Yöntem makalesi

Laboratuvar ortamında Hava-sıvı arayüzünde akciğer epitel hücrelerinin esrar maruziyetleri

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68102

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

Bu makalede

Özet

Hava-sıvı arayüzünde esrar buharı maruziyetini incelemek için standartlaştırılmış bir in vitro model oluşturuyoruz. Bu model, buharlaştırılmış esrarın etkilerini incelemek için sistematik bir yaklaşım sunmakta ve sigaraya alternatif olarak kenevir buharlaştırıcılarına artan ilgiyi ele almaktadır.

Özet

Esrar, dünya çapında tahmini 192 milyon insan tarafından kullanılmaktadır. Çoğu insan, akciğer sağlığını olumsuz yönde etkileyebilecek yanma yan ürünleri içeren esrar dumanının solunması yoluyla esrar kullanır. Bu risklerin bilinmesi, kuru kenevir çiçeğini yakmadan ısıtan kenevir buharlaştırıcılarına olan ilginin artmasına neden olmuştur. Buharlaşan kenevir, soluma için hala kannabinoidleri serbest bırakır, ancak bitki materyalini daha düşük bir sıcaklıkta ısıtır. Şu anda kuru kenevir buharının etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış bir in vitro model bulunmamaktadır. Bu nedenle, hücrelerin apikal olarak buharlaşmış esrara maruz bırakıldığı ve böylece akciğer epitel hücre fizyolojisini daha doğru bir şekilde simüle ettiği bir hava-sıvı arayüzünde (ALI) akciğer hücre kültürlerinin maruz kalması için bir model oluşturduk. Bu protokol, kenevir buharının hücre yüzeyine tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde verilmesini sağlayarak, buharlaşmış kenevirin hücresel ve moleküler etkilerini araştırmak için güvenilir bir platform sağlar. Bu çalışma, gelecekteki klinik öncesi kenevir araştırmaları için bir ölçüt olarak hizmet edebilecek bir in vitro kenevir buharı dağıtım yöntemini standartlaştıran ilk çalışmadır.

Giriş

Esrar tipik olarak, ister eğlence amaçlı ister tıbbi amaçlı olsun, bitkinin çiçeğinin eklem şeklinde yakılmasından kaynaklanan dumanın solunmasıyla kullanılır. Esrarın temel biyolojik aktiviteleri, solunduğunda vücuda salınan Δ 9-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC) ve kannabidiol (CBD) gibi kanabinoidlerden kaynaklanmaktadır. Kenevir dumanı ayrıca kanserojenler, mutajenler ve teratojenler dahil olmak üzere olumsuz sağlık sonuçlarına neden olma potansiyeline sahip pirojenik bileşikler içerir1. Bu endişeler göz önüne alındığında, kenevir çiçeğini yakmadan ısıtan kenevir buharlaştırıcılarına yönelmeye ilgi vardır, bunun daha sonra solunması için kannabinoidlerin salınmasına izin vermesi, ancak yanma ürünleri olmadan yapılması umuduyla. Esrar buharının kimyasal bileşenlerini karakterize etmek için, kannabinoidlerin yanı sıra çeşitli solunum toksiklerinin varlığını gösteren, bu cihazların güvenli olduğu fikrine meydan okuyan bazı çalışmalar yapılmıştır 2,3. Buharlaşmış esrarın akciğerleri ve diğer organları nasıl etkilediğine dair bilgilerde önemli boşluklar vardır.

Hücre kültürü çalışmaları, solunan maddelerin hücresel düzeyde spesifik etkilerini izole etmek ve anlamak için toksikolojide gereklidir ve insan biyolojisi ile ilgili yüksek verimli, uygun maliyetli ve mekanik içgörüler sağlar. Hücrelerin kültürlenme yöntemi de bir in vitro deneyden elde edilen genel sonuçların önemli bir belirleyicisidir. Çoğu hücre kültürü çalışması, hücrelerin plastik üzerinde büyütüldüğü ve apikal olarak sulu ortama maruz bırakıldığı batık bir ortam kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, hava yolu epitel hücreleri bu konuda benzersiz bir zorluk teşkil etmektedir. Solunum sistemi boyunca, epitel hücrelerinin apikal yüzeyi hava ile temas halindedir. Alveoller içinde, epitel hücreleri yüzey aktif madde üretirken, diğer hava yolu epitel hücreleri mukus üretir; Toplu olarak, bu akciğer fonksiyonunu korur ve sürdürür. Batık kültürler, apikal hava maruziyetini taklit edemez ve in vivo ortamı doğru bir şekilde modelleme yeteneklerini sınırlar. Batık kültür modellerine bir alternatif, solunum epitel hücrelerinin apikal olarak havaya maruz bırakılırken bazolateral tarafta ortam bulunan kollajen kaplı bir zar üzerinde büyütüldüğü hava-sıvı arayüzünde (ALI) kültürlemedir. ALI'de kültürlenen epitel hücreleri, polarize olma, yüzey aktif madde veya mukus üretme ve bu ortamda bağlantılar oluşturma yetenekleri nedeniyle solunum epitelinin daha doğru modelleridir4.

