Mekanik kıkırdak aşırı yüklenmesine kondrosit yaralanması yanıtını daha iyi anlamak için protokol, 24 saat boyunca subletal olan bir ex vivo kıkırdak etki modelinin geliştirilmesini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro Sığır Kıkırdak Eksplantlarında Subletal Kondrosit Hasarı Oluşturmak için Etki Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Travma Sonrası Osteoartrit (PTOA), tipik olarak 6 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen önemli eklem travmasından sonra ortaya çıkan yaygın, dejeneratif ve ağrılı ilerleyici bir eklem hastalığıdır. Darbeye bağlı kıkırdak travması, PTOA ile sonuçlanan bir kondrosit yaralanması yanıtı ile sonuçlanır. Kondrosit hasarı ile ilişkili moleküler olayların anlaşılması, PTOA'yı önlemek veya ilerlemesini yavaşlatmak için tedaviler geliştirmek için gereklidir. Bunu kolaylaştırmak için, 24 saat boyunca öldürücü olmayan bir ex vivo kıkırdak darbe modeli geliştirilmiştir. Osteokondral eksplantlar, sığır metakarpofalangeal eklemlerinden hasat edildi ve eksplantlara darbe yüklerini iletmek için bir damla kulesi kullanıldı. Stres ve etkinin eklem kıkırdağına nispeten homojen bir şekilde uygulanmasını sağlamak için, eksplantlar kemik yüzeyi yukarı bakacak şekilde konumlandırıldı ve kemik yukarıdan etkilendi. Eksplantlara 4.0 cm, 4.5 cm ve 5.0 cm taşıma yüksekliklerinden farklı yükler uygulandı, bu da sırasıyla 10.87 ± 1.84 MPa, 11.69 ± 0.67 MPa ve 12.98 ± 0.75 MPa'lık ortalama tepe gerilmeleri ile sonuçlandı. Çalışma, darbe sonrası kültür sırasında kıkırdakta subkondral kemik varlığının rolünü ve etki sırasında takılı veya gevşek bir tutucu kullanmanın etkisini, hücre canlılığını ve apoptozu değerlendirerek analiz etti. 4,5 cm'den etkilenen eklem kıkırdağı, takılı bir tutucu ve hemen kemik çıkarılması ile birlikte, darbeden 24 saat sonra minimum hücre ölümü ile kıkırdak yaralanmasını indüklemek için en uygun modeli sağladı.
Giriş
Travma sonrası osteoartrit (PTOA), Amerika Birleşik Devletleri'nde 5 milyondan fazla yetişkini etkileyen zayıflatıcı bir hastalıktır1. Kıkırdağa tek bir travmatik etki, kondrosit yaralanması yanıtını tetikleyerek erken başlangıçlı semptomlara ve eklem ağrısı ve disfonksiyonu ile ömür boyu sürecek bir mücadeleye yol açabilir2. Kıkırdağın içsel onarım kabiliyeti çok azdır veya hiç yoktur ve bu nedenle, hastalığın ilerlemesini değiştirmek için tedaviler geliştirmeye yönelik doldurulmamış bir ihtiyaç vardır3. PTOA, açıkça tanımlanmış tek bir travmatik olayla ilişkili ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yerel bir mezbahadan elde edilen sığır uzuvlarının kullanımı, dokular gıda tüketimi için işlenen hayvanlardan ölüm sonrası toplandığı için etik onay gerektirmedi.
1. Osteokondral eksplant hasadı
- Eksplant hasadından önce aşağıdaki malzemeleri bir otoklav kullanarak sterilize edin: Fosfat tamponlu salin (PBS; eklem başına yaklaşık 1 L), Karot matkap ucu, Su döner adaptörü, bir otoklavlanabilir yıkama şişesi, bir neşter sapı, iki forseps ve bir otopsi testere bıçağı.
- PBS'yi içerecek şekilde bir leğenin içine matkap presi ve mengene ile doku kültürü başlığı kurun. Karot ma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Osteokondral eksplantlara mekanik darbe yükü, doku üzerinde 4.0 cm, 4.5 cm ve 5.0 cm taşıma yüksekliğine sahip bir damla kulesi kullanılarak uygulandı (n = 3 veya 4). Taşıyıcının serbest bırakılmadan önce yüksekliğinin arttırılması, daha yüksek darbe kuvvetleri, ortalama tepe gerilmeleri, yükleme oranları ve darbe enerjileri ile sonuçlandı (Tablo 1).
