranın bazı bölgelerinde kan veya doku birikmişse, nazikçe silerek temizlemek için enzimatik solüsyona batırılmış pamuklu bir üçgen kullanın.
      8. Kuruduktan sonra ızgarayı kutusuna geri koyun.
    2. Hayvana ötenazi yapmak
      1. Bir fare için, hayvanı kafa fiksasyonundan çıkarın ve ötenazi odasına yerleştirin. 5 mL izofluran içeren bir gazlı bez ekleyin ve solunumun kesilmesinden sonra 60 saniye bekleyin. Geri çekilme refleksi eksikliğini doğrulayın ve keskin bir makas kullanarak kafasını kesin.
      2. Bir sıçan için 0.2 mL pentobarbital IP enjekte edin. Solunumun kesilmesinden sonra 60 saniye bekleyin, hayvanı sırt üstü yatırın ve çift torakotomi yapmak için # 11 bıçak kullanın.
    3. Ekipmanın temizlenmesi
      1. Tüm cerrahi aletleri laboratuvar lavabosuna götürün ve cerrahi bir havlu üzerine koyun. Aletlere% 10 çamaşır suyu solüsyonu püskürtün ve lavaboda iyice yıkayın. Daha kirli aletler için, yıkamadan önce bir çamaşır suyu çözeltisine batırılmalarına izin verin.
      2. Alternatif olarak, aletleri lavaboda bir fırça ile ovarak suyla bir toz deterjan (örneğin Contrex AP) kullanın.
      3. Aletler temizlendikten ve durulandıktan sonra, alkollü mendillerle silin ve saklama alanlarına geri koyun.
    4. Çalışma alanını sterilize etme
      1. Kullanılmış tüm iğneleri ve bıçakları keskin alet kabına atın.
      2. Kirlenmiş pamuklu çubukları, üçgenleri ve alkollü mendilleri biyolojik tehlike torbasına atın.
      3. Çalışma alanını kapatmadan önce teçhizat odasındaki tüm çalışma yüzeylerini alkolle silin ve tüm aletleri temizleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik yöntemler ve laminer kayıtlarla birlikte elektrokortikografik sinyallerin kaydedilmesi için protokolleri tanımladık. Burada, farenin somatosensoriyel korteksinden (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3) ve sıçanların işitsel korteksinden duyusal stimülasyona yanıt olarak (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6) elde edilen tipik sinyaller sunulmaktadır....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokoller, yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μECoG) dizilerinin laminer problar ve optogenetik tekniklerle entegre edilmesini sağlar. Bu protokolün kemirgen modellerinde kullanım kolaylığı, onu kortikal dinamiklerin araştırılması için güçlü bir araç haline getirir ve denek sayısı kolayca artırılabilir. Yüksek yoğunluklu μECoG ızgarası, farelerde ve sıçanlarda birden fazla alanda kortikal topografyanın verimli, uzamsal olarak hassas bir şekilde haritalanmasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı LDRD Sinir Sistemleri ve Makine Öğrenimi Laboratuvarı (K.E.B.), NINDSR01 NS118648A (K.E.B. & D.E.F.) ve NINDS R01 NS092367 (D.E.F.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 tek kullanımlık # 11 bıçakSwann Morton303Cerrahi prosedürler için
2 tek kullanımlık # 10 bıçakSwann Morton3901Cerrahi prosedürler için
30 mm kafes çubuklarıThorlabsERkafes bileşenleri
30 mm kafes plakasıThorlabsCP33Tlensleri tutarken
%70 etanolDecon LabsV1016Temizleme / Dezenfektan (%70'e kadar seyreltilmiş)
Amalgambond PLUS Ayarlanabilir Hassas Aplikatör Fırçası Deniz Mavisi 200/BXHenry Schein1869563çimento için hassas aplikatör
Amalgambond PLUS Katalizör 0.7 mL Şırınga EaHenry Schein1861119çimento bileşeni
Amplifikatör (Tucker-Davis Technologies)Tucker-Davis TechnologiesPZ5M-512İşitsel uyaran ve kayıt için kullanılır yazılım.