Geleneksel batık hücre kültürü yöntemlerinin karşılaştığı ek bir husus, kannabinoidler gibi hidrofobik bileşiklerin sulu ortamda zayıf bir şekilde çözünmesidir5. Etanolik ekstraktlar, batık kültürlerde 6,7,8,9,10,11,12 hidrofobik bileşikleri incelemek için yaygın bir çözücüdür. Bu ekstraktlar, hem hidrofobik hem de hidrofilik bileşiklerin sulu bir ortamda çözülmesine izin verir. Bununla birlikte, bir sınırlama, her ikisi de biyoyararlanımı değiştirebilen bileşik aglomerasyonun yanı sıra ortamla etkileşime giren bileşikler potansiyelidir13,14. Son zamanlarda, aerosol faz bileşiklerinin, expoCube15 (ALI/Transwell in vitro/ex vivo maruz kalma sistemi) ve diğerleri gibi gelişmiş maruz kalma sistemleri kullanılarak bir çözücü veya ortamın yokluğunda hücrelere iletilmesine izin veren gelişmeler olmuştur. Gelişmiş bir maruz kalma sistemi kullanılarak aerosollerin ve partikül süspansiyonlarının doğrudan biriktirilmesi, partikül fizikokimyasal özelliklerini önemli ölçüde değiştirdiği bilinen batık maruziyetler için çok önemli olan toplama-yeniden süspansiyon sürecini ortadan kaldırır16. Burada, ALI'de bir alveoler epitel hücre hattının maruziyeti için standart bir protokol tanımlanmıştır.

Protokol

1. ALI'de akciğer epitel hücrelerinin kültürü

NOT: Burada, ALI'de A549 hücrelerinin kültürlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Çalışmada kullanılacak hücre tipi için lütfen literatürü inceleyiniz. Farklı hücre hatları, farklılaşmak, sıkı bağlantılar oluşturmak ve yüzey aktif madde / mukus üretmek için ALI'de farklı bir süreye ihtiyaç duyar.

  1. Hücre kültürü
    1. 500 mL'lik bir DMEM şişesine 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 5 mL Glutamax, 5 mL antibiyotik-antimikotik ve 500 μL Gentamisin ekleyerek ortamı hazırlayın.
    2. Hazırlanan ortamı 37 ° C'ye ısınması için 10-15 dakika su banyosuna yerleştirin.
    3. Biyogüvenlik kabinine %70 etanol püskürtün ve silin. Ortam ısındıktan sonra, sterilize edilmiş biyogüvenlik kabininin altına yerleştirin.
    4. Kültür kaputunun altında, 15 mL'lik bir tüpe yaklaşık 10 mL ortam pipetleyin.
    5. Hücreleri sıvı nitrojenden alın ve bir su banyosunda hafifçe çalkalayarak çözün.
    6. Kültür kaputunun altında, kriyoviyalin çözülmüş hücrelerini 15 mL'lik tüpe pipetleyin.
    7. 15 mL'lik tüpü 300 g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    8. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    9. Peleti ortamla karıştırın ve T75 şişesine aktarın.
    10. T75 şişesini mikroskop altında kontrol edin.
    11. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2 ile doymuş nem ile inkübe edin.
    12. Hücre kültürü ortamını her 2-3 günde bir yenileyin.
    13. İstenilen hücre sayısına ulaşılana kadar hücreleri geçin ve büyütün. Bir 12 oyuklu plakayı tohumlamak için 3 × 106 hücre gereklidir.
  2. Transwell'lerin kollajen kaplaması
    1. Kollajen çözeltisinin hazırlanması
      1. 10 mg kollajen Tip IV'ü 50 μL buzlu asetik asit ile 20 mL ddH2O'da çözün.
      2. 37 °C'de 30 dakika, ara sıra döndürerek tamamen eriyene kadar inkübe edin.
      3. 0.22 μm'lik bir filtreden süzülerek çözeltiyi sterilize edin.
      4. 1.5 mL çözeltiyi 15 mL'lik tüplere alın ve -20 ° C'de saklayın.
    2. Transwell filtrelerinin Kollajen Tip IV ile kaplanması
      1. Bir tüp kollajen tip IV'ü (50 μg/mL) -20 °C'den çözün.
      2. Her Transwell filtresine 150 μL kollajen ekleyin.
        NOT: Yalnızca 12 oyuklu plakalar pozlama sistemiyle uyumludur.
      3. Kapakları açık olan plakaları kuruması için 18 saat biyogüvenlik kabininde (BSC) bırakın.
      4. 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak sterilize edin.
    3. Plakaları 4 °C'de, parafilme sarılmış olarak 30 güne kadar saklayın.
    4. Hücreleri kaplamadan önce, filtrelerin her iki tarafını steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile durulayın.
  3. Eklerde hücrelerin tohumlanması ve ALI'ye geçiş
    1. Plaka ve hücre süspansiyonunun hazırlanması
      1. 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1,5 mL önceden ısıtılmış hazırlanmış ortamı pipetleyin.
      2. Plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
      3. Hazırlanan ortamda 5 × 105 hücre / mL konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
    2. Eklerde tohumlama hücreleri
      1. Hazırlanan hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabininin altına yerleştirin.
      2. Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'sini (2,5 × 105 hücre/insert) insertteki zarın üstüne pipetleyin.
      3. Plakayı plaka kapağı ile örtün ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri yerleştirin.
    3. ALI'yi kurun
      1. Hücreleri tohumladıktan 24 saat sonra apikal ortamı çıkarın.
      2. Bazolateral ortamı 0,6 mL hazırlanmış ortamla değiştirin. Bu noktada, hücreler apikal olarak havaya maruz bırakılır ve ALI'yi oluşturur.
      3. A549 hücrelerini ALI'de 2 haftaya kadar kültürleyin, hücrelerin daha önce karakterize edildiği gibi farklılaşmasına izin vermek için her 2 günde bir ortamı değiştirin4.

