Method Article

In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, Modüler Klonlamanın (MoClo) polisistronik operonların klonlanması için nasıl uyarlanabileceğini gösteren adım adım bir protokol sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modüler Klonlama (MoClo) araç takımları, çok genli yapıların hızlı bir şekilde birleştirilmesini sağlar. Bunlar, tanıma bölgelerinin dışına çıkan Tip IIS kısıtlama enzimlerini kullanan Golden Gate klonlamasına dayanmaktadır. Tanıma ve kesme dizisi ayrıldığından, Tip IIS kısıtlama enzimleri tarafından oluşturulan çıkıntılar kasıtlı olarak seçilebilir ve klonlama stratejileri tipik olarak doğru şekilde birleştirilmiş DNA parçalarının kesilmesini önler. Bu, tek bir reaksiyonda birden fazla DNA parçasının yüksek verimli bir şekilde birleştirilmesine izin verir. MoClo'da, promotörler, ribozomal bağlanma bölgeleri, kodlama dizileri ve sonlandırıcılar gibi bireysel fonksiyonel DNA parçalarına ve ayrıca daha yüksek dereceli montajlara, yeniden kullanılabilir parça kütüphanelerinin oluşturulabilmesi için standartlaştırılmış çıkıntılar atanır. Bakteriyel MoClo araç setlerinin çoğu, monosistronik transkripsiyonel birimleri klonlamak için tasarlanmıştır ve polisistronik operonların montajı için yapılandırılmış bir yol sağlamaz. Bu protokol, polisistronik transkripsiyon birimlerinin Giriş ve Çıkış Klonlama araç seti ile montajını gösterir. Aynı yaklaşım diğer MoClo araç setlerine de aktarılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler klonlama, rekombinant DNA'nın plazmit gibi bir replikona sokulması, moleküler biyolojide temel bir metodolojidir. DNA'nın yapım ve montaj yöntemleri son yıllarda giderek daha karmaşık hale geldi. Şimdiye kadar, araştırmacılar sentezlenmiş DNA1'den tüm sentetik kromozomları ve hatta genomları oluşturabilirler. Geleneksel moleküler klonlama genellikle özel klonlama stratejilerine dayanır ve büyük çok genli yapılar için zahmetli ve pahalı olabilir2. Son yıllarda, Golden Gate (GG) klonlama ve türetilmiş hiyerarşik Modüler Klonlama (MoClo) araç takımları 2,3, zaman ve maliyet açısından verimli DNA montajına izin vermek için popüler çözümler haline geldi.

Tip IIS restriksiyon enzimleri, yönlü (palindromik olmayan) bir diziyi tanıyan ve bu tanıma dizisinin dışında parçalanan endonükleazlardır4. Sonuç olarak, bölünme ile oluşturulan çıkıntı dizileri tanıma bölgesine bağlı değildir, ancakseçilebilir 4. Ayrıca, burada 'parçalar' olarak adlandırılan fonksiyonel DNA parçaları, bölünme, birleştirilecek parçalarınuçlarından tanıma bölgesini kaldıracak şekilde tasarlanabilir 2. GG klonlama stratejileri, tek kap reaksiyonlarında verimli çok parçalı DNA montajlarına izin vermek için bundan yararlanır5. MoClo araç kitleri, GG klonlamasına dayanır ve çok genli yapıların montajı için modüler ve hiyerarşik bir yol sağlamayı amaçlar. Parçaları monte etmek için kullanılan çıkıntılar standartlaştırılarak yeniden kullanılabilir ve değiştirilebilir parça kütüphanelerinin oluşturulmasına olanak tanır. MoClo araç kitleri, birden fazla DNA dizisini kabul etmek ve monte edilen ürünü serbest bırakmak için tasarlanmış alıcı plazmitlere dayanır. Her alıcı plazmit, biri DNA kargosunu kabul etmek ve diğeri birleştirilmiş DNA'yı serbest bırakmak için kullanılan iki farklı Tip IIS enziminin iki tanıma bölgesini içerir 3,6. Bu ilkenin bir örneği, tek bir parçanın, bir sonlandırıcının, bir MoClo alıcı plazmidine (Seviye 0) klonlanması için Şekil 1'de gösterilmiştir. Hem alıcı plazmid hem de ek, restriksiyon enzimi BbsI tarafından, uyumlu çıkıntılar bırakacak ve BbsI tanıma bölgelerini ortadan kaldıracak şekilde kesilir. Bu nedenle, doğru şekilde bağlanmış plazmitler artık BbsI tarafından kesilmez. Elde edilen plazmitin tip IIS enzimi SapI ile kesilmesi, daha önce eklenen parçayı bir sonraki montaj adımında (Seviye 1) serbest bırakır.