Mafsallı kolayar vida sistemini tutmak içinNogaDG60103
Işık toplama için asferik lensler (ve ışığı odaklamak için bir tane)ışığı toplamak içinThorlabsACL25416U-B
İşitsel ekipmanTucker-Davis Technologies, Sony, CorteraRP2.1 Gelişmiş Gerçek Zamanlı İşlemci/HB7 Kulaklık Sürücüsüİşitsel uyaran ve kayıt yazılımı için kullanılır.
BuprenorfinSteril Ürünler LLC# 42023017905Genel analjezi
C & B Metabond Baz Çimento EaHenry Schein1864477çimento bileşeni
C& B Metabond L-Toz Çimento Şeffaf 3 g Henry Schein1861068çimento bileşeni
Klorprotiksen hidroklorür (fare)Sigma AldrichCat. Hayır. C1671Sedasyon için aynı gün hazırlanmalı ve 4
Özel tasarlanmış 128 kanallı mikro-elektrokortikografi (μ ECoG) ızgaralarıNeuronexusE128-200-8-40-HZ64Nörofizyoloji kayıtları için. Korteks üzerine yerleştirilir.
Dengofoam jelatin süngerlerDengen dental600034 (SKU)kuru veya ıslak, steril sodyum klorür çözeltisi ile doyurulmuş olarak kullanılabilir
Matkap ucu, boyut 5 ila 9 (Fare)Güzel Bilim Araçları19007-XXXX, matkap ucunun boyutudur, örneğin 05 veya 09. Fare prosedürleri için
Matkap ucuÇelik Yuvarlak Bur (5,5 mm/7,5 mm)LZQ AraçlarıDental Bar Matkap Ucu Paslanmaz Çelik BurSıçan prosedürleri için
Dumont No. 5 forsepsGüzel Bilim Araçları11251-10Cerrahi prosedürler için
Dumont cımbız #5 bükülmüş 45°Kraniyotomi penceresini çıkarmak içindünya hassas aletleri14101
DVD Oynatıcı (Sony)SonyCDP-C345Uyaran setlerini kabul etmek ve oynatmak için kullanılan sistem
Elektrostatik HoparlörSonyXS-162ESİşitsel uyaran ve kayıt yazılımı için kullanılır. Teçhizat içinde bulunur, sedasyonlu kemirgene ses çalar
Enzimatik deterjan (Enzol)Gelişmiş sterilizasyon ürünleri2252Temizleme/Dezenfektan
EverEdge 2.0 Ölçekleyici Orak Çift Uçlu H6/H7 #9Henry Schein6011862Kafatasını ovmak için
NarishigeU-3C'deince ayar vida sistemiOptik fiber ucun
hassas konumlandırılması içinAltın pimHarwin IncG125-1020005Farede temas referansı için kullanılır Gümüş tele lehimlenmiş
Kavrama forsepsleriGüzel Bilim Araçları00632-11Cerrahi prosedürler için
İzofluranCovetrus11695067772bir buharlaştırıcı gerektirir
Ketamin (Hidroklorür Enjeksiyonu) (Sıçan)Dechra17033-101-10Anestezi/Analjezik
LEDYeni EnerjiLED XLAMP XPE2 MAVİ SANCAKMavi LED ışık kaynağı
LED sürücüThorlabsLEDD1BLED sürücü
LidokainCovetrusVINB-0024-6800% 1'e seyreltilecek
6451603845Genel analjezi için kullanılan anti-enflamatuar
MikromanipülatörNarishige (Stereotaksik Teçhizat)SR-6R + SR-10R-HT bileşenleriECoG ve kemirgeni ince hareketlerle manipüle etmek için kullanılır
No. 2 forsepsGüzel Bilim Araçları91117-10Cerrahi prosedürler için
No. 55 forsepsGüzel Bilim Araçları1129551Cerrahi prosedürler için
Oftalmik kayganlaştırıcı (Suni gözyaşları)Akorn17478-062-35Cerrahi prosedürler
sırasında gözleri kurumaya karşı korumak için kullanılırFiber optik 200 ve mikro; m Çekirdek çapıThorlabsM133L02FC/PC konektörü 2 m uzunluğunda
Pentobarbital (Sıçan)Covetrus / DechraVINV-C0II-0008Anestezi/Analjezik
Platin SiyahSigma205915-250MGNörofizyoloji kayıtları için (&mu üzerindeki kontakları elektrokaplamak için kullanılır; ECoG şebekeleri).
