Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68075

⸱

23 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biocomplexity and Engineering Biology, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Futian Biomedical Innovation R&D Center, The Chinese University of Hong Kong, 3Ciechanover Institute of Precision and Regenerative Medicine, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 6Department of Computer Science and IT, University of Southern Punjab

Bu makalede

Özet

Burada, canlı HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonu ve fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, kanser hücrelerinde insülin sinyal yolları ve metabolik düzenleme hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir araçtır.

Özet

Metabolik olarak düzenlenmiş Akt aktivasyonu, insülin sinyal kaskadında kritik bir düğümdür ve diyabet ile kanser arasındaki ilişkiye dair değerli bilgiler sağlar. HepG2 hücrelerindeki Akt aktivitesini hassas bir şekilde ölçmek için, genetik olarak kodlanmış Akt'a özgü biyosensörlerle Förster Rezonans Enerji Transferini (FRET) kullanan sağlam, tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik. Bu protokol, lazer taramalı konfokal mikroskop donanımı ve yazılım konfigürasyonu için özel yönergelerin yanı sıra, FRET tabanlı biyosensörleri eksprese etmek için hücre kültürü, görüntüleme kabı hazırlığı ve HepG2 hücrelerinin transfeksiyonu için ayrıntılı adımları ana hatlarıyla belirtir. Sonuçlar, tanımlanmış bir açma eşiği olan ancak kapanma eşiği olmayan yapısal Akt aktivasyonu ile karakterize edilen geri dönüşümsüz bir anahtar sergileyen HepG2 hücrelerinde benzersiz insülin sinyalleme modellerini gösterdi. Buna karşılık, miyotüpler tersine çevrilebilir bir anahtar gösterir. HepG2 hücrelerindeki kalıcı Akt aktivasyonu, metabolik bozuklukların ve kanserin ilerlemesini anlamak için daha geniş etkilerle birlikte, hepatik hücrelerde insülin direnci ve metabolik düzensizliğin altında yatan mekanizmaları düşündürmektedir. Bu protokol, çeşitli hastalık bağlamlarında Akt ile ilgili sinyal yollarını ve hücresel davranışları keşfetmek için değerli bir çerçeve sunar.

Giriş

Diabetes mellitus, insülin direnci ve bozulmuş glukoz homeostazı ile karakterize önemli bir küresel sağlık sorunu oluşturmaktadır1. İnsülin glikoz metabolizmasında, hücre büyümesinde ve sağkalımda çok önemli bir rol oynadığından, bu hastalığın patofizyolojisini aydınlatmak için insülin sinyal yollarının kapsamlı bir şekilde anlaşılması çok önemlidir2. Çok sayıda çalışma, insülin sinyalinin çeşitli kanserleri önemli ölçüde etkilediğini, insülin direncini tümör ilerlemesine ve kötü hasta sonuçlarına bağladığını göstermiştir 3,4,5,6. Yaygın olarak kullanılan bir hepatoselüler karsinom hücre hattı olan HepG2 hücreleri, insülin direncini ve metabolik düzensizlik ile kanser gelişimi arasındaki etkileşimi incelemek için değerli bir model görevi görür7. Geleneksel olarak, araştırmacılar insülin tepkilerini dereceli olarak görmüşlerdir; Bununla birlikte, son çalışmalar, tek tek hücrelerin, spesifik insülin konsantrasyon eşiklerindemeydana gelen yanıtsızlık ve tam yanıt arasında belirgin geçişler sergileyen iki durumlu yanıtlar sergileyebileceğini ortaya koymuştur 8,9.

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, canlı hücrelerdeki biyomoleküllerin uzaysal-zamansal dağılımını incelemek için güçlü bir araçtır10. FRET, moleküler dinamiklerden bilgi çıkararak, gerçek zamanlı olarak Akt aktivasyonu gibi süreçler hakkında bilgi sağlar ve bu da onu canlı hücreleri incelemek için paha biçilmez bir teknik haline getirir11,12. Bu görüntüleme yönteminin, özellikle kesin moleküler etkileşimlerin çok önemli olduğu metabolik hastalıklar ve kanserde hücresel dinamiklerin incelenmesinde gerekli olduğu kanıtlanmıştır13. FRET ayrıca moleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayarak insülin direnci ve tümör ilerlemesi gibi mekanizmalara ışık tutar14,15. FRET biyosensörleri, tümör mikro ortamlarını, ilaç direncini ve metabolik bozuklukları incelemek için kanser araştırmalarında çok önemlidir16. Hassaslaştırılmış emisyon (SE), alıcı ağartma (AB), floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ve spektroskopi gibi FRET algılama yöntemlerinin her biri moleküler etkileşimleri ölçmek için belirgin avantajlar sunar17. SE, verici ve alıcı floroforlar arasındaki enerji transferini ölçerek, etkileşen biyomoleküllerin18 yakınlığı ile ilişkili emisyon spektrumlarında ölçülebilir bir kayma ile sonuçlanır. AB, alıcı floroforun seçici fotoağartmasını kullanır ve donör floresansındaki değişiklikleri izler, bu da araştırmacıların etkileşim kinetiğini ve mesafelerini19 değerlendirmesine olanak tanır. FLIM, moleküler etkileşimlerin20 hassas nano ölçekli ölçümlerini sağlamak için FRET verimliliğinden doğrudan etkilenen donör floroforun floresan bozunma oranlarını değerlendirir.

