Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68149

⸱

30 Mayıs 2025

 ,  ,  , 
1Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/National Clinical Research Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 2Key Laboratory of Cancer Genomic Biology, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 3Changping Laboratory, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tümör ilerlemesinin farklı aşamalarını temsil eden özofagus organoid modellerinin oluşturulmasını ve histolojik analizini açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların normalden kanserli dokulara geçiş sırasında hücresel morfoloji, mekansal organizasyon ve moleküler belirteç ekspresyon modellerindeki değişiklikleri incelemelerini sağlar.

Özet

Organoidler, tümör oluşumu ve kanser tedavisinin anlaşılmasını ilerletmek için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Farklı tümör evrelerini temsil eden insan organoid modelleri üreterek ve histolojik analizler yaparak, tümör ilerledikçe hücresel morfoloji, mekansal mimari ve temel moleküler belirteçlerin ekspresyonundaki değişiklikler hakkında daha derin bir anlayış elde etmek mümkündür. Bu çalışma, özofagus skuamöz hücre organoidlerinin oluşturulması ve kültürü için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Ek olarak, protokol, fiksasyon, gömme ve boyama gibi teknikleri kullanarak, organoidler içindeki kritik moleküllerin ekspresyon modellerini ve uzamsal organizasyonunu değerlendirmek için yöntemleri ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol sayesinde, özofagus skuamöz epitel hücrelerinin mekansal yapısında ve tümör oluşumu sırasında çeşitli tümör biyobelirteçlerinin ekspresyonunda önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Protokol, organoidlerin yapımını ve histolojik analizini kolaylaştırarak, araştırmacıların tümör oluşumu ve terapötik müdahalenin farklı aşamalarında epitel hücrelerinin mekansal mimarisini ve moleküler değişikliklerini araştırmalarını sağlar.

Giriş

Tümör oluşumu, hücrelerde ilerleyici moleküler ve morfolojik değişiklikler ile karakterize karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir 1,2. Kötü prognoz 3,4 ile yaygın bir malignite olan özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC), bu aşamalı ilerlemeyi dört farklı aşamada örneklemektedir: normal mukoza, düşük dereceli intraepitelyal neoplazi (LGIN), yüksek dereceli intraepitelyal neoplazi (HGIN) ve invaziv karsinom5. Bu aşamalar boyunca, epitel hücreleri, normal bir durumdan malign bir duruma ilerlerken doku morfolojisinde sistematik değişikliklerin eşlik ettiği moleküler ekspresyon modellerinde ve uzamsal organizasyonda dinamik değişiklikler sergiler 6,7. ESCC patogenezinin anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, tümör evriminin mekansal ve zamansal yönlerini sadık bir şekilde özetleyen deneysel modellerin eksikliği - sistematik histolojik ve moleküler analizlere olanak sağlarken - hastalığın ilerlemesi ve terapötik gelişimin daha derin mekanik anlayışını engellemiştir.

2D ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatları, onkogenezin anlaşılmasına önemli katkılarda bulunmuş olsa da, doğal tümörlerin biyolojik karmaşıklığını ve patolojik özelliklerini çoğaltmada doğal olarak sınırlıdır8. Hayvan modelleri, in vivo bağlam sağlasa da, türe özgü farklılıklar nedeniyle insan tepkilerini genellikle zayıf bir şekilde tahmin eder9. Buna karşılık, organoidler, insan dokularının hücresel heterojenliğini, mimarisini ve işlevselliğini sadık bir şekilde koruyan dönüştürücü bir klinik öncesi platform olarak ortaya çıkmıştır 10,11,12,13. Klinik öncesi modeller olarak, organoidler primer tümörlerin özelliklerini daha iyi yakalar ve tümör ilerlemesi sırasında önemli moleküler olayların ve hücresel değişikliklerin ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar14. Örneğin, Chen ve ark. epitelyal-fibroblast etkileşimlerini aydınlatmak için ESCC'nin farklı aşamalarından hasta kaynaklı özofagus organoidlerini kullandı ve sonuçta ANXA1-FPR2 sinyal eksenini ESCC patogenezi6'nın kritik bir itici gücü olarak doğruladı. Benzer şekilde, Ko ve ark. ESCC başlangıcını ve immün kaçışı yönlendiren temel genetik belirleyicileri tanımlamak için genetik olarak tasarlanmış özofagus organoidleri kullandılar ve organoid modellerin hastalık özelliklerini nasıl etkili bir şekilde özetleyebileceğini ve yeni terapötik hedefleri nasıl ortaya çıkarabileceğini gösterdi15.

