Method Article

Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı Kullanılarak İçme Suyundaki Mikroplastiklerin Multimodal Analizi

DOI:

10.3791/68200

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1SiMPore Inc., 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3URnano, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, içme suyundaki kirletici partiküllerin düzenli bir şekilde yakalanması ve analizi için optik olarak şeffaf ve düz bir alt tabakayı sergileyen bir protokol sunuyoruz. Burada sunulan Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı (SNAP): sıvı ortamdaki partiküllerin yakalanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanması için esnek bir boru hattıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplastik kirliliğinin insan gıda ve su kaynaklarındaki biyolojik etkisi büyük ölçüde bilinmemektedir ve içme suyu kaynakları bu mikroplastik kirlenmeden muaf değildir. Burada, içme suyundaki mikroplastikleri yakalamak, ölçmek ve tanımlamak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım gösteriyoruz. Aynı substrat üzerinde bireyselleştirilmiş, ölçülebilir ve çok modlu parçacık analizi için asılı parçacıkları düzlemsel bir gözlem alanında birleştiren önemli bir "konsantrasyon faktörü" sağlayan yeni Silikon nitrür nanomembranlardan yararlanan Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı (SNAP) olarak adlandırılan analitik bir iş akışı sunuyoruz. SNAP'in birincil avantajları, geleneksel olarak boyutlandırılmış filtre disklerine yerleştirilmiş ultra ince, Silisyum nitrür bazlı membranların kullanılmasından kaynaklanmaktadır ve polimerik MP'lerin polimerik olmayan bir arka plan üzerinde doğrudan yakalanmasını ve analiz edilmesini sağlar. Rochester, NY bölgesinden elde edilen içme suyu örnekleri, konut musluk kaynaklarından toplandı ve SNAP kullanılarak analiz edildi. Her numunedeki parçacıklar, optik ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Raman spektroskopisi ve enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDX) ile karakterize edildi ve tanımlanan çeşitli bileşenler, yakalanan toplam parçacıklarla orantılı olarak ölçüldü.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplastikler, 1,2 boyutunda beş milimetreden daha küçük olan sentetik polimerler olarak tanımlanır. Mikroplastik (MP) kirliliği, giderek artan bir insan sağlığı, çevre ve ekolojik sorundur. MP kontaminasyonu her türlü su kaynağında bulunmuştur; Tatlı su, okyanuslar ve hatta içme suyu kaynakları3. MP'ler, birincil plastik kaynaklarının4 yanı sıra sentetik tekstillerin 5,6,7 parçalanmasından üretilir. Milletvekilleri her yerde bulunur ve insan plasentası, dışkı ve kan gibi insan dokularında bulunmuştur 8,9,10. 2023 ve 2024'te sırasıyla 4.100 ve 4.600'den fazla yayının (PubMed verileri; anahtar kelime "mikroplastikler") kanıtladığı gibi, MP araştırmalarına artan bir ilgi ve insanların MP'lere maruz kalmasına ilişkin artan bir kamuoyu endişesi var. Artan bir kamuoyu endişesine yanıt olarak, Kaliforniya Eyaleti11 ve bazı AB ülkeleri12 gibi çeşitli hükümet düzenleyici kurumları, içme suyunda MP seviyelerine ilişkin yönetmelikleri uygulamıştır (veya uygulayacaktır). Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, ABD Çevre Koruma Ajansı kısa süre önce milletvekillerini yeni bir endişe kirleticisi olarak ilan etti. Bununla birlikte, insan risk değerlendirmesi, MP'lerin güvenilir ve tekrarlanabilir tespiti için yöntemlerin eksikliği nedeniyle ciddi şekilde engellenmektedir.

MP'lerin karakterizasyonu, MP'lerin7'nin görsel özelliklerini ve bileşimlerini anlamak için sırasıyla optik ve elektron mikroskobu 13 gibi analitik yöntemlere ve spektroskopik ve spektrometrik tekniklere 1,14,15 dayanır. MP içeren numuneler, MP'leri karakterize etmek, tanımlamak ve nicelleştirmek için birden fazla analiz içermeli ve en azından spektroskopi/spektrometri (yani, Raman spektroskopisi, kızılötesi spektroskopisi veya piroliz gazı kromatografisi-kütle spektrometresi, vb.) Science of the Total Environment16 gibi çevresel örneklerde plastiklerin ölçümü için minimum gereksinimlere göre gereklidir. Raman spektroskopisi, özellikle biyolojik numunelerde malzeme tanımlaması ile ilgili olarak, kızılötesi (IR) spektroskopiden daha çok yönlüdür. Raman spektroskopisi, daha büyük parçacıklar gerektiren ve numune yerleştirme üzerinde daha fazla kısıtlamaya sahip olan bir ışık emici teknik olan IR'den daha küçük parçacıkları daha kolay analiz etmesini sağlayan bir ışık saçılma tekniğidir17. Daha önce, Silikon veya Silikon oksit içeren Raman spektroskopisi için substratların, minimum arka plan gürültüsü18 ile güvenilir sonuçlar verebileceği öne sürülmüştü.

Genellikle bir analiz türüyle uyumlu olan belirli analitik teknikler için substratlar (yani, IR spektroskopisi için gerekli olan Altın kaplı substratlar) genellikle iletim ve/veya yansıma ışık mikroskobu ile uyumlu değildir. Daha sonra, tekrarlanan alt örnekleme, her bir ayrı analiz için uygun örnekler üretmek için araştırmacılar arasında popülerdir, ancak alt örnekleme zaman alıcıdır ve düşük bolluktaki partiküllerihariç tutabilir 1,2,6. Tipik olarak, partiküllerin bir substrattan diğerine manuel transferleri, aynı partikülü farklı analitik modalitelerle karakterizasyon ve tanımlama için analiz etmek için gereklidir, ancak bu yavaş, manuel transferler yanlılık, kontaminasyon ve kayıp olasılığını artırır ve ayrıca MP'lerin analizini yalnızca manuel olarak manipüle edilebilen en büyük boyutlu partiküllerle sınırlar13. Bu yetersiz iş akışları, literatürdebildirilen MP nicelemesindeki önemli değişkenliğe katkıda bulunan çok sayıda zorluk ve güvenilirlik sorunu ortaya çıkarmaktadır 3,7.

Burada, MP'leri yakalamak, karakterize etmek, tanımlamak ve nicelleştirmek için Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı (SNAP) olarak adlandırdığımız analitik bir iş akışı sunuyoruz ve Rochester, NY bölgesinden elde edilen içme suyu örneklerini analiz ederek SNAP'in faydasını gösteriyoruz. SNAP, birden fazla teknik kullanarak içme suyundan MP'leri konsantre etmek ve analiz etmek için tek tip bir alt tabaka sunan entegre Silikon nanomembranlara sahip geleneksel olarak boyutlandırılmış 25 mm çaplı filtre diskleri (membran özellikleri için Ek Tablo S1'e bakın) ile etkinleştirilir15,19. MP'leri azalan kesme boyutlarına sahip nanomembranlar (silindirik gözenekli 20 μm mikro gözenekli Silisyum nitrür (MPSN) ve dikdörtgen prizma gözenekli 8.0 μm mikroyarık Silisyum nitrür (MSSN)) üzerine sıralı olarak konsantre ettikten ve yakaladıktan sonra, SNAP üç ardışık analitik adımı kolaylaştırır: 1) numune boyama, optik mikroskopi ve MP miktar tayini, 2) Raman spektroskopisi ile partikül tanımlama, ardından 3) taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile partikül karakterizasyonu, tek bir nanomembran substrat üzerine yakalanan aynı parçacıkların çoklu analizlerini mümkün kılar.

Hem kaplanmamış Silikon nanomembran (SiN) filtre disklerini hem de Altın kaplı Silikon nanomembran (Au-SiN) filtre disklerini kullanarak çoklu SNAP boru hatlarını gösteriyoruz: Boru hattı A) SiN üzerinde gerçekleştirilen SNAP ve aynı MP'leri çoklu analitik tekniklerle sıralı olarak karakterize eden; Boru Hattı B) Raman spektroskopisi ile Au-SiN üzerinde gerçekleştirilen SNAP; ve Boru Hattı C) Enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDX) ile donatılmış SEM ile Au-SiN üzerinde gerçekleştirilen SNAP (Şekil 1). Bu nedenle SNAP varyasyonları, bir dizi numune türü ve analitik teknik için kullanılabilen esnek, kolaylaştırılmış analitik iş akışlarıdır. Polimerik membranlara11 dayanan daha önce yayınlanmış yöntemlerin aksine, SNAP'in avantajları, sentetik polimer MP'lerin polimerik olmayan, Silikon bazlı bir membran üzerine yakalandığı ve MP'lerin polimerik olmayan bir arka plan üzerinde bileşimsel olarak tanımlanmasını sağlayan Silikon nanomembranların kullanımından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, Silikon nanomembranlar, kırışma eğiliminde olan polimerik membranların aksine, çoklu otomatik mikroskopi ve spektroskopi tekniklerine olanak tanıyan tek tip odak düzlemleri sunar.