Bu protokolde, Giriş ve Çıkış Klonlama MoClo araç kutusukullanılır 7. Burada, Seviye 0 plazmitleri, 5' çevrilmemiş bölgelere (UTR'ler) sahip promotörler, kodlama dizileri ve 3'UTR'lere sahip sonlandırıcılar gibi tanımlanmış temel genetik parçaları içerir, Şekil 1, Seviye 0'ın şematik bir genel bakışını göstermektedir. Seviye 1'de, birden fazla parça bir transkripsiyon ünitesine (TU) monte edilmektedir, Şekil 2, Seviye 1 parçalarına ve klonlamaya şematik bir genel bakış göstermektedir. Klonlama İçi ve Dışı MoClo, 3 nükleotid çıkıntıları oluşturan bir Tip IIS enzimi kullanılarak Seviye 1'deki transkripsiyon birimlerinin izsiz montajı için tasarlanmıştır. Bu, montaj için ATG başlatma ve TGA durdurma kodonlarını kullanarak, çıkıntıların kodlama dizisinin kodon rasteri içinde tamamen olmasını sağlar. M ve P seviyeleri, Seviye 1 plazmitleri 3,8'den salınan çoklu transkripsiyon birimlerinin montajı için kullanılır. Şekil 3, Seviye M ve P'ye klonlama için parçaların şematik bir genel bakışını ve Seviye M'de bir bicistronic operonun montajını göstermektedir (bir bicistronic operon, çoklu kodlama dizilerini (CDS'ler) ifade eden bir transkripsiyonel birimdir). Seviye P ve M, birinden diğerine yinelemeli döngüye izin verecek şekilde tasarlanmıştır, öyle ki monte edilebilecek parça sayısında teorik bir sınır yoktur, ancak bu protokolde açıklanmamıştır, çünkü bu protokolün ana odak noktası bir bicistronic operonun montajını göstermektir. Monte edilebilecek parça sayısında bir sınırlama olmamasına rağmen, monte edilebilecek bir yapının boyutunda bir sınır vardır; 100.000 bp'ye kadar bir MoClo kiti9 kullanılarak monte edilmiştir. Ayrıca, toksik genler içeren büyük yapılar veya yapılar hücre üzerinde bir yüke neden olabilir; Bu örnekler için, değiştirilmiş protokoller yayınlanmıştır10.

İç ve Dış Klonlama başlangıçta polisistronik transkripsiyon birimlerinin montajı için bir şema tanımlamadı. Polisistronik operonlar, bakterilerde çok yaygın bir gen organizasyon modudur 11,12,13 ve bu nedenle, modüler bir şekilde aşağıdan yukarıya montajlarına kayda değer bir ilgi vardır 14. Burada, İç ve Dış Klonlama kullanılarak polisistronik operonların montajı için yapılandırılmış bir şema açıklanmaktadır. Sunulan şema, polisistronik transkripsiyon birimleri içindeki kodlama dizilerinin konumunun yanı sıra hem mono hem de polisistronik transkripsiyondan oluşan montajların kolayca değiştirilmesine izin verir.

Aşağıdaki adım adım protokol, İç ve Dış Klonlama kullanılarak bir polisistronik operonun tasarımını ve klonlanmasını gösterir. Polisistronik transkripsiyon birimlerini klonlamak için sunulan strateji, diğer MoClo araç setlerine kolayca uyarlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, In-Cloning standardının üç Seviyesi (0, 1 ve M) aracılığıyla bir polisistronik operonun tasarımını ve montajını açıklar. Burada birleştirilen polisistronik operon bir promotör ile başlar, ardından bir ribozomal bağlanma bölgesi (RBS), bir kodlama dizisi (CDS), ikinci bir RBS, ikinci bir CDS ve son olarak bir sonlandırıcı (Şekil S1) gelir. Tasarlanan klonlama stratejisinin doğru olduğundan emin olmak için klonlamayı in silico simüle etmek için moleküler klonlama yazılımının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bir promotörün Seviye 0 parçası olarak montajının, bir kodlama dizisi ve bir sonlandırıcı ile bir RBS'nin bir Seviye 1 Transkripsiyon Ünitesine monte edilmesinin ve Seviye M'de bir bisiktronik operonun montajının bir örneği burada açıklanmıştır ve tüm montajın şematik bir genel bakışı Şekil S1'de gösterilmiştir.