FRET tekniklerini kullanarak, yakın zamanda C2C12 türevi miyotüplerde 8,9,21,22,23,24 bistabil insülin yanıtları gösterdik. Keşfettiğimiz gibi, Akt aktivasyonu için farklı açma ve kapama eşikleri, kademeli tüm vücut insülin doz yanıtının, insülin uyaranından başlayarak hücre altı sinyal kaskadının karmaşıklığını yalanladığını ve bu da tek hücre düzeyinde ya hep ya hiç yanıtı ile sonuçlandığını göstermektedir 21,22,23,24. Diğer hücre tiplerinde bistabilitenin varlığını test etmek için, HepG2 hücrelerini insülin ile uyardık ve yanıtlarını tek hücreli FRET görüntüleme kullanarak kaydettik. HepG2 hücrelerini değişen insülin konsantrasyonları ile uyardık ve bir Akt biyosensörü kullanarak tek hücre düzeyinde Akt aktivitesini izledik. Akt biyosensörü, donör florofor olarak gelişmiş camgöbeği floresan proteini (ECFP)25 ve alıcı florofor olarak sarı floresan proteinin (YPet) en parlak varyantını içerir.26, peptit dizisi SGRPRTTTFADSCKP içeren bir Eevee bağlayıcı ile bağlanır. Bu peptit, insan glikojen sentaz kinaz 3β'dan (GSK3β) optimize edilmiş fosforile Akt (pAkt) için bir substrat görevi görür. Fosforile edilmemiş durumda, verici ve alıcı floroforlar arasındaki uzamsal ayrım, enerji transferini engelleyen Förster yarıçapını aşıyor. İnsülin stimülasyonu üzerine, Akt fosforilasyonu meydana gelir ve SGRPRTTTFADSCKP'nin fosforilasyonuna yol açar. Bu süreç, vericiyi ve alıcıyı Förster yarıçapı içine getiren ve FRET27'yi mümkün kılan konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Sonuç olarak, FRET sinyal yoğunluğu, fosforile Akt moleküllerinin miktarı ile ilişkilidir ve insülin aracılı hücresel yanıtların gerçek zamanlı olarak ölçülmesine izin verir.

Başlangıçta C2C12'den türetilmiş miyotüplerde insülin sinyalini incelemek için geliştirilen bu protokol, HepG2 hücrelerine başarıyla uygulanmış ve farklı donanım ve yazılım platformlarında kullanılmıştır, böylece uygulanabilirliğini, uyarlanabilirliğini ve çok yönlülüğünü göstermiştir. HepG2 hücreleri, yapısal Akt aktivitesi sergiler, bu da onları karaciğere özgü insülin sinyalini ve metabolik süreçleri incelemek için ideal bir in vitro model yapar. Protokolün temel özellikleri protokol bölümünde adım adım açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tek HepG2 hücrelerinde Akt fosforilasyonunu izlemek için FRET canlı hücre görüntülemede yer alan deneysel adımlara genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Plazmid edinimi, yayılması ve saflaştırılması

NOT: Bu bölüm, tek hücreli FRET analizi için gerekli olan plazmidin elde edilmesi, çoğaltılması ve saflaştırılması için temel adımları özetlemektedir.