Daha önce, analitik modelleme, model partikül zorlukları ve içme suyu ve hava numuneleri19,20 ile MP analizleri için Silikon nanomembranların kullanımını ve ayrıca model partikülleri kullanarak filtrasyon ve optik mikroskopi özelliklerini yaygın olarak kullanılan dört membranlakarşılaştırarak karakterize etmiştik 15. Bu protokolde, dört içme suyu örneğinde milletvekillerinin analizi için SNAP'in faydasını sezgisel olarak gösteriyoruz. Örnekler, daha büyük Rochester, NY bölgesindeki dört farklı su kaynağından toplandı. Bu çalışmaya dahil edilen her örnek, Ontario Gölü, Hemlock Gölü, Hemlock ve Ontario'nun bir karışımı ve Canandaigua Gölü gibi farklı bir yüzey suyu kaynağından kaynaklanmıştır (Şekil 2). Bu içme suyu kaynaklarından yakalanan parçacıklar arasında polistiren (PS) ve polietilen (PE) gibi yaygın plastikler, demir, silika gibi ağır metaller ve sentetik olmayan parçacıklar yer aldı.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kalite kontrol prosedürleri ve Ultrapure çözelti hazırlıkları

  1. Laminer akış başlığı ve eldiven temizliği
    1. Don PPE (kişisel koruyucu ekipman): %100 pamuklu laboratuvar önlüğü ve nitril eldivenler.
      NOT: KKD protokol boyunca süreklidir.
    2. Nitril eldivenlere %99 İzopropil alkol (IPA) püskürtün. Ellerinizi birbirine sürtün ve ardından ~ 18 MΩ, 0.22 μm filtrelenmiş su ile durulayın. Kalıp ayırıcıyı eldivenlerden çıkarmak için bunu 3 kez yapın.
    3. Doğal elyaf hassas bir görev mendilini dörde katlayın, ardından %70 IPA püskürtün. Başlık yüzeyini uzun darbelerle arkadan öne doğru silin ve hassas görev mendilini her iki vuruşta bir kullanılmayan bir yüzeye yeniden katlayın. Tüm yüzeyler temizlenene kadar davlumbazı temizlemeye devam edin, kirlendikten sonra mendili yenisiyle değiştirin.
    4. Silikon rulo matı açın ve kalan parçacıkları toplamak için kaputun yüzeyi boyunca yuvarlayın. Silikon silindiri temizlemek için %99 IPA püskürtün ve eldivenli bir el ile ovalayın, ardından 18 MΩ, 0,22 μm filtrelenmiş su ile durulayın. 3x tekrarlayın, ardından davlumbazda havayla kurumaya bırakın.
    5. Eldivenleri adım 1.1.2'deki gibi yeniden durulayın.
  2. Ultra saf su ve IPA üretimi.
    1. 1 L'lik bir kabı 18 MΩ su ile doldurun ve davlumbazın içine yerleştirin.
    2. 60 mL'lik bir şırınga ve bağlı 0.22 μm kesme şırınga filtresini, şırınga ve bağlı filtreden en az 200 mL 18 MΩ su süzerek hazırlayın.
      NOT: Bir şırınga pompası zaman kazandıracaktır ancak açıklanan protokolü gerçekleştirmek için bir gereklilik değildir.
    3. Vidalı cam kapaklı bir kabı 3x 18 MΩ, 0.22 μm filtrelenmiş su ile durulayın. 0.22 μm şırınga filtreli 18 MΩ filtrelenmiş su ile doldurun.
    4. Ultra saf IPA oluşturmak için 18 MΩ, 0,22 μm filtrelenmiş su yerine istenen % IPA konsantrasyonu ile 1.2.1-1.2.3 adımlarını tekrarlayın.

2. Filtrasyon yoluyla sıvı numunelerden partikül yakalama

NOT: Aşağıdaki protokol su dışındaki sıvı numunelerle kullanılabilir. Doğrulanmış numune toplama yöntemleri, çalışmasının ve numunenin ihtiyaçlarına göre araştırmacının takdirine bırakılmalıdır.

  1. KKD don.
    NOT: Eldivenlerin ve başlık yüzeylerinin 1.1.2-1.1.5 adımlarına uygun olarak temizlendiğinden emin olun.
  2. Ultrapure %99 IPA içeren bir silikon conta püskürtün, eldivenli parmaklarla ovalayın ve ardından Ultrapure suyla durulayın. Her conta için bu 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Filtrasyonda kullanılacak conta sayısı, kullanılacak filtre diski sayısı artı 1'e eşittir. Görsel montaj grafiği için Şekil 1B'ye bakın.
  3. Adım 1.1.2'de astarlanan şırıngayı kullanarak, şırıngaya 30 mL Ultra saf su ve 30 mL hava alarak 60 mL şırınganın içini Ultra saf su ile durulayın. Bir şırınga filtresini vidalayın, ardından kuvvetlice çalkalayın ve dağıtın. Bunu 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Numunenin hacmine bağlı olarak gerektiği gibi herhangi bir boyutta şırınga kullanılabilir.
  4. Filtrasyon aparatını Şekil 1B'deki görsel montaj grafiğinde gösterildiği gibi monte edin.
    NOT: Montaj ve demontaj sırasında filtre disklerini ve contaları tutmak için temiz cımbız kullanın.
    1. Sıralı filtrelemeler için, disk ile destek friti arasında bir conta, her disk arasında bir conta ve disk ile filtrasyon hunisi arasında bir conta olduğundan emin olun.
    2. Disklerin, yığının en üstünde en büyük kesme filtresi ve en altta en küçük kesme filtresi olacak şekilde sipariş edildiğinden emin olun.
  5. Filtre diski yığınından negatif akış olacak şekilde aparata giden vakumu açın.
  6. Arka plan kirliliğinin ölçülmesi
    NOT: Aşağıdaki işlem, şırınga temizliğinin ve Ultrapure ortam üretiminin değerlendirilmesini ve sistem bileşenlerinin katkıda bulunduğu arka plan parçacıklarının belirlenmesini sağlar.
    1. Durulanmış şırınga ile, dağıtılan tüm sıvının filtrelendiğinden emin olmak için üst diskin ortasındaki nanomembranın üzerine 50 mL Ultra saf su dağıtın.
      NOT: Daha büyük numune hacimleri (yani >50 mL) filtreleniyorsa, bir cam filtrasyon hunisi önerilir. Cam filtrasyon hunisini adım 2.3'teki gibi temizleyin. Ek laboratuvar gereçleri ek partikül kontaminasyonu riskine neden olabilir. Temizleme prosedürlerine özen gösterin ve ilgilenilen numuneleri kullanmadan önce temizliği her zaman boş filtrasyonlarla onaylayın.
    2. Ultra saf suyun süzülmesine izin verin. Filtrasyondan sonra vakumu bir dakika daha açık tutun. Numune tamamen kuruduktan sonra vakumu kapatın.
    3. Temiz cımbız kullanarak filtre disklerini contalardan dikkatlice çıkarın ve diskleri cam Petri kabı veya karartılmış kutu gibi saklama için uygun temiz ve etiketli kaba yerleştirin.
    4. Optik analiz, partikül sayımı vb. için filtre disklerini mikroskopi altında görüntüleyin.
  7. Sıvı numuneler için, adım 2.2'deki gibi ek bir conta temizleyin. Her benzersiz sıvı ortam numunesi için yeni bir şırınga alın ve adım 2.3'ü tekrarlayın.
  8. İstenilen miktarda numune alın ve numuneyi üst diskin ortasındaki nanomembranın üzerine yavaşça dağıtın.
  9. Numune filtrasyonu tamamlandıktan sonra, numunedeki tüm partiküllerin tüm yüzeylerden filtre diskinin ortasındaki membran üzerine yeterince durulandığından emin olmak için 1 mL Ultra saf su ile 3 kez durulama yapın.
  10. 3x durulanmış numuneyi tamamen kurutmak için vakumu bir dakika daha açık tutun, ardından vakumu kapatın.
    1. 2.7-2.10 arasındaki adımları tekrarlayın. ilgilenilen örneğin gerçekleştirilecek her bir kopyası için.

3. Floresan boya hazırlama ve boyama

NOT: Nil Kırmızısı ve/veya Tripan Mavisi ile floresan boyama, ilgilenilen Raman spektroskopi lazerleriyle etkileşime girebilir.

