Mekanik kıkırdak aşırı yüklenmesine kondrosit yaralanması yanıtını daha iyi anlamak için protokol, 24 saat boyunca subletal olan bir ex vivo kıkırdak etki modelinin geliştirilmesini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro Sığır Kıkırdak Eksplantlarında Subletal Kondrosit Hasarı Oluşturmak için Etki Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Travma Sonrası Osteoartrit (PTOA), tipik olarak 6 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen önemli eklem travmasından sonra ortaya çıkan yaygın, dejeneratif ve ağrılı ilerleyici bir eklem hastalığıdır. Darbeye bağlı kıkırdak travması, PTOA ile sonuçlanan bir kondrosit yaralanması yanıtı ile sonuçlanır. Kondrosit hasarı ile ilişkili moleküler olayların anlaşılması, PTOA'yı önlemek veya ilerlemesini yavaşlatmak için tedaviler geliştirmek için gereklidir. Bunu kolaylaştırmak için, 24 saat boyunca öldürücü olmayan bir ex vivo kıkırdak darbe modeli geliştirilmiştir. Osteokondral eksplantlar, sığır metakarpofalangeal eklemlerinden hasat edildi ve eksplantlara darbe yüklerini iletmek için bir damla kulesi kullanıldı. Stres ve etkinin eklem kıkırdağına nispeten homojen bir şekilde uygulanmasını sağlamak için, eksplantlar kemik yüzeyi yukarı bakacak şekilde konumlandırıldı ve kemik yukarıdan etkilendi. Eksplantlara 4.0 cm, 4.5 cm ve 5.0 cm taşıma yüksekliklerinden farklı yükler uygulandı, bu da sırasıyla 10.87 ± 1.84 MPa, 11.69 ± 0.67 MPa ve 12.98 ± 0.75 MPa'lık ortalama tepe gerilmeleri ile sonuçlandı. Çalışma, darbe sonrası kültür sırasında kıkırdakta subkondral kemik varlığının rolünü ve etki sırasında takılı veya gevşek bir tutucu kullanmanın etkisini, hücre canlılığını ve apoptozu değerlendirerek analiz etti. 4,5 cm'den etkilenen eklem kıkırdağı, takılı bir tutucu ve hemen kemik çıkarılması ile birlikte, darbeden 24 saat sonra minimum hücre ölümü ile kıkırdak yaralanmasını indüklemek için en uygun modeli sağladı.
Giriş
Travma sonrası osteoartrit (PTOA), Amerika Birleşik Devletleri'nde 5 milyondan fazla yetişkini etkileyen zayıflatıcı bir hastalıktır1. Kıkırdağa tek bir travmatik etki, kondrosit yaralanması yanıtını tetikleyerek erken başlangıçlı semptomlara ve eklem ağrısı ve disfonksiyonu ile ömür boyu sürecek bir mücadeleye yol açabilir2. Kıkırdağın içsel onarım kabiliyeti çok azdır veya hiç yoktur ve bu nedenle, hastalığın ilerlemesini değiştirmek için tedaviler geliştirmeye yönelik doldurulmamış bir ihtiyaç vardır3. PTOA, açıkça tanımlanmış tek bir travmatik olayla ilişkili olduğundan, hastalık ilerlemeden önce müdahale etme fırsatı vardır. Bununla birlikte, bu tedavilerin geliştirilmesi, kondrosit yaralanma yanıtını düzenleyen ve travma sonrası osteoartriteyol açan moleküler sinyalizasyon hakkındaki bilgi boşluğu nedeniyle engellenmektedir 2,3,4. Kondrosit hasarını takiben moleküler olayların daha iyi anlaşılması, kondrosit hasarı yanıtını kurtaran ve PTOA 2,5,6 gelişimini önleyen veya geciktiren yeni terapötik tedavilerin tasarlanmasına yardımcı olabilir.