  1. pEevee-iAkt-NES-YPet plazmidini kullanın (Şekil 2A).
    NOT: Plazmid, Japonya'daki Ulusal Temel Biyoloji Enstitüsü'nden (NIBB) Prof. Kazuhiro Aoki tarafından cömertçe sağlanmıştır.Akt izleme için kullanılan FRET biyosensörleri ve ilgili kontrolleri için plazmid haritaları Şekil 2'de gösterilmektedir. pEevee-iAkt-NES-ECFP (bağışçı; Şekil 2B) ve pEevee-iAkt-NES-Ypet (alıcı; Şekil 2C) Plazmitler, FRET deneyleri9 sırasında kalibrasyon kontrolleri olarak kullanılır.
    NOT: Şekil 3 , molekül içi FRET biyosensörünün bileşimini ve mekanizmasını göstermektedir.
  2. Plazmidi çoğaltmak için, kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleri kullanarak bakteriyel transformasyon gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Dönüştürülmüş hücreleri 100 μg / mL ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, ampisiline dirençli bir koloni seçin ve plazmid amplifikasyonu için 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş LB suyunda kültürleyin.
  3. Plazmit DNA'yı saflaştırmak için, yüksek saflık ve verim elde etmek için ticari olarak temin edilebilen bir plazmit DNA saflaştırma kiti ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Bir spektrofotometre kullanarak absorbans oranlarını (A260 / A280 ve A260 / A230) ölçerek DNA kalitesini değerlendirin (bkz. 1.8-2.0 ve 2.0-2.2 arasındaki oranlar optimal olarak kabul edilir. Transfeksiyon için uygun olduğundan emin olmak için agaroz jel elektroforezi yoluyla plazmit bütünlüğünü doğrulayın.

2. Hücre kültürü prosedürü

NOT: Steril bir ortam sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için tüm hücre kültürü prosedürlerini bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirin. HepG2 hücre kültürü iş akışı Şekil 4'te gösterilmiştir. HepG2 hücreleri için komple besiyeri, Minimum Esansiyel Besiyeri (MEM), fetal sığır serumu (FBS), %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA), 1 mM Sodyum Piruvat, 2 mM L-glutamin takviyesi, 100 U/mL Penisilin-Streptomisin ve 2.5 μg/mL antibiyotik-antimikotik solüsyondan oluşur (bkz. Malzeme Tablosu, Tablo 1).

  1. Dondurulmuş HepG2 hücrelerini, şişeyi tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir termomikser veya su banyosuna yerleştirerek hızla çözün.
  2. Çözülmüş hücreleri, 10 mL tam büyüme ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücrelere termal şoku en aza indirmek için kullanmadan önce tüm büyüme ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
  3. Hücreleri peletlemek için tüpü 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  4. Hücre peletini rahatsız etmemek için geniş delikli bir pipet ucu kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.
  5. Peletleri 10 mL taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
  6. Hücre süspansiyonunu 75 cm²'lik bir doku kültürü şişesine aktarın.
  7. Şişeyi 37 °C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin
    NOT: Eki onaylamak ve iyileşmeyi değerlendirmek için hücreleri sonraki 24-48 saat boyunca gözlemleyin. Ortamı değiştirmeden önce düzgün bağlanmayı sağlamak için hücreleri en az 4 saat rahatsız etmeyin. İlk 4 saat boyunca inkübatörü sık sık açmaktan kaçının, çünkü bu hücre bağlanmasını bozabilir. Tüm hücre kültürü prosedürleri sırasında güvenli bir çalışma ortamı sağlamak için kurumsal biyogüvenlik protokollerini takip edin ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. HepG2 hücrelerini, optimal büyüme koşullarını korumak ve hücre canlılığını ve büyüme potansiyelini etkileyebilecek aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için p-80 birleşmeye ulaştıklarında alt kültür.
  8. Alt kültürleme için, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
  9. Hücre tek tabakasını kaplamak için 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Optimum aktivite için tripsinin 37 °C'ye önceden ısıtıldığından emin olun. Hücreleri aşırı tripsinize etmeyin, çünkü bu canlılığı azaltabilir. Ayrılmayı doğrulamak için hücreleri mikroskop altında izleyin.
  10. 37 °C'de yaklaşık 5 dakika inkübe edin.
  11. Hücreler ayrıldığında, tripsini nötralize etmek için 2 mL tam ortam ekleyin ve hücreleri pipetleme yoluyla toplayın.
  12. Topakları parçalamak ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin.
  13. Her yeni şişeye 3 mL tam ortam ekleyin, ardından hücreleri her şişeye 1:2 oranında bölünerek aktarın.
    NOT: Erken geçişler için, hücreleri 1:2 oranında seyrelterek bölün. 4-5. pasajlardan sonra, uygun şekilde 1:4 veya 1:5 oranında seyreltmeler gerçekleştirilebilir.
  14. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.
    NOT: Eki onaylamak ve kurtarmayı değerlendirmek için 24 saat sonra hücreleri kontrol edin.
  15. Rutin kültür için, pH indikatörü pembeden sarıya değişirse ve asitlenmeyi gösterirse kültür ortamını her 2-3 günde bir veya daha erken değiştirin.
    NOT: Hücrelere zarar verebileceğinden ortamın çok asidik hale gelmesine izin vermeyin.
  16. Hücre sağlığını sağlamak için hücre morfolojisini düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin.
    NOT: Kısa süreli depolama için HepG2 hücrelerini -80 °C'de dondurun; Uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklayın. Bu deneyde kullanılan dondurma ortamının bileşimi (Tablo 2)'de özetlenmiştir.