Darbeden sonra 24 saat boyunca öldürücü olmayan bir ex vivo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın amacı, kondrosit hasarını takiben moleküler olayları incelemek için hücre canlılığından ödün vermeyen bir kıkırdak etki modelini karakterize etmek ve optimize etmekti ve nihai hedef, PTOA ilerlemesini önlemek için yaralı hücreleri kurtaran bir tedavi geliştirmekti. Bu amaç doğrultusunda, osteokondral çekirdeklerin kemik kısmına mekanik bir yük verildi ve bu yük kıkırdak dokusuna aktarıldı. Ayrıca, farklı darbe yüksekliklerini, farklı tutucu plakaların çarpma sırasındaki etk.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH NIAMS Grant R21 AR080255 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye işleme ve imalat konusundaki uzmanlığını sağladığı için Kevin Carr'a teşekkür eder. Yazarlar, bu çalışma için doku sağladığı için Mooresville Kasap Dükkanı'na (Mooresville, IN) teşekkür eder. Yazarlar, Indiana Biyolojik Mikroskopi Merkezi çekirdek tesisindeki personele konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #11 steril neşter bıçağı | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Kıkırdağı kemikten çıkarın |
| #22 steril neşter bıçağı | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Sığır dokularından cildi çıkarın ve bağları keserek eklemi açın |
| 10-1000 ul pipet ucu | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Ölçün ve aktarın PBS, kültür ortamı ve diğer çözümler |
| 200 geçirmez etanol | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Cerrahi aletleri dezenfekte etmek ve doku hazırlama ve işleme sırasında steril bir ortam sağlamak için sterilizasyon maddesi olarak% 70 etanol hazırlamak için kullanılır. |
| 50 mL santrifüj tüpü (steril) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Medya ve numuneleri saklamak için kullanılır |
| 5 galonluk damacana | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Döner adaptöre hortumla bağlanan steril PBS kabı. |
| 6 kuyulu plaka (steril) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Osteokondral çekirdekleri toplama, darbe çalışmaları öncesi inkübasyon ve görüntüleme sırasında önceden ısıtılmış ortamla steril bir ortamda geçici olarak saklamak için kullanılır |
| İvmeölçer | Kistler | 8743A5 | Bir darbe sırasında üretilen ivmeyi ölçmek için kullanılır |
| Apoptoz boyama kiti (CellEvent) | Thermo Fisher Scientific | C10423 | Apoptotik hücreleri tespit etmek ve görselleştirmek için kullanılır |
| Otoklavlanabilir yıkama şişeleri | Nalgene | 2405-0500 | Doku toplama sırasında kıkırdağı nemlendirmek için steril PBS ile doldurun. |
| Otopsi testeresi | Mopec | BD 810 | Eklemi açtıktan veya osteokondral çekirdeği çıkardıktan sonra fazla kemiği çıkarın |
| Otopsi testere bıçağı | Mopec | BD 101 | Osteokondral eksplantları izole etmek ve serbest bırakmak için kemiği kesmek için kullanılır. |
| Betadine | Avrio Sağlık L.P. | n/a | Sığır numunelerinin dış kısımlarının davlumbaza taşınmadan önce dezenfekte edilmesi için kullanılır ve son osteokondral numunelerin dezenfekte edilmesi için seyreltilir. |
| Şeffaf 4 ft hortum | n/a | n/a | PBS içeren 5 litrelik damacanayı PBS'yi taşımak için matkap presinin döner adaptörüne bağlamak için kullanılır. |
| Karot matkap ucu & nbsp; | UKAM Endüstriyel Süper Sert Aletler | 3EDCD7160 | Eklem kıkırdağı ve subkondral kemiği delerek osteokondral eksplantları kemikten çıkarmak için kullanılır.- Matkap ucunun çapı: 7/16 "(Elektroliz Elmas Karot Matkaplar) |
| Hilal anahtarı | McMaster Carr | 5362A1 | Kelepçeyi (eklemi yerinde tutan) sıkmak ve karot matkap ucunu sıkmak için kullanılır |
| Tek kullanımlık serolojik pipetler | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | PBS ve kültür ortamını ölçün ve aktarın |