Mevcut metodoloji, normal epitelden invaziv karsinomlara kadar histolojik ilerlemeyi yansıtan çok aşamalı ESCC organoidleri oluşturmak için tekrarlanabilir bir protokol oluşturarak özofagus kanseri modellemesindeki önemli sorunları çözmektedir. Bu sistem, histolojik işleme ve multipleks immünofloresan (mIF) analizi için standartlaştırılmış protokollerle birlikte epitel sapını korumak için L-WRN koşullandırılmış bir ortam kullanarak optimize edilmiş kültür koşullarını entegre eder ve tümör oluşumu sırasında uzamsal ve moleküler değişiklikleri uzunlamasına analiz etmek için ideal bir platform sağlar. 2D kültürler gibi alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, bu organoid platform, doku mimarisini benzersiz bir şekilde koruyarak, T hücresi yanıtlarını inhibe ederek tümör bağışıklık kaçışına aracılık eden bağışıklık kontrol noktası proteini PD-L1 (CD274) dahil olmak üzere uzamsal olarak organize edilmiş moleküler belirteçlerin görselleştirilmesini sağlar 16,17,18ve çoğalma belirteci Ki-67. Protokol, normal özofagus ve prekanseröz doku geçişinden organoidleri mümkün kılarak, araştırmacıların normal dokudan tümör19'a kadar sürekli bir organoid model oluşturmasına yardımcı olur. Bu protokol, tümör oluşumu sırasındaki mekansal ve moleküler değişikliklerin ayrıntılı analizini sağlayarak, araştırmacılara kanser gelişimi ve ilerlemesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için güçlü bir araç sunar ve potansiyel olarak gelişmiş terapötik stratejilere yol açar.

Bu metodoloji özellikle ESCC ve ilgili skuamöz malignitelerde epitelyal karsinogenez, tümör mikroçevre etkileşimleri veya terapötik yanıtları araştıran araştırmacılar için uygundur. Modüler tasarımı, uygun doğrulama adımlarının dahil edilmesi koşuluyla, diğer moleküler belirteçleri veya sinyal yollarını incelemek için adaptasyona izin verir. Bu protokol, standartlaştırılmış ancak esnek bir platform sunarak, tümör biyolojisinde klinik öncesi araştırmaları ilerletmeyi ve mekanik içgörülerin hedefe yönelik tedavilere dönüştürülmesini hızlandırmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Kanser Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 20/069–2265, 22/221-3423 ve 23/305-4047). Özofagus doku örnekleri, insan özofagus organoidlerinin oluşturulması amacıyla 2021 ve 2024 yılları arasında Çin Tıp Bilimleri Akademisi Kanser Hastanesinde özofagus skuamöz hücreli karsinomu (ESCC) için ameliyat veya erken tarama yapılan hastalardan elde edildi. Bu çalışmaya dahil edilen hastaların hiçbiri örnek toplanmadan önce kemoterapi veya radyoterapi almamıştı. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı ve ilgili klinik bilgiler tıbbi kayıtlardan alındı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların tam listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Özofagus epitelyal organoidlerinin hazırlanması

