Yöntem makalesi

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal füzyon ve fisyonun dinamik dengesi, adenozin trifosfat (ATP) homeostazına ek olarak çok sayıda hücresel fonksiyonu etkileyen mitokondriyal homeostaza doğrudan katkıda bulunur. Bu nedenle, stres koşulları altında mitokondriyal morfolojinin değerlendirilmesi, mekanik araştırmalar için çok önemlidir. Bu çalışma, bir MitoTracker çözeltisinin hazırlanmasını, mitokondrinin boyanmasını, görüntüleme parametrelerinin optimizasyonunu ve morfolojik özelliklerin tespitini kapsayan mitokondriyal morfolojiyi analiz etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. MitoTracker'lar yaygın olarak kullanılan, uygun maliyetli mitokondriye özgü boyalardır. Bununla birlikte, mitokondriyal morfolojide bazı değişiklikler, algılanamayan ve mitokondrinin gerçek durumunu yansıtamayan uygunsuz kullanım nedeniyle meydana gelebilir. Bu nedenle, MitoTrackers kullanarak mitokondriyal morfolojideki değişikliklerin nasıl analiz edileceğini anlamak gerekir. Protokol, mitokondriyal morfolojik analiz protokolünü göstermek için 1-metil-4-fenilpiridinyum iyodür (MPP +) ile uyarılan SH-SY5Y hücrelerini kullandı. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, MPP + ile uyarılan hücreler, mitokondriyal ayak izinin azaldığını gösteren morfolojik parametrelerle daha küçük ve daha parçalanmış mitokondri sergiledi. Bu sonuçlar, MitoTracker boyamanın, çeşitli koşulları incelemek için uygulanabilecek (küçük değişikliklerle) mitokondriyal morfolojik analiz için etkili ve uygulanabilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal morfoloji, mitokondriyal füzyon ve fisyonun dinamik dengesi ile korunur ve bu nedenle, enerji homeostazını ve diğer birçok hücresel fonksiyonu etkileyerek nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve iltihaplanma gibi çeşitli patolojilere yol açar 1,2,3,4,5 . Mitokondriyal morfolojiyi gözlemlemek için, konfokal mikroskopla kullanılmak üzere hem problar hem de antikorlar dahil olmak üzere birkaç mitokondri seçici boyama geliştirilmiştir. Tetrametilrosamin ve rodamin 123 gibi bazı mitokondriye özgü problar, mitokondriyal membran potansiyeline (MMP) dayalı olarak işlev görür ve bu da MMP'yi bozan koşullar 6,7 çalışmalarında uygulanabilirliklerini sınırlar. Tersine, antikor boyama, sabit hücrelerde mitokondriyal morfolojiyi incelemek için MMP'den bağımsız morfolojik değerlendirme sağlar. Uygun bir leke, sabit hücrelerde mitokondriyal morfolojinin değerlendirilmesine izin verse de, bazı indükleyiciler tarafından bozulmuş canlı hücrelerde mitokondriyal morfolojinin incelenmesi zor olmaya devam etmektedir. Hücre geçirgen katyonik ve mitokondriye özgü bir floresan probu olan MitoTracker, hem canlı hem de sabit hücrelerin boyanmasına izin vererek bu zorluğa bir çözüm sunar. Bu prob, çeşitli hastalıkların çalışmalarında mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 8,9,10,11. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, prob üretici tarafından sağlanan yönergelere sıkı sıkıya bağlı olarak kullanıldığında bile, yüksek arka plan sinyali ve spesifik olmayan bağlama gibi sorunlar bildirmiştir. Bu gözlemler, mitokondriyal morfolojinin başarılı bir şekilde analiz edilmesi için numune hazırlama ve görüntü elde etmenin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır.

Mitokondriyal morfolojinin analizini kolaylaştırmak için çeşitli görüntü işleme programları ve algoritmaları geliştirilmiştir 12,13,14,15,16. Bu çalışmada, mitokondriyal morfolojiyi analiz etmek için ImageJ'de Mitokondriyal Ağ Analizi (MiNA) makro aracını kullandık13. Bu araç, birey sayısı (herhangi bir dalı olmayan yapılar), ağ sayısı (en az bir bağlantı pikseline sahip nesne sayısı), ortalama uzunluk (tüm çubukların ve dalların ortalama uzunluğu), medyan uzunluk (tüm çubukların ve dalların medyan uzunluğu), uzunluk standart sapması (bireysel uzunlukların standart sapması), ortalama Ağ Boyutu (ağ başına ortalama dal sayısı), medyan Ağ Boyutu (ağ başına dal sayısının orta değeri), ağ Boyutu Standart Sapması (ağ başına dal sayısının standart sapması) ve mitokondriyal ayak izi (arka plan ayrımından sonraki toplam sinyal alanı). Bu protokolde, mitokondriyal ayak izi temsili bir parametre olarak seçilmiştir.