2. LC / MS kullanılarak esrar buharı maruziyetinin dozimetri değerlendirmesi

NOT: Protokolün bu bölümünde, Δ 9-THC konsantrasyonlarını analiz ederek her bir kuyucuk içinde biriken kenevir buharı dozunu karakterize etmek için hücresiz yöntemler kullanılmıştır. Δ9-THC plastik malzemelere yapışır, bu nedenle numune toplama için sadece cam şişeler kullanılmalıdır. Bu yöntem, seçilen kenevir çeşidinin Δ 9-THC içermesini gerektirir.

  1. Pozlama sisteminin hazırlanması ve kurulumu
    1. Pozlama sistemi için boruyu belirtilen akış yoluna göre ayarlayın (Şekil 1A, B): ENDS Ünitesi > Kondenser > Şişirme Pompası > Aeroneb pompalı İzometrik Numune Alma Tertibatı > expoCube > Filtreli Nem Sensörü > expoCube Pozlama Akış Portu.
    2. Sistemi 35 °C ve 50 °C'ye ısıtmak için sıcaklık kontrollerini açın.
    3. Sistemin sızıntısız olduğundan ve basınçların doğru ayarlandığından emin olmak için akış testleri yapın (expoCube'deki SCIREQ Teknik Notu: Düzensiz Akışları Sorun Giderme Kılavuzu'na bakın).
    4. %75'in üzerinde bağıl nem elde etmek için Aeroneb pompalarını çalıştırın.
  2. Dozimetri testi ve buharlaştırıcı hazırlama
    1. Kenevir buharlaştırıcı hazırlığı
      1. Kenevir çiçeğini bir bitki değirmeni kullanarak öğütün.
      2. Her bir kısmı düzenlemek için bir hap ayırıcı kullanarak 0.25 g alikotları tartın.
      3. Paslanmaz çelik ekleri, pozlama sistemi içindeki 12 oyuklu transwell plakasının pozlama sırasına yerleştirin.
  3. Paslanmaz çelik eklerin kenevir buharına maruz kalması
    1. Pozlamaya başla
      1. Buharlaştırıcı fırını 0,25 g kenevir ile paketleyin.
      2. Kenevir buharlaştırıcısını güvenli bir conta ile maruz kalma sisteminin ENDS Ünitesine takın ve istenen şişirme rejimine başlayın. Buharlaştırıcıyı Smart Path Seviye 2 sıcaklık ayarına ayarlayın.
        NOT: Bu çalışmada kullanılan maruz kalma sistemi, Seviye 1 (176-188 ° C), Seviye 2 (188-199 ° C), Seviye 3 (199-210 ° C) ve Seviye 4 (210-221 ° C) dahil olmak üzere seçilebilecek dört akıllı yol seviyesine sahiptir.
      3. flexiWare yazılımında bir puff profili oluşturun (veri toplama yazılımı; SCIREQ Teknik Notu: flexiWare 8 için Profil Oluşturma Kılavuzu'na bakın). Bu protokol için, 4 puf/dk frekansında 70 mL'lik bir puf hacmi kullanın.
      4. Kenevir çiçeğini buharlaştırıcı fırından çıkararak ve buharlaştırıcıya taze 0,25 g kenevir ekleyerek keneviri değiştirmeden önce kuru ot buharlaştırıcısını 5 dakika çalıştırın. Sürekli maruz kalma için iki buharlaştırıcı arasında geçiş yapın.
      5. İstenen maruz kalma süresine ulaşılana kadar 2.3.1.1-2.3.1.4 adımlarına devam edin.
    2. Her maruziyetten sonra, cımbız kullanarak ekleri pozlama sisteminden dikkatlice çıkarın ve aşağıda açıklandığı gibi numune toplama için hazırlayın.
  4. LC/MS analizi için numunelerin toplanması ve hazırlanması
    1. Cımbız kullanarak, her maruziyete karşılık gelen filtreleri 10 mL LC / MS dereceli metanol içeren etiketli bir cam şişeye yerleştirin (örneğin, Pozlama 1, Pozlama 2, Pozlama 3).
    2. Ek parçayı yıkayın.
      1. Açıkta kalan her bir paslanmaz çelik parçayı 10 mL LC / MS sınıfı metanol içeren etiketli bir cam şişeye yerleştirin.