  1. L-WRN şartlandırılmış ortamın hazırlanması
    1. L-WRN hücre hattının hazırlanması
      1. L-WRN hücre hattını (-80 °C'de saklayın) 37 ° C'lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözün. 5 mL önceden ısıtılmış bazal kültür ortamı ile karıştırın (% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM).
      2. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı atın. Hücreleri 2-3 mL taze önceden ısıtılmış seçim ortamı (% 10 FBS, 0.5 mg / mL higromisin B ve 0.5 mg / mL G-418 içeren DMEM) ile yeniden süspanse edin.
        NOT: Ortamı 4 °C'de tutun (maksimum saklama 1 ay).
      4. Hücreleri, seçim ortamını içeren 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde kültürleyin.
    2. L-WRN hücre hattının geçişi
      1. % 0.025 tripsin-EDTA (37 ° C'de 1-2 dakika) kullanarak birleşen hücreleri ayırın ve 1: 2 oranında bölün.
    3. L-WRN şartlandırılmış ortamın toplanması
      1. Kültür ortamını% 80 hücre birleşiminde bazal kültür ortamı ile değiştirin. Süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın.
      2. Hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için 0,22 μm membrandan süzün. Süzüntüyü L-WRN ile koşullandırılmış bir ortam olarak toplayın.
        NOT: L-WRN şartlandırılmış ortamı 4 ° C'de (1 hafta) veya -80 ° C'de (6 ay) tutun.
  2. İnsan özofagus organoid kültür ortamı (H-EOCM) hazırlığı
    1. H-EOCM hazırlığı
      1. 4 ° C'de 4 saatlik dengelemenin ardından L-WRN ile koşullandırılmış ortamı (1.5 mL hacim) vorteksleyin.
      2. H-EOCM oluşturmak için Gelişmiş DMEM / F12 ortamını bu katkı maddeleriyle birleştirin:% 3 L-WRN koşullu ortam, 1× Anti-Anti, 1× L-glutamin, 1× N2 takviyesi, 1× B27 takviyesi, 0.15 mM HEPES, 40 ng / mL EGF, 10 μM Y-27632 ve 50 μM A83-01.
        NOT: Altı aylık koruma için H-EOCM'nin donmuş muhafazasını -20 ° C'de tutun.
  3. Deney öncesi hazırlık
    1. H-EOCM'yi 4 saat boyunca 4 ° C'de tutarak çözdürün.

2. İnsan özofagus organoidinin kurulması

  1. Malzemelerin hazırlanması
    1. Bazal membran matrisini ve H-EOCM'yi 4 °C'de çözün. Bir sonraki deney için cerrahi makas ve cımbızı sterilize edin.
    2. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 24 oyuklu plakayı 37 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Doku işleme ve hücre izolasyonu
    NOT: ESCC tümör dokusu, displastik lezyonlar (tümör kenarından ≤2 cm) ve uyumlu normal özofagus dokusu (tümör kenarından ≥5 cm) cerrahi rezeksiyon yapılan ESCC'li aynı bireylerden toplandı. Ek olarak, önceki çalışmalarımızda anlatıldığı gibi bir ESCC erken tespit ve tarama programı aracılığıyla çok aşamalı özofagus örnekleri elde edildi 6,7.
    1. Numuneyi oda sıcaklığında yıkama tamponu ile 5 mL santrifüj tüplerinde ×Anti-Anti ve 0.15 mM HEPES içeren PBS) üç kez temizleyin.
      NOT: Kontaminasyon riskini azaltmak için numuneleri üç defadan fazla yıkayın.
    2. Steril makas kullanarak dokuyu 1 mm3 parçaya doğrayın. Parçaları 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
    3. Numuneyi 1 mL sindirim tamponu ile askıya alın ve dokuyu sindirmek için 37 ° C, 50-100 rpm'de 10-20 dakika çalkalayın.
    4. Karışımı 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    5. Çökeltiyi 500 μL% 0.025 tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Enzimatik aktiviteyi durdurmak için% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM ekleyin.
    6. Süspansiyonu 70 μm steril bir filtreden geçirin. Süzüntüyü 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    7. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj filtratı. Süpernatanı atın. Hücreleri 100 μL H-EOCM ile yeniden süspanse edin.
  3. Organoid tohumlama
    1. Hücre yoğunluğunu belirleyin, ardından süspansiyonda 5.000-15.000 hücre içeren 1.5 mL'lik taze bir santrifüj tüpü hazırlayın.
    2. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin. 50-100 μL bazal membran matrisindeki hücreleri eşit şekilde nazikçe yeniden süspanse edin.
      NOT: Katılaşmayı önlemek için bazal membran matrisini 4 °C'de saklayın.
    3. Her 24 oyuklu plakanın merkezine karışık hücrelerle birlikte 50 μL bazal membran matrisi ekleyin. Bazal membran matrisini 37 °C inkübasyon (30 dakika süre) ile polimerize edin.
    4. Bazal membran matrisini kaplamak için 500 μL önceden ısıtılmış H-EOCM (37 °C) ekleyin. Organoidleri 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
  4. Orta değiştirme
    1. Harcanan ortamı aspire edin ve 500 μL taze H-EOCM (37 °C'ye ısıtılmış) ile doldurun.
      NOT: H-EOCM'yi 3 günlük aralıklarla değiştirin.