1. Seviye 0: Parçaların evcilleştirilmesi

NOT: "Evcilleştirme" terimi, bir moleküler parçanın bir MoClo parça kütüphanesine entegre edildiğini ve MoClo kitinin Seviyeleri boyunca monte edilebileceğini belirtmek için kullanılır. Tipik olarak, kit içinde kullanılan Tip IIS kısıtlama enzimlerinin tüm tanıma bölgeleri, örneğin eşanlamlı yeniden kodlama ile evcilleştirilecek kısımdan çıkarılır.

  1. Ek parçanın tasarımı
    1. Operonda bir araya getirilecek promotör, CDS ve sonlandırıcı gibi moleküler parçaları seçin.
      NOT: Bu protokolde operon, indükleyici bileşik N- (β-Ketokaproil) -L-homoserin lakton (OC6) 17 varlığında LuxR proteini tarafından aktive edilebilen promotör PLuxB ile başlar. GFP, operonun ilk CDS'sidir; RBS'si iGEM'dir BBa_B0064. GFP'yi terminal olmayan bir bağlayıcı olan 'terminatör köprüsü' takip eder. İkinci CDS mTurkuaz'dır. RBS, bir RBS hesap makinesi18 tarafından tasarlanmıştır. Son olarak, operon sonlandırıcıL3S2P21 19 ile sona erer.
    2. Parçanın monte edilmesi gereken konumu seçin, Şekil 1'de bir genel bakış gösterilmiştir. Konuma bağlı olarak, GG'de kullanılacak alıcı plazmidi seçin.
      NOT: Parçalar daha sonra çeşitli pozisyonlarda kullanılmak üzere evcilleştirilebilir. Örneğin, bir promotör daha sonra bir 5'UTR parçasına (pSL252) bağlanarak tek bir parça olarak monte edilebilir veya halihazırda bulunan bir 5'UTR (pSL099) ile evcilleştirilebilir. Bir CDS, bir etiket olmadan monte edilmek (pSL102), bir N-terminal etiketi ile monte edilmek (pSL104), bir C-terminal etiketi (pSL101) ile monte edilmek üzere dört alıcı plazmidde monte edilebilir veya hem N-terminal etiketi hem de bir C-terminal etiketi (pSL103) ile monte edilmek üzere. Verilen örnekte, promotör pSL252'ye evcilleştirilir, ilk RBS pSL253'e evcilleştirilir, ilk CDS pSL102'ye evcilleştirilir, sonlandırıcı köprü pSL106'ya evcilleştirilir, ikinci RBS pSL099'a evcilleştirilir, ikinci CDS pSL102'ye evcilleştirilir ve sonlandırıcı pSL106'ya evcilleştirilir.
    3. Seçilen alıcı plazmide dayalı olarak tasarlanan ek parçaya uzantılar ekleyin. Tablo 1 , alıcı plazmid başına GG montajı için gereken uzantıya genel bir bakış sağlar. Bu uzantılar, PCR için primerlerin tasarımı sırasında, bir parçayı oluşturmak için iki oligo'nun tavlanması durumunda oligoların tasarımı sırasında veya gen sentezi sırasında eklenmelidir.
      NOT: Bir parçanın evcilleştirilebilmesi için, parçanın kendisinin kit içinde kullanılan Tip IIS enzimlerinin, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') ve BsaI'nin (5'-GGTCTC-3') tanınma bölgelerini içermediğinden emin olmak gerekir. Parçalarda tanıma bölgelerinin varlığı, doğru montajın verimliliğini büyük ölçüde azaltır, çünkü nihai ürün kullanılan Tip IIS enzimi tarafından kesilebilir (bkz. Şekil 1).