      2. Şişeleri maruziyete göre etiketleyin (örn., Pozlama 1 Kuyu 1-4).
    3. Δ 9-THC'yi çıkarın
      1. Δ 9-THC'yi çıkarmak için şişeleri 10 dakika boyunca eklerle sonikasyon yapmak için bir sonikatör banyosu kullanın.
      2. Ekleri 10 mL taze metanol içeren ikinci bir cam şişe setine aktarın ve 10 dakika daha sonikat yapın.
    4. Δ 9-THC seviyelerini ölçmek için hazırlanan tüm numuneleri (kuyular, yıkama ve filtre) LC/MS analizi için gönderin.
  5. Dozimetri hesaplamaları
    1. LC/MS analiz sonuçlarını kullanarak, maruziyet akışının dozimetrisini (filtrede biriken miktar) ve kuyudaki dozimetriyi belirlemek için biriken Δ9-THC miktarını hesaplayın.
    2. Δ 9-THC için maruz kalma akış filtresi ile kuyu biriktirme arasındaki oranı hesaplayın.
    3. Maruziyet sırasında hücrelere verilecek dozu belirlemek için bu oranı kullanın.

3. Kuvars kristali mikro terazi kullanılarak esrar buharı maruziyetinin dozimetri değerlendirmesi

NOT: Bu yöntem, maruziyetler sırasında biriken kenevir buharı parçacıklarının kütlesini değerlendirmek için bir Kuvars Kristal Mikro Terazinin (QCM) kurulumunu ve kalibrasyonunu detaylandırır. Her QCM, esrar buharı maruziyetinin hassas dozimetrisini sağlayan gerçek zamanlı ölçümler sağlar.

  1. Pozlama sisteminde QCM'nin hazırlanması ve kurulumu
    1. Pozlama sistemini daha önce açıklandığı gibi yapılandırın.
    2. Klips konektörünü kullanarak her bir QCM'yi elektronik modülüne bağlayın ve modülü 7 pimli bir konektörle inExpose (solumaya maruz kalma platformu) ünite girişlerine bağlayın.
    3. QCM ek(ler)ini, QCM'nin iyi hizalandığından emin olarak, pozlama sisteminin pozlama tarafındaki bir kuyu plakasına yerleştirin.
    4. Sistem 35 °C ve 50 °C hedef sıcaklıklarda stabilize olana kadar maruz kalma sistemini bağlı QCM'lerle önceden ısıtın.
    5. Deneysel ayarlara göre mikro akışları ve pozlama akışlarını etkinleştirin.
  2. QCM'yi kalibre etme
    1. Her pozlama çalışmasından önce QCM'yi kalibre etmek için veri toplama yazılımı kalibrasyon sihirbazını kullanın.
    2. Mavi kalibrasyon çubuğunun sabitlenmesini bekleyin, ardından doğru kütle hesaplamaları için QCM rezonans frekansını kaydetmek üzere İleri'yi seçin.
      NOT: Beklenen kalibrasyon aralığı -%15 ila %15'tir. Sapmalar, kirli bir QCM veya bağlantısı kesilmiş LEMO konektörü gibi sorunları gösterebilir.
  3. QCM sinyallerinin gerçek zamanlı izlenmesi
    1. QCM çıkışlarını izleyin; Sistem, biriken birikmiş kütleyi çıkarır. Değer, veri toplama yazılımında hem bir grafiğin parçası hem de gerçek mevcut değer olarak görüntülenir.
      NOT: Her deneysel çalıştırma için, maksimum ve minimum biriktirme de yazılımda rapor edilir.
  4. QCM'yi temizleme
    1. Doğruluğu korumak için, her deneyden sonra QCM'yi temizleyin.
    2. Her QCM ekinin içine 1 mL %70 izopropil alkol ekleyin.
    3. Kalıntıları çözmek için alkol solüsyonunu 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    4. Alkol solüsyonunu çıkarın ve bir sonraki kullanımdan önce QCM'nin tozsuz bir ortamda tamamen kurumasını bekleyin.