Povidone İyot %10Betadinehttps://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/katalog numarası yok (perakende değil
) Toz deterjan (Contrex AP)Decon Labs5204Temizlik / Dezenfektan
Oksijen tüpü için önceden kesilmiş bantULINE (Çeşitli Sağlayıcılar)S-14726Oksijen tüpünü kemirgen stereotaksik teçhizatın burun konisine takmak için kullanılır
Neşter kolu # 3#10, #11 ve # 15 bıçakları için500236-G
SıyırıcıGüzel Bilim Aletleri1007516Cerrahi prosedürler için
Kısa 30 G iğnelerExelInt26437Cerrahi prosedürler ve enjeksiyonlar için
Silver WireWarner Instruments63-1319Nörofizyoloji kayıtları için (Topraklama ve referans elektrot olarak kullanılır).
Sterilize salin (enjeksiyon için% 0.9 sodyum klorür)Hospira00409-7101-67 (NDC)Enjekte edilebilir sıvıların seyreltilmesi ve vücut sıvılarının değiştirilmesi için
Stoelting Hopkins BulldogGüzel Bilim Araçları10-000-481Cerrahi prosedürler için
Yüzey dezenfektanı (Coverage Plus NDP Dezenfektan)Steris yaşam bilimleri638708Temizlik/Dezenfektan
TDT ZIF-klipsli konektörler satın alma için.Tucker-Davis TechnologiesZIF-Clip Analog BaşlıklarECoG'yi dış satın alma ekipmanına bağlar
İki uçlu tutma çatalıTucker-Davis TechnologiesZ-ROD128TDT klipslerini mikromanipülatöre bağlamak için kullanılır
Xylazine (Rat)Covetrus1XYL006Anestezi/Analjezik
İnce LED 3 boyutlu tuzlu Meloksikam Covetrus içindedünya hassas aletleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  2. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Nunez, P. L., Srinivasan, R. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press, USA. (2006).
  4. Mountcastle, V. B., Powell, T. P. Central nervous mechanisms subserving position sense and kinesthesis. Bull Johns Hopkins Hosp. 105, 173-200 (1959).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
  6. Lewis, C. M., Bosman, C. A., Womelsdorf, T., Fries, P. Stimulus-induced visual cortical networks are recapitulated by spontaneous local and interareal synchronization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E606-E615 (2016).
  7. Bouchard, K. E., Mesgarani, N., Johnson, K., Chang, E. F. Functional organization of human sensorimotor cortex for speech articulation. Nature. 495 (7441), 327-332 (2013).
  8. Fabrication and testing of a large area, high density, parylene MEMS µECoG array. Ledochowitsch, P., et al. 2011 IEEE 24th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, Cancun, Mexico, , (2011).
  9. Bosman, C. A., et al. Attentional stimulus selection through selective synchronization between monkey visual areas. Neuron. 75 (5), 875-888 (2012).
  10. Rubehn, B., Bosman, C., Oostenveld, R., Fries, P., Stieglitz, T. A MEMS-based flexible multichannel ECoG-electrode array. J Neural Eng. 6 (3), 036003(2009).
  11. Baratham, V. L., et al. Columnar localization and laminar origin of cortical surface electrical potentials. J Neurosci. 42 (18), 3733-3748 (2022).
  12. Kellis, S., et al. Decoding spoken words using local field potentials recorded from the cortical surface. J Neural Eng. 7 (5), 056007(2010).
  13. Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nat Neurosci. 14 (12), 1599-1605 (2011).
  14. A transparent µECoG array for simultaneous recording and optogenetic stimulation. Ledochowitsch, P., Olivero, E., Blanche, T., Maharbiz, M. M. 2011 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Boston, MA, USA, , (2011).
  15. Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. J Neurosci Methods. 256, 220-231 (2015).
  16. Laminar origin of evoked ECoG highgamma activity. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. Dougherty, M. E., Nguyen, A. P. Q., Baratham, V. L., Bouchard, K. E. 2019, 4391-4394 (2019).
  17. Tian, H., Xu, K., Zou, L., Fang, Y. Multimodal neural probes for combined optogenetics and electrophysiology. iScience. 25 (1), 103612(2022).
  18. Gonzales, D. L., et al. A translaminar spacetime code supports touchevoked traveling waves. bioRxiv. , (2024).
  19. Leonard, M. K., et al. Largescale singleneuron speech sound encoding across the depth of human cortex. Nature. 626 (7999), 593-602 (2024).