Kondrosit hasarının moleküler sinyalizasyonunu daha iyi anlamak için, önceki araştırmalar, kıkırdak eksplantlarını mekanik olarak etkileyen damla kuleleri veya benzer cihazlar kullanmıştır, böylece bir yaralanma yanıtı başlatılır. Bu çalışmalar, mekanik özelliklerdeki ve yapıdaki 7,8, matris hasarı ve sentezi 6,9,10,11, mitokondriyal disfonksiyon 12,13,14,15, iyon taşıma yolları 16,17,18 dahil olmak üzere bu yanıtın birçok yönünü karakterize etmeye çalışmıştır.19 ve gen ifadesi 9,11,20,21,22,23. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğunda, hücre canlılığı ya rapor edilmemiştir ya da tehlikeye girmiştir, bazı çalışmalarda %50 veya daha düşük hücre canlılığı ile 24,25,26. Düşük hücre canlılığının kafa karıştırıcı etkileri, yaralanma yanıtının incelenmesini zorlaştırabilir. Eklem travmasını hemen takip eden kondrosit ölümü geri döndürülemez, ancak kondrosit hasarını tedavi eden tedaviler sonraki PTOA27'yi hafifletir. Kondrosit hasarı ile ilişkili moleküler değişiklikleri tanımlamak ve canlı hücrelerin kaybını önlemek için, kondrosit canlılığını bir süre koruyan bir kıkırdak etki modeli gereklidir. Ek olarak, kıkırdak dokusu boyunca nispeten homojen olan bir kondrosit yaralanma yanıtı oluşturan bir kıkırdak etkisi, hücre davranışını analiz etmede en tutarlı sonuçları sağlayacaktır.
Çalışmanın amacı, akut kıkırdak yaralanması yanıtına özgü sinyal yollarını inceleme yeteneğini koruyan eklem kıkırdağı için uygun maliyetli bir ex vivo darbe yaralanması modeli geliştirmek ve karakterize etmekti. Ek olarak, böyle bir model, yaralanma yanıtını kurtarmak için potansiyel tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir. Bunu başarmak için, önce bir matkap presine monte edilmiş elmas uçlu bir karot ucu kullanarak, iskelet olarak olgun hayvanlardan sığır metakarpofalangeal eklemlerinden kıkırdak eksplantlarını hasat etmek için steril bir teknik geliştirdik. Metakarpofalangeal eklemler, hayvanlar gıda tüketimi için işlendiğinde mezbaha tarafından atılır ve bu eklemi kolay erişilebilir ve ucuz bir doku kaynağı haline getirir. Daha sonra, osteokondral numunenin bir düşme kulesi cihazının altındaki bir tutucuya yerleştirildiği bir darbe yaralanması modeli oluşturduk. Bu modelde, osteokondral örnekler, eklem yüzeyi aşağı bakacak şekilde # 8 ayna cilalı paslanmaz çelik bir yüzeye yerleştirildi ve kemik, kıkırdak dokusuna nispeten düzgün bir yük vererek yukarıdan bir darbeye maruz bırakıldı. Çarpma sonrası 24 saat boyunca kondrosit canlılığını korurken hala apoptotik moleküler yaralanma yanıtını tetikleyen etki parametreleri belirlendi. Çarpma sırasında numunenin farklı miktarlarda yanal hareketine izin veren tutucular, hücre canlılığı ve apoptoz üzerindeki etkileri açısından değerlendirildi; Son olarak, çarpma sonrası subkondral kemikten kıkırdak çıkarılmasının etkisi değerlendirildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yerel bir mezbahadan elde edilen sığır uzuvlarının kullanımı, dokular gıda tüketimi için işlenen hayvanlardan ölüm sonrası toplandığı için etik onay gerektirmedi.
1. Osteokondral eksplant hasadı
- Eksplant hasadından önce aşağıdaki malzemeleri bir otoklav kullanarak sterilize edin: Fosfat tamponlu salin (PBS; eklem başına yaklaşık 1 L), Karot matkap ucu, Su döner adaptörü, bir otoklavlanabilir yıkama şişesi, bir neşter sapı, iki forseps ve bir otopsi testere bıçağı.
- PBS'yi içerecek şekilde bir leğenin içine matkap presi ve mengene ile doku kültürü başlığı kurun. Karot matkap ucunu ve döner adaptörü matkap presine monte edin ve döner adaptör memesini bir hortumla sterilize edilmiş PBS ile doldurulmuş bir damacanaya bağlayın. Otopsi testeresini monte edin ve davlumbazın içine yerleştirin (Şekil 1A-B).
- Tek kullanımlık alt pedleri, her eklem için bir tane olmak üzere doku kültürü başlığında bir yığın halinde yayın.