4. Hücreleri esrar buharına maruz bırakmanın sonuçları

NOT: Bu protokol, kenevir buharının expoCube sistemi kullanılarak ALI'de kültürlenen solunum hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tasarlanmıştır. 3- (4, 5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) ve laktat dehidrojenaz (LDH) dahil olmak üzere maruziyet sonrası tahliller, doza bağlı sitotoksisite ve metabolik aktivite hakkında bilgi sağlar.

  1. Esrar buharı dağıtımı
    1. Maruz kalma sistemini yukarıda açıklandığı gibi kurun: Sistemin 35 °C ve 50 °C sıcaklığa ve %75'in üzerindeki bağıl nem seviyelerine ulaştığından emin olun.
    2. Bir QCM kullanıyorsanız, klips konektörünü kullanarak cihazı elektronik modülüne bağlayın ve modülü 7 pimli bir konektörle soluma maruz kalma birimi girişlerine bağlayın. Tekil QCM ekini, QCM'nin iyi hizalandığından emin olarak expoCube'un pozlama tarafındaki bir kuyu plakasına yerleştirin.
    3. Pozlama sistemini açın ve hücre kültürü plakasını içine yerleştirin.
    4. Bölüm 2'ye göre istenen süre boyunca puf rejimine başlayın. QCM'nin kullanılması, biriken toplam buharın gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin verecektir.
    5. Maruz kalma sonrası, istenen tahlil zaman noktasına kadar hücreleri inkübatöre geri koyun.
    6. Bazolateral bölme, apikal bölme yıkama (yüzey aktif madde veya mukus için) ve hücre lizatı dahil olmak üzere çeşitli bölmelerden gerektiği gibi numune toplayın.
    7. Doz Seçimi Testleri: Optimal dozu ve potansiyel sitotoksisiteyi belirlemeye yardımcı olmak için LDH ve MTT tahlillerini kullanın.
  2. ALI'deki hücreler için LDH testi
    1. Medyayı toplayın: Pozlama sonrası istenen zaman noktasında, medyayı bazolateral bölmeden toplayın.
    2. Toplanan 100 μL ortamı 96 oyuklu şeffaf bir mikroplakaya aktarın.
    3. Her oyuğa 100 μL taze hazırlanmış LDH reaksiyon karışımı ekleyin.
    4. Plakayı oda sıcaklığında (15-25 °C) 30 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun.
    5. 600 nm'nin üzerinde bir referans dalga boyu kullanarak 490-492 nm'de absorbansı ölçün.
    6. Aşağıdaki formülü kullanarak sitotoksisiteyi hesaplayın:
      Sitotoksisite (%) = (deneysel değer-negatif kontrol)/(pozitif kontrol-negatif kontrol) x 100
  3. ALI'deki hücreler için MTT testi
    1. Daha önce kurulduğu gibi ALI'de kültür A549 hücreleri.
    2. Pozlama sisteminde maruz kalma işleminden sonra, istenen tahlil zaman noktasına kadar hücreleri inkübatöre geri koyun.
    3. MTT çözeltisini yapmak için 1 mg MTT'yi 1 mL PBS'de çözün.
    4. Hücrelerin apikal tarafına 500 μL MTT çözeltisi ve bazolateral bölmeye 500 μL MTT çözeltisi ekleyin.
    5. Hücreleri 1 saat boyunca 37 ° C'lik inkübatöre geri koyun.
    6. Tüm ortamları dikkatlice çıkarın.
    7. Apikal tarafa 500 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ve bazolateral tarafa 1.000 μL DMSO ekleyin.
    8. Formazan kristallerini çözmek için 1 saat inkübe edin.
    9. Çözeltiyi hem apikal hem de bazolateral taraflardan toplayın ve birleştirin.
    10. 540 nm'de (OD540) bir referansla 690 nm'de (OD690) absorbansı ölçün.
    11. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın:
      Hücre canlılığı (%) = 100 × (Ortalama OD_exposure/Ortalama OD_negative kontrolü)