  20. Renz, A. F., et al. OptoEDura: a soft, stretchable ECoG array for multimodal, multiscale neuroscience. Adv Healthc Mater. 9 (17), 2000814(2020).
  21. Buzsáki, G. Rhythms of the brain. , Oxford University Press, USA. (2006).
  22. Yang, W., et al. A fully transparent, flexible PEDOT:PSS-ITO-Ag-ITO based microelectrode array for ECoG recording. Lab Chip. 21 (6), 1096-1108 (2021).
  23. Buzsáki, G. Largescale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  24. Schalk, G., et al. Realtime detection of eventrelated brain activity. Neuroimage. 43 (2), 245-249 (2008).
  25. Kellis, S., et al. Multiscale analysis of neural activity in humans: implications for microscale electrocorticography. Clin Neurophysiol. 127 (1), 591-601 (2016).
  26. Buzsáki, G., Schomburg, E. W. What does gamma coherence tell us about interregional neural communication. Nat Neurosci. 18 (4), 484-489 (2015).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecondtimescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Cardin, J. A., et al. Driving fastspiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  29. Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decisionrelated activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
  30. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56 (2), 339-355 (2007).
  31. Crone, N. E., Sinai, A., Korzeniewska, A. Highfrequency gamma oscillations and human brain mapping with electrocorticography. Prog Brain Res. 159, 275-295 (2006).
  32. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC crerecombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  33. Mountcastle, V. The columnar organization of the neocortex. Brain. 120 (4), 701-722 (1997).
  34. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  35. Muller, L., Chavane, F., Reynolds, J., Sejnowski, T. J. Cortical travelling waves: mechanisms and computational principles. Nat Rev Neurosci. 19 (5), 255-268 (2018).
  36. Sato, T. K., Nauhaus, I., Carandini, M. Traveling waves in visual cortex. Neuron. 75 (2), 218-229 (2012).
  37. Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Columnar specificity of intrinsic horizontal and corticocortical connections in cat visual cortex. J Neurosci. 9 (7), 2432-2442 (1989).
  38. Angelucci, A., et al. Circuits and mechanisms for surround modulation in visual cortex. Annu Rev Neurosci. 40 (1), 425-451 (2017).
  39. Singer, W., Gray, C. M. Visual feature integration and the temporal correlation hypothesis. Annu Rev Neurosci. 18, 555-586 (1995).
  40. Quiroga, R. Q., et al. Invariant visual representation by single neurons in the human brain. Nature. 435 (7045), 1102-1107 (2005).
  41. Fusi, S., Miller, E. K., Rigotti, M. Why neurons mix: high dimensionality for higher cognition. Curr Opin Neurobiol. 37, 66-74 (2016).
  42. Stringer, C., et al. Spontaneous behaviors drive multidimensional, brainwide activity. Science. 364 (6437), eaav7893(2019).
  43. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using celltypespecific expression of channelrhodopsin2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  44. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nat Neurosci. 21 (6), 881-893 (2018).
  45. Mahn, M., et al. Highefficiency optogenetic silencing with somatargeted anionconducting channelrhodopsins. Nat Commun. 9 (1), 4125(2018).
  46. Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating lowimpedance tetrodes by electroplating with additives. Sens Actuators A Phys. 156 (2), 388-393 (2009).
  47. Halnes, G., et al. Electric Brain Signals: Foundations and Applications of Biophysical Modeling. , Cambridge University Press. (2024).
  48. Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat Rev Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
  49. Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
  50. Schalk, G., Leuthardt, E. C. Braincomputer interfaces using electrocorticographic signals. IEEE Rev Biomed Eng. 4, 140-154 (2011).
  51. Chestek, C. A., et al. Longterm stability of neural prosthetic control signals from silicon cortical arrays in rhesus macaque motor cortex. J Neural Eng. 8 (4), 045005(2011).
  52. Branco, M. P., et al. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Micro ElectrocorticographyLaminar PolytrodesOptogenetic ManipulationCortical ProcessingSensory Evoked ResponsesHigh Gamma ActivityTonotopic MappingRodent Brain RecordingAuditory CortexWhisker Somatosensory Cortex

İlgili makaleler