3. Organoidlerin pasajı

  1. Malzemelerin hazırlanması
    1. Bazal membran matrisini ve H-EOCM'yi 4 °C'de çözün. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 24 oyuklu plakayı 37 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Organoidin sindirimi
    1. H-EOCM ortamını nazikçe çıkarın. Bazal membran matrisini eritmek için kuyuya 500 μL önceden soğutulmuş geçiş tamponu (1× Anti-Anti ve 0,15 mM HEPES içeren Gelişmiş DMEM/F12, 4 °C'ye önceden soğutulmuş) ekleyin.
    2. Bazal membran matrisini 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde geçiş tamponu ile birleştirin. Kuyuyu 500 μL önceden soğutulmuş geçiş tamponu ile yıkayın ve kalan organoidleri almak için tamponu toplayın.
    3. Tamponu 4 ° C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin. Tüpe 500 μL rekombinant tripsin ekleyin ve enzimatik sindirim için inkübe edin (37 °C, 15 dakika). 5 dakikalık aralıklarla yeniden askıya alın.
    4. Sindirilmiş numuneyi santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, 4 °C). Süpernatanı atın. 3.2.6 ve 3.2.7 adımlarını tekrarlayın. Hücreleri 100 μL H-EOCM'de yeniden süspanse edin.
  3. Organoid tohumlama
    1. Organoid tohumlama için adım 2.3'ü tekrarlayın.

4. Organoid dondurma ve geri kazanım

  1. Organoid dondurma
    1. Malzemelerin hazırlanması için adım 2.1'i tekrarlayın.
    2. Organoidlerin sindirimi için adım 3.2'yi tekrarlayın.
    3. Organoid dondurma
      1. Hücre yoğunluğunu belirleyin, ardından süspansiyonda 10.000 hücre bulunan 1,5 mL'lik yeni bir santrifüj tüpü hazırlayın.
      2. Numuneleri RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
      3. Hücreleri 500-1000 μL kriyoprezervasyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Yeni bir kriyotüpe aktarın. Kriyotüpü -80 °C'de 24 saat dondurun. Uzun süreli koruma için sıvı nitrojen depolama sisteminde arşivleyin.
  2. Donma organoidinin çözülmesi
    1. Malzemelerin hazırlanması için 2.1 adımını tekrarlayın.
    2. Donma organoidinin çözülmesi
      1. Kriyotüpü 37 °C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika hızla çözdürün. Donmuş materyali 9 mL önceden ısıtılmış bazal kültüre (37 °C) aktarın ve hücreleri eşit şekilde yeniden süspanse edin.
      2. Hücre süspansiyonunu 400 x g'da (RT'de) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    3. Organoid tohumlama
      1. Organoidleri tohumlamak için adım 2.3'ü tekrarlayın.