  1. Nil Kırmızısı (NR) ile Boyama
    1. KKD don.
    2. Eldivenleri ve başlığı 1.1.2-1.1.5 adımlarındaki gibi temizleyin.
    3. Numune filtrasyonunu adım 2.7-2.10'da belirtildiği gibi tamamlayın.
    4. İki cam vidalı kapaklı kabı 3x Ultrapure su ile durulayın.
    5. Temiz bir cam kapta Ultrapure% 99 IPA'da 0.1 mg / mL'lik bir NR çözeltisi hazırlayın.
    6. Karıştırmak için yavaşça 10x ters çevirin.
    7. NR çözeltisini 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi ile ikinci cam vidalı kapaklı kaba süzün.
      NOT: NR'yi ön filtrelemek için kullanılan filtre, numuneleri filtrelemek için kullanılan filtreden daha küçük bir kesime sahip olmalıdır.
    8. Lekelenecek filtre diskini vakumlu toplama şişesinin destek fritine yerleştirin.
    9. 0.1 mg / mL NR çözeltisinin 20 μL'sini filtre diskinin ortasındaki nanomembran üzerine pipetleyin.
      NOT: Leke, nanomembranın gözenekli yüzeyini tamamen kaplamalıdır. 20 μL yeterli değilse, nanomembranın tüm gözenekli alanları uygun şekilde leke ile kaplanana kadar ek leke ekleyin.
    10. Lekeyi 5 dakika inkübe edin.
    11. İnkübasyon tamamlandıktan sonra lekeyi vakumla filtreleyin.
    12. Fazla NR lekesini çıkarmak için 1 mL Ultrapure %99 IPA ile 3 kez durulayın.
      NOT: Karşı boyama yapılacaksa bu adımdan sonra aşağıdaki Tripan Mavisi boyama bölümüne geçin.
    13. Kalan sıvıyı filtrelemek ve kurutmak için filtre diskinin vakum açıkken 2 dakika boyunca destek fritinin üzerine oturmasına izin verin. 2 dakika sonra kurumazsa, filtre diskini temiz bir cam Petri kabı kullanarak 2-5 dakika boyunca 70 °C'lik bir fırına aktarın.
    14. Kuruduktan sonra, adım 2.6.4'te açıklandığı gibi floresan mikroskobu yapın ve bölüm 4'e geçin.
  2. Tripan Mavisi (TB) ile Boyama
    1. KKD don.
    2. Eldivenleri ve başlığı 1.1.2-1.1.5 adımlarında belirtildiği gibi temizleyin.
    3. Numune filtrelemeyi 2.7-2.10 adımlarından tamamlayın veya 3.2.4 adımıyla başlayın.
    4. İki cam vidalı kapaklı kabı 3x Ultrapure su ile durulayın.
    5. Bir kapta% 0,4 TB lekesi hazırlayın.
      NOT: TB'yi ön filtrelemek için kullanılan filtre, numuneleri filtrelemek için kullanılan filtreden daha küçük bir kesime sahip olmalıdır.
    6. Karıştırmak için yavaşça 10x ters çevirin.
    7. TB leke solüsyonunu 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi ile ikinci cam vidalı kapaklı kaba süzün.
      NOT: TB'yi ön filtrelemek için kullanılan filtre, numuneleri filtrelemek için kullanılan filtreden daha küçük bir kesime sahip olmalıdır.
    8. Lekelenecek filtre diskini vakumlu toplama şişesinin destek fritine yerleştirin.
    9. %0,4 TB lekesinin 20 μL'sini filtre diskinin ortasındaki nanomembranın üzerine pipetleyin.
      NOT: Leke, nanomembranın gözenekli yüzeyini tamamen kaplamalıdır. 20 μL yeterli değilse, nanomembranın tüm gözenekli alanları lekeyle uygun şekilde kaplanana kadar damla damla ek leke ekleyin.
    10. Lekeyi 5 dakika inkübe edin.
    11. 5 dakika inkübe ettikten sonra lekeyi vakumla süzün.
    12. 1 mL hacim 3x Ultra saf su ile durulayın.
    13. Kalan sıvıyı filtrelemek ve kurutmak için filtre diskinin vakum açıkken 2 dakika boyunca destek fritinin üzerine oturmasına izin verin. 2 dakika sonra kurumazsa, filtre diskini temiz bir cam Petri kabı kullanarak 2-5 dakika boyunca 70 °C'lik bir fırına aktarın.
    14. Kuruduktan sonra, adım 2.6.4'te açıklandığı gibi floresan mikroskobu yapın ve bölüm 4'e geçin.

4. Floresan mikroskobu ile partikül miktar tayini

  1. Optik mikroskopi görüntü yakalama
    1. Filtre diskini bir silikon conta kullanarak bir mikroskop lamı üzerinde hareketsiz hale getirin veya bir mikroskop tablası ile filtre diski kullanımına özel bir hizalama lamı kullanın. Görüntülenecek filtre diskini mikroskop aşamasına taşıyın.
    2. Algılanan maksimum sayımlar dedektör kamerasının maksimum aralığının ~ %90'ı olacak şekilde parlak alan aydınlatması kullanarak nanomembranı görüntüleyin.
      NOT: Bu %90 değeri, beyaz seviyeleri 65.535 olan 16 bitlik bir dedektör için ~59.000'dir.
    3. Maksimum piksel yoğunlukları dedektör kamerasının maksimum aralığının ~%25'i civarında olacak şekilde floresan aydınlatma kullanarak nanomembranı görüntüleyin.
    4. Görüntüyü 16 bit bileşik TIFF formatında kaydedin.
  2. Floresan mikroskobu ile partikül miktar tayini
    1. Görüntü analizi platformunu kullanarak, 4.1.4'te oluşturulan kompozit TIFF'in floresan kanallarını Bölünmüş Kanallar işlevini kullanarak parlak alan kanalından ayırın.
    2. Eşik işlevini kullanarak piksel yoğunluklarını 10.000 değerine eşikleyin.
      NOT: Parçacıklarda çiçeklenme varsa, eşik çok düşüktür ve yükseltilmelidir.
    3. PNG formatında ayrı bir görüntü kaydedin.
    4. Benek Giderme işlevini kullanarak parazit piksellerini kaldırmak için görüntüdeki benekleri giderin.
    5. Watershed işlevini kullanarak görüntüyü Watershed yapın.
      NOT: Bu işlev, büyük bitişik parçacıkları daha küçük parçalara ayırma pahasına benzer boyuttaki bitişik parçacıkları ayırır. Genellikle mevcut büyük parçacıklardan çok daha fazla küçük parçacık olduğundan, bu iyi bir değiş tokuş olabilir, ancak uzun lifleri küçük parçacıklardan oluşan ipliklere ayırmak gibi istenmeyen etkilere sahip olabilir. Verileri kabul etmeden önce görüntü sonuçlarını inceleyin.
    6. Parlak alan görüntüsündeki bir gözeneğin genişliğini ölçerek eşikli floresan görüntülerin ölçeğini ayarlayın. Ölçeği piksel/μm cinsinden ayarlamak için ölçülen gözenek genişliğini kullanın.
      NOT: Dikdörtgen gözenekler için en küçük genişlik ürün etiketiyle eşleşecektir. Dairesel gözenekler için çap, nanomembranın gözenek boyutunu (yani kesilmesini) belirten ürün etiketiyle eşleşecektir.
    7. Görüntü analizi platformunun Parçacıkları Sayma işlevini eşikli floresan görüntüye uygulayın ve Alan, min ve maks.
    8. Floresan alanlarını görselleştiren kompozitler oluşturmak için floresan ve parlak alan görüntülerini işleyin.
    9. Adım 4.2.2'deki ile aynı değeri kullanarak floresan görüntünün eşiğini alın.
    10. Görüntü analizi platformunu kullanarak kanalları birleştirin. Floresan kanalını Kırmızı kanala ve parlak alan görüntüsünü Griler kanalına atayın .
    11. Kompoziti PNG dosyası olarak kaydedin.