3. Görüntüleme kaplarının poli-l-lizin ile kaplanması

  1. Tüm yüzeyi kaplamak için görüntüleme kabı başına 1 mL 0.1 mg / mL Poli-L-Lizin çözeltisi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Poli-L-Lizin konsantrasyonunu belirli hücre tipi gereksinimlerine göre ayarlayın.
  2. Kültür yüzeyinin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için tabağı hafifçe sallayın.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için süreç boyunca steril koşullar sağlayın.
  3. Bulaşıkları gece boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
  4. Pipetleyerek bulaşıklardan fazla Poli-L-Lizin çözeltisini aspire edin.
  5. Yüzeyi PBS ile üç kez durulayın, her seferinde 5 dakika dinlendirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre büyümesinin inhibisyonunu önlemek için bağlanmamış Poli-L-Lizin'i görüntüleme kabından tamamen çıkarın. Cam tabanın kazınmasını veya zarar görmesini önlemek için plakaları nazikçe durulayın.
  6. Kaplanmış görüntüleme kaplarını en az 3 saat boyunca 37 °C'de havayla kurutun.
  7. Kaplanmış görüntüleme kaplarını hemen kullanın veya 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.

4. HepG2 hücrelerinin transfeksiyonu

NOT: HepG2 transfeksiyon yöntemi Şekil 5'te gösterilmiştir.

  1. HepG2 hücrelerini, transfeksiyondan 24-48 saat önce önceden kaplanmış görüntüleme kaplarına tohumlayın ve p-90 birleşmeye ulaştıklarından emin olun.
  2. FRET biyosensörünü kodlayan transfeksiyon reaktifini ve plazmidi buz üzerinde çözün. Kullanmadan önce iyice girdap yapın ve kısa bir dönüş yapın (örn. 5,000 saniye boyunca 5 x g) ( Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Kullanmadan önce transfeksiyon reaktifinin ve plazmidin tamamen çözüldüğünden emin olun.
    DİKKAT: Transfeksiyon reaktifinin verimliliğini azaltabileceğinden, tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
  3. FRET biyosensörünü reaksiyon tamponu ile kodlayan 8 μg plazmidi 100 μL'lik bir nihai hacme ekleyin. Yüksek hızda (yaklaşık 3.000-5.000 x g) 5 saniye vorteksleyerek iyice karıştırın.
    NOT: Polimer bazlı transfeksiyon reaktifini eklemeden önce daima tampona plazmit ekleyin. Çözeltinin en az 50 μL'si reaksiyon tamponundan oluşmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Seyreltilmiş plazmit DNA'sını içeren tüpe 2.4 μL transfeksiyon polimeri ekleyin. Yüksek hızda (yaklaşık 3.000-5.000 × g) 15 saniye girdap yaparak iyice karıştırın.
    NOT: Her zaman 1 μg DNA başına 0,3 μL transfeksiyon polimeri kullanın.
    DİKKAT: Tek tip nanopartikül kompleksleri oluşturmak için transfeksiyon polimerinin plazmit DNA ile iyice karıştırıldığından emin olun.
  5. Nanopartikül komplekslerinin oluşmasına izin vermek için biyosensör ve polimer karışımını 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Transfeksiyon polimerini 30 dakikadan fazla çözelti içinde tutmaktan kaçının, çünkü bu transfeksiyon verimliliğini azaltabilir.
    DİKKAT: Transfeksiyon verimliliğinin azalmasına neden olabilecek aşırı inkübasyonu önlemek için inkübasyon süresini dikkatlice izleyin.
  6. Alttaki içeriği toplamak için tüpü 5.000 x g'da 5 saniye boyunca döndürün, ardından 100 μL nanopartikül kompleks çözeltisinin tamamını hücre kültürü ortamına damla damla ekleyin. Karıştırmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın.
    NOT: Nanopartikül kompleks çözeltisinin, hücre kültürü ortamına eşit olarak dağıtmak için damla damla eklendiğinden emin olun.
    DİKKAT: Hücreleri yerinden oynatabileceğinden veya komplekslerin eşit olmayan dağılımına neden olabileceğinden, kuvvetli sallanmaktan kaçının.
  7. Plakayı 37 ° C'de 4 saat ila gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir, ancak verimli transfeksiyon için tipik olarak 4 saat yeterlidir.
    DİKKAT: Uzun süreli inkübasyondan (>16 saat) kaçının, çünkü bu hücre canlılığını azaltabilir.
  8. Nanopartikül komplekslerini aspirasyon ile hücrelerden çıkarın, bunları 2 mL taze tam büyüme ortamı ile değiştirin ve plakayı analiz zamanına kadar 37 ° C inkübatöre geri koyun. En yüksek ekspresyon tipik olarak transfeksiyondan 48 saat sonra ulaşır.
  9. Hücreleri floresan mikroskobu altında analiz edin.
    NOT: Doğru sonuçlar elde etmek için mikroskobun floresan görüntüleme için uygun şekilde kalibre edildiğinden emin olun.
    DİKKAT: Fototoksisiteyi önlemek için görüntüleme sırasında hücrelerin yoğun ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