NOT: Alt pedler, eklemi açarken damlayabilecek PBS ve sinovyal sıvıyı emer. Birkaç alt pedin istiflenmesi, çok ıslandığında üst tabakanın kolayca çıkarılmasını sağlar ve prosedür boyunca temiz ve kuru bir çalışma alanı sağlar. - PBS'de %70 etanol içeren bir adet 50 mL test tüpü ve %0.13 v/v betadin içeren başka bir 50 mL test tüpü hazırlayın ve bunları davlumbazın içine yerleştirin. Doku işleme sırasında steriliteyi korumak için forseps ve neşter sapını etanol test tüpüne yerleştirin ve davlumbazın arkasına steril bir 6 oyuklu hücre kültürü plakası yerleştirin.
- Beklenen numune başına 3 mL hücre kültürü ortamı hazırlayın. Kültür ortamı, 0.9 mM sodyum piruvat, insülin, transferrin ve selenyum (ITS), 50 mg / mL L-askorbik asit, minimal esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B içeren Modifiye Eagle's Medium'dan (DMEM) oluşur. Kullanım gününde L-askorbik asit ve ITS ekleyin28.
- Kurban edildikten sonraki 6 saat içinde yerel bir mezbahadan iskelet olarak olgunlaşmış hayvanlardan sığır ön ayakları elde edin. Taşıma sırasında dokuyu buz üzerinde tutun.
- Eklem kapsülünü açmadan bir et şeridi testeresi kullanarak tırnağı çıkararak metakarpofalangeal eklemi izole edin. Eklem kapsülünü delmeden # 22 neşter bıçaklarını kullanarak cildi çıkarın.
- Kiri temizlemek için biyogüvenlik kabininin dışındaki her bir bacağı soğuk suyla iyice durulayın ve dezenfekte etmek için betadin ile kaplayın.
- Doku kültürü başlığının içinde, yeni bir # 22 neşter bıçağı kullanarak eklem kapsülünü açın. Distal eklemi izole edin ve eklem kıkırdağını bir yıkama şişesinden PBS ile nemlendirin (Şekil 1C). Hidrasyonu korumak için eklem kıkırdağını PBS ile ıslatılmış steril gazlı bezle örtün.
- Otopsi testeresi ile metatarsı keserek distal metakarpofalangeal eklemi daha da izole edin (Şekil 1D). Distal eklemi, kapalı kıkırdak yukarı bakacak şekilde mengeneye yerleştirin ve sabitlenene kadar sıkın. Tüm süreç boyunca, kıkırdak üzerindeki gazlı bezi PBS ile düzenli olarak nemlendirin.
- Gazlı bezi bir kondilden uzağa katlayın ve mengenenin konumunu, karot ucu eklem yüzeyinin en düz bölgesinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın (Şekil 1E).
- PBS'nin karot ucundan akmasına izin vermek için damacana vanayı açın. Dokuyu PBS ile sürekli olarak nemlendirmek ve delme sırasında numuneleri soğutmak için bir yıkama şişesi kullanın.
NOT: Damacana ve yıkama şişesinden gelen PBS, karot alma işlemi sırasında soğutma etkisine sahiptir. - Matkap ucunu kondilin yüzeyine bastırarak kondilin içine yavaşça girin. Basıncı sık sık boşaltın ve ısının dağılmasına izin verin. Karot derinliği subkondral kemiğe yaklaşık 2 mm olana kadar devam edin. Her iki taraf için tekrarlayın (Şekil 1E).
NOT: Aşırı ısınma belirtileri arasında hızlı sıvı buharlaşması veya yanık kokusu bulunur. - Kemiği eklem kıkırdak yüzeyine paralel olarak keserek osteokondral çekirdekleri serbest bırakmak için otopsi testeresini kullanın, keserken PBS'yi yıkama şişesinden otopsi testeresi ve osteokondral kemiğin arayüzüne sıkmaya devam edin. Bu adım sırasında, dehidrasyonu önlemek için nemli gazlı bezi eklem kıkırdağının yüzeyinde tutun.
- Osteokondral çekirdekleri (Şekil 1F) tüm eklemler işlenene kadar seyreltik betadin solüsyonunda (bkz. adım 1.3) saklayın.