5. Raman Spektroskopisi

  1. Raman enstrümanını ve ilgili bilgisayarını açın ve her birinin başlamasına izin verin.
  2. Yazılımı Raman cihazına bağlı bilgisayarda açın.
  3. Yazılım başlatıldığında, program ekranının alt şeridindeki Geçerli Sistem Etkinliği ve Dedektör durumunun sırasıyla Hazır olarak okunduğundan ve yeşil renkte olduğundan emin olun.
  4. Ekranın altındaki Otomatik Kalibrasyon (AC) düğmesi kırmızıysa, istediğiniz otomatik kalibrasyonu çalıştırın ve devam etmeden önce bitmesini bekleyin.
  5. Yalnızca bir lazer ve bir ızgara kullanıyorsanız:
    1. Otomatik Kalibrasyon ekranında Çıkış'a tıklayın, ardından Edinme sekmesindeki Cihaz Kurulumu altındaki ilgili açılır listelerden istediğiniz lazeri ve ızgarayı seçin.
    2. Ekranın altındaki kırmızı AC düğmesine dönün ve Mevcut lazer/Izgara'ya tıklayın ve kalibrasyon rutininin çalışmasına izin verin.
  6. Tüm lazerleri ve ızgaraları kullanıyorsanız, Tüm Lazerler ve Izgaralar'ı seçin ve sistemin çalışmasına izin verin.
  7. Birden fazla lazer ve/veya ızgara kullanıyorsanız, Özel lazerler/Izgaralar'ı seçin ve istenen tüm ayarları seçin. Ardından, kalibrasyonun çalışmasına izin verin.
  8. Alet taretinde ve yazılım içinde Alım sekmesindeki Alet Ayarları altında 20x uzun çalışma mesafesi (LWD) hedefini seçin.
  9. Bu hedef mevcut değilse, filtre diskinin yüksekliğine uygun bir çalışma mesafesine sahip alternatif bir düşük büyütme hedefi (örn. 5x veya 10x) kullanın.
    NOT: Filtre diskinin nanomembranında ilk gezinmeyi kolaylaştırmak için daha düşük bir büyütme hedefiyle başlayın.
  10. Filtre diskini, optik yolun içinde olacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin.
  11. Görselleştirme optiklerini açmak için üst şeritte Video Alımı'na tıklayın.
  12. Filtre diskinin nanomembranını odaklamak için cihazdaki kaba ve ince odak tekerleklerini kullanın.
  13. Gözenekleri bilgisayar ekranındaki nokta imleç çizgileri ile kabaca kareleyin.
  14. Bu kare hizalamayı elde etmek için filtre diskini tabla üzerinde hafifçe döndürün veya mikroskop aşamasında filtre diski kullanımına özel bir hizalama sürgüsü kullanın.
  15. Sağ üstteki Edinme sekmesi altında, en iyi sonuçları elde etmek için seçilen aydınlatıcı modunun Karanlık alan olduğundan emin olun.
  16. Dikişli bir görüntü elde etmek için, Veri Sekmeleri şeridindeki Video sekmesine gidin.
  17. İstediğiniz ilk görüş alanına gidin, ardından video penceresinin sağ üst köşesindeki Mozaik düğmesini tıklayın ve haritaya ekleyin. Enstrüman joystick'i ile istediğiniz alanın dış karşı köşesine gidin ve haritaya ekleyin.
  18. Son görüntüde tüm alanların düzgün bir şekilde odaklandığından emin olmak için mozaik alımını ViewSharp ile çalıştırın.
    NOT: Daha düşük büyütme hedefleri, görüntü mozaiği elde etmek için daha az zaman alırken, daha yüksek büyütme hedefleri daha uzun sürecektir.
  19. Görüntü mozaiği oluşturulduktan sonra, görüntüye sağ tıklayın ve ParticleFinder'a Gönder'e basın.
  20. Eşik ayarlarıyla etkileşim kurmak için sağ üst şeritteki ParticleFinder sekmesine gidin.
  21. Uygun parçacıkların seçildiğinden emin olmak için, Merkez, Parçacık ve Saydamlık kutularını işaretlemek için ParticleFinder veri sekmesi altındaki Görüntü'ye sol tıklayın. Saydamlık kaydırıcısını %50'ye ve Orta'nın piksel boyutunu 2 piksele ayarlayın.
    NOT: Merkez seçimi, her parçacığın ortasına bir nokta yerleştirir ve Parçacık seçimi, parçacık olarak belirlenen her alanın üzerine %50 şeffaflıkta bir kaplama yerleştirir. Bu ayarlar her bir parçacığın yerini belirleyecek ve her parçacığın kenarlarını tanımlayacaktır.
  22. Gerekirse, tüm parçacıkların ve boyut/şekil parametrelerinin doğru bir şekilde tanımlandığından emin olmak için programın sağ tarafındaki ParticleFinder sekmesi altında parçacık eşikleme ve morfoloji/boyut seçim parametrelerini düzenleyin. Morfolojik parametrelerin nasıl uygulanabileceğine dair bir örnek için Ek Tablo S2'ye bakın.
    1. Otomatik partikül algılama yeterli değilse, manuele geçin ve doğru nesnelerin çoğu partikül olarak tanımlanana kadar eşik değerlerini kademeli olarak ayarlayın.
    2. Tespit edilen parçacıkların morfolojisinin daha fazla iyileştirilmesi gerekiyorsa, Morfolojik filtreleri uygula'nın yanındaki kutuyu işaretleyin. Ortaya çıkan açılır menülerde uygun parametreleri ve yoğunluklarını seçin.
      NOT: Parametrelerin seçilme sırası çıktıyı etkileyebilir.
  23. Parçacıkların boyutu, şekli veya diğer morfolojik nitelikleri kritik faktörlerse, Parçacık ön filtresini uygula seçeneğinin yanındaki kutuyu işaretleyin, ardından parametreleri gerektiği gibi seçin ve düzenleyin.
  24. Parçacıklar tanımlandıktan ve seçilen şekilleri/kenarları kabul edilebilir hale geldikten sonra, Sonuçlar bölümünün altındaki parçacık görüntülerinin kaydırılabilir önizleme listesine gidin. İlgili parçacık görüntüsüne tıklayarak ilgilendiğiniz parçacık(lar)ı seçin.
  25. Ekranın üst kısmındaki video kamera düğmesiyle canlı görüntüyü açın.
  26. Büyütme numarasına tıklayarak ve alt şeritteki uygulama içindeki açılır menüden ilgili hedefi seçerek 50x LWD hedefine geçin.
  27. Gerekirse ince ayar düğmesiyle parçacık(lar)ı tekrar odağa getirin.
  28. Raman spektroskopisi ile analiz edilmek üzere tek tek parçacıkların görüntülerini yakalayın ve görüntüleri uygun adlarla ayrı dosyalar olarak kaydedin.
  29. Raman spektroskopisi ile analiz edilecek parçacığın istenen alanının lazer ışını konumu altında doğru bir şekilde konumlandırıldığından emin olun.
  30. Analiz için parçacığın uygun alanı seçildikten sonra, görselleştirme optiklerini kapatmak için pencerenin üst kısmındaki TÜMÜNÜ DURDUR düğmesine basın.
  31. Lazeri 532 nm'ye, lekelenmemiş parçacıklar için %1 güce ve floresan lekeli parçacıklar için 785 nm veya 830 nm'ye ayarlayın.
  32. Edinme süresini 10 saniyeye ve birikimleri 5'e ayarlayın.
  33. Veri sekmeleri menüsünden Spectra sekmesini seçin, ardından Gerçek Zamanlı Ekranı (RTD) başlatmak için oynat düğmesine basın.
    NOT: Ayarları optimize etmek için RTD sırasında elde edilen bilgileri kullanın.
  34. Ayarlardan ve sonuçlardan memnun kaldığınızda, RTD'yi durdurmak için TÜMÜNÜ DURDUR'a basın.
  35. Son satın alma artık RTD düğmesinin yanındaki daire şeklindeki Spectrum Aquisition düğmesine basılarak toplanabilir.
  36. Toplanan spektrumları uygun adlarla ayrı dosyalar olarak kaydedin.
  37. 5.28-5.36 arasındaki adımları tekrarlayın. ilgilenilen her parçacık için.
  38. Örnekle işiniz bittiğinde, filtre diskini çıkarın ve hedefi hem dürbün üzerinde hem de yazılım içinde manuel olarak 20X LWD'ye geri getirin.
  39. Yeni örnek(ler) için 5.10-5.37 adımlarını tekrarlayın.

6. Spektral tanımlama

  1. Satın alınan veya kendi kendine oluşturulmuş bir Raman spektral veritabanı mevcut değilse, şu adresteki açık kaynaklı spektroskopi kitaplığına gidin: https://www.openanalysis.org/openspecy/
    NOT: OpenSpecy, çevresel MP'leri ve lifleri tanımlamak için geçerli olan 276 polimer ve malzemeden oluşan üç farklı kitaplıktan636 spektrum içeren açık kaynaklı bir Raman ve IR spektroskopisi veritabanıdır 21. Ön ve son işlenmiş spektral veriler, bu kaynakla kullanım için eşit derecede uygundur.
  2. Raman spektrumlarını ayrı ayrı .csv dosyaları olarak kaydedin.
    1. Sütun A'yı dalga numarası ve ardından spektrumların dalga numaraları olarak etiketleyin ve B sütunu Yoğunluk ve ardından dalga numarası başına tepe yoğunluk değerleri olarak etiketlenmelidir.
  3. .csv dosyasını sol üstteki Gözat çubuğuna sürükleyip bırakarak spektrumları açın.
  4. Önişleme ve tanımlama'yı açın.
  5. Ön İşleme altında, Eşik Sinyali Gürültüsü, Min-Maks Normalleştirme, Yumuşatma/Türetme, Dalga Sayılarına Uygun ve Temel Düzeltme'yi açın.
    NOT: Buradaki özel ayarlar, analiz edilen spektrumların bireysel özelliklerine bağlı olarak ayarlanabilir.
  6. Tanımlama altında, spektrum türü olarak Raman'ı ve Kitaplık Dönüşümü olarak Türev'i seçin.
    NOT: Bu kütüphane IR spektroskopisi için de kullanılabilir. Analiz penceresi beyaz bir spektrum, analiz için yüklenen spektrum ve şüpheli tanımlama eşleşmesi olan kırmızı bir spektrum gösterecektir.
  7. 0,70'> bir eşleşme r veya makul tepe şekli korelasyonları döndürmeyen herhangi bir spektrumla, önerilen ilk 5 sonucu, tercih edilen şekilde potansiyel eşleşmeleri araştırmaya başlamak için bir yer olarak kullanın.
  8. Ölçülen tepe değerlerinin, o tepe için bir eşleşmeyi onaylamadan önce, seçilen referans spektrumlarında karşılık gelen bir tepe noktasının ±10 dalga sayısı içinde olduğundan emin olun.
  9. Spektral korelasyonları, korelasyon değerlerini ve şüpheli eşleşmenin kaynaklandığı veritabanını kaydedin.
  10. Dosyaları bireysel ihtiyaçlara göre indirin.

7. Taramalı elektron mikroskobu

NOT: SEM analizinden önce filtre diskini metal kaplama yapmıyorsa, bölüm 7.2'ye geçin.

