Method Article

Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı

DOI:

10.3791/68037

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, DNA yakalama boncuk saflaştırması ile birleştirilen boncuk çırpmayının, Mycobacterium tuberculosis örneklerinden DNA çıkarmak için hızlı ve tutarlı bir yöntem sağladığını ve bu da onu yeni nesil dizileme uygulamaları için etkili bir seçim haline getirdiğini gösterir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüberküloz ölümcül bir hastalıktır ve etken ajan bakteri olan Mycobacterium tuberculosis'te antibiyotik ilaç direncinin ortaya çıkması tedavi sonuçlarını kötüleştirmektedir. Özel terapötik rejimler yoluyla tüberküloz hasta sonuçlarını iyileştirmek için dizileme teknolojileri aracılığıyla kesin ve hızlı ilaç direnci tanımlaması gereklidir. DNA ekstraksiyon yöntemi, sonraki moleküler tahliller için kritik öneme sahiptir ve Mycobacterium'un sert hücre duvarı, birçok klinik numunenin düşük basil yükü ve balgam matrisinin karmaşıklığı nedeniyle karmaşıktır. Bildirilen çok sayıda M. tuberculosis DNA ekstraksiyon yöntemi vardır, ancak şu anda altın standart yoktur. Ayrıca, bu yöntemlerin çok azının tutarlı bir şekilde çalıştığı gösterilmiştir ve birçoğu düşük kaynaklı ve yüksek yüklü tüberküloz ortamları için uygun değildir. Sonuç olarak, laboratuvarlar sıklıkla kendi prosedür değişikliklerini uygulamaya koyar ve bu da önemli yöntem değişkenliğine neden olur. Burada, hem klinik balgamdan hem de qPCR'ye uygun DNA üreten kültürden Mikobakteriyel DNA ekstraksiyonu için uygun maliyetli ve standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz ve klinik tanı laboratuvarlarında kullanım için düşünülmesi gereken bir protokol sunuyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaca dirençli tüberkülozun (TB) saptanması için hedefe yönelik yeni nesil dizileme (NGS) ve tüm genom dizilemesi (WGS) kullanılarak M . tuberculosis'ten yüksek kaliteli DNA çıkarılması gereklidir, ancak genellikle göz ardı edilir. İlaca dirençli tüberküloz tanısı için şu anda Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilen Deeplex-MycTB (GenoScreen) ve tüm genom dizilimi gibi hedefli NGS yaklaşımları da dahil olmak üzere klinik NGS uygulamaları için tutarlı, yüksek kaliteli DNA sağlamak üzere standartlaştırılmış bir protokol geliştirdik. Özellikle, DSÖ bu NGS tabanlı tanı stratejilerini önerirken, bunları desteklemek için belirli DNA ekstraksiyon protokollerini belirtmez. Yöntemimiz, DSÖ onaylı testlerin yanı sıra yüksek kaliteli mikobakteriyel DNA gerektiren yeni teknolojilerle de kullanılabilir.

Ekstraksiyon zorluğu, M. tuberculosis'in mikolik asitler ve lipitlerden oluşan benzersiz hücre duvarından kaynaklanır ve bu da kırılmayı son derece zorlaştırır. Mevcut yayınlanmış ekstraksiyon çözeltileri, lizis (örneğin, sonikasyon, kimyasal, ısı ve boncuk dövme) ve DNA ekstraksiyon yöntemlerinde (örneğin, fenol-kloroform ekstraksiyonu, etanol çökeltme, CTAB bazlı ve sütun ve boncuk bazlı yöntemler) önemli farklılıklara sahiptir, bu da DNA verimi, saflığı ve kalitesinde farklılıklara neden olur 1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,16. Ek olarak, araştırma grupları nadiren aynı DNA ekstraksiyon yöntemini kullanır ve genellikle başarıyı farklı şekilde ölçer. Bu, hangi yöntemin en iyi sonucu verdiğini belirlemeyi zorlaştırır, çünkü optimal yaklaşım moleküler uygulamanın türüne bağlıdır. Örneğin, uzun okuma dizilimi kullanarak balgamdaki M. tuberculosis yapısal varyantlarını çözmek, yalnızca küçük bir rpoB bölgesini hedefleyen ücretli bir tanı aracını çalıştırmaktan daha yüksek kaliteli DNA ve daha doğru polimeraz gerektirir. DNA ekstraksiyon başarısını daha da karmaşık hale getiren birkaç faktör vardır. Ekstrakte edebileceğimiz DNA miktarı, numune tipine, kaç bakteri bulunduğuna ve prosese müdahale eden maddelerin (birlikte ekstrakte edilmiş mikobakteriyel olmayan DNA ve PCR inhibitörleri) olup olmadığına bağlı olarak değişir. Bir laboratuvar teknisyeninin pipet ölçüm yapma hızı gibi teknik hususlar bile sonuçları etkileyebilir. Klinik ortamlarda yaygın olarak karşılaşılan düşük bakteri yüklerine veya yüksek düzeyde kirletici DNA'ya sahip numuneleri işlerken mevcut yöntemler genellikle yetersiz kalmaktadır 17,18,19.