  2. GG reaksiyonu
    1. GG reaksiyonu için, istenen ekin 50 fmol'ü, alıcı plazmidin 50 fmol'ü, 1 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 1 μL T4 ligaz ve 1 μL BbsI ekleyin. Toplam 10 μL hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Ek olarak, istenen ek olmadan aynı reaksiyona sahip bir negatif kontrol ekleyin.
    2. Aşağıdaki programı bir termocycler'da çalıştırın: 3 dakika boyunca 37 ° C'lik 25 döngü (37 ° C, kısıtlama enziminin optimal sıcaklığıdır) ve 4 dakika boyunca 16 ° C (16 ° C, T4 ligazın optimum sıcaklığıdır), ardından 50 ° C'de 20 dakika boyunca son bir sindirim (50 ° C'de, T4 ligaz çok az aktivite gösterir veya hiç aktivite göstermez, restriksiyon enzimi hala işlev görebilirken, böylece nihai üründeki kesilmemiş alıcı plazmit miktarını sınırlar) ve enzimlerin 80 ° C'de 20 dakika boyunca ısı inaktivasyonu (80 ° C'de, tüm enzimler ısıyla inaktive edilir ve reaksiyon sonlandırılır)6.
    3. 50 μL'lik kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine 5 μL GG reaksiyonu ekleyerek GG reaksiyonunu dönüştürün ve daha önce yayınlanmış bir protokol15'te açıklandığı gibi bir geri kazanım adımı ile bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirin.
    4. 100 μg / mL spektinomisin içeren bir Luria-Bertani (LB) agar plakasına 100 μL dönüşüm büyümesi yayın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    5. Her iki plakadaki beyaz kolonilerin sayısını sayarak negatif kontrolün dönüşüm verimliliğini tüm montajınkiyle karşılaştırın. Montajın negatif kontrolden yaklaşık 10 kat (veya daha fazla) beyaz kolonisi varsa bir sonraki adıma geçin.
      NOT: Elde edilen kolonilerin çoğunluğu beyaz olmalı ve kırmızı kolonilerin sadece küçük bir kısmı olmalıdır. Klonlama araç setindeki alıcı plazmitler, mCherry (Seviye 0 ve Seviye 1) veya LacZα (Seviye M ve Seviye P) içeren ikili bir seçim kasetine ve bir giraz inhibitörünü kodlayan bir ccdB genine sahiptir. GG reaksiyonunun dönüşümü, ccdB'ye duyarlı E. coli hücrelerinde gerçekleştirilir, bu nedenle, yalnızca birleştirilmiş plazmide sahip hücreler büyüyebilirken, orijinal alıcı plazmit çoğaltılamaz. ccdB'ye duyarlı suşların örnekleri arasında DH5α ve TOP10 bulunur. mCherry/LacZα , ccdB mekanizmasından16 kaçan hücrelerin görsel olarak tanımlanmasına izin verir.
    6. Her montaj için, bir pipet ucu ile koloninin bir miktar materyalini alarak ve her biri 100 μg / mL spektinomisin ile 5 mL LB ortamına yeniden süspanse ederek iki beyaz koloni yetiştirin ve 250 rpm'de çalkalama inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre sütun bazlı bir plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin. Ekstrakte edilen plazmitin Sanger dizilemesi ile beklenen diziye sahip olduğunu doğrulayın.