- Osteokondral çekirdekleri PBS'de durulayın ve numuneleri, 3 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı (0.9 mM sodyum piruvat, insülin-transferrin-selenyum (ITS), 50 mg / mL L-askorbik asit, esansiyel olmayan amino asitler, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B) içeren steril 6 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın 28. Numuneleri 37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde ertesi günkü darbe prosedürüne kadar saklayın.
2. Osteokondral eksplant etkisi
- Ayna cilalı darbe yüzeyine sahip paslanmaz çelik darbe tutucu imal edin (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2) ve düşme kulesi taban plakasında ilgili delikler açın (Ek Şekil 3).
- Darbe prosedüründen önce aşağıdaki malzemeleri bir otoklav kullanarak sterilize edin: 15 mm çapında paslanmaz çelik küresel çarpma kafası, ayna cilalı darbe yüzeyli paslanmaz çelik tutucu, 4 6/32 vida, 4 rondela, forseps.
- Daha önce tasarlanmış ve üretilmişbir düşme kulesini 29 bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Bu çalışma için toplam taşıma kütlesi 15 g olan, bir yük hücresi ve ivmeölçer (Şekil 2A) ile donatılmış bir taşıyıcıya monte edilmiş 358.4 mm çapında küresel çarpma kafasına sahip bir düşme kulesi kullanın.
- Tutucuyu dört otoklavlı vidayla düşme kulesinin taban plakasına sabitleyin (Şekil 2B). Bu çalışmada, 8,7 mm ve 9,1 mm çapında dairesel açıklıklara sahip tutucular test edilmiştir.
- Kemik yukarı bakacak şekilde düşme kulesinin çarpma kafasının altındaki tutucuya (Ek Şekil 1, Ek Şekil 2, Ek Şekil 3) bir osteokondral çekirdek yerleştirin.
NOT: Osteokondral çekirdeğin kemik yukarı bakacak ve eklem yüzeyiaşağı bakacak şekilde yerleştirilmesi 30 daha homojen yükleme için seçilmiştir. - Düşme kulesi taşıyıcısını, kemiğin üst kısmına göre istenen yüksekliğe ayarlayın. Pilot çalışmalardan yaklaşık düşme kulesi yüksekliğini belirleyin. Bu çalışmada 4.0, 4.5 ve 5.0 cm'lik yükseklikler değerlendirildi.
- Mil durdurucusunu serbest bırakarak (Şekil 1A) ve çarpma tertibatı kafasının yerçekimi ağırlığı altında numune üzerine düşmesine izin vererek düşme kulesi taşıyıcısını serbest bırakmadan hemen önce veri toplama yazılımındaki (Ek Kodlama Dosyası 2) Başlat düğmesine tıklayın. Taşıyıcıyı hemen kaldırın ve mil durdurucusuna koyun.
NOT: Çarpma sırasında, çarpma kafası ile taşıyıcı arasına yerleştirilmiş bir yük hücresinden ve ayrıca bir ivmeölçerden gelen sinyalleri kaydeden bir veri toplama modülüne bağlı veri toplama yazılımı kullanılarak veriler 100 kHz'de toplanacaktır. Çarpmadan sonra arabayı mümkün olan en kısa sürede kaldırsak da, ikinci bir darbeyi önlemek için geri tepme önleyici özelliği veya başka bir mekanizması yoktur. - Veri toplama yazılımı tarafından oluşturulan .txt dosyasını Matlab veri analizi koduyla (Ek Kodlama Dosyası 2, https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis'da da mevcuttur) aynı klasöre yerleştirin ve ham verileri filtrelemek ve etki parametrelerini hesaplamak için veri analizi kodunu çalıştırın.
NOT: Veri analiz kodu, darbe enerjisini hesaplamak için 0.563 mm'lik bir kıkırdak kalınlığı kullanır. Bu, iğne yöntemi 31 ve bir Biomomentum Mach-1 mekanik test cihazı kullanılarak ayrı bir çalışmada, beş örneğin her birinde >50 yerden alınan ortalama kıkırdak kalınlığı olarak belirlendi. Etki parametreleri daha önce açıklandığı gibi hesaplanır32. - Uygun şekilde # 11 neşter bıçağıyla kıkırdağı kemikten çıkarın. Numuneyi ortama ve nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun ve ertesi gün görüntülemeye kadar %5 CO2 ile 37 °C'de nemlendirin.