Özel tamponda boncuk çırpma ve ardından bir boncuk temizleme protokolü, diğer yöntemlere göre önemli avantajlar sunar. Operatöre bağlı varyasyon olasılığını azaltan ve aşağı akış NGS uygulamaları için DNA bütünlüğünü koruyan basit ve hızlı bir iş akışıdır. Bu standartlaştırılmış yaklaşım, özellikle DSÖ tarafından önerilen NGS ilaç direnci testlerini ve tüm WGS uygulamalarını kullanarak güvenilir, tekrarlanabilir sonuçlar arayan klinik laboratuvarlara uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kaliforniya San Francisco Üniversitesi'nde (UCSF) Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi onayı (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) altında yürütülmüştür ve UCSF araştırma etiği yönergelerini takip etmektedir. Discovery Life Sciences tarafından IRB onaylı bir Rıza Feragatnamesi protokolü kapsamında toplanan kalıntı balgam örneklerini, TB dışı solunum rahatsızlığı olan bireylerden aldık.

1. Tamponların hazırlanması

  1. Özel Triton tamponu (Tablo 1): 100 mL özel Triton tamponu hazırlamak için 2 mL 5 M NaCl, 1 mL 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 mL Triton X-100 ve 0.2 mL 0.5 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA). Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için ultra saf su ekleyin. Kullanmadan önce filtre sterilize edin. Son tampon 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ve %1 Triton X-100 içerir.
  2. Düşük EDTA'lı TE (Tablo 2): 100 mL Düşük EDTA'lı TE Tamponu hazırlamak için 1 mL 1M Tris-HCl (pH 8) ve 0.02 mL 0.5 M EDTA'yı birleştirin. Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için ultra saf su ekleyin. Son tampon 10 mM Tris-HCl ve 0.1 mM EDTA içerir.

2. Lizis tüplerinin hazırlanması

  1. Bir neşter bıçağı kullanarak, bükülme noktasının hemen altındaki 1,5 mL'lik vidalı kapaklı bir borunun altını dikkatlice kesin.
  2. Ucu bir P1000 ucundan kesin, ucuna yakın V şeklinde bir kama kesin ve vidalı kapak borusunun hazırlanan tabanını içine sıkıştırın. Kepçe şeması için Şekil 1'e bakın.
  3. Steril bir kabı (örn. bir rezervuar veya Petri kabı) 0,1 mm Zirkonya-Silikat Boncuklar ile doldurun ve bir kepçe boncuk (~ 200 mg) 1,5 mL vidalı kapaklı tüplere dağıtmak için hazırlanan kepçeyi kullanın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Şirket içi boncuk dağıtım kepçesi. Kepçe, ~ 200 mg 0.1 mm zirkonyum boncukların işleme tüplerine kolayca aktarılması için tasarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Girdinin hazırlanması

NOT: Tüm numune hazırlama işlemleri tesisinizin biyogüvenlik protokollerine göre yapılmalıdır. Aerosole maruz kalma riskini en aza indirmek için bulaşıcı materyallerin Sınıf II Biyogüvenlik Kabini (BSC) içinde kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz.