  1. SEM için numunelerin metal kaplaması
    1. Filtre diskini karbon bant kullanarak çelik bir SEM saplamasına monte edin.
    2. Bir püskürtücüye yerleştirin ve hazneyi 50 mTorr'a kadar pompalayın.
    3. Püskürtme Ar (Argon) izolasyon vanasını açın.
    4. Ar'ı iğneli valf aracılığıyla hazneye 300 mTorr basınca sokarak sistemi boşaltın, ardından hazneyi 50 mTorr'a kadar boşaltın. 3x tekrarlayın.
    5. İğneli valf ile son basıncı 100 mTorr'a ayarlayın.
    6. Bir Au hedefi kullanarak, püskürtme yoluyla filtre diskine Au biriktirin.
      NOT: Diğer hedef kaynaklar (örneğin, Pt, Ir, Si, vb.) alternatif olarak Au yerine kullanılabilir; 20 mA akım, 100 mTorr'da 0,1 Angstrom/s biriktirme üretir.
    7. Sistemi havalandırın ve filtre diskini çıkarın. Filtre diskini paslanmaz çelik saplamaya bağlı tutun.
  2. SEM görüntü yakalama
    1. Saplamayı çok kademeli Zeiss Auriga tutucusuna bir ayar vidasıyla sabitleyin.
    2. SEM'i ve onu çalıştıran bilgisayarları açın ve her birinin başlatılmasına izin verin.
    3. SEM'e bağlı yazılımı açın.
    4. Sistemin vakum altında olduğunu doğrulayın (5e-6 Torr).
    5. Yük kilidi odasının ana gövdesindeki Vent düğmesine basarak yük kilidini boşaltın ve yük kilidini açın.
    6. Çok aşamalı tutucuyu teflon kaplı yerleştirme aparatına monte edin ve ekli vida plakasını kullanarak transfer kolunu sabitleyin.
    7. Yük kilidini kapatın ve yük kilidi odası ana gövdesindeki Sakla'ya basarak yük kilidini aşağı pompalayın.
      NOT: Mağaza düğmesinde yeşil ışıkların yanıp sönmesi durduğunda tamamlama gerçekleşir.
    8. Çok kademeli tutucuyu s'ye yükleyintage transfer kapısını açarak ana gözlem odasında.
    9. Yük kilidinin ana gövdesindeki Aktar'a basın. Kapı düşecek ve iç hazneyi açığa çıkaracaktır.
    10. Yük kilidi kolunu (çok kademeli tutucuya vidalanmış) takın ve çok kademeli tutucuyu s'ye sabitleyintage.
    11. Yük kilidi transfer kolunu sökün ve kolu yük kilidine oturacak şekilde tamamen geri çekin.
    12. Aktar'a basarak aktarma kapısını kapatın.
    13. Yazılımın sağ alt köşesindeki EHT üzerine basarak izolasyon vanasını açın.
    14. Yazılımın veri bölgesinde çalışma mesafesini 5 mm ve hızlanma voltajını 20 kV olacak şekilde ayarlayın.
    15. XY ve Z kumanda kollarını kullanarak filtre diski membranını lokalize edin.
    16. Görüntü netlenene kadar Z joystick'i kullanarak sahneyi kaldırın.
    17. Orta konsoldaki XY stigmator düğmelerini ve odak tekerleğini ayarlayarak astigmatizmayı düzeltin.
    18. Merkezi konsol üzerindeki büyütme tekerleğini ayarlayarak örnek parçacıkları istenen büyütmede görüntüleyin, 2,048 x 1,536 çözünürlükte 8 veya 16 bit tiff formatında görüntüler yakalayın.
  3. EDX partikül analizi
    1. SEM bilgisayarının masaüstünde ChamberScope CCD'yi kapatın.
      NOT: Bu adım tamamlanmazsa, EDX dedektörü sinyalle boğulacak ve hiçbir veri kaydedilmeyecektir.
    2. EDX bilgisayarında APEX EDX yazılımını açarak, sağ üst köşedeki menüde dedektörü açarak EDX dedektörünü soğutun.
    3. Görüntü Yakala'ya tıklayarak eşleme için kullanılabilecek düşük çözünürlüklü bir SEM görüntüsü yakalayın.
    4. Yazılım ekranının üst kısmındaki Eşleme Sekmesi menüsünü açın.
    5. Ayarlar altında, ~5 dakika uzunluğunda olması gereken tahmini bir yakalama süresi sağlamak için çözünürlüğü (256 x 256) ve piksel bekleme süresini (0,16 μs) ve kare numarasını (32-64) ayarlayın.
    6. Menünün sol üst köşesindeki Harita Oluştur'a tıklayın.
    7. Öğe aramasını manuel olarak ayarlamak için Öğe Önizlemesini Onayla'yı seçin veya yazılımdan gelen Otomatik Tanımlanan tepe noktalarına güvenin.
    8. Tamamlandıktan sonra haritalama yazılımının sağ üst bölümündeki Otomatik Rapor işlevini kullanarak bir rapor oluşturun.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proses boşlukları ve arka plan kirliliği
Kabul edilebilir bir boş sonuç, ya hiç parçacık içermeyen ya da o kadar az parçacık içeren bir sonuçtur ki, arka plan (yani proses) kontaminasyonu (varsa) deneyin sonuçlarını karıştırma veya bozma olasılığı yüksek değildir. Optimal olmayan bir boş sonuç, ilgilenilen parçacıkların arka plan kontaminasyonundan ayırt edilmesinin zor olacağı birçok parçacık içeren bir sonuçtur.

Kabul edilebilir proses kontaminasyon seviyesi mümkün olduğunca sıfıra yakın veya sıfıra yakın olmalıdır, ancak sıfıra ulaşılamıyorsa, gözlemlenen arka plan partiküllerinin sayısındaki tutarlılık çok önemlidir. Sonuçların tutarlılığını belirlemek için birkaç boş örnek çalıştırın. Kalite kontrol protokollerindeki özen (bkz. Bölüm 1), kontaminasyonun azaltılması ve işleme sırasındaki uygun çevresel koşullar, düşük arka plan kontaminasyon seviyelerinin korunması için çok önemlidir. Arka plan kontaminasyon sonuçları ve kabul edilebilirlik, büyük ölçüde kullanılan nanomembranların kesilmesine ve laboratuvar koşullarının genel temizliğine de bağlı olabilir. Daha düşük kesme membranlarına (örneğin, < 8 μm) sahip daha küçük partiküller için analiz yaparken, ilgilenilen partiküllerin ve benzer büyüklükteki arka plan kirleticilerinin nispi bolluğunun her ikisinin de katlanarak artacağını ve kalite kontrolünde daha yüksek seviyelerde sıkılık gerektireceğini dikkate alın22. Herhangi bir kontaminasyon seviyesi kabul edilemez olsa da, koşullar sıkı bir şekilde kontrol edildiği ve yüksek derecede tutarlılık sağlandığı sürece, çevresel mikroplastiklerin iyi analizleri veya ilgili analizler yine de yapılabilir.

Numune filtreleme
Şekil 3'teki örnek veri kaskadında gösterildiği gibi, aslına uygun bir multimodal analiz oluşturmak için ideal bir numune filtrasyonu gereklidir. Bu tür numune filtrasyonu, nanomembran yüzeyi boyunca iyi dağılmış partiküllerle sonuçlanacaktır (örneğin, membran yüzey alanı kaplamasının yaklaşık üçte biri ile). Parçacık agregasyonu (üst üste binen parçacıkların büyük kümeleri) gibi zayıf dağılmış parçacıklar, üst üste binen parçacıklar güvenle kolayca ayırt edilemediğinden, hem manuel hem de otomatik parçacık sayma yöntemlerini karıştıracaktır. Bu tür veriler genellikle analizden çıkarılır ve bu da değerli ilgi bilgilerinin kaybına yol açabilir. Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi iyi dağılmış parçacıklar, herhangi bir spektroskopik veya nicelik tayini, doğru bir şekilde yorumlanması, tanımlanması ve nicelleştirilmesi daha zor sonuçlar verebilecek çeşitli bileşimlere sahip yığılmış veya üst üste binen parçacıklar tarafından karmaşık hale getirilmemesini sağlar.

Nil Kırmızısı ve Tripan Mavisi boyama
Optimum floresan partikül boyama örneklerinin temsili görüntüleri, 20 μm'lik bir kesme SiN filtre diski üzerinde Şekil 3B'de gösterilmektedir. Nanomembran yüzeyinden NR veya TB lekesinin az durulanması yanlış pozitif sonuçlar oluşturabilir. Yetersiz durulama nedeniyle zarın yüzeyinde tutulan her iki lekeden oluşan artık partiküller, yanlış bir şekilde lekeli partiküller olarak yorumlanabilir. Yetersiz durulamanın meydana geldiğinin bir işareti, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, nanomembranın filtrelenmiş numuneden partikül veya tespit edilebilir kalıntı filmler/kalıntılar içermeyen alanlarının gözlem sırasında floresan olmasıdır. Görüntülemeden sonra, filtre diski temiz koşullarda tutulduğu sürece, tek tek nanomembran filtre diskini vakum filtrasyon aparatına (eksi contalar) yerleştirerek, vakumu açarak ve başka bir hacimde Ultrapure% 99 IPA (NR için) veya Ultrapure su (TB için) filtre diskinin nanomembranına filtreleyerek yeniden durulama yapılabilir. Kullanılan ek durulama ortamının toplam hacmini kaydedin. En iyi sonuçları elde etmek için, yeniden durulama adımından kaynaklanan herhangi bir kontaminasyonu hesaba katmak için yeniden durulama yapmadan önce tüm nanomembran yüzeyinin mikroskopi görüntülerini alın.

Raman spektroskopisi
Kaplanmamış SiN üzerinde gerçekleştirilen Raman spektroskopisi, lazer dalga boyuna bağlı olarak belirgin bir tepe üretebilir ve bu tepe noktası, yaklaşık olarak 520 cm-1 dalga sayısı bölgesi23 içindeki düşük bolluk sinyallerini maskeleyebilir. İlgilenilen Raman spektrumları Silikon veya Silisyum Nitrür arka plan tepe noktasından yeterince ayrılmışsa, kaplanmamış SiN filtre disklerinin kullanılması yeterli Raman spektroskopisi sonuçları vermelidir. Bu raporda, B ve C işlem hatlarının her ikisi de Au-SiN filtre disklerini kullandı. Au-SiN'in altın kaplaması, doğal Si zirvesini maskeleyerek, düşük bolluk spektrumlarının 520 cm-1 dalga sayılarının yakınında veya yakınında daha güvenilir bir şekilde toplanmasını sağlar. Ek olarak, Raman mevcut değilse Au-SiN IR spektroskopisi ile kullanılabilir. Her zaman cihazdaki en düşük güç ayarlarıyla (yani lazer yoğunluğu) başlayın ve ardından oksitlenmiş parçacıklar gibi bazı ilgili parçacıklar kırılgan olabileceğinden ve lazer tarafından hasar görebileceğinden veya tahrip olabileceğinden kademeli olarak artırın.