2. Seviye 1: Pozisyonların belirlenmesi

NOT: Seviye 1, parçaların evcilleştirilmesi ile bir polisistronik operonun montajı arasındaki Seviyedir (Şekil 2). Burada, ara montajların son yapıdaki konumları belirlenir. Operon içindeki bir Seviye 1 düzeneğinin konumu, farklı bir Seviye 1 alıcı plazmid kullanılarak değiştirilebilir. Verilen örnek, bir bicistronic ünitesinin montajını tanımlar, ancak verilen şema, altı adede kadar kodlama dizisinin (her biri bir RBS ile) montajı için kolayca uyarlanabilir. Daha fazla kodlama dizisinin birleştirilmesi ayrıca Seviye P ve M arasında geçiş yapmayı gerektirir. Seviye P ve M arasındaki yinelemeli döngü ile, tek bir operonda birleştirilebilecek kodlama dizilerinin sayısında sabit bir üst sınır yoktur.

  1. Parça seçimi ve alıcı plazmitler
    1. Bir transkripsiyon ünitesine monte edilecek seviye 0 parçalarını seçin. En azından, bunların bir destekleyici, bir CDS ve bir sonlandırıcı içermesi gerekir.
    2. Transkripsiyon ünitesinin operonda monte edilmesi gereken konumu seçin. Bu konuma bağlı olarak, uygun alıcı plazmidi seçin. Şekil 2'de bir genel bakış gösterilmiştir.
      NOT: Örnek olarak gösterilen bisiktronik operonun yapımı için 7 DNA parçası, iki Seviye 1 yapısında birleştirilmiştir. Promotör, ilk RBS, ilk CDS ve sonlandırıcı köprü pSL68'e monte edilir; ikinci RBS, ikinci CDS ve sonlandırıcı pSL69'a monte edilir.
  2. GG reaksiyonu
    1. GG reaksiyonu için, istenen eklerin her birinden 50 fmol, alıcı plazmidin 50 fmol'ü, 1 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 1 μL T4 ligaz ve 1 μL SapI ekleyin. Toplam 10 μL hacme nükleaz içermeyen su ekleyin.
    2. Aşağıdaki programı bir termocycler'da çalıştırın: 3 dakika boyunca 37 ° C'de 25 döngü ve 4 dakika boyunca 16 ° C, ardından 20 dakika boyunca 50 ° C'de son bir sindirim ve enzimlerin 80 ° C'de 20 dakika boyunca ısı inaktivasyonu6.
    3. İsteğe bağlı: GG reaksiyonuna 0,5 μL SapI ekleyin ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: SapI, kullanılan diğer tip IIS kısıtlama enzimleri kadar kararlı değildir. GG reaksiyonundan sonra SapI ile bir sindirim adımının, yeniden bağlanmış alıcı plazmidi taşıyan koloni miktarını azalttığı bulunmuştur. SapI, bu son sindirim adımına ihtiyaç duymayabilecek bir izoşizomer olan BspQI'ye sahiptir.
    4. 50 μL'lik kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinde 5 μL'lik GG reaksiyonunu dönüştürün ve tercihen adım 1.2.3'te gerçekleştirilen gibi bir geri kazanım adımı ile bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirin.
    5. 100 μg/mL ampisilin içeren bir LB agar plakası üzerinde dönüşüm büyümesinin 100 μL plakası. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    6. Her biri için, bir pipet ucu ile koloninin bir miktar materyalini alarak ve her biri 100 μg / mL ampisilin ile 5 mL LB ortamında yeniden süspanse ederek iki beyaz koloni yetiştirin. Gece boyunca 37 °C'de 250 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre sütun bazlı bir plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    7. BbsI ile bir kısıtlama özeti aracılığıyla doğru montajı onaylayın ve oyuğun boyutunun ekin beklenen boyutuyla eşleşip eşleşmediğini kontrol edin. 1 μL uygun 10x sindirim tamponu ve 1 μL BbsI ekleyerek 1000 ng plazmit DNA'yı sindirin. Toplam 10 μL hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Reaksiyonu 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    8. Sindirilmiş plazmidi %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyerek jel elektroforezi gerçekleştirin, jeli 35 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
      NOT: Sonucu tahmin etmek için bir agaroz jeli simüle etmek için beklenen plazmitin in silico sindirimi gerçekleştirilebilir.

3. Seviye M: Bir polisistronik operonun montajı

NOT: Bu adımda, polisistronik operon monte edilmektedir. Sunulan bir bicistronic operon durumunda, iki Seviye 1 kesici uç 1 ve 2 konumlarına monte edilir. Buna göre, alıcı plazmid pMA60 seçilir. Ayrıca, bir uç bağlayıcı gereklidir. Tüm Seviye M ve P alıcı plazmitleri, ikinci çıkıntı olarak GGGA çıkıntısına sahiptir. Uç bağlayıcılar, kesici uç ve alıcı plazmid arasında köprü kurar ve bir Seviye P yapısının Seviye M'ye montajını sağlar ve bunun tersi de geçerlidir. İki Seviye 1 kesici ucun Seviye P montajı için, uç bağlayıcı pMA668 kullanılır ve üçüncü ve son konumu alır. Seviye M ve P'ye genel bir bakış ve klonlama adımının görselleştirilmesi Şekil 3'te gösterilmektedir. Yalnızca Seviye M (veya P) üzerinde montaj ile, 6 kodlama dizisine kadar operonlar klonlanabilir (konum 1-6). Konum 7, son bağlayıcı tarafından alınıyor. Bir operonda daha yüksek sayıda kodlama dizisinin montajı mümkündür, ancak bu protokolde açıklanmayan Seviye M'ye (veya P'ye) döngü gerektirir.