Bu çalışmanın amacı, temel ayrıntılara odaklanarak mitokondriyal morfolojik analiz için adım adım bir protokol sağlamaktır. Bu protokolü göstermek için MPP+ ile indüklenen SH-SY5Y hücrelerini kullandık. MPP+, dopaminerjik nöronlarda mitokondriyal solunum zincirinin kompleks I'ini inhibe ederek mitokondriyal morfolojiye ve fonksiyonazarar verir 8,17. Bu çalışmada açıklanan morfolojik analiz protokolü, mitokondriyal ağların morfolojik özelliklerini tanımlamak için yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde edilmesini ve ilgili parametrelerin değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlık

  1. 1 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için MPP+'yı dimetil sülfoksit (DMSO) ile çözün ve karanlıkta -30 °C'de saklayın (bkz.
  2. 1 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için 50 μg MitoTracker'ı (MitoTracker Red CMXRos) 94 μL DMSO'da çözün. Stok çözeltisini birkaç mikrosantrifüj tüpüne alın ve daha fazla kullanılana kadar -30 ° C'de ışıktan koruyarak saklayın.
  3. SH-SY5Y hücrelerini, 37 ° C'de% 5CO ve% 95 hava ile nemlendirilmiş bir ortamda% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı F-12 ortamı ile şişelerde inkübe edin. Geçiş için, hücreleri% 0.05 tripsin çözeltisi ile 1 dakika ayırın ve 100 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.

2. MPP+ stimülasyon

  1. SH-SY5Y hücrelerini cam tabanlı konfokal tabaklara tohumlayın ve gece boyunca %1 (h/h) FBS ile takviye edilmiş DMEM/F12 ortamında tutun.
  2. Kültür ortamını değiştirin, ardından hücreleri 24 saat boyunca MPP + ile veya MPP + olmadan inkübe edin.

3. MitoTracker boyama

  1. DMEM / F12'yi önceden ısıtın, ardından 12 nM'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için MitoTracker stok çözeltisini DMEM / F50 ile seyreltin. Tüm prosedür boyunca çözeltiyi ışıktan koruyun.
  2. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve konfokal bulaşıkları 2x taze DMEM/F12 ile yıkayın.
  3. Her tabaktaki hücreleri 1 mL MitoTracker çalışma solüsyonu ile karanlıkta 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  4. MitoTracker çalışma solüsyonunu çıkarın ve 2x'i DMEM/F12 ile yıkayın.
  5. Her yemeğe 1 mL DMEM / F12 ekleyin ve görüntülemeden önce hücre inkübatöründe inkübe edin.

4. Konfokal mikroskop için görüntüleme parametreleri

  1. Sonraki işlemler için mikroskobu önceden dengeleyin. Toplama panelinin altında, uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayarak ışık yolu ile ilgili parametreleri ayarlayın.
  2. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: iğne deliği boyutu, 1,2 AU; piksel tarama boyutu, 1.024 x 1.024; piksel bekleme süresi, 2,4 μs (ortalama 2x)  (kalibrasyon amaçları için tutarlı tutun).

5. Görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesi

DİKKAT: Görünür ve/veya görünmez bir lazerden gelen hem doğrudan hem de saçılan radyasyona gözün maruz kalmasından kaçının.

  1. Fototoksisiteyi önlemek için bir plan apokromatik 60x objektif lensi (1.4 NA) kullanarak hücrelere odaklanmak için halojen ışığı kullanın.
  2. Lazer gücünü ve yüksek voltajı (HV) doygunluk seviyesinin hemen altına ayarlayın, yakınlaştırma faktörünü 3'e ayarlayın ve ardından görüntüleri yakalayın.
  3. Herhangi bir ayarı değiştirmeden görüntü yakalamak için ilgilenilen bölgeyi hareket ettirin ve hücrelere odaklanın.

6. Veri analizi

NOT: Veriler, MiNA eklentisi13 ile önceden yüklenmiş ImageJ kullanılarak analiz edilmiştir. Doğru ilgili ölçümler elde etmek için, görüntüler temiz ve parlak boyama ile bağımsız olarak çözülmüş mitokondriyi yakalamalıdır.

  1. İkili dönüştürme ve iskeletleştirmeden önce görüntü kalitesini artırmak için görüntüyü açın ve ön işlem gerçekleştirin. Tek bir hücrenin alanını seçmek için ROI aracını kullanın. İşlemi Uygulayın | Filtreler | Keskinliği artırmak için Keskinliği Azaltma Maskesi işlevi ve İşlem | Gürültünün aşırı yükseltilmesini azaltmak için Kontrastı Geliştir özelliği. Özellikle tuz ve karabiber gürültüsünü gidermek için İşlem | Filtreler | Medyan fonksiyonu (bkz. Ek Şekil S1).
  2. Tanımlayıcı parametreleri hesaplamak üzere basitleştirilmiş bir morfolojik model oluşturmak için, görüntüyü eşikleme yoluyla ikiliye dönüştürün ( Süreç | İkili | İkili Yap) ve ardından İskeletleştirme işlevini kullanarak ikili görüntüyü iskeletleştirin ( İşlem | İkili | İskeletleştirme) (bkz . Ek Şekil S2).
  3. Analiz | İskelet | İskelet (2D/3D) işlevini analiz edin. İskeletleştirilmiş görüntüdeki dokuz tanımlayıcı parametreyi hesaplamak için MiNA aracını kullanarak analizi basitleştirin (bkz. Ek Şekil S3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, birbirine bağlı üç optimizasyon modülü aracılığıyla mitokondriyal morfolojik analiz için ayrıntılı, adım adım bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir: numune hazırlama protokollerinin standardizasyonu, konfokal mikroskopi görüntüleme için optik parametrelerin sistematik optimizasyonu ve hesaplamalı görüntü işleme kılavuzları. Optimal numune hazırlama protokolü, güvenilir mitokondriyal görüntüleme verileri elde etmek için kritik öneme sahiptir. MitoTracker Red CMXRos konsantrasyonlarının sistematik değerlendirm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, stres koşulları altında canlı hücrelerde mitokondriyal morfolojiyi analiz etmek için sistematik bir metodoloji oluşturmaktadır. Mitokondriyal görüntülemede önemli prosedür adımları şunları içerir: uygun bir MitoTracker prob konsantrasyonu, görüntü elde edilmeden önce konfokal bulaşıkların iyice yıkanması, hücresel durumdaki bozulmaların en aza indirilmesi ve uygun görüntüleme parametrelerinin ayarlanması.

Daha yüksek konsantrasyonlarda MitoTracker ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81974501) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-metil-4-fenilpiridinyum iyodür (MPP+)Macklin HakkındaM875357Oksidatif stresi indüklemek için kullanılır
Konfokal çanakYUVA801001Hücreleri kültürlemek için kullanılır
Konfokal mikroskopNikonC2Görüntü yakalamak için kullanılır
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12ThermoFisher Bilimsel11320033Hücrelere besin sağlamak için kullanılır
Dimetil sülfoksit (DMSO)BeyotimeST038 SerisiMitotracker probunu çözmek için kullanılır
Fetal sığır serumu (FBS)ThermoFisher BilimselA3161001CHücrelere besin sağlamak için kullanılır
ResimJUlusal Sağlık EnstitüleriResimJMitokondriyal morfolojiyi analiz etmek için kullanılır
MitoTracker Kırmızı CMXRosThermoFisher BilimselM7512 SerisiMitokondriyi görselleştirmek için kullanılır
Fosfat Tampon Salin (PBS)ThermoFisher BilimselC10010500BTKonfokal bulaşıklardaki hücreleri yıkamak için kullanılır
SH-SY5Y hücresiATCCCRL-2266 (İngilizce)Mitokondriyal morfolojiyi analiz etme iş akışını göstermek için kullanılır
TI-SH-U Sahne AdaptörüNikonMEC59110Numuneleri sabitlemek için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MitoTracker StainingSH SY5Y CellsMitochondrial FusionMitochondrial FissionFluorescence ImagingSkeletonization AnalysisMPP StimulationImage Segmentation

İlgili makaleler