Sonuçlar

expoCube sistemi ile yapılan deneyler sırasında, dört kuyu kenevir buharı maruziyetini alır, dört kuyu araç kontrolleri olarak şartlandırılmış havaya maruz bırakılır ve kalan dört kuyu negatif kontroller olarak tamamen kapatılır (Şekil 1C)17. Bu kurulum, tedavi edilen, araç ve negatif koşullar arasında kesin bir karşılaştırma yapılmasını sağlar. Sistem, hücre kültürleri için uygun bir ortam oluşturmak üzere nemlendirilir (Şekil 2) ve sistem içindeki sıcaklık düzenlemesi, termoforez yoluyla partikül birikimini artırarak buharlaşmış bileşiklerin hücrelere verimli bir şekilde verilmesine izin verir18. Maruziyeti ölçmek için, hücre maruziyet bölgesinde esrar buharı birikiminin bir işareti olarak Δ9-THC miktarını ölçüyoruz. Bu nicelleştirme, maruz kalma sürelerini ve dozlarını optimize etmek için çok önemlidir ve araştırmacıların hücre kültürü deneylerinde istenen dozları elde etmek için aktif maruz kalma sürelerini ayarlamalarını sağlar (Şekil 3). Maruz kalma akış filtresinde toplanan Δ 9-THC'nin tek tek kuyucuklarda biriken miktara oranını hesaplayarak, hücrelere verilen gerçek dozu tahmin edebiliriz (Tablo 1). Hesaplanan bu doz, istenen maruz kalma aralığını bildirerek, esrar buharına hücresel tepkileri tutarlı ve ölçülebilir bir şekilde incelemek için optimal parametrelerin belirlenmesine yardımcı olur. Bu, seçilen kenevir suşunun kannabinoid profiline bağlı olarak diğer kannabinoidler için de yapılabilir. Ek olarak, gerçek zamanlı esrar buharı birikimini ölçmek için QCM analizi yapılabilir. Şekil 4, buharlaştırıcı ve kenevir malzemesinin her 30 dakikada bir değiştirildiği 5 dakikalık bir zaman dilimi boyunca kenevir buharı birikimini göstermektedir. Her kuyu, zaman içinde kütlede tutarlı bir artış gösterdi ve bu da bütün kenevir buharı parçacıklarının etkili ve sürekli biriktiğini gösterdi.

figure-results-1
Şekil 1: ALI'de esrar buharı maruziyeti için ALI/Transwell in vitro/ex vivo maruziyet sisteminin şeması. (A) Kenevir buharı üretmek için DaVinci MIQRO buharlaştırıcı kullanıldı. Bu numune nemlendirilir ve izokinetik örnekleyiciden geçirilerek maruz kalma bölgesine taşınır. Kontrol ünitesi, hava akışı çıkışlarında ve sıcaklık gradyanlarında ayarlamalara izin verir. (B) Pozlama sistemi kurulumunun fotoğrafları. (C) ExpoCube'un içi üç sıraya ayrılmıştır: esrar buharına maruz kalma için bir test sırası, şartlandırılmış havanın bir araç kontrol sırası ve herhangi bir hava akışı tarafından dokunulmadan kalan kapalı negatif kontrol sırası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Zaman içinde kaydedilen bağıl nem (%) profili. Bu veriler, Aeroneb'ler etkinleştirildiğinde, ortalama% 75'lik bir neme ulaşıp koruduğunda bağıl nem seviyelerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Esrar buharına 30 dakikalık maruziyetin ardından LC/MS analizi yoluyla Δ 9-THC birikiminin miktarının belirlenmesi.(Bir-C) Δ9-THC birikimi, her biri 1,5 g yüksek THC'li kenevir çeşidi kullanılarak üç bağımsız 30 dakikalık buhar maruziyetinden sonra her kuyucukta ölçüldü. Δ9-THC seviyeleri LC / MS ile ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 30 dakikalık bir maruz kalma rejimi boyunca ALI / Transwell in vitro / ex vivo maruziyet sisteminde esrar buharı birikiminin QCM ölçümleri. (AD)Her grafik, zaman içinde mikrogram (μg) cinsinden ölçülen kütle ile 1-4 kuyularındaki kenevir buharı parçacıklarının kümülatif birikimini temsil eder. Biriktirme oranı, tüm kuyularda sabit bir birikim olduğunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Birincil Akış Filtresi Biriktirme (μg)Kuyu Birikimleri (μg)Kuyuda biriken birincil akışın yüzdesi (%)
Pozlama 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Pozlama 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Pozlama 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Ortalama2422.94.30.18
Standart sapma292.80.40.03

Tablo 1. ALI / Transwell in vitro / ex vivo maruziyet sistemindeki Δ9-THC birikiminin, maruziyet akış filtresi ile hücre maruziyet bölgesi arasında karşılaştırılması.