Seçilen parçacıkları Raman spektroskopisi ile analiz ederken, geri dönen bir spektrumun güvenilirliğini belirlemek çok önemlidir. Bazı parçacıklar otomatik olarak floresan yayabilir ve bu floresan, parçacık sinyalinin yorumlanmasını maskeleyebilecek veya karmaşıklaştırabilecek spektral ölçüme gürültü ekleyecektir. Bu gürültü, çok çeşitli dalga sayılarını kapsayan ve temeldeki verileri birleştiren yüksek yoğunluklu bir bant şeklini alacaktır. Şekil 3C ve Şekil 4C,D'de gösterilen uygun spektrumlar, taban çizgisi düzeltmesinden önce bile, daha kısa dalga sayıları aralıkları boyunca açıkça tanımlanmış zirvelere sahip olacaktır. Çevredeki sinyallerin herhangi birinden en az üç kat daha büyük bir tepe noktası ortaya çıkmazsa, toplanan spektrumların ya arka plan gürültüsü olması ya da söz konusu parçacığı analiz etmek için farklı cihaz ayarlarının gerekli olması muhtemeldir. Her numune için uygun lazer dalga boyunun seçildiğinden emin olun. 532 nm lazer gibi daha düşük dalga boylu lazerler, floresan tarafından üretilen sinyali yeterince işleyemez. 782 nm veya 830 nm lazer gibi daha yüksek dalga boylu bir lazer, bir spektrum döndürmek için yeterli floresanı yeterince görmezden gelebilir. Numunenin türüne bağlı olarak, farklı partikül türleri için farklı lazerler uygun olacaktır ve mümkünse, tek bir filtre diskinde veri toplama sırasında değiştirilebilir.

Parçacıkların bileşimini belirlemek için, toplanan spektrumları bir referans spektrum veritabanındakilerle karşılaştırılır. Belirli bir parçacık spektrumunun güvenilir bir şekilde tanımlanması, p'ten daha büyük bir Pearson katsayısı (r) verecektir (r > 0.70). Optimal olmayan Raman verileri, 0.70'< olan Şekil 5B'de gösterilmektedir. MP tanımlama sonuçları, potansiyel MP kirliliği kaynaklarının belirlenmesinde faydalıdır. Partikül tanımlama sonuçlarını görüntülemek için, analiz edilen partikülün bir görüntüsü ve spektrumları Şekil 3C ve Şekil 4C'deki gibi gösterilebilir.

Taramalı elektron mikroskobu
Hem SiN hem de Au-SiN filtre diskleri, filtrasyon ile partikül yakalandıktan hemen sonra SEM ile uyumludur. SiN filtre diskleri SEM'den önce ve partikül yakalamadan sonra Au veya Pt ile kaplanmamışsa, bazı partiküller SEM'in iyonizasyon ışını tarafından daha kolay "yüklenebilir", bu da partikülün parlamasına veya görüntülerde çok parlak görünmesine neden olabilir. Bu parlaklık/parlama, parçacığın morfolojisini maskeleme gibi zayıf kontrast nedeniyle görselleştirme ile ilgili sorunlara neden olabilir. Azaltmak için, daha sonraki SEM/EDX analizi için analiz edilmesi zor veya ilgilenilen küçük parçacıkları işaretlemek için SEM'den önce optik/floresan mikroskobu ve Raman spektroskopisi gerçekleştirin, ardından nanomembranı protokol bölüm 7'de belirtildiği gibi Au veya Pt ile kaplayın ve SEM/EDX gerçekleştirin.

Partikül yakalamadan sonra ve SEM analizinden önce SiN veya Au-SiN'nin Au veya Pt ile kaplanması, partiküller artık atılan metal tabaka altında iyonlaşmaya duyarlı olmadığından, görüntüleme sırasında bu şarj etkisinin önlenmesine yardımcı olur. Bu kaplama, kontrastı ve çözünürlüğü geliştirir, böylece Şekil 3D'de (lif ve fragman) veya oksitlenmiş parçacıklar üzerindeki çukurlar ve çatlaklar gibi yüzey morfolojilerinde görüldüğü gibi, belirli bir parçacığın daha büyük bir morfolojik anlayışı elde edilebilir. SEM analizinden önce metal kaplama parçacıkları, spektroskopi veya floresan görüntüleme ile daha fazla analiz edilmelerini kalıcı olarak önleyecek ve yalnızca SEM/EDX analizlerini hala mümkün kılacaktır. Partiküllerin kaplanması ve bu nedenle SEM/EDX'in gerçekleştirilmesi, amaçlanıyorsa herhangi bir işlemdeki son adımlar olmalıdır.

EDX ölçümleri, metal kaplamadan önce ve sonra yakalanan parçacıklar üzerinde gerçekleştirilebilir. EDX, Raman analizi için algılama boyut sınırından daha küçük olan herhangi bir parçacıkla iyi bir şekilde eşleşen belirli bir parçacığın veya alanın spesifik temel bileşimini veya metal, alaşımlar, suya doymuş partiküller ve kullanım için mevcut Raman lazer ışınlarına maruz kaldığında güçlü bir şekilde floresan yayan parçacıklar gibi belirli Raman lazer dalga boylarıyla analiz edilmesi zor olabilen temel bileşimleri ortaya çıkarabilir. Bu çalışmada, parçacıklar 6 nm kalınlığında bir Au tabakası ile kaplanmıştır. 20 kV ışın gücü ve 5 mm odak uzaklığı ile 200x-3.000x büyütme arasında SEM görüntüleme yapıldı. Seçilen parçacıkların ilgili SEM görüntüleri Şekil 3D'de gösterilmiştir.

Temsili EDX sonuçları Şekil 3F'de gösterilmektedir. Yüzde ağırlığı %1'den az olan elemanlar, cihazın hassasiyetine bağlı olarak eser veya güvenilmez olarak kabul edilebilir; Bu nedenle, %1 olarak bir eşik belirledik. EDX analizi için seçilen parçacıklar kaplanmışsa, temel veri raporunda tespit edilebilir miktarda kaplama mevcut olacaktır. Kaplanmamış SiN filtre diskleri kullanılıyorsa, Şekil 3F'de gösterildiği gibi Si ve N sinyalleri gözlenecektir. Sentetik polimer parçacıklarının çoğu aynı zamanda C, H ve O elementlerini de içerecektir, çünkü ne yazık ki, biyolojik kaynaklardan gelen sentetik olmayan parçacıkların çoğu da aynı elementlerden yapılmıştır, ancak sentetik olmayan parçacıklar, proteinlerde olduğu gibi S gibi elementleri de içerebilir. Bileşimdeki bu benzerlik, Nil Kırmızısı ve Tripan Mavisi ile karşı boyama yönteminin sentetik ve sentetik olmayan parçacıkları ayırt etmek için yararlı olmasının nedenidir, ancak Nil Kırmızısı aynı zamanda sentetik olmayan parçacıkları da lekeleyebildiğinden, kapsamlı bir tanımlama aracı değildir. Sonuçları doğrulamak için herhangi bir boyama prosedürü ile birlikte yukarıda önerilenler gibi ek analiz parametreleri kullanılmalıdır. Ek olarak, EDX, Raman spektroskopisi için algılama boyut sınırının dışında kalan parçacıkları (yani, 1 μm < ölçen nanoplastikler) potansiyel olarak tanımlamak için yararlı bir araç olabilir.

figure-results-1
Şekil 1: SNAP boru hatları. (A) SNAP boru hatlarının şemaları, aynı nanomembran üzerindeki aynı parçacıkları bir dizi farklı analitik teknikle karakterize eder. Boru Hattı A) 1) Vakum filtrasyonu yoluyla içme suyu örneklerinden yakalanan ilgili parçacıkların 2) sentetik ve sentetik olmayan polimerik parçacıkların farklılaşması için sırasıyla Nil Kırmızısı ve Tripan Mavisi ile boyandığını, ardından 3) Raman spektroskopisi yoluyla parçacık tanımlamasını ve 4) parçacık morfolojisini ve element tanımlamasını karakterize etmek için SEM/EDX'i gösterir. Boru hattı B) 1) Au-SiN üzerine parçacık yakalamayı ve ardından 2) Raman spektroskopisini gösterir. Boru Hattı C) 1) Au-SiN üzerine parçacık yakalama ve ardından SEM/EDX gösterir. (B) Vakum aparatındaki filtrasyon kurulumundaki filtre diskinin ve silikon contanın şeması, silikon contalarla ayrılmış 20 μm MPSN, ardından 8.0 μm MSSN nanomembran boyunca sıralı filtrelemeyi gösterir. Kısaltmalar: SNAP = Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı; SEM = taramalı elektron mikroskobu; EDX = enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi; MPSN = mikro gözenekli Silisyum nitrür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İçme suyu numunesi toplama kaynakları. Monroe County Su İdaresi tarafından yayınlanan ve Greater Rochester, NY bölgesinde dört içme suyu örneğinin her birinin toplandığı yerleri gösteren bölgesel bir harita. Örnekler farklı yüzey suyu kaynaklarından elde edilmiştir: Ontario Gölü (mavi), Hemlock Gölü (yeşil), hem Hemlock Gölü hem de Ontario Gölü (sarı) ve Canandaigua Gölü (mor). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İçme suyu örneklerinden yakalanan partiküller üzerinde gerçekleştirilen SNAP Boru Hattı A'dan yapılan analizlerin özeti. (A) 20 μm'lik bir kesme SiN üzerinde temsili bir içme suyu örneğinden yakalanan parçacıkların gri tonlamalı görüntüsü. (B) Nil Kırmızısı (sahte renkli kırmızı parçacıklar) ve Tripan Mavisi (yanlış renkli mavi parçacıklar) temsil etmek için karşı boyanmış parçacıkların yanlış renkli kaplama görüntüsü. (C) Pearson'ın r değeri 0,97 olan Nil Kırmızısı lekeli bir parçacığı polietilen olarak tanımlayan referans (kırmızı) ve toplanan (beyaz) Raman spektrumları, analiz edilen parçacığın temsili görüntüsü ile. (D) Her ikisi de Tripan Mavisi lekesini alan bir lifin (üst panel) ve parçanın (alt panel) parçacık morfolojisi analizini gösteren iki farklı parçacık tipinin elektron mikrografı. (E) Hem 20 μm hem de 8 μm kesme nanomembranları üzerine sırayla yakalanan Nil Kırmızısı lekeli parçacıkların miktarının belirlenmesi. (F) Rastgele seçilen bir parçanın özetlenmiş EDX element analizi ve analiz edilen partikülün temsili SEM görüntüsü ile sonuçların analitik ayrıntıları. Kısaltmalar: SNAP = Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı; SEM = taramalı elektron mikroskobu; EDX = enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: İçme suyu örneklerinden yakalanan partiküller üzerinde SNAP Boru Hattı B'den yapılan analizlerin özeti. 20 μm MPSN ve 8.0 μm MSSN Au-SiN filtre disklerinde yakalanan dört ev içme suyu örneğinden üç randomize partikülün Raman spektral analizi. 20 μm ve 8 μm Au-SiN için toplam aktif membran alanının temsili karanlık alan görüntüleri sırasıyla A ve B'de gösterilmiştir. Bu görüntüleme modunda parçacıklar sarı görünürken arka plan karanlık kalır ve otomatik parçacık sayımını kolaylaştırır. (C) 20 μm ve (D) 8.0 μm Au-SiN üzerinde sentetik ve sentetik olmayan partiküllerin temsili Raman spektrumları. (E) 20 μm ve (F) 8.0 μm Au-SiN için toplam partikül sayımları, otomatik partikül bulma yazılımı tarafından belirlenen boyut aralıklarına göre gruplanır. Kısaltmalar: SNAP = Silikon Nanomembran Analiz Boru Hattı; SEM = taramalı elektron mikroskobu; EDX = enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi; MPSN = mikro gözenekli Silisyum nitrür; MSSN = mikroyarık Silisyum nitrür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Suboptimal floresan Görüntüleme ve Raman spektroskopisi sonuçları. (A) Zarın muhtemelen yetersiz durulamadan kaynaklanan Nil Kırmızısı lekesini koruduğu lekeli parçacıkların (sol panel) optimal olmayan bir floresan görüntüsü. Raman spektroskopisi için iki parçacık, bir Tripan Mavisi lekeli lif ve bir Nil Kırmızısı lekeli parça (sağ panel) seçildi. (B) Pearson katsayısının (r) p'ten az olduğu (r < 0,70) optimal olmayan Raman spektroskopisi sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Filtre diskleri içindeki silikon nanomembranların özellikleri. Bu tabloda gösterilen, minimum gözenek boyutu, yüzde gözeneklilik, Au kaplamalı ve kaplamasız membranların kalınlığı, membranın aktif alanı ve ayarlanmış bir sabit basınçta uygulanan pozitif basınçla membrandan gaz geçirgenliği dahil olmak üzere SiN filtre diskleri içindeki membranların özellikleridir. Kesme (yani gözenek boyutu), gözeneklilik, kalınlık ve membran alanı, SEM görüntülerindeki özelliklerin ölçülmesiyle belirlenir. Gaz geçirgenlik verileri, 103.42 kPa'da uygulanan N 2 pozitif basınç için ortalama ± standart sapma (n = 10) olarak rapor edilir. Kısaltmalar: Au = Altın; Six Ny = Stokiyometrik Olmayan Silisyum Nitrür. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S2: ParticleFinder partikül sayımları ve parametreleri. Her numuneden tüm membran alanı görüntü mozaikleri alındı ve her bir görüntü mozaiği, toplam parçacık sayımlarını toplamak için analiz edildi. Bu tabloda, kullanılan parametreler ve her bir numune görüntüsü için toplam partikül sayımlarının hangi sırayla belirleneceği ve belirli boyut fraksiyonlarındaki partikül sayımları gösterilmektedir. Parametreler, partiküllerin türü, miktarı ve şeklinin yanı sıra görüntüleme sırasında her bir zarın spesifik yansıtıcılığı göz önüne alındığında numuneden numuneye değişir. Bu tablodaki veriler Şekil 4'te görselleştirilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplastik kirliliğin azaltılması giderek artan bir endişe konusudur; Ve azaltmanın ilk adımı, kontaminasyonun varlığını belirlemektir. Kolaylaştırılmış bir yakalama ve anında analiz yöntemi, araştırmacılara zaman kazandırmak ve hassas örnek ölçümlerini korumak için çok önemlidir. Bu rapor, gerçekleştirilen tüm analizler için tek bir substrat kullanan, sıvı numunelerde bu tür MP'lerin analizi için geliştirdiğimiz SNAP yöntemlerinin varyasyonlarına dayalı esnek iş akışlarını açıklamaktadır. Numune, partiküllerin yakalanması ve bir filtre diskinin içine yerleştirilmiş bir Silikon nanomembran üzerine izole edilmesi için vakumla filtrelenmelidir. Arka plan kontaminasyonunun yeterli şekilde azaltılması, anlamlı sonuçlar için kritik öneme sahiptir. Filtrasyon sırasında dağıtım şırıngası veya cam vakum hunisi üzerindeki herhangi bir kirletici partikül numuneyi kontamine edebilir ve aynı anda yakalanabilir, bu nedenle doğru sonuçlar için Bölüm 1 kalite kontrol protokollerini özenle takip etmek çok önemlidir. Araştırmacıları bireysel süreçlere ve laboratuvar koşullarına özgü arka plan kontaminasyonu konusunda bilgilendirmek için yalnızca ortam kontrolleri önerilir. Burada açıklanan protokol, sıvı bir numunenin vakumla filtrelenmesinin yanı sıra numuneden partiküllerin iki farklı kesme SiN filtre diskinde yakalanmasına ve izole edilmesine dayanır. Tüm boru hatları için, parçacık yakalama ve izolasyon diğer yöntemlerden önce gelmelidir, ancak diğer tüm tanımlama yöntemleri, araştırmacı için en uygun sırayla yapılabilir.

Sonuçların aletler arasında tekrarlanabilirliğini göstermek için bu çalışma için iki floresan mikroskop kullanıldı. Talimat adımları, kullanımının baskınlığı nedeniyle floresan mikroskobu için bir Olympus BX61'in kullanımını özellikle detaylandırır ve gri tonlamalı görüntüleme için parlak alan, TRITC kanalı (Örn. ~543 nm; Em. NR lekeli parçacık görüntüleme için ~593 nm) ve Cy5 kanalı (Örn. ~649 nm; Em. ~ 667 nm) uygun olduğu şekilde TB lekeli parçacık görüntüleme için. Boyama sonuçlarını görüntülemek için, 2.048 x 2.040 piksel çözünürlükte ve 16 bit derinlikte kanal görüntülerinin bir kaplamasını oluşturmanızı öneririz (görüntü işleme için FIJI/ImageJ kullanıyoruz, daha sonra görüntü analiz platformu olarak anılacaktır). Tüm nanomembran görüntüleri, Şekil 4A,B'deki gibi veya Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi seçilen ilgi alanları olarak görüntülenebilir.

Nil Kırmızısı, sentetik polimer MP'leri boyamak için yaygın olarak kullanılır, ancak lipofilik ve hidrofobik doğası nedeniyle biyolojik kaynaklardan sentetik olmayan polimerleri lekeleyebilir ve potansiyel olarak MP miktar tayin sonuçlarınıbozan yanlış pozitiflere neden olabilir 24,25,26. Yanlış pozitif olayların ayırt edilmesine yardımcı olmak için protokol bölüm 3'te belirtildiği gibi bir Tripan Blue karşı boyama adımı önerilir, ancak kapsamlı bir çözüm değildir ve sonuçları doğrulamak için ek analiz ölçümleriyle eşleştirilmelidir. Parçacıkların Nil Kırmızısı floresansı, arka plan sinyalini önemli ölçüde artırabileceğinden Raman spektroskopisi analiziyle ilgili bir endişe kaynağıdır. Bununla birlikte, bu çalışmada, 830 nm lazerle Raman spektroskopisinden önce polimerleri Nil Kırmızısı ve Tripan Mavisi ile karşı boyadık ve Şekil 3'te gösterildiği gibi çok az gürültü gözlendi.

Raman spektroskopisi için uygun olan lazerlerin bazı dalga boyları, 532 nm lazer gibi lekeli parçacıklardan gelen floresansı göz ardı edemez ve bu nedenle, ilgilenilen parçacığın bileşimini doğru bir şekilde tahmin etmede önemli zorluklara neden olabilir. Yakalandıktan sonra parçacıkların metal kaplanması, SEM görüntüleme sırasında kontrastı artırmak için yararlıdır, ancak sonraki herhangi bir spektroskopik veya floresan analizle uyumlu değildir. Proses akışının ve kaplama türlerinin uygun şekilde dikkate alındığından emin olmak için deney kurulumundan önce istenen tüm ölçümleri not edin. Au-SiN filtre diskleri, iletim mikroskobunun iş akışı için çok önemli olmadığı veya Raman veya IR spektroskopisinin kullanıldığı belirtilen tüm analizler için kullanılabilir.