5. Organoidin histolojik analizi

  1. Parafine gömülü bölümlerin hazırlanması
    1. Malzemelerin hazırlanması
      1. 50 mL gömme matrisini (sulu çözelti: %2 agar + %2.5 jelatin) otoklav ile 250 mL'lik bir şişede sterilize edin. 5 mL'yi 15 mL'lik santrifüj tüplerine ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
    2. Organoid sabitleme
      1. 3.2.1-3.2.2 adımlarını tekrarlayın. Çökeltiyi 1.5 mL'lik taze bir tüpte 1 mL geçiş tamponu ile yeniden süspanse edin.
      2. 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Organoidleri 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de en az 6 saat inkübe edin.
    3. Organoid gömme
      1. Karışımı santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, RT). Süpernatanı çıkarın. Tüpe 1 mL geçiş tamponu ekleyin ve çökeltmeyi yeniden askıya alın.
      2. Karışımı santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, RT). Süpernatanı çıkarın.
      3. Gömme ortamı (5 mL) olan bir tüpü (15 mL) su banyosuna (100 mL, 150 mL kap) yerleştirin. Su kaynamaya başlayana kadar maksimum güçte mikrodalga.
        NOT: Mikrodalgada pişirmeden önce 15 mL'lik tüpün kapağını sökün.
      4. Organoidleri 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 μL gömme jeli ile yeniden süspanse edin. Jel tamamen sertleşene kadar tüpü 4 °C'ye soğutun.
      5. Katılaşmış jeli% 70 etanole aktarın. 4 °C'de saklayın.
    4. Parafin blok hazırlama
      1. Jeli etanol serisinden (%30 → %50 → %70 → %80 → %95 → %100) ile konsantrasyon başına 30 dakika kurutun.
      2. Katılaşmış jeli 30 dakika boyunca berrak ksilenin içine koyun. Katılaşmış jeli parafine batırın ve ısıtılmış bir parafin istasyonu kullanarak gömün.
      3. Bir mikrotom ile 4 μm kalınlığında dilimler kesin. Slaytlara monte edin ve 65 °C'de 1 saat kurutun. Kuru koşullarda saklayın.
  2. Organoid dilimlerin immünohistokimya (IHC) boyanması
    1. Mum alma ve hidrasyon
      1. Dilimleri doku temizleme maddesinde 65 °C'de 40 dakika ısıtın. Slaytı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze doku temizleme maddesine daldırın.
      2. Slaytları etanol serisi içeren cam tepsilerden işleyin: 10 dakika boyunca %100 etanole daldırın ve bir kez tekrarlayın, ardından 5 dakika boyunca %95 etanole, ardından 5 dakika boyunca %85 etanole, ardından 5 dakika boyunca %75 etanole aktarın ve son olarak 10 dakika boyunca %4 PFA'ya yerleştirin.
      3. Termostabil hazneye sterilize su ekleyin ve çalkalayıcıda 80 rpm'de 5 dakika tutun. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
    2. Antijen alımı
      1. Slaytları daldırmak için termostabil hazneye Tris-EDTA antijen (pH 9.0) alma solüsyonu ekleyin. Slaytları içeren termostabil odayı kaynayana kadar maksimum yoğunlukta (700 W, 3 dakika) mikrodalgada ısıtın. Mikrodalgayı düşük güç ayarında (70 W, 15 dakika) tutun ve oda sıcaklığına soğutun.
      2. Damıtılmış suda 2 dakika boyunca 80 rpm'de bir çalkalayıcıda yıkayın. İki kez tekrarlayın. Organoidlerin yerini histolojik bir kalemle daire içine alın.
    3. Peroksidaz blokajı
      1. Numune alanını kaplamak için peroksidaz bloke edici solüsyonu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin.
      2. Slaytları termostabil bir odaya aktarın. PBST'de (PBS + %0.1 Tween 20) 80 rpm'de 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    4. Birincil antikor inkübasyonu
      1. Slaytlardaki fazla PBST damlacıklarını nazikçe silin.
        NOT: Slaytlardaki organoidlere dokunmaktan kaçının.
      2. Organoid alanı kaplamak için seyreltilmiş birincil antikoru bırakın. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 ° C'de 8-14 saat nem odasında inkübe edin. Bu adımı tekrarlayın.
    5. İkincil antikor inkübasyonu
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için seyreltilmiş HRP ikincil antikorunu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrarlayın.
    6. DAB (3,3′-Diaminobenzidin) boyama
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için 1× DAB bırakın. Renk kahverengiye dönene kadar oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edin.
      2. Renk değişimini sonlandırmak için slaytları 5-10 saniye damıtılmış suya batırın. Adımı tekrarlayın.
    7. Hematoksilen boyama
      1. Hematoksilen içinde 5-8 dakika boyayın. 5-10 s boyunca% 1 asit alkolde (% 70 alkolde% 1 HCl) farklılaştırın.
      2. Slaytları 5-10 saniye damıtılmış suya batırın. Bu adımı tekrarlayın.
    8. Dehidratasyon
      1. Slaytları cam tepsilerden sırayla işleyin: 5 dakika boyunca %75 etanole daldırın, 5 dakika boyunca %85 etanole aktarın, 5 dakika boyunca %95 etanole geçin, ardından her biri 10 dakika boyunca %100 etanole iki ayrı daldırma yapın ve son olarak iki ardışık 20 dakikalık periyot boyunca ksilen içine yerleştirin.
    9. Sürgülü montaj
      1. Şeffaf hale gelene kadar nötr sakıza ksilen ekleyin. Havayla hafifçe kurulayın. Ardından, organoid alanı kaplamak için ksilen ile sakız damlatın.