5. HepG2 hücrelerinin açlıktan ölmesi

NOT: Transfeksiyon adımını tamamladıktan sonra, insülin stimülasyonu ve FRET görüntülemeden önce hücreleri serumdan aç bırakın. Bu, FBS'de bulunan insüline bağlı Akt yolu aktivasyonunu en aza indirir ve tutarlı temel Akt aktivitesi seviyeleri sağlar. Bu deneyde kullanılan açlık ortamının bileşimi (Tablo 3)'te açıklanmıştır. BSA toz halinde gelir. % 0.1 (a / h) bir çözelti hazırlamak için, iyice karıştırarak 3 mL DMEM içinde 0.1 g BSA'yı sulandırın. Solüsyonu 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve DMEM ekleyerek son hacmi 100 mL'ye ayarlayın.

  1. Kültür ortamını çıkarın ve görüntüleme kaplarını 1x PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez durulayın.
    NOT: İki PBS yıkaması, artık serumun ve deneye müdahale edebilecek herhangi bir insülin veya büyüme faktörünün tamamen çıkarılmasına yardımcı olur.
  2. Görüntüleme kaplarına 2 mL açlık ortamı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücrelerin cam tabandan çıkmasını önlemek için ortamı tabağın kenarına yavaşça ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
    NOT: 4 saatlik inkübasyon, hücresel metabolizmayı senkronize etmek için idealdir; Bununla birlikte, deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak süre uzatılabilir.

6. HepG2 hücreleri için FRET canlı hücre görüntüleme

NOT: Bu bölüm, tek HepG2 hücrelerinde Akt fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini izlemek için FRET canlı hücre görüntüleme için talimatlar sağlar. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, canlı HepG2 hücreleri için mikroskop kurulumunu, işleme prosedürlerini ve görüntüleme koşullarını optimize etmek önemlidir. Mikroskop kurulumu, FRET görüntüleme için görüntüleme koşullarını optimize etmek için çok önemlidir. Kararlı çalışmayı sağlamak için PC/konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kurulumunu üreticinin talimatlarına göre adım adım izleyin. FRET görüntüleme için özelleştirilmiş CLSM konfigürasyonu (Şekil 6)'da gösterilmiştir.

  1. Mikroskobu, bilgisayarı, tarayıcıyı, lazer başlatmayı, piezo aşamasını ve epifloresan LED ışık kaynağını çalıştırmak için uzaktan kumanda anahtarını açın. Herhangi bir olası hasarı önlemek için gücü açmadan önce tüm bileşenlerin doğru şekilde bağlandığından emin olun.
  2. Lazer başlatmada anahtarı AÇIK konuma çevirin ve FRET için gerekli olan her iki lazeri (457 nm ve 514 nm lazer çizgileri) etkinleştirmek için düğmelere basın.
    NOT: Optimum FRET görüntüleme için uygun filtrelerin ve ayarların yerinde olduğundan emin olun. Lazer çizgisi seçimi, biyosensörün uyarma ve emisyon profillerine dayanmalıdır.
  3. Mikroskoba bağlı bilgisayara ve monitöre güç sağlamak için anahtarlı uzatma kablosunu açın.
    NOT: Herhangi bir ekipman hasarını önlemek için gücü açmadan önce tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olun.
  4. Windows'ta oturum açın ve mikroskopi yazılımını başlatın.
  5. Görüntüleme kurulumunu başlatmak için Edinme için A1'e tıklayın. FRET deneyinin gereksinimlerine göre uygun optik konfigürasyonları seçin.
  6. Optimum görüntüleme koşulları için lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini gerektiği gibi ayarlayın. Mikroskop tablası üst inkübatörünü dikkatlice takın ve vidalarla sabitleyin.
    NOT: İnkübatöre veya mikroskop aşamasına zarar vermemek için vidaları aşırı sıkmayın.
  7. İç su banyosunu steril çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Üst ısıtıcıyı güvenli bir şekilde takın ve sahne ısıtıcısı, banyo ısıtıcısı ve lens ısıtıcısı için güç kaynağını açın (Şekil 7A).
    NOT: Sisteme dökülmesini önlemek için aşırı doldurmayın. Canlı hücre görüntüleme için tutarlı sıcaklık koşullarını korumak için tüm ısıtıcıların düzgün çalıştığından emin olun.
  8. Görüntüleme için 40x yağa daldırma lensini kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Teknik özellikler için üreticinin web sitesine bakın.