  1. Bakteri hücre kültürü
    1. ~ 5 mL M. tuberculosis kültürünü (MGIT veya bulanık sıvı kültür) 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde maksimum hızda (≥ 3.000 x g) 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
    2. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, peleti bozmadan süpernatantın ~ 500 μL dışındaki tamamını dikkatlice çıkarın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.
    3. Peleti 350 μL'lik özel Triton tamponunda yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Gerekirse (yani, bir BSL-3 dışında işlenmek üzere numuneleri çıkarmak için), numuneyi standart çalıştırma prosedürlerine göre devre dışı bırakın.
  2. Balgam hazırlama
    1. 1-5 mL balgam örneğini (spontan veya indüklenmiş) steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  3. DTT sıvılaştırma
    1. Balgam örneğine dört hacim 100 mM ditiyotreitol ekleyin (hacim değişebilir). Ticari bir reaktif kullanıyorsanız, üreticinin seyreltme talimatlarına uyun.
    2. 30 saniye boyunca iyice girdaplayın. Oda sıcaklığında (20-25 °C) 7 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca tekrar girdap.
    3. 3.3.1 adımlarını tekrarlayın. ve 3.3.2. 1x, çok viskoz numuneler için 5 adede kadar inkübasyon-girdap döngüsü gerçekleştirin.
    4. 10 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 3.000 x g) santrifüjleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, süpernatantın ~ 500 μL'si hariç hepsini dikkatlice atın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.
    5. Peleti 350 μL özel Triton tamponunda yeniden süspanse edin.
  4. NALC-NaOH sıvılaştırma
    1. NALC-NaOH çözeltisini hazırlamak için, üreticinin hazırlama ve seyreltme talimatlarını izleyin.
    2. Balgam örneğine dört hacim NALC-NaOH çözeltisi ekleyin (spontan veya indüklenmiş, hacim değişebilir).
    3. 30 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında (20-25 °C) 7 dakika inkübe edin. 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarını tekrarlayın. 1 kat. Çok viskoz numuneler için 5 adede kadar inkübasyon-girdap döngüsü gerçekleştirin.
    4. 50 mL işaretine PBS ekleyin. Karıştırmak için kısaca girdap. 10 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 3.000 x g) santrifüjleyin.
    5. 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, süpernatanın ~ 500 μL'si hariç hepsini dikkatlice atın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.
    6. Peleti 350 μL özel Triton tamponunda yeniden süspanse edin. Gerekirse (yani, bir BSL-3 dışında işlenmek üzere numuneleri çıkarmak için), numuneyi standart çalıştırma prosedürlerine göre devre dışı bırakın.

4. DNA'nın Ekstraksiyonu

  1. İnaktive edilmiş bakteriyel süspansiyonu (3. adımdan itibaren 350 μL), ~ 250 μL 0,1 mm Zirkonya-Silikat Boncuk içeren, iyi etiketlenmiş 1,5 mL'lik yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın.
  2. Bead, koşular arasında 2 dakika dinlenme ile 45 saniye boyunca 6,5 m/s hızla lizatı yendi. Toplam üç boncuk çırpma döngüsü için tekrarlayın.
  3. 2 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 12.000 x g) santrifüjleyin ve 150 μL süpernatanı iyi etiketlenmiş yeni bir tüpe aktarın. Boncukları veya hücre kalıntılarını aktarmamaya dikkat edin.
  4. Temizleme manyetik boncuklarının 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin ve kullanmadan önce tamamen yeniden süspansiyon sağlamak için iyice girdaplayın.
  5. 180 μL (1,2x hacim) temizleme manyetik boncukları ekleyin ve 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
  6. Manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin ~ 2 dakika boyunca temizlenmesini bekleyin. Bir P200 pipeti kullanarak, manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice atın.
  7. Tüp hala manyetik rafın üzerindeyken, 500 μL taze hazırlanmış p (h/h) etanol ekleyin ve karşı tüp duvarı boyunca manyetik boncuklara dağıtın. 30 saniye bekleyin.
  8. 4.5 adımlarını tekrarlayın. - 4.7. toplam iki yıkama için. Son yıkamanın sonunda, kalan etanolü bir P10 pipeti ile temizleyin. Boncukları ~ 2 dakika kısa bir süre kurutun.
  9. Boncuk peleti opak hale geldikten hemen sonra, tüpü manyetik raftan çıkarın ve 20 μL Düşük EDTA'lı Tris Tamponu içinde yeniden süspanse edin. Boncukların kurumasına ve çatlamasına izin vermeyin.
  10. Tüm boncukların çözelti içinde olduğundan emin olmak için pipetleme veya vorteksleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  11. Manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin ~ 2 dakika berraklaşmasını bekleyin. Ayrıştırılmış DNA'yı, aşağı akış analizi için iyi etiketlenmiş yeni bir tüpe aktarın. Manyetik boncuk taşınmasını önlemek için <20 μL ekstrakte edilmiş DNA'yı aspire edin.