      2. Lamel uygulayın. Slaydı tarayın ve analiz edin.
  3. Multipleks immünofloresan (mIF) boyama
    1. Mum alma ve hidrasyon için adım 5.2.1'i tekrarlayın.
    2. Peroksidaz blokajı için adım 5.2.3'ü tekrarlayın.
    3. Antijen alımı için adım 5.2.3'ü tekrarlayın.
    4. Koyun serumu blokajı.
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için koyun serumu bloke edici solüsyon ekleyin. Oda sıcaklığında bir nem odasında 30 dakika inkübe edin.
      2. PBST'de 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    5. Primer antikor inkübasyonu için adım 5.2.4'ü tekrarlayın.
    6. İkincil antikor inkübasyonu için adım 5.2.4.1'i tekrarlayın.
      1. Organoid alanı kaplamak için spesifik ikincil antikor solüsyonu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın.
        NOT: Bu adımdan deneyin sonuna kadar slaytları ışıktan koruyun.
    7. Floresan boya boyama
      1. Adım 5.3.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için floresan boya solüsyonu damlatın.
      2. Oda sıcaklığında bir nem odasında 10-20 dakika inkübe edin. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın.
    8. Çoklu boyama için 5.3.3-5.3.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. DAPI boyama
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için DAPI solüsyonunu bırakın. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın. Ardından, 5.3.4.2 adımını tekrarlayın.
      2. Slaytları 2 dakika sterilize suya batırın.
    10. Sürgülü montaj
      1. Organoid alanı kaplamak için damla antifade montaj ortamı. Lamel uygulayın.
    11. Bir slayt tarayıcı kullanarak dijital görüntüler elde edin ve bunları analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, ESCC tümör oluşumunun farklı aşamalarında organoid örneklemesi ve histolojik analizi tanımlar (Şekil 1). ESCC hastalarından normal özofagus mukozası, düşük dereceli intraepitelyal neoplazi (LGIN), yüksek dereceli intraepitelyal neoplazi (HGIN) ve tümör dokularından numune alınarak, tümör oluşumunun farklı aşamalarını temsil eden organoidler oluşturulabilir. Ayrıca, bu organoidlerin parafin gömülmesi ve kesitlendirilmesi gerçekleştirildi, ardından immünofloresan boyama yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Organoidlerin kurulması ve histolojik analizi, tümör ilerlemesinin modellenmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Protokol, tümöroluşumu 20'yi incelemek için mevcut yöntemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır. Geleneksel 2D hücre kültürü sistemlerinden farklı olarak, organoidler, in vivo koşulları daha iyi yansıtan karmaşık üç boyutlu mimariyi ve hücresel heterojenliği korur. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, insan dokusundan türetilen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir finansal veya çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, Kanser Hastanesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi (CAMS) ve Pekin Birliği Tıp Koleji'ndeki (PUMC) araştırmaya katılan tüm hastalara ve doktorlara teşekkür eder. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82203156'den Z.Z.'ye), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2023YFC3503200'den Z.Z.'ye) ve Çin Tıp Bilimleri Akademisi Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2023-I2M-QJ-002'den S.Z.'ye) tarafından finanse edilmektedir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m filtreMerckCat # SLGPR33RB
24 kuyulu plakaCorningCat # 3524
%4 ParaformaldehitBeyotimeCat # P0099
70 & mu; m steril süzgeçFalconCat # 352350
A83-01Tocris BioscienceCat # 2939
Gelişmiş DMEM / F12GibcoCat # 12634028
AgarSolarbioCat # A8190
Anti-Anti (Antibiyotik-Antimikotik)GibcoCat # 15240062
B-27 takviyesiGibcoCat # 17504044
CO2 inkübatörüThermo Kedi # 371GPCN
Kollajenaz IVGibcoKedi # 17104019
KriyostörKÖK HÜCREKedi # 07930
DMEMCorningKedi # 10-013-CV
EGFGibcoKedi # PHG0313
Fetal sığır serumuHücre Teknolojileri Kedi# 30070
G-418Sigma Kedi# A1720
JelatinSolarbioKedi # G8061
GlutaMAXGibcoKedi # 35050061
Büyüme faktörü azaltılmış MatrigelCorning Kedi# 354230
HE boyama kitiPekin Yili İnce Kimyasallar Co, LtdNA
HEPESGibcoKedi # 15630080
Histolojik kalemZsbioKedi#ZLI-9305
Higromisin BSigma Cat# 400050
İmmünohistokimyasal boyama kitiZSGB-BIOPV-8000
L-WRNATCCCRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 takviyesiGibcoCat # 17502048
Nötr sakız ZsbioCat # ZLI-9555
Opal 5 Renkli Manuel IHC KitiPANOVUEKedi # 10144100100
PBSMeilunBioKedi # MA0015
Tavşan Monoklon anti-PD-L1CSTKedi # 13684; RRID:AB_2687655
Tavşan Poliklonal anti-Ki67AbcamKedi# ab16667; RRID:AB_302459
Tavşan Poliklonal anti-KRT6AProteintech Kedi# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Koyun serumuZsbioKedi # ZLI-9056
TrypLE ExpressGibcoKedi # 12604021
TrypLE-EDTAGibcoKedi # 15400-054
Tüm slayt görüntü tarayıcıHamamatsuKedi # C13210
Y-27632Selleck Kimyasallar Kedi# S1049