  1. figure-protocol-1

    figure-protocol-2

    figure-protocol-3
    figure-protocol-4

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonunu araştırmak için, hücreler önceden kaplanmış görüntüleme kaplarına ekildi ve Akt fosforilasyonunun gerçek zamanlı izlenmesini sağlamak için tasarlanmış FRET tabanlı biyosensör pEevee-iAkt-NES (Şekil 2A) ile transfekte edildi. Transfeksiyonu takiben, hücreler metabolik durumlarını senkronize etmek ve bazal insülin sinyalini en aza indirmek için serumsuz bir ortamda 4 saat boyunca serum açlığına maruz kaldılar.

Hücreler daha sonra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

HepG2 hücrelerinde Akt fosforilasyonunu izlemek için canlı hücre FRET görüntüleme protokolü, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için birkaç temel adım içerir. İlk kritik adım, rutin hücre bakımını, görüntüleme kaplarının kaplanmasını ve hücre tohumlamasını içeren hücre kültürüdür. Uygun kaplama, stabil hücre yapışması sağladığı, ayrılmayı önlediği ve tutarsız verilere yol açabilecek kaymayı en aza indirdiği için hızlandırılmış görüntüleme deneyleri sırasında hücre bağlanması ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Shenzhen Doğa Bilimleri Vakfı (JCYJ20240813113606009), Shenzhen-Hong Kong Teknoloji ve Yenilik İşbirliği Bölgesi (HZQB-KCZYB-2020056), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32070681), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2019YFA0906002) ve Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,25 tripsin-EDTAGibcoKedi#25200-056Hücre yıkama için buz gibi PBS kullanın
15 mm cam tabanlı hücre kültürü kabıYUVAKedi#801001
2  mL Nalgene kriyojenik şişelerTermo BilimselKedi#5012-0020
5 mL Stripette Serolojik PipetlerCorningKedi#4487
%95 EtanolKermelKedi#C028005
A1 HD25/A1R HD25 konfokal mikroskopNikonhttps://www.nikon.com/Büyütme: 40×, Sayısal Diyafram (NA): 1.30, Piksel Bekleme Süresi: 2.4 ms, Piksel Boyutu: 1024
AmpisilinSigma-AldrichKedi#A9393
Sığır serum albümini (BSA)VWR Yaşam BilimleriKedi#N208-10g
Corning 25  cm2 dikdörtgen kültür şişeleriCorningKedi#430639
Kontes 3 otomatik hücre sayacıTermo Bilimselhttp://www.thermofisher.com/#AMQAX2000
Kontes hücre sayma odası slaytlarıTermo Bilimselhttp://www.thermofisher.com/#C10228
Dijital vorteks karıştırıcılarTermo Bilimselhttps://www.thermofisher.com/
Dimetil sülfoksitSigma-AldrichKedi#D2650
Eppendorf Safe-Lock Tüpler 1.5  MlEppendorf BelediyesiKedi#022363204
EZ-PCR mikoplazma tespit kitiBiyolojik EndüstrilerKedi# 20-700-20
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, AvustralyaGibcoKedi#10099141
GlutaMAX TakviyesiGibcoKedi#35050061
GraphPad Prizma 9GraphPad Yazılımıhttps://www.graphpad.com/
HepG2Ulusal Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510  http://www.cellbank.org.cn/
Daldırma Yağı Tip 37Cargille LaboratuvarlarıKedi #16237
InsülinSigma-AldrichKedi#I5500-50MG37 °'e kadar sıcak; C kullanmadan önce
LB Et Suyu (1x)DavetliKedi#10855001
Minimum Temel Ortam (MEM)GibcoKedi#1109508037 °'e kadar sıcak; C kullanmadan önce
mySPIN 12  Mini SantrifüjTermo Bilimselhttps://www.thermofisher.com/
NanoDrop BirTermo Bilimselhttps://www.thermofisher.com
Nikon Plan Fluor 40×/1.30 Yağ LensiNikonhttps://www.nikon.com/
NIS-Elementler-ARNikonhttps://www.nikon.com/
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) (100x)GibcoKedi#11140050
Tek Atışlık LB Agar Plakaları DavetliKedi#A55802
One Shot Stbl3 kimyasal olarak yetkin E.  ColiDavetliKedi#C737303
ParafilmPARAFILMKedi#B8R05606
PBS (fosfat tamponlu salin)GibcoKedi#10010023
pEevee-iAkt-NES (7,033  kan basıncı)Miura et  al31https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit
Penisilin-streptomisinGibcoKedi#15070063
Plazmosin profilaktikInvivoGenKedi#ant-mpp
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-AldrichKedi#P4832
Hassas genel amaçlı banyolarTermo Bilimselhttps://www.thermofisher.com/
QIAprep spin mini hazırlık kitiQIAGENKedi#27106
SnapGeneDotmatics tarafından SnapGenehttps://www.snapgene.com
Sodyum Piruvat (100 mM)GibcoKedi#11360070
Şırınga filtre ünitesi, 0.22  μ mKırlangıçKedi#SLGP033RS
Tokai Hit sahne üstü kuluçka makinesiTOKAI VURUŞUhttps://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator
UltraPure DNase/RNase içermeyen damıtılmış suDavetliKedi#10977015
Xfect Transfeksiyon ReaktifiTakara HakkındaKedi#631317