  1. GG reaksiyonu için, istenen her ek parçadan 50 fmol, alıcı plazmidden 50 fmol, 1 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 1 μL T4 ligaz ve 1 μL BbsI ekleyin. Toplam 10 μL hacme nükleaz içermeyen su ekleyin.
  2. Aşağıdaki programı bir termocycler'da çalıştırın: 3 dakika boyunca 37 ° C'lik 50 döngü ve 4 dakika boyunca 16 ° C, ardından 20 dakika boyunca 50 ° C'de son bir sindirim ve enzimlerin 80 ° C'de 20 dakika boyunca ısı inaktivasyonu6.
  3. 50 μL'lik kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinde 5 μL'lik GG reaksiyonunu dönüştürün ve adım 1.2.3'te gerçekleştirildiği gibi bir geri kazanım adımı ile bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirin.
  4. Dönüşüm büyümesinin 100 μL'sini 100 μg/mL spektinomisin içeren bir LB agar plakasına yayın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de veya düzeneğin metabolik bir yükü veya toksisitesi bekleniyorsa 30 °C'de inkübe edin.
  5. Her meclis için iki beyaz koloniden bir kültür yapın. Bu amaçla, bir pipet ucunu koloniye batırın ve 5 mL LB'yi 100 μg/mL spektinomisin ile aşılamak için kullanın. 37 °C veya 30 °C'de 250 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre sütun bazlı bir plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
  6. Adım 2.2.7'de gerçekleştirildiği gibi, kesik boyutunun kesici ucun beklenen boyutuyla eşleşip eşleşmediğini kontrol ederek BsaI ile bir kısıtlama özeti aracılığıyla doğru montajı onaylayın.
    NOT: Yapı, onay için Sanger sıralaması tarafından kapsanamayacak kadar uzun olabilir. Daha sonra, çeşitli dizileme hizmeti sağlayıcılarından ticari bir hizmet olarak sunulan tüm plazmid dizilemesi ile doğrulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Seviye 0'dan Seviye M'ye kadar bir polisistronik operonun aşağıdan yukarıya montajının sonuçları gösterilmektedir (Şekil S1). Operon, indükleyici bileşik N- (β-Ketokaproil) -L-homoserin lakton (OC6) 17 varlığında LuxR proteini tarafından aktive edilebilen promotör PLuxB ile başlar. GFP, operonun ilk CDS'sidir, RBS'si iGEM BBa_B0064'dir. GFP'yi terminal olmayan bir bağlayıcı olan 'terminatör köprüsü' takip eder. İkinci RBS, bir R...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler klonlama, özellikle geçici klonlama stratejileriyle zaman alıcı ve hantal olabilir. MoClo araç kitleri, modülerlikleri, hiyerarşik montajları ve yüksek verimli tek kap reaksiyonları ile moleküler klonlamayı iyileştirebilir. Golden Gate reaksiyonları yoluyla DNA montajına güveniyorlar. Standartlaştırılmış çıkıntılar sayesinde, moleküler parça kütüphaneleri yeniden kullanılabilir ve başkalarıyla paylaşılabilir 3,6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV ve DS, MaxGENESYS projesi çerçevesinde Max Planck Topluluğu tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpisilinMerck Yaşam BilimiA9518
Bakteriyel agarFisher Scientific P0011B
BBSI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α Yetkin hücreler
Eppendorf  Mastercycler  Nexus Termal DöngüleyicileriEppendorf6333000014
EzDrop 1000 Mikro-Hacimli SpektrofotometreMavi Işınlı BiyoteknolojiBRED-1000
GeneJET Plazmid Miniprep KitiTermo BilimselK0503
In- & Out- Klonlama Araç Set
Ligase tamponuNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific BP358
New Brunswick Innova®   42/42R - Üst üste Yığılabilir Kuluçka MakinesiEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Şarkıcı EnstrümanlarıPHB-007
SapINew England BiolabsR0569
SpectinomycinMerck Yaşam BilimiS4014
Standart laboratuvar eşyaları
T4 DNA ligazıNew England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TriptonFisher Scientific LP0042B
Maya ekstraktıFisher Scientific LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles