Yöntem makalesi

Glikan Analizi için Microglia'dan Mitokondriyal Hazırlık

DOI:

10.3791/68179

⸱

30 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglial hücrelerden saflaştırılmış mitokondrinin hazırlanması, N-glikan salınımı için mitokondriyal proteinlerin izolasyonu ve yüksek çözünürlüklü doğru kütle analizörü kütle spektrometresine bağlı kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu kullanılarak hücre altı, mitokondriyal glikanların hızlı tespiti için bir protokol geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrogliadaki mitokondriyal proteinlerin glikozilasyon modellerini anlamak, nörodejeneratif hastalıklardaki rollerini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada, kültürlenmiş mikrogliadan izole edilen mitokondriyal proteinlerin glikomik analizi için yeni ve yüksek verimli bir metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, mikroglial kültürlerden mitokondrinin izolasyonunu, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesini, ardından glikan tespitini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş bir protein ekstraksiyonunu ve mitokondriyal glikozilasyonun ayrıntılı profillerini sağlamak için kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (IR-MALDESI) yüksek çözünürlüklü doğru kütle (HRAM) kütle spektrometresini içerir.

Bu protokol, izolasyon sırasında mitokondriyal bütünlüğün korunmasının önemini vurgular ve ekstraksiyondan sonra mitokondriyal saflığın ölçülmesi de dahil olmak üzere tekrarlanabilirliği sağlamak için sıkı kalite kontrolü kullanır. Bu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili mitokondriyal değişiklikler hakkında fikir veren in vitro çeşitli deneysel koşullar altında mikroglial mitokondrideki glikozilasyon değişikliklerinin kapsamlı bir şekilde profillenmesine izin verir. Bu yaklaşım, diğer in vitro tedavilere, diğer kültürlenmiş hücre tiplerine veya birincil hücrelere uyarlanabilir. Bu standartlaştırılmış yaklaşım sayesinde, mikroglial mitokondriyal glikanların anlaşılmasını ilerletmeyi ve daha geniş nörodejeneratif araştırma alanına katkıda bulunmayı amaçlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, beyindeki baskın yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir ve yetişkin beynindeki hücrelerin %10-15'ini oluşturur 1,2. Beyin mikro çevresini dinamik olarak izlemek ve beyin homeostazını sürdürmek için normal beyin fonksiyonunu düzenlemek için reseptör repertuarlarını kullanırlar3. Mikroglia, mikro çevrelerindeki değişikliklere karşı çok hassastır ve hücre morfolojisinde, immünofenotip ve fonksiyonda patolojik durumlar veya çeşitli stimülasyonlarla değişikliklere uğrar. Mikroglial aktivasyon durumları, fagositoz, sitokin üretimi veya doku onarımı gibi işlevleri için gerekli olan hücresel enerji taleplerinden etkilenir. Bu nedenle, hücresel enerji metabolizması, mikroglial fonksiyondaki değişikliklerin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar4. Mikroglial disregülasyon, proinflamatuar sitokinlerin (ör., IL-1β, TNF-α) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı salınımına yol açarak beyni nöroinflamasyona yatkın hale getirir 5,6. Kronik mikroglial düzensizlik ve bunun sonucunda ortaya çıkan nöroinflamatuar ortam, nörodejenerasyon için bir temel oluşturur7.

Beyin, vücut ağırlığının sadece %2'sini, ancak vücudun toplam enerji tüketiminin %20'sini oluşturur. Mitokondri, beyin hücrelerinde birincil enerji kaynağıdır ve hem akut hem de kronik beyin bozukluklarının patogenezinde kilit oyuncular olarak işlev görür8. Önceki çalışmalar, yaşlanmada9 mikroglial aktivasyon ile metabolik işlev bozukluğu ile Alzheimer hastalığı10,11 gibi yaşa bağlı bozukluklar arasında güçlü bir ilişki kurmuş ve mitokondrinin hücresel yaşlanma ve nörodejenerasyondaki önemli rolünü vurgulamıştır. Bozulmuş mitokondriyal fonksiyon, yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklar sırasında enerji üretiminin azalmasına, oksidatif stresin artmasına ve nöroinflamasyonun artmasına neden olur.

Kapsamlı araştırmalar mitokondrinin enerji metabolizması, yaşlanma ve beyin bozukluklarındaki rolünü aydınlatmış olsa da, mitokondriyal biyoloji ve fonksiyonda glikosilasyon gibi yaygın translasyon sonrası modifikasyonların rolü yeterince araştırılmamıştır. Glikan adı verilen şeker parçalarının glikozilasyon enzimleri tarafından proteinlere enzimatik olarak eklenmesi olan glikozilasyon, mikroglia da dahil olmak üzere çoğu beyin hücresinde en yaygın translasyon sonrası modifikasyondur. Aktive edilmiş mikroglia, hücre içi veya hücre yüzeyi glikan ekspresyonunu düzenleyerek enflamatuar uyaranlar altında bağışıklık fonksiyonlarını modüle eder12. Stimülasyon sonrası mikroglia tarafından sergilenen pro- ve anti-enflamatuar tepkiler de glikanlar13 tarafından düzenlenir. Mitokondriyal proteinler ayrıca işlevlerini ve lokalizasyonlarını düzenleyen bu glikan modifikasyonlarına sahiptir. Bununla birlikte, mikrogliadaki hücreye özgü mitokondriyal glikozilasyon modellerinin ayrıntılı analizi, hücre altı glikozilasyonun araştırılmasındaki teknik zorluklar nedeniyle eksiktir. Mikroglial fenotipi modüle etmede glikozilasyonun iyi karakterize edilmiş rollerine rağmen, glikanların mitokondriyal fonksiyonu ve ardından mikrogliadaki hücresel immünofenotip modüle etmedeki rolü tam olarak anlaşılamamıştır.

Mitokondriyal protein glikozilasyonunu araştıran sınırlı çalışmalar, öncelikle glikosilasyon paternlerinin lektin bazlı tanımlanmasına odaklanmıştır. Lektinler, glikan bileşimi hakkında ayrıntılı bilgi sağlama özgüllüğü ve yeteneğinden yoksun olan biyomoleküler glikan kısımlarını14,15 bağlayan glikan bağlayıcı proteinlerdir. Kütle spektrometrik modaliteleri, lektin analizinin sunduğu analitik zorlukların üstesinden gelmek için glikan bileşimlerinin ayrıntılı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Böyle bir modalite, kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (IR-MALDESI), nötr türleri desorbe etmek ve onları ortogonal bir elektrosprey tüyüne tabi tutmak için biyolojik numunelerde16 bulunan suyu rezonans olarak uyarmak için bir orta IR lazer kullanarak hibrit bir iyonizasyon stratejisi kullanır, ardından yüksek çözünürlüklü doğru kütle Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir. IR-MALDESI daha önce doku metabolitlerinin17 doğrudan analizi için, hızlı analiz18, yumuşak iyonizasyon yöntemi ve klorlu glikan eklentilerinin19 izotopik dağılım modellerine dayalı olarak N-bağlı glikanların sialik asit içeriğinin tahmin edilebilirliği gibi belirgin avantajları ile gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu platformun hücre altı glikanların doğrudan analizi için adaptasyonu gösterilmemiştir.

Burada, mikroglial hücrelerden mitokondriyal izolasyon, mitokondriyal N-glikanların izolasyonu ve IR-MALDESI kütle spektrometresi kullanılarak mitokondriyal N-glikan tespiti ve analizi için yüksek verimli bir protokol bildiriyoruz. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonda glikozilasyonun rolüne ilişkin yeni içgörülerin ortaya çıkarılmasında ve potansiyel olarak nöroinflamatuar ve nörodejeneratif bozukluklar için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde temel olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BV2 Mikroglial hücre hattı kültürü

  1. BV-2 hücrelerini (C57BL / 6 farelerinden türetilen mikroglial hücreler) %10 Fetal Sığır serumu (FBS), %1 Penicillium-Streptomisin (PenStrep) ve %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) ile desteklenmiş DMEM düşük glikoz ortamında koruyun.
  2. Hücreleri T-175 şişelerinde büyütün ve% 70-80 birleşmeye ulaşmalarına izin verin.
  3. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 5 dakika boyunca hücre ayrışma enzimleri ile inkübe ederek hücreleri bölün, ardından enzimlerin eşit hacimde hücre ortamı ile inaktivasyonu ve hücrelerin oda sıcaklığında (RT) 500 × g'da 5 dakika santrifüjlenmesi ile hücreler bölün.
    NOT: Burada kullanılan hücre ayrışma enzimleri, BV2 hücrelerinde tripsin'den daha naziktir ve hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu korumak için kullanılabilir.
  4. Ortamı aspire edin, hücre peletini 1 mL büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Bu adımda hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullandık.
  5. Mitokondriyal izolasyonu gerçekleştirmek için, hücre peleti 2 × 107 (20 milyon hücre/topak) içeriyorsa devam edin.

2. Mitokondrinin mikroglial hücrelerden izolasyonu

NOT: İşlem boyunca her şeyi buz üzerinde tutarak hızlı çalışın. Mitokondriyal izolasyon için kullanılan mitokondriyal izolasyon kitinin üç bileşeni vardır: Reaktif A (hücre lizis tamponu), Reaktif B (stabilize edici tampon) ve Reaktif C (mitokondriyal yıkama tamponu). Kullanmadan hemen önce reaktif A'ya ve reaktif C'ye proteaz inhibitörleri ekleyin.

  1. Pelet 2 × 107 hücre, hasat edilen hücreleri 2.0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyerek santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın.
  2. 800 μL mitokondriyal izolasyon reaktifi A (hücre lizis tamponu) ekleyin, orta hızda 5 saniye girdap yapın ve tüpü tam olarak 2 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: 2 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
  3. 10 μL mitokondriyal izolasyon reaktifi B (stabilize edici tampon) ekleyin, 5 saniye boyunca maksimum hızda girdap yapın ve tüpü 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, her dakika maksimum hızda girdap yapın.
  4. 800 μL mitokondri izolasyon reaktifi C (mitokondriyal yıkama tamponu) ekleyin, karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin ve tüpü 700 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Girdap yapmayın.
  5. Süpernatanı 2.0 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 × g'da döndürün.
  6. Süpernatanı (sitozolik kısımlar) yeni bir tüpe aktarın. Pelet, izole edilmiş mitokondriyi içerir.
  7. Pelete 500 μL Mitokondri izolasyon reaktifi C ekleyin ve 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleyin.
  8. Peleti protein miktar tayini ve işlenmesi için kullanın veya daha fazla kullanıma kadar peleti -80 °C'de saklayın.

3. MikroBCA testi kullanılarak protein tahmini

NOT: Bu protokol için protein tahmini, farklı reaktifler ve tahliller kullanılarak gerçekleştirilebilir. Sitozolik veya mitokondriyal proteinlerin miktar tayini, tahlilde kullanılan toplam protein konsantrasyonuna karşı normalleştirilerek gerçekleştirilebilir.

  1. 0 μg/mL ile 200 μg/mL (0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) arasında sığır serum albümini (BSA) standartlarını ve sadece lizis tamponu ile boşlukları hazırlayın.
  2. Numuneleri içeren düz tabanlı 96 oyuklu plakaya her standarttan 150 μL ekleyin.
  3. 25 kısım Mikro BCA Reaktifi MA (bikinkoninik asit (BCA) çözeltisi) ve 24 kısım Reaktif MB (bakır sülfat çözeltisi) ile 1 kısım Reaktif MC (stabilize edici tampon) (25:24:1, Reaktifler MA:MB:MC) karıştırın çalışan bir reaktif oluşturmak için. Her numuneye ve standarda 150 μL karışık BCA reaktifi ekleyin.
  4. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
  5. 562 nm'de absorbansı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın ve protein konsantrasyonunu standart eğri ile ölçün. Numune protein konsantrasyonlarını elde etmek için boş standart absorbansı diğer tüm bireysel standartların ve bilinmeyen numune replikasyonlarının absorbans ölçümünden çıkarın.

4. Mitokondriyal preparat kalite kontrolü (western blot)

  1. Protein miktar tayinini gerçekleştirmek için radyoimmünopresipitasyon test tamponu (RIPA) tamponundaki mitokondriyal peleti yeniden süspanse edin. Mikro BCA testini kullanarak her numune için protein konsantrasyonunu belirleyin.
  2. Numuneleri numune tamponunda 94 ° C'de5 dakika denatüre edin.
  3. Moleküler ağırlık işaretleyicisi ile birlikte prekast jellere eşit miktarda (20 μg) mitokondriyal protein yükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Jeli 100 V'ta 50 dakika çalıştırın.
    NOT: Çalışma süresi değişebilir, bu nedenle proteinler numune tamponundaki boya ile gösterilen jelin sonuna ulaştığında jeli durdurduğunuzdan emin olun.
  5. 20 V'ta 7 dakika boyunca bir western blot transfer sisteminde kuru transfer protokolünü kullanarak proteinleri jelden bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
  6. Membranı çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici solüsyonu (Tablo 1) kullanarak bloke edin.
  7. 4 oC'de gece boyunca bloke edici tamponda membrana uygun primer antikor dilüsyonları ekleyin (COXIV = 1: 3.000, GAPDH = 1: 3.000).
    NOT: Mitokondriyal preparatta nükleer, endoplazmik retikulum (ER) kontaminasyonunun yokluğu, batı lekelerinde lamin (nükleer belirteç) ve ERp57 (ER belirteç) gibi ek belirteçler kullanılarak test edilebilir.
  8. Membranı yıkama tamponu ile 3 x 15 dakika yıkayın (Tablo 1).
  9. Membranı, HRP konjuge ikincil antikorun uygun seyreltilmesi ile oda sıcaklığında oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde inkübe edin
  10. Membranı yıkama tamponu ile 3 x 15 dakika yıkayın.
  11. Geliştirme için bir kemilüminesan substrat kiti kullanın.
  12. Bir jel ve membran görüntüleyici kullanarak membranı tarayın.

5. Mikrogliadan N-glikan ekstraksiyonu için mitokondriyal protein izolasyonu

  1. İzole edilmiş mitokondriyi 50 μL protein izolasyon tamponunda (Tablo 1) yeniden süspanse edin ve 20 dakika buz üzerinde bırakın.
  2. Üç kez aspire edin ve dağıtın ve buz üzerinde 20 dakika bırakın (kullanmadan önce girdap). Mitokondriyal pelet tamamen çözünmemişse, 50 μL daha izolasyon tamponu ekleyin ve aynı tüpe toplayın.
  3. 13.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı geri kazanın, -80 °C'de en az 1 saat dondurun ve bir vakum yoğunlaştırıcıda mümkün olduğunca kurutun.
  5. IR-MALDESI için PNGase özet tamponunu (Tablo 1) kullanarak glikan izolasyonundan önce yeniden askıya alın.

6. IR-MALDESI için mitokondriyal N-glikan preparatı

  1. 25-250 μg protein (maksimum 250 μL hacimde) izole edilmiş mitokondriyal proteinleri 10 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme (MWCO) filtresine yükleyin.
  2. Filtredeki her numuneye 2 μL 1 M ditiotreitol (DTT) ekleyerek glikan kısımlarını açığa çıkarmak için protein numunelerini azaltın.
  3. Numuneyi 200 μL PNGase sindirim tamponu ile seyreltin ve filtreyi bozmamak için hafifçe girdaplayın.
  4. Numuneyi 56 °C'de 30 dakika inkübe ederek mitokondriyal proteinleri denatüre edin.
  5. Mitokondriyi ~200 mM'lik bir nihai konsantrasyon verecek şekilde alkillemek için 50 μL 1 M iyodoasetamid kullanın ve 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
  6. Denatüre mitokondriyal yöntemleri daha da konsantre etmek için, numuneleri 40 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
  7. Numuneyi 100 μL PNGase sindirim tamponu ile yıkayın.
  8. Glikoproteini filtre üzerinde 14.000 × g'da 20 dakika boyunca konsantre edin ve akışı atın. Yıkama ve konsantre adımını 2x, toplam 3x olacak şekilde tekrarlayın ve filtrenin ölü hacminde (~5 μL) bir konsantre elde edin. Tüm akışları atın.
  9. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra toplama şişesini atın. Gelecekteki tüm eluentler ve yıkamalar için yeni bir toplama şişesi kullanın.
  10. Glikanları denatüre mitokondriyal glikopatlardan ayırmak için taze bir toplama şişesine aktarın ve filtreye 2 μL gliserol içermeyen PNGase (75.000 birim / mL) ekleyin. 98 μL PNGase digest tamponu ekleyin, toplam hacmi 100 μL'ye getirin ve filtre üzerinde yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın.
  11. Mitokondriyal proteinlerden tüm N-glikanları enzimatik olarak parçalamak için numuneleri 37 ° C'de 18 saat inkübe edin.
  12. Numuneyi 20 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyerek salınan mitokondriyal N-glikanları elute edin.
  13. Filtreye 100 μL PNGase sindirim tamponu ekleyerek mitokondriyal glikanları yıkayın ve 20 °C'de 20 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin. Kalan N-glikanları içeren yıkamayı, eluent ile aynı toplama şişesinde toplayın. 2x tekrarlayın ve filtreyi toplama şişesinden çıkarın.
  14. Mitokondriyal glikan örneklerini -80 °C dondurucuda donana kadar (30-60 dakika) inkübe edin ve bir vakum yoğunlaştırıcıda (400 μL için 4-6 saat) oda sıcaklığında tamamlanana kadar kurutun.
    NOT: N-glikanlar, analizden önce 6 aya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  15. Kurutulmuş N-bağlı glikanları IR-MALDESI analizinden hemen önce 50 μL LC / MS dereceli suda yeniden süspanse edin.

7. IR-MALDESI kütle spektrometresi ile salınan glikanların tespiti

  1. Deneyin her günü kütle kalibrasyonu yapın. Kalibrasyon solüsyonunu bir şırınga pompasına yükleyin ve 1,2 μL/dk hızında itin. Hem pozitif hem de negatif modlarda kütle kalibrasyonu için kararlı bir elektrosprey bulutu elde etmek için 3,5 kV'luk bir voltaj uygulayın.
  2. 5 μL yeniden süspanse edilmiş mitokondriyal glikanları bir Teflon mikrokuyu slaytı üzerindeki bir numune noktasına pipetleyin.
  3. Patlama başına 1,8 mJ enerji ile ablasyon için 2,97 μm dalga boyunda çalışan bir orta IR lazer kullanın.
  4. Negatif iyonizasyon modunda N-glikanları iyonize edin ve tespit edin. 3,2 kV voltajda 2 μL/dk akış hızına sahip stabil bir elektrosprey tüyü oluşturmak için %60 asetonitril ve 1 mM asetik asitten oluşan elektrosprey solvent kullanın.
  5. Analizi gerçekleştirmek için, IR-MALDESI'yi m/z 200'de 240.000FWHM'lik bir kütle çözme gücüne ayarlanmış bir HRAM kütle spektrometresine bağlayın ve negatif iyonizasyon modunda 500 ila 2.000 m/z arasında analiz edin.
  6. Otomatik kazanç kontrolünü (AGC) kapatın ve 90 ms'lik sabit bir enjeksiyon süresi ayarlayın. Yüksek kütle ölçüm doğruluğu (MMA) elde etmek için her spektrumun gerçek zamanlı dahili kalibrasyonu için EasyIC kaynağını kullanın.

8. Mitokondriyal N-glikan veri analizi

  1. Minimum iyon akısı eşiği 1.000 iyon/s olan çift ve üç yüklü iyonları belirlemek için monoizotopik kütleleri arayarak ve izotopik dağılımları onaylayarak N'ye bağlı glikanları manuel olarak tanımlayın.
  2. Ham kütle spektrumlarını m/z oranlarından nötr monoizotopik kütlelere dönüştürün.
  3. Potansiyel glikan bileşimlerini belirlemek için monoizotopik kütleleri çevrimiçi bir oligosakkarit yapı tahmin aracına yükleyin. Deneysel olarak seçilmiş bir glikomik veritabanı20 kullanarak ek açıklamaları onaylayın; her tanımlamanın 2,5 ppm MMA marjı içinde olduğundan, çekirdek N-bağlı glikan yapısını (Hex3HexNAc2) içerdiğinden ve pentoz, KDN veya HexA monosakkaritlerini hariç tuttuğundan emin olun.
  4. SNFG isimlendirme21'i kullanarak onaylanmış glikan yapılarını çizin.
  5. Ham kütle spektrumlarından glikanların nispi bolluğunu elde edin ve iyonlar/s/μg elde etmek için μg cinsinden mitokondriyal protein miktarına karşı normalleştirin.
  6. Klor eklentilerinin sayısını belirlemek için N-bağlı glikanların teorik ve deneysel dağılımları arasındaki uyumun iyiliğini test etmek için Ki-kare analizini kullanın. Bu, sialik asitlerin19 sayısının doğrudan belirlenmesine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, kütle spektrometrik glikan analizi için BV2 mikroglial hücre hattından mitokondrinin izolasyonunda yer alan adımların şematik bir taslağını temsil etmektedir. Mikroglial hücrelerin aynı başlangıç yoğunluğundan farklı mitokondriyal preparatlar arasındaki mitokondriyal protein izolasyonunun tekrarlanabilirliği, mikro BCA testi kullanılarak tahmin edilen mitokondriyal protein konsantrasyonu arasında önemli bir fark göstermeyen Şekil 2'de temsil edilmektedi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, beynin yerleşik bağışıklık hücreleridir ve glikan modifikasyonları, mikroglia'nın immünofenotipini ve işlevini modüle eder. Bu bağışıklık fonksiyonları, ağırlıklı olarak mitokondri tarafından sağlanan önemli hücresel enerji gerektirir. Özellikle, mitokondriyal proteinler ayrıca, hücre altı glikozilasyonun araştırılmasındaki teknolojik zorluklar nedeniyle önemli ölçüde az çalışılmış olan glikan modifikasyonları da sunar. Mitokondriyal glikozilasyonu araştıran çoğu çalışma, glik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, NCSU'daki Muddiman Laboratuvarı'nda yüksek lisans öğrencisi olan Seth Eisenberg'e kütle spektrometrik protokolünün video kaydına yardımcı olduğu için teşekkür eder. Bu araştırma kısmen, Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'ndeki Mühendislik Okulu İnovasyon Üyeleri Programı tarafından desteklenmiştir, AG068309 D.J.T.'ye ve R01GM087964-12'den DCM'ye kadar. Bu el yazmasındaki şemalar BioRender kullanılarak çizilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Equipment
Amersham 600 görüntüleyiciCytvia 29194217Jel ve membran görüntüleyici
Kontes 3 otomatik hücre sayacıFisher ScientificX003SZ1LY9
Kuru Banyo Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher scientific 
i-Blot2 Jel Transfer CihazıInvitrogenIB21001Western blot transfer sistemi
Ters mikroskopHücre Tedavisi04355223EA
Mikroplaka okuyucu82050-760
Mini jel tankıInvitrogenA25977
Açık Hava RockerFisher Marka88861025
Pipet çocuk BioTek229310
Vorteks karıştırıcıIntegra- VWR
Mitokondri izolasyon reaktifleri 
Mitokondriyal İzolasyon kitiThermofisher scientific 89874
Fosfotaz İnhibitörüThermofisher scientific 
Proteaz İnhibitörüThermofisher scientific 1861281
N-glikan izolasyonu ve IR-MALDESI reaktifleri
Asetik asit Fisher ScientificA11350%50 ESI çözücü
Asetonitril &Sigma Aldrich34851-4L1 mM ESI çözücü
Amonyum bikarbonat ve nbsp;Fisher ScientificA643500100 mM
Kalibrasyon ÇözeltisiThermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Ditiyotreitol Sigma AldrichAC4263801001 M
İyodoasetamidSigma AldrichA322-10VL
LC/MS sınıfı suThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP010 75000 U/mL, N-glikan salınımı için enzim 
N-glikan izolasyonu ve IR-MALDESI sarf malzemeleri< / em>< / strong>
Amicon santrifüj filtrelerFisher Scientific UFC50102410 kDa MWCO
Kütle spektrometresiOrbitrap Exploris 240
Mid-IR LazerJGM Associates, Burlington, MA, ABD
Teflon mikrokuyu slaytıProsolia, Indianapolis, IN, ABD
strong>N-glikan analiz yazılımları
GlycoMod Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy 
https://glyconnect.expasy.org/Protein izolasyonu ve western blot sarf malzemeleri  < / em>< / güçlü >
Basix jel yükleme uçları (10 & mikro; L) Basix13-611-102
Basix jel yükleme uçları ( 200 & mikro; L) Basix13-611-116
Hücre sıyırıcıVWR labs14-388-100
i-Blot NC düzenli yığınlarInvitrogenIB23001
i-Blot2 PVDF Düzenli YığınlarInvitrogenIB24001
10  &mikro; L mikropipetFisher ScientificFBE00010
20 & mikro; L mikropipetInvitrogenFBE00020
200  &mikro; L mikropipet Fisher MarkaFBE00200
1000 & mikro; L mikropipetFisher markaFBE01000
10  &mikro; L pipet uçları VWR laboratuvarları76322-528
20  &mikro; L pipet uçlarıVWR labs76322-134
200  &mikro; L pipet uçları VWR laboratuvarları76322-150
1000  &mikro; L pipet uçlarıVWR labs76322-154
Kuyu plakası ve nbsp;Fisher marka14-388-100
Protein izolasyonu ve western blot reaktifleri 
Actin antikoru ( Ev sahibi : Tavşan )Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri8457T
Anti-Tavşan IgG HRP Bağlantılı Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri7074S
Bolt %4-12 Bis-Tris PlusInvitrogenNW04120BOX
Sığır Serumu AlbüminFisher biyoreaktifleriBP9700-100
COXIV antikoru ( Ev sahibi : Tavşan)Hücre Sinyal Teknolojileri4844S
GAPDH antikoru ( Konak : Tavşan)Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri2118S
MicroBCA protein tahlil KitiThermofisher scientific 23235
Nupage MOPS SDS Çalışma Tamponu [20x]Thermofisher scientific NP0001
SAYFA Cetvel önceden boyanmış protein merdiveniThermofisher scientific 815-968-0747Seyreltme = 7  &mikro kullanın; İlk kuyuya yüklemek için L
Fosfat tamponlu tuzlu su Aniara DiagnosticsA12-9423-510x tozdan 1x PBS hazırlayın 
Pierce ECL Western Blotting SubstratThermofisher scientific 32106Kemilüminesan substrat kiti
RIPA TamponThermofisher scientific 89901
Numune TamponuNovexB0007Cıvata LDS numune tamponu, numunenin numune tamponuna 3: 1 oranında hazırlanır
Tween-20MP BiyomedikalTWEEN201
Doku kültürü sarf malzemeleri 
Countess SlaytlarAvantor229411
Eppendorf tüpleriCell Treat414004-265612-5884
2 mL aspirasyonlu pipetVista lab5090-0010E
5 mL serolojik pipet Fisher Scientific13-678-11D
10 mL serolojik pipet Basix13-678-11E
25 mL serolojik pipetVista labFB012937
50 mL serolojik pipetVista lab14955233
15 mL Konik tüpAvantor229225A
50 mL konik tüpHücre tedavisi4190-0050
T-75 cm2 Doku kültürü şişesiFisher Scientific
T-180 cm2 Doku kültürü şişesiFisher ScientificFB012939
Doku kültürü reaktifleri  < / em>< / güçlü >
BV2 mikroglial hücre hattı Yaratıcı Biyoarray CSC-I2227ZC57 / BL6 neonatal mikroglia'dan türetilen Ölümsüzleştirilmiş Fare Mikrogliası (BV2);
Hücre ayrışma enzimleri Thermofisher bilimsel 12563029TrypLE 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) Düşük Glikoz Ortamı Gibco10567014
Fetal SığırSerumu CytivaSH30071.03HI
Minimum Esansiyel Orta (MEM) Esansiyel Olmayan Amino AsitlerGibco11140050
Penicillium StreptomisinCytiviaSV30010
Fosfat tamponu salinCorning21-040-CV
Tripan Mavi leke% 0.4İnvitrojenT10282
888700031861274<FB012937 Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroglial MitokondrilerMitokondriyal zolasyonN Glikan TespitiIR MALDESIY ksek z n rl kl K tle SpektrometrisiProtein EkstraksiyonuMitokondriyal GlikozilasyonN rodejeneratif Hastal klarKalite Kontrol

İlgili makaleler