NOT: Darbeden hemen sonra veya darbeden 24 saat sonra kemikten kıkırdak çıkarmanın etkisi bu çalışmada değerlendirilmiştir.
3. Kıkırdak örneklerinde hücre canlılığının karakterizasyonu
- Gerekirse kıkırdağı kemikten çıkarın. Kıkırdak örneğini keskin bir neşter ile ikiye bölün. Birden fazla kesim yapmaktan kaçının; Pürüzsüz bir kenar sağlamak için tek bir kesi yapmayı hedefleyin.
- İlgilenilen her yarım numuneyi PBS'de 5 μM etidyum homodimer ve 2.5 μM kalsien'den oluşan bir çözeltiye daldırın. Işıktan koruyun ve canlı ölü lekelenmesini tamamlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Numuneleri PBS 2x ile durulayın ve görüntülemeye kadar numuneleri PBS'de tutun. Boyama tamamlandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede görüntü.
- Kıkırdak örneğini bir mikroskopi kabında birkaç damla PBS üzerinde dik tutun, böylece tam yarım daire mikroskobun önünden görülebilir. Ters konfokal mikroskopla görüntü yakalayın. Kendi kendine dik duramıyorsa, kıkırdağı forseps ile hafifçe bükün.
- Birlikte verilen eklentiler33 ile bir ImageJ dağıtımı olan FIJI'yi kullanarak, önce Image > Type > 8-bit'e tıklayarak görüntüyü 8 bit'e dönüştürün. Ardından, Görüntü altında eşiği ayarlayın > > Eşiğini Ayarlayın ve Uygula'yı tıklayın. Ardından, İşlem > İkili altındaki Havza işlevini gerçekleştirin ve Parçacıkları Analiz Et... Hem yeşil hem de kırmızı kanallar için analiz et'in altında. Gruplar arasında doğru karşılaştırmalar yapmak için her örnek için tutarlı bir z yüksekliğinde yakalanan görüntüleri analiz edin.
- Canlı hücre sayısını örnekteki toplam hücre sayısına bölerek hücre canlılığını hesaplayın.
4. Kıkırdak örneklerinde apoptozun karakterizasyonu
- İlgilenilen her yarım numuneyi PBS'de 8 μM Kaspaz-3/7 Yeşil Tespit Reaktifine batırın. Işıktan koruyun ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Numuneleri PBS 3x ile yıkayın. Lekeli numuneleri %4 paraformaldehit (PFA) içinde 15 dakika inkübe ederek sabitleyin. Tekrar PBS ile yıkayın ve görüntüye kadar PBS'de saklayın. Lekelenmeden sonraki 24 saat içinde görüntü.
- Konfokal mikroskop ile görüntü (yukarıdaki adım 3.4'e bakın). Gruplar arasında floresan yoğunluğunun geçerli karşılaştırmaları için, objektif lens, uyarma lazer gücü, fotoçoğaltıcı tüp dedektörü kazancı, iğne deliği boyutu, optik dilim kalınlığı, tarama hızı, çizgi ortalaması ve görüntü çözünürlüğü dahil olmak üzere tüm numuneler için tutarlı görüntüleme parametrelerini koruyun.
- ImageJ'nin FIJI uzantısını kullanarak Analiz Et > Ölçümleri Ayarla... menüsü altında Ortalama gri değer'i seçin.
- Bir görüntüde gösterilen örneğin tüm alanının ana hatlarını çizmek için Çokgen Kesit Aracı'nı kullanın. Analiz menüsü altındaki Ölçüm işlevini gerçekleştirin ve gruplar arasında aynı işleme parametrelerini kullanarak ortalama gri değeri kaydedin.
- Görüntünün örneği içermeyen bir alanını seçmek için Çokgen Kesit aracını kullanın ve Ölçü işlevini yeniden gerçekleştirin. Bunu arka plan ortalama gri değeri olarak kaydedin.
- Numune ortalama gri değerinden arka plan ortalama gri değerini çıkararak floresan yoğunluğunu hesaplayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Osteokondral eksplantlara mekanik darbe yükü, doku üzerinde 4.0 cm, 4.5 cm ve 5.0 cm taşıma yüksekliğine sahip bir damla kulesi kullanılarak uygulandı (n = 3 veya 4). Taşıyıcının serbest bırakılmadan önce yüksekliğinin arttırılması, daha yüksek darbe kuvvetleri, ortalama tepe gerilmeleri, yükleme oranları ve darbe enerjileri ile sonuçlandı (Tablo 1).