Burada gösterilen yöntemlerin yanı sıra, ilgilenilen parçacıkları yakalamak ve izole etmek için kullanılan nanomembranlar, bireysel araştırmacıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Nanomembranlar bir dizi spektroskopik analiz için uygundur ve araştırmacı, filtrelenmekte olan ortamı, sindirilmiş hayvan dokuları27, enjekte edilebilir farmasötikler ve yağ örnekleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, ilgilenilen başka bir örnek ortamı ile değiştirebilir. Bu çalışma için iki Raman spektroskopisi cihazı kullanıldı ve öğretim adımları, Şekil 4'te gösterilen tüm verileri toplayan ve işleyen bir Horiba XploRA Plus Raman cihazının kullanımını özellikle detaylandırıyor. İlgilenilen parçacıkların cihazın lazerlerinin nokta boyutuyla uygun şekilde analiz edilebilmesini sağlamak için her bir Raman mikroskobu için algılama boyutu sınırını kabul etmek de önemlidir. Raman ile partikül tanımlama sonuçlarını görüntülemek için, referans ve numune spektrumları ile analiz edilen partikülün bir görüntüsü Şekil 3C ve Şekil 4C'deki gibi gösterilebilir.

Protokol bölüm 6, açık kaynaklı bir spektral kitaplık kullanarak parçacık tanımlama talimatlarını detaylandırır. Partiküllerin düzgün düz bir zar üzerine düzlemsel olarak yakalanmasının yanı sıra zarın düzenli gözenek dizisi, öngörülebilir, otomatik görüntüleme sağlar. SiN'nin hem 400 nm hem de 1.000 nm kalınlıkları ve Silisyum nitrür bileşimi, onlara mükemmel optik şeffaflık kazandırır, ancak bazı spektroskopik alet parametrelerinde yoğun bir Silikon zirvesi de döndürebilir. Raman analizi ile çıplak, metal kaplı olmayan SiN kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Si tepe noktası bir kalibrasyon sinyali olarak işlev görebilir, ancak tepe noktasının yoğunluğu, Si'nin sinyaliyle aynı dalga sayısı bölgesindeki düşük yoğunluklu spektrumların sinyallerini de maskeleyebilir. Bu çalışmada 830 nm lazer kullanılırken bu tür Si zirveleri gözlenmemiştir.

Burada kullanılan SiN (400 nm veya 1.000 nm kalınlığında) ve Au-SiN'nin (520 nm veya 1.120 nm kalınlığında) ultra ince doğası, onlara mükemmel filtrasyon, optik ve spektroskopik özelliklerini kazandırdı. Bununla birlikte, bu membranlar, aşırı diferansiyel basınç (yani ≥-206 kPa), cımbız veya parmaklarla doğrudan dokunma veya yanlış conta yerleştirme gibi fiziksel hasarlardan korunmalıdır. Membranları muhafaza eden filtre diski onları korur ve normal kullanımda kullanım kolaylığı sağlar. Filtre disklerini manipüle ederken, yalnızca siyah dış halkaya dokunun, asla aktif membran alanına dokunmayın. Burada kantitatif olarak rapor edilmese de, yakalanan partiküllerin az miktarda membran yüzey alanına (sırasıyla 20 μm için 3 x 3 mm ve 8,0 μm kesme membranları için 3 x 0,7 x 3 mm) toplanması, ilgilenilen partikülleri bulmak ve analiz etmek için gereken süreyi azaltarak toplam numune analiz süresini potansiyel olarak azaltır. Bu "konsantrasyon faktörü" gelecekteki araştırmalara değerdir ve araştırmacılar için SiN filtre disklerinin benzersiz bir avantajını sunabilir. MP karakterizasyonu15 için yaygın olarak kullanılan diğer membranlara kıyasla daha yüksek yüzey alanı normalleştirilmiş akış hızlarıyla birlikte, yalnızca düzgün bir şekilde düz ve odak içi SiN'nin nispeten daha küçük bir alanını görüntülemeye ihtiyaç duyan otomatik parçacık görüntüleme rutinleri, toplam analiz sürelerini daha da azaltabilir. Bununla birlikte, varsayımsal konsantrasyon faktörü ile ilgili herhangi bir faydanın, geleneksel ve SiN filtre disklerinde toplam işlem sürelerinin (filtrasyondan görüntü analizine kadar) karşılaştırılarak ampirik olarak gösterilmesi gerekmektedir.

Yerel musluk suyu numuneleri üzerinde SNAP varyasyonlarının faydasını sezgisel olarak gösterdik. Burada açıklanan protokol, Rochester, NY çevresindeki içme suyu kaynaklarından MP yakalamaya odaklanmaktadır. Numune toplama şu şekilde ilerledi: her numune toplama için, toplama başlamadan önce musluktan en az bir litre su akıtıldı. Yeni, sızdırmaz polipropilen şişeler çalışan musluğa alındı ve toplanmadan önce doğrudan açıldı. Toplama işlemi devam etmeden önce şişeler içme suyu ile durulanmadı. Her numune, birbiri ardına toplanan iki adet 500 mL'lik şişeden oluşuyordu. Her su numunesi ayrı bir evin boru sisteminden geldi ve boru malzemesi numune alma boyunca tutarlı değildi. Son su kullanım miktarı, toplanma zamanı, boruların yaşı ve numunenin geldiği evin yaşı gibi değişkenler bu çalışmada kontrol edilememiştir. Bu, doğrulanmış bir örnek toplama protokolü değildi. Her araştırmacı kendi toplama prosedürlerini geliştirmeli ve doğrulamalıdır. Bununla birlikte, yöntemlerin tam olarak açıklanması adına, yukarıdaki açıklama dahil edilmiştir. Filtre diskleri, bir dizi analitik yöntem için aynı alt tabaka üzerinde tekrarlanan analize izin verir. Standart deneme tekrarları dışında alt örnekleme veya çoklu örnekleme gerekmez. Alt örnekleme ve birden fazla numune ihtiyacının ortadan kaldırılması, düşük bolluktaki hedefler hakkında bilgi yakalamada güveni artırır. Çok modlu analiz yöntemlerinin etkinleştirilmesine ek olarak, SiN filtre diskleri, birim alan15 başına daha hızlı filtreleme hızının zaman kazandıran kalitesi nedeniyle diğer benzer filtreleme ortamlarına göre belirgin bir avantaj sağlar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JR ve JM, SiMPore Inc.'in kurucuları ve hissedarlarıdır. JR, bu çalışmada gösterilenler gibi Silisyum Nitrür filtrelerinin kullanılmasını sağlayan bir patent başvurusunun ortak mucididir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Horiba Scientific'ten Peng Miao, XploRA Plus Raman spektroskopi sisteminin kullanımı ve uzmanlığıyla bu yayını cömertçe destekledi. Elektron mikroskobu görüntülemesi, Rochester Üniversitesi'ndeki Entegre Nanosistemler Merkezi'nde (URnano) gerçekleştirildi. Mikrofabrikasyon, Rochester Institute of Technology'deki Yarı İletken ve Mikro Sistem İmalat Laboratuvarı'nda (SMFL) gerçekleştirildi.

Bu yayında bildirilen araştırmalar, kısmen Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü tarafından Ödül No. SiMPore'a R44ES031036 ve Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Ödül No. kapsamında Ontario Gölü Mikroplastik Merkezi (LOMP) tarafından. P01 ES035526 ve Ulusal Bilim Vakfı Ödül No. OCE-2418255 Rochester Üniversitesi'ne. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve herhangi bir finansman kuruluşunun resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Cam beherPyrex1000-1L
1 L Cam vakum toplama şişesiMillipore SigmaZ290459-1EA
%100 pamuklu laboratuvar önlüğüLandauLA-3172
100 mL cam filtrasyon hunisi Advantec311000
https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html %99 izopropil alkolFisher ScientificA416-20
APEX EDSEDAXEDX yazılımı, yakalanan parçacıklar üzerinde EDX analizi yapmak için kullanılır.
Denton Prep Püskürtme SistemiDenton Vakum DESKII : 293618089Altın kaplama sistemi
FIJI, görüntü analiz platformuImageJV 1.54FFIJI (FIJI sadece ImageJ'dir) - ImageJ 
Cam vidalı kapaklı şişeCorning 1395-250
KimwipesKimtech06-666-11C
LabSpec6Horiba ScientificHoriba Raman yazılımı ParticleFinder ve ViewSharp
Laminer akış başlığıiçeren Air ScienceVLF-72A
Mikroskop Olympus  / NikonBX61 / Ti2eOptik mikroskopi için uygun floresansa sahip herhangi bir mikroskop kullanılabilir.
MPSN SiN filtreleriSiMPore Inc.FD25-8.0-AU; FD25-8.0-NC
FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Monoject 60 mL şırıngaCoviden8881560265
Nil Kırmızısı tozTCIN0659
Nitril EldivenAnsell Microflex19-167-17
OpenSpecyopenanalysis.orgAçık kaynak, spektral kütüphane
FırınVWR1310Yerçekimi Konveksiyonlu Yardımcı Fırın
P20 PipetBrandtech705872
Pipet ucuPremium ŞişelerGS 151140R
Dökme destek fritAdvantec311000Paketin bir parçası
Raman enstrümanıHoribaXplora PLUS
Kauçuk tıpaAdvantec311000Paket
SEM cihazının bir parçasıZiessAuriga AurigaSerisi, Modüler Kiriş iş istasyonu
Silikon contalarSiMPoreCONTA-25-RŞeffaf döküm PDMS contaları, 0,8 mm kalınlığında
Silikon RuloSanyue ( ASIN: B07XDTNPS3)Silikon rulo -  8 x 5 x 2 inç
SmartSEMZeiss Auriga Sprey şişesiniçalıştırmak için kullanılan ZeissV8
UlineS-7273
Şırınga filtreleri Thermo ScientificCH2225-PES0.22 ve mikro; M Luer Lock Şırınga Filtreleri, 25 mm 
Şırınga pompasıYeni Era Pompa Sistemleri A.Ş.NE-1000İsteğe bağlı, ancak tavsiye edilen
Tripan Mavisi -% 0.4Millipore SigmaT8154-20