5. Mikobakteriyel DNA'nın qPCR sayımı

  1. Mikobakteriyel DNA'yı 99 mikobakteriyel atpE'nin (Rv1305) nükleotidini hedefleyen kantitatif bir PCR kullanarak ölçmek için, 5 μL üniversal prob ana karışımı (2x), her biri 0.4 μL ileri primer (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) ve ters primer (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0.2 μL TaqMan probu (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3') içeren buz üzerinde numune başına 10 μL'lik bir reaksiyon karışımı birleştirin, 10 μM), 2 μL DNA şablonu ve 2 μL nükleaz içermeyen su (Tablo 3).
  2. Reaksiyonu aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak çalıştırın: 60 saniye boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon, ardından 10 saniye boyunca 95 °C'lik 35 döngü ve 30 saniye boyunca 60 °C (burada bir yakalama ile, 2.11 °C/s'lik bir rampa hızı kullanılarak; Tablo 4).
    NOT: Bu durumda, qPCR, bir QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR Sisteminde VIC etiketli prob ile bir TaqMan testi kullanılarak gerçekleştirildi,
  3. Tüm örnekleri, standartları ve denetimleri teknik üçlüler halinde çalıştırın. Saflaştırılmış M. tuberculosis DNA'sının seri dilüsyonlarını kullanarak standart eğriler oluşturun. Analiz Yazılımını kullanarak bağıl niceleme analizi yapın.
  4. Elde edilen göreli niceleme değerlerini CSV formatına aktarın ve ekstraksiyon yöntemlerinde DNA verimlerini karşılaştıran kutu grafikleri oluşturmak için R Studio'yu (sürüm 2024.09.1+394) kullanarak görselleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ekstraksiyon protokolünü hem kültürlenmiş M. tuberculosis hem de M. tuberculosis çivili balgam örneklerinde test ettik (her durum için n = 3). Kültürlenmiş M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 kullanarak, girişi 50 μL'de 8.4 x10 6 hücreye standardize ettik, bu da 200 GU'da 1 mL'lik bir MGIT kültürüne eşdeğerdir. Balgam deneyleri için, tüberküloz dışı solunum rahatsızlıkları olan bireylerden (ticari olarak elde edilen) toplanan 1 mL balgamı iki farklı bakteri konsantrasyonuyla (50.000, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, aşağı akış moleküler ve NGS uygulamaları için manyetik boncuk temizleme ile boncuk çırpma kullanarak yüksek kaliteli M. tuberculosis DNA'sının çıkarılması için sağlam, doğrulanmış bir protokol sunuyoruz.

Yöntem, mevcut M. tuberculosis DNA ekstraksiyon protokollerine göre çeşitli avantajlar sunar. Geleneksel fenol-kloroform ekstraksiyonu tipik olarak birkaç gün sürer ve tehlikeli kimyasallar içerirken, bu yöntem minimum tehlikeli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mm Zirkonya-Silikat BoncuklarBiospec Ürünleri11079101ZMikobakteriyel hücreleri parçalamak için boncuk çırpma adımı için kullanılan boncuklar
AMPure XP BoncuklarıBeckman CoulterA63880 SerisiLizis sonrası DNA temizliği için manyetik boncuklar
EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher BilimselAM9260GÖzel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri
Hızlı Hazırlık 24MPbio, Amerika Birleşik Devletleri1160045006,5 m/s'de boncuk çırpma ekipmanı
İleri AstarThermo Fisher BilimselÖzel sentezPrimer dizisi: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Su, moleküler biyoloji sınıfı)Thermo Fisher BilimselBP2819-1Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri
Luna Üniversal ProbNew England BiyolaboratuvarlarıM3004 SerisiMikobakteriyel DNA sayımı için qPCR reaktifi
MycoPrep KitiBDSKU/REF 240863NALC-NaOH Balgam İşleme için BD MycoPrep Numune Parçalama
NaCl (Sodyum Klorür, 5M çözeltisi)Thermo Fisher BilimselAM9759 SerisiÖzel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri
PBSMillipore SigmaP2272Balgam İşleme
Ters AstarThermo Fisher BilimselÖzel sentezPrimer dizisi: GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan SondasıThermo Fisher BilimselÖzel sentezProb sırası: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8.0)Thermo Fisher BilimselAM9855GÖzel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri
Triton X-100Thermo Fisher Bilimsel28314Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. bioRxiv. , (2020).
  3. Doyle, R. M., et al. Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing. J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).
  4. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories. J Clin Microbiol. 32, (1994).
  5. Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).
  6. Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria. Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).
  7. De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study. BMC Res Notes. 6, 561(2013).
  8. Pan, S., et al. Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis. J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).
  9. Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).
  10. Votintseva, A. A., et al. Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples. J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).
  11. Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk. Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).
  12. Oh, T. S., et al. An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis. Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).
  13. Miyata, M., et al. Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping. Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).
  14. Votintseva, A. A., et al. Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures. J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).
  15. Kolia-Diafouka, P., et al. Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens. Front Microbiol. 9, 2224(2018).
  16. Bonnet, I., et al. A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples. Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).
  17. Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. bioRxiv. , (2024).
  18. Schwab, T. C., et al. Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia. J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).
  19. Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows. Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).
  20. Oberacker, P., et al. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).
  21. Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis. HardwareX. 19, e00576(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterial DNA ExtractionBead BeatingCustom BufferTuberculosis DiagnosticsDrug Resistance DetectionSputum Sample ProcessingMagnetic Bead CleanupQuantitative PCRNext Generation SequencingCell Lysis

Related Articles