Kaynaklar

  1. GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
  2. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  3. Poloz, Y., Stambolic, V. Obesity and cancer, a case for insulin signaling. Cell Death Dis. 6 (12), e2037(2015).
  4. Arcidiacono, B., et al. Insulin resistance and cancer risk: an overview of the pathogenetic mechanisms. Exp Diabetes Res. 2012, 789174(2012).
  5. Godsland, I. F. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer. Clin Sci (Lond). 118 (5), 315-332 (2009).
  6. Tsugane, S., Inoue, M. Insulin resistance and cancer: epidemiological evidence. Cancer Sci. 101 (5), 1073-1079 (2010).
  7. Yudhani, R. D., et al. In vitro insulin resistance model: A recent update. J Obes. 2023, 1964732(2023).
  8. Akhtar, J., et al. Bistable insulin response: The win-win solution for glycemic control. iScience. 25 (12), 105561(2022).
  9. Akhtar, J., Imran, M., Wang, G. Protocol for live-cell Forster resonance energy transfer imaging to reveal the bistable insulin response of single C2C12-derived myotubes. STAR Protoc. 5 (2), 103109(2024).
  10. Kamino, K., et al. Optimal inference of molecular interaction dynamics in FRET microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), e2211807120(2023).
  11. Kraft, A. E., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time visualization of second messengers in living cells. Methods Mol Biol. 1563, 85-90 (2017).
  12. Veeriah, S., et al. High-throughput time-resolved FRET reveals Akt/PKB activation as a poor prognostic marker in breast cancer. Cancer Res. 74 (18), 4983-4995 (2014).
  13. Conway, J. R. W., et al. Monitoring AKT activity and targeting in live tissue and disease contexts using a real-time Akt-FRET biosensor mouse. Sci Adv. 9 (17), eadf9063(2023).
  14. Chandris, P., Giannouli, C. C., Panayotou, G. Imaging approaches for the study of metabolism in real time using genetically encoded reporters. Front Cell Dev Biol. 9, 725114(2021).
  15. Yang, J., et al. Longitudinal FRET imaging of glucose and lactate dynamics and response to therapy in breast cancer cells. Mol Imaging Biol. 24 (1), 144-155 (2022).
  16. Mandrou, E., et al. A reliable system for quantitative G-protein activation imaging in cancer cells. Cells. 13 (13), 1114(2024).
  17. Fang, C., Huang, Y., Zhao, Y. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection. Am J Transl Res. 15 (2), 694-709 (2023).
  18. Miller, J. N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst. 130 (3), 265-270 (2005).
  19. Verveer, P. J., Rocks, O., Harpur, A. G., Bastiaens, P. I. Imaging protein interactions by FRET microscopy: FRET measurements by acceptor photobleaching. CSH Protoc. 2006 (6), (2006).
  20. Vu, C. Q., Arai, S. Quantitative imaging of genetically encoded fluorescence lifetime biosensors. Biosensors (Basel). 13 (10), 939(2023).
  21. Wang, G. A more holistic view of the logarithmic dose-response curve offers greater insights into insulin response. J Biol Chem. 301 (1), 108037(2025).
  22. Wang, G. Body mass dynamics is determined by the metabolic Ohm's law and adipocyte-autonomous fat mass homeostasis. iScience. 23 (6), 101176(2020).
  23. Wang, G. Raison d'être of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis. J R Soc Interface. 11 (101), 20140892(2014).
  24. Wang, G. Optimal homeostasis necessitates bistable control. J R Soc Interface. 9, 2723(2012).
  25. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  26. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  27. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nat Protoc. 8 (2), 265-281 (2013).
  28. Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B., Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74 (5), 2702-2713 (1998).
  29. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophys J. 45 (5), 939-946 (1984).
  30. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy. , US 6456734 United States Patent and Trademark Office (2002).
  31. Miura, H., Matsuda, M., Aoki, K. Development of a FRET biosensor with high specificity for Akt. Cell Struct Funct. 39 (1), 9-20 (2014).