| Tek kullanımlık alt ped | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Daha fazla rahatlık ve hijyen için hasat sırasında su ve sıvıları emmek için karşı alanı kaplamak için kullanılır |
| Tek kullanımlık vakum filtre üniteleri | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filtre PBS ve diğer çözümler |
| Matkap presi | WEN | 433TV 3.25-İnç | Osteokondral numuneleri delmek için kuvvet uygulayın- WEN 433TV 3.25-İnç Endüstriyel Mukavemet Tezgah |
| Üstü Matkap pres eğme açısı mengenesi | WEN | TV434 | Karot alma işlemi sırasında osteokondral numuneleri istenen açıda sabit bir konumda sabitler. |
| Damla kulesi | özel yapım | n/a | Numuneleri etkilemek için kullanılır |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a | Hücre canlılığı ve apoptoz nicelemesi dahil olmak üzere mikroskopi görüntülerini işlemek ve analiz etmek için kullanılan yazılım |
| Forseps | Fisherbrand | 12-000-163 | Başlıkta doku kesmek, eklemi açmak ve numuneleri aktarmak için kullanılır |
| Gazlı bez (steril) | Dukal | 6412 | Eklem kapsülünü açtıktan sonra eklem kıkırdağını nemlendirmek için kullanılır |
| Cam 1 litrelik medya şişesi | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | Steril PBS saklamak için kullanılır; |
| Eldivenler | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Toplama ekibini korumak için kullanılır |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS) | Gibco | 41400-045 | Medya eki |
| LabVIEW veri toplama yazılımı | National Instruments | n/a | Sonraki analiz için darbe testi sırasında yük hücresinden ve ivmeölçerden veri yakalar. |
| L-askorbik asit | Merck | A4403 | Medya takviyesi |
| Lazer konfokal tarama mikroskobu | Olympus | FV1000D | Lekeli doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülerini yakalamak için kullanılır. |
| Canlı ve ölü tahlil boyama kiti | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Hücre canlılığını değerlendirmek için doku örneklerinde canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kullanılır |
| Yük hücresi | Kistler | 9712B5000 | Bir çarpma sırasında uygulanan kuvveti ölçmek için kullanılır. |
| MATLAB | MathWorks Inc. | n/a | |
| Et şerit testere | Skymsen | MSKLE | Sığır örneklerinden karpal toynağı çıkarın |
| Mikropipet 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Ölçme ve aktarma PBS ve kültür ortamı |
| Minimal esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asit çözeltisi | Gibco | 11140-050 | Medya takviyesi |
| Modifiye Eagle' s Orta (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Osteokondral eksplant kültürü. |
| Penisilin-Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Medya takviyesi |
| Fosfat tamponlu salin | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Fizyolojik koşulları korumak, dehidrasyonu önlemek ve lekelenme solüsyonları hazırlamak için dokuları durulamak, nemlendirmek ve soğutmak için kullanılır |
| Düşme kulesinde numune tutucu | özel yapım | n/a | Çarpma sırasında osteokondral çekirdeği sabitler. |
| Neşter sapı | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Hassas kesim, doku diseksiyonu ve eklemin açılması için kullanılır. |
| Vidalar (cad'ye ekleyin) | 6-32 diş Boyut-18-8 Paslanmaz Çelik Soket Başlı Vidalar | ||
| Sodyum piruvat | Gibco | 11360-070 | Medya takviyesi |
| Küresel çarpma kafası | McMaster Carr | 9292K52 | Darbe prosedürü öncesi otoklav |
| Cerrahi maskeler | Filtre | maskesi 375101 | Toplama ekibini korumak için kullanılır |
| Su döner adaptörü | UKAM Endüstriyel Süper Sert Aletler | 7035812 | Delme işlemi sırasında soğutma için sürekli bir PBS akışı sağlamak üzere karot matkap ucuna bağlanır. |
Kaynaklar
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
- Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