Tartışma

ALI'deki hücrelerin kültürlenmesi, geleneksel batık kültürlere kıyasla in vivo hava yolu koşullarını daha doğru bir şekilde temsil etme kabiliyeti nedeniyle solunum araştırmalarında önemli bir yöntemdir19. ALI'de kültürleme, akciğer epitel hücrelerinin apikal yüzeylerinde doğrudan havaya maruz kalmasına izin verirken, bazolateral taraftaki kültür ortamından temel besinleri korur. Bu kurulum, hücrelerin, solunan partikülleri ve patojenleri yakalamak ve uzaklaştırmak için kritik olan solunum savunma mekanizmasının temel bileşenleri olan yüzey aktif madde veya mukus üretmesini sağlar20,21,22. A549 hücreleri, in vitro çalışmalar için yaygın olarak kullanılır, ancak ALI için kullanılabilecek birçok solunum epitel hücre kültüründen sadece biridir. Silva ve ark. nazal boşluktan alveollerekadar ALI için solunum epitelinin hücre hatlarını ve primer kültürlerini gözden geçirmişlerdir 22. Sunulan ALI maruz kalma sisteminin esnekliği, farklı hücre hatları ve birincil hücreler için uyarlanmasına izin verir.

ALI kültürleri, özellikle hava kirleticileri, partikül maddeler ve diğer solunabilir maddeler üzerine yapılan araştırmalar için in vitro inhalasyon çalışmaları için giderek daha fazla "altın standart" olarak kabul edilmektedir23. ALI modellerinin birincil avantajı, in vivo insan etkilerine daha fazla çevrilebilir içgörüler sağlama yeteneklerinde yatmaktadır. Bununla birlikte, dikkate değer bir dezavantaj, ALI maruziyetleri için standartlaştırılmış protokollerin olmamasıdır, bu da çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği ve karşılaştırılabilirliği etkiler. Boşluklardan biri, standartlaştırılmış bir pozlama iş akışıdır. Hücreleri ALI'de esrar buharına maruz bırakarak, esrarın hücresel fonksiyon, canlılık ve sitotoksisite üzerindeki etkileri değerlendirilebilir. Bu maruziyetler, sitotoksisite, inflamasyon ve oksidatif stres belirteçleri dahil olmak üzere biyolojik sonuçların ayrıntılı bir değerlendirmesine izin verir. Biriken kannabinoidlerin kesin olarak ölçülmesi, kenevir buharının (ve diğer kenevir ürünleri formlarının) hücresel etkileri üzerinde tekrarlanabilir çalışmalara olanak tanıyarak, kontrollü bir laboratuvar ortamında potansiyel sağlık etkilerine ilişkin anlayışımızı ilerletmektedir.

Gelişmiş maruz kalma sistemleri, hücre yüzeyine doğrudan parçacık birikimi sağlayarak geleneksel batık kültürlerdeki sınırlamaları ele alır ve böylece fizyolojik olarak daha ilgili maruziyetler sağlar. Bu aynı zamanda çözücülerin veya taşıyıcıların potansiyel etkilerini de azaltır. Maruz kalma sistemleri, bu çözücülere ihtiyaç duymadan doğrudan partikül birikimine izin vererek, araçla ilgili etkileri en aza indirmeye yardımcı olur. Bununla birlikte, araçla ilgili bazı hususlar devam etmektedir. Örneğin, kontrolsüz nem seviyeleri, istenmeyen hücre stresine24 neden olabilir ve potansiyel olarak deneysel sonuçları etkileyebilir. Nemin optimum seviyelere ulaşmak için dikkatli bir şekilde düzenlenmesini sağlamak, hücre stabilitesini ve sonuçlarda doğruluğu korumak için çok önemlidir. Ek olarak, her parçacık, aerosol veya gaz karışımı, hücre yüzeyindeki birikimi değiştirebilecek kendine özgü fizikokimyasal özelliklere sahiptir25. Bu nedenle, her benzersiz ürün için bir maruz kalma rejimini karakterize etmek önemlidir. Partikül birikimini etkileyebilecek faktörler arasında termoforez, partiküllerin daha yüksek bir bölgeden daha düşük bir sıcaklık26'ya hareketi yer alır. Termoforez, partiküllerin hücrelere yönlendirilmesine yardımcı olur ve biriktirme verimliliğini artırır.

Dozlama tutarlılığı ve hassasiyeti, özellikle aerosoller veya partiküller söz konusu olduğunda, ALI'deki maruz kalma sistemleriyle çalışırken ek zorluklardır. Akciğerde in vivo partikül birikimi, partikül boyutu, şekli, yoğunluğu ve çözünürlüğünün yanı sıra maruz kalan akciğerin spesifik bölgesinden etkilenen karmaşık bir süreçtir27. Bu faktörler, in vitro olarak tekrarlanması zor olabilen çeşitli biriktirme oranlarına neden olur. Çok parçacık dozimetrisi (MPPD) gibi matematiksel modeller, in vivo biriktirme oranlarını tahmin etmek ve in vitro doz translasyonuna rehberlik etmek için yararlı araçlardır28. Bununla birlikte, in vitro dozlamanın in vivo maruziyet senaryolarıyla eşleştirilmesi, özellikle heterojen bileşimlere sahip karmaşık aerosoller için bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Hücresiz doz karakterizasyonu için, bileşikler hem ekin duvarlarına hem de hücrelerin tipik olarak yerleştirileceği tabana yapışabileceğinden, paslanmaz çelik kesici uç yıkamalarının birikmeyi abartma eğiliminde olduğuna dikkat etmek önemlidir. QCM, yalnızca doğrudan hücre kültürü konumunda biriken kütleyi ölçerek, özellikle hücre maruziyetiyle ilgili birikimin daha doğru bir değerlendirmesini sağlayarak burada bir avantaj sunar.

Toksikoloji fizyolojik olarak daha ilgili modellere doğru ilerledikçe, birleşik ALI maruziyet protokollerinin benimsenmesi, in vitro bulgular ile in vivo insan tepkileri arasındaki boşluğu doldurmada temel olacak ve sonuçta solunum toksiklerinin ve bunların sağlık üzerindeki etkilerinin daha güvenilir değerlendirmelerini destekleyecektir.

Açıklamalar

PG ve BU, SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc.'de istihdam edilmektedir. ETW, Mitacs Hızlandırma Programı aracılığıyla SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc.'de staj yaptı. Diğer yazarların ifşa edecek herhangi bir ihtilafı yoktur

Teşekkürler

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibe 162273 tarafından desteklenmiştir. CJB, Fonds de Recherche du Québec -Santé (FRQS) tarafından desteklendi. Bu çalışma aynı zamanda ETW'ye #IT34076 bir Mitacs hibesi ile de desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Santrifüj tüpü, Raf (Polistiren Raf), SterilMontreal Biotech Inc.
30 mL cam şişelerThomas Scientific1755F32
A549 hücreleriATCCCCL-185
Antibiyotik-antimikotik (100x)Wisent450-115-EL
Kenevir otu değirmeni ve nbsp;Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
anahtar kelimeler=herb%2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=ot%2Böğütücü%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=1
İnsan plasentasından kollajen, tip IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0.4 &mikro; m gözenekli polyester membran EklerKök Hücre Teknolojileri38023
Sitotoksisite tespit kiti (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C kuru ot buharlaştırıcıDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich34869
DMEM ortamıWisent319-005-CL
Kurutulmuş kenevir çiçeğiSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Değer & fv1 = THC		Kannabinoid İçeriği: 17 – %23 THC < % 0.1 CBD 
Fetal sığır serumuWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Sürüm 8.4.1
GentamisinWisent450-134-XL
Buzul asetik asitSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube in vitro maruz kalma paketi   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
LC/MS sınıfı metanolSigma-Aldrich106035
Fosfat tamponlu tuzlu suThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Yüzey, Filtre KapağıThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Yüzey, Filtre KapağıThermoFisher Scientific
Tiazolil mavi tetrazolyum bromürSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Ultrasonik temizleyici banyosuVWR18303Sonikatör Banyosu
Haftalık hap düzenleyiciHealthSmart640-8223-0000
MBI601051C156499

Kaynaklar

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kenevir Buharına Maruz Kalmaİnhalasyon ToksikolojisiBuharlaştırıcı Maruziyet SistemiKuvars Kristal MikroteraziSolunum Hücre KültürüGerçek Zamanlı DozimetriBuhar Birikimi ÖlçümüPreklinik Akciğer Modeli
Laboratuvar ortamında Hava-sıvı arayüzünde akciğer epitel hücrelerinin esrar maruziyetleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.