  32. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  33. Rani, K., Sengupta, S. Multi-stimuli programmable FRET based RGB absorbing antennae towards ratiometric temperature, pH and multiple metal ion sensing. Chem Sci. 12 (47), 15533-15542 (2021).
  34. Betolngar, D. B., et al. pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Anal Bioanal Chem. 407 (14), 4183-4193 (2015).
  35. Salonikidis, P. S., et al. An ion-insensitive cAMP biosensor for long term quantitative ratiometric fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements under variable physiological conditions. J Biol Chem. 286 (26), 23419-23431 (2011).
  36. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. Biotechnol Alia. 3, 1-18 (1997).
  37. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry A. 99 (4), 407-416 (2021).
  38. Batta, A., Hajdu, T., Nagy, P. Improved estimation of the ratio of detection efficiencies of excited acceptors and donors for FRET measurements. Cytometry A. 103 (7), 563-574 (2023).
  39. Coullomb, A., et al. QuanTI-FRET: a framework for quantitative FRET measurements in living cells. Sci Rep. 10 (1), 6504(2020).
  40. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  41. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophys J. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  42. Hochreiter, B., Kunze, M., Moser, B., Schmid, J. A. Advanced FRET normalization allows quantitative analysis of protein interactions including stoichiometries and relative affinities in living cells. Sci Rep. 9 (1), 8233(2019).
  43. Liu, H., Zhang, F., Mishra, S. K., Zhou, S., Zheng, J. Knowledge-guided fuzzy logic modeling to infer cellular signaling networks from proteomic data. Sci Rep. 6, 35652(2016).
  44. Garrido-Rodriguez, M., Zirngibl, K., Ivanova, O., Lobentanzer, S., Saez-Rodriguez, J. Integrating knowledge and omics to decipher mechanisms via large-scale models of signaling networks. Mol Syst Biol. 18 (7), e11036(2022).
  45. Greenwald, E. C., Polanowska-Grabowska, R. K., Saucerman, J. J. Integrating fluorescent biosensor data using computational models. Methods Mol Biol. 1071, 227-248 (2014).
  46. Zhao, Z., Xia, J. Computational Approaches for Modeling Signal Transduction Networks. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  47. Wang, G., Krueger, G. R. Computational analysis of mTOR signaling pathway: bifurcation, carcinogenesis, and drug discovery. Anticancer Res. 30 (7), 2683-2688 (2010).
  48. Wang, G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases. Phys Biol. 7 (4), 046015(2010).
  49. Chedere, A., Hari, K., Kumar, S., Rangarajan, A., Jolly, M. K. Multi-stability and consequent phenotypic plasticity in AMPK-Akt double negative feedback loop in cancer cells. J Clin Med. 10 (3), 472(2021).
  50. Mosca, E., et al. Computational modeling of the metabolic States regulated by the kinase akt. Front Physiol. 3, 418(2012).
  51. Liao, J., Madahar, V., Dang, R., Jiang, L. Quantitative FRET (qFRET) technology for the determination of protein-protein interaction affinity in solution. Molecules. 26 (21), 6339(2021).
  52. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: Principle applications recent advances and challenges. Diagnostics (Basel). 13 (8), 1375(2023).
  53. Mattheisen, J. M., et al. Application of bioluminescence resonance energy transfer to quantitate cell-surface expression of membrane proteins. Anal Biochem. 684, 115361(2024).
  54. Lionetti, M. C., La Porta, C. A. M. FLIM-FRET investigation of heterogeneous huntingtin aggregation in HeLa cells. Methods Mol Biol. 2551, 595-604 (2023).
  55. Petutschnig, E. K., Pierdzig, L., Mittendorf, J., Niebisch, J. M., Lipka, V. A novel fluorescent protein pair facilitates FLIM-FRET analysis of plant immune receptor interaction under native conditions. J Exp Bot. 75 (3), 746-759 (2024).
  56. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Gotz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. J Vis Exp. 66, e4081(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FRET G r nt lemens lin SinyalizasyonuMetabolik D zenlemeGenetik Kodlu Biyosens rlerKonfokal MikroskopiH cre TransfeksiyonuMetabolik BozukluklarKanser Sinyalizasyonu
HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.