Darbeden sonra 24 saat boyunca öldürücü olmayan bir ex vivo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın amacı, kondrosit hasarını takiben moleküler olayları incelemek için hücre canlılığından ödün vermeyen bir kıkırdak etki modelini karakterize etmek ve optimize etmekti ve nihai hedef, PTOA ilerlemesini önlemek için yaralı hücreleri kurtaran bir tedavi geliştirmekti. Bu amaç doğrultusunda, osteokondral çekirdeklerin kemik kısmına mekanik bir yük verildi ve bu yük kıkırdak dokusuna aktarıldı. Ayrıca, farklı darbe yüksekliklerini, farklı tutucu plakaların çarpma sırasındaki etk...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH NIAMS Grant R21 AR080255 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye işleme ve imalat konusundaki uzmanlığını sağladığı için Kevin Carr'a teşekkür eder. Yazarlar, bu çalışma için doku sağladığı için Mooresville Kasap Dükkanı'na (Mooresville, IN) teşekkür eder. Yazarlar, Indiana Biyolojik Mikroskopi Merkezi çekirdek tesisindeki personele konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #11 steril neşter bıçağı | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Kıkırdağı kemikten çıkarın |
| #22 steril neşter bıçağı | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Sığır dokularından cildi çıkarın ve bağları keserek eklemi açın |
| 10-1000 ul pipet ucu | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Ölçün ve aktarın PBS, kültür ortamı ve diğer çözümler |
| 200 geçirmez etanol | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Cerrahi aletleri dezenfekte etmek ve doku hazırlama ve işleme sırasında steril bir ortam sağlamak için sterilizasyon maddesi olarak% 70 etanol hazırlamak için kullanılır. |
| 50 mL santrifüj tüpü (steril) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Medya ve numuneleri saklamak için kullanılır |
| 5 galonluk damacana | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Döner adaptöre hortumla bağlanan steril PBS kabı. |
| 6 kuyulu plaka (steril) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Osteokondral çekirdekleri toplama, darbe çalışmaları öncesi inkübasyon ve görüntüleme sırasında önceden ısıtılmış ortamla steril bir ortamda geçici olarak saklamak için kullanılır |
| İvmeölçer | Kistler | 8743A5 | Bir darbe sırasında üretilen ivmeyi ölçmek için kullanılır |
| Apoptoz boyama kiti (CellEvent) | Thermo Fisher Scientific | C10423 | Apoptotik hücreleri tespit etmek ve görselleştirmek için kullanılır |
| Otoklavlanabilir yıkama şişeleri | Nalgene | 2405-0500 | Doku toplama sırasında kıkırdağı nemlendirmek için steril PBS ile doldurun. |
| Otopsi testeresi | Mopec | BD 810 | Eklemi açtıktan veya osteokondral çekirdeği çıkardıktan sonra fazla kemiği çıkarın |
| Otopsi testere bıçağı | Mopec | BD 101 | Osteokondral eksplantları izole etmek ve serbest bırakmak için kemiği kesmek için kullanılır. |
| Betadine | Avrio Sağlık L.P. | n/a | Sığır numunelerinin dış kısımlarının davlumbaza taşınmadan önce dezenfekte edilmesi için kullanılır ve son osteokondral numunelerin dezenfekte edilmesi için seyreltilir. |
| Şeffaf 4 ft hortum | n/a | n/a | PBS içeren 5 litrelik damacanayı PBS'yi taşımak için matkap presinin döner adaptörüne bağlamak için kullanılır. |
| Karot matkap ucu & nbsp; | UKAM Endüstriyel Süper Sert Aletler | 3EDCD7160 | Eklem kıkırdağı ve subkondral kemiği delerek osteokondral eksplantları kemikten çıkarmak için kullanılır.- Matkap ucunun çapı: 7/16 "(Elektroliz Elmas Karot Matkaplar) |
| Hilal anahtarı | McMaster Carr | 5362A1 | Kelepçeyi (eklemi yerinde tutan) sıkmak ve karot matkap ucunu sıkmak için kullanılır |
| Tek kullanımlık serolojik pipetler | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | PBS ve kültür ortamını ölçün ve aktarın |
| Tek kullanımlık alt ped | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Daha fazla rahatlık ve hijyen için hasat sırasında su ve sıvıları emmek için karşı alanı kaplamak için kullanılır |
| Tek kullanımlık vakum filtre üniteleri | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filtre PBS ve diğer çözümler |
| Matkap presi | WEN | 433TV 3.25-İnç | Osteokondral numuneleri delmek için kuvvet uygulayın- WEN 433TV 3.25-İnç Endüstriyel Mukavemet Tezgah |
| Üstü Matkap pres eğme açısı mengenesi | WEN | TV434 | Karot alma işlemi sırasında osteokondral numuneleri istenen açıda sabit bir konumda sabitler. |
| Damla kulesi | özel yapım | n/a | Numuneleri etkilemek için kullanılır |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a | Hücre canlılığı ve apoptoz nicelemesi dahil olmak üzere mikroskopi görüntülerini işlemek ve analiz etmek için kullanılan yazılım |
| Forseps | Fisherbrand | 12-000-163 | Başlıkta doku kesmek, eklemi açmak ve numuneleri aktarmak için kullanılır |
| Gazlı bez (steril) | Dukal | 6412 | Eklem kapsülünü açtıktan sonra eklem kıkırdağını nemlendirmek için kullanılır |
| Cam 1 litrelik medya şişesi | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | Steril PBS saklamak için kullanılır; |
| Eldivenler | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Toplama ekibini korumak için kullanılır |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS) | Gibco | 41400-045 | Medya eki |
| LabVIEW veri toplama yazılımı | National Instruments | n/a | Sonraki analiz için darbe testi sırasında yük hücresinden ve ivmeölçerden veri yakalar. |
| L-askorbik asit | Merck | A4403 | Medya takviyesi |
| Lazer konfokal tarama mikroskobu | Olympus | FV1000D | Lekeli doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülerini yakalamak için kullanılır. |
| Canlı ve ölü tahlil boyama kiti | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Hücre canlılığını değerlendirmek için doku örneklerinde canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kullanılır |
| Yük hücresi | Kistler | 9712B5000 | Bir çarpma sırasında uygulanan kuvveti ölçmek için kullanılır. |
| MATLAB | MathWorks Inc. | n/a | |
| Et şerit testere | Skymsen | MSKLE | Sığır örneklerinden karpal toynağı çıkarın |
| Mikropipet 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Ölçme ve aktarma PBS ve kültür ortamı |
| Minimal esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asit çözeltisi | Gibco | 11140-050 | Medya takviyesi |
| Modifiye Eagle' s Orta (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Osteokondral eksplant kültürü. |
| Penisilin-Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Medya takviyesi |
| Fosfat tamponlu salin | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Fizyolojik koşulları korumak, dehidrasyonu önlemek ve lekelenme solüsyonları hazırlamak için dokuları durulamak, nemlendirmek ve soğutmak için kullanılır |
| Düşme kulesinde numune tutucu | özel yapım | n/a | Çarpma sırasında osteokondral çekirdeği sabitler. |
| Neşter sapı | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Hassas kesim, doku diseksiyonu ve eklemin açılması için kullanılır. |
| Vidalar (cad'ye ekleyin) | 6-32 diş Boyut-18-8 Paslanmaz Çelik Soket Başlı Vidalar | ||
| Sodyum piruvat | Gibco | 11360-070 | Medya takviyesi |
| Küresel çarpma kafası | McMaster Carr | 9292K52 | Darbe prosedürü öncesi otoklav |
| Cerrahi maskeler | Filtre | maskesi 375101 | Toplama ekibini korumak için kullanılır |
| Su döner adaptörü | UKAM Endüstriyel Süper Sert Aletler | 7035812 | Delme işlemi sırasında soğutma için sürekli bir PBS akışı sağlamak üzere karot matkap ucuna bağlanır. |
Kaynaklar
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
- Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
- Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
- Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
- Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
- Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
- Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
- Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
- Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
- Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
- Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
- Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
- Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
- Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
- Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
- Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
- Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
- Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
- Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
- Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
- Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
- Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
- Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
- Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
- Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
- Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
- Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
- Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
- Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
- Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