Kaynaklar

  1. Zhang, S., et al. Tumor initiation and early tumorigenesis: Molecular mechanisms and interventional targets. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 149(2024).
  2. Sánchez-Danés, A., Blanpain, C. Deciphering the cells of origin of squamous cell carcinomas. Nat Rev Cancer. 18 (9), 549-561 (2018).
  3. Abnet, C. C., Arnold, M., Wei, W. -Q. Epidemiology of esophageal squamous cell carcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 360-373 (2018).
  4. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  5. Lin, D. -C., Wang, M. -R., Koeffler, H. P. Genomic and epigenomic aberrations in esophageal squamous cell carcinoma and implications for patients. Gastroenterology. 154 (2), 374-389 (2018).
  6. Chen, Y., et al. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (5), 903-918.e8 (2023).
  7. Chang, J., et al. Genomic alterations driving precancerous to cancerous lesions in esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (12), 2038-2050.e5 (2023).
  8. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nat Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  9. Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 1 (8), 545-559 (2023).
  10. Tang, X. -Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 168(2022).
  11. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  12. Yan, H. H. N., Chan, A. S., Lai, F. P. -L., Leung, S. Y. Organoid cultures for cancer modeling. Cell Stem Cell. 30 (7), 917-937 (2023).
  13. Jiang, Y., et al. Establishing mouse and human oral esophageal organoids to investigate the tumor immune response. Dis Model Mech. 17 (1), dmm050319(2024).
  14. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  15. Ko, K. -P., et al. Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion. Gastroenterology. 165 (3), 613-628.e20 (2023).
  16. Kornepati, A. V. R., Vadlamudi, R. K., Curiel, T. J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat Rev Cancer. 22 (3), 174-189 (2022).
  17. Jiang, X., et al. Role of the tumor microenvironment in PD-L1/PD-1-mediated tumor immune escape. Mol Cancer. 18 (1), 10(2019).
  18. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  19. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  20. Fujii, M., Sekine, S., Sato, T. Decoding the basis of histological variation in human cancer. Nat Rev Cancer. 24 (2), 141-158 (2024).
  21. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  22. Tong, L., et al. Patient-derived organoids in precision cancer medicine. Med. 5 (11), 1351-1377 (2024).
  23. Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  24. Sun, C. -P., Lan, H. -R., Fang, X. -L., Yang, X. -Y., Jin, K. -T. Organoid models for precision cancer immunotherapy. Front Immunol. 13, 770465(2022).
  25. Kobayashi, H., et al. The origin and contribution of cancer-associated fibroblasts in colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 162 (3), 890-906 (2022).
  26. Du, L., et al. Targeting stemness of cancer stem cells to fight colorectal cancers. Semin Cancer Biol. 82, 150-161 (2022).
  27. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  29. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (4), 203-222 (2020).
  30. Han, X., et al. Landscape of human organoids: Ideal model in clinics and research. The Innovation. 5 (3), 100620(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T m rogenez ModellemesiOrganoid K lt rMultiplex mm nofloresanBazal Membran MatrisiYass H creli KarsinomT m r Biyobelirte leriUzamsal MimariEpitel H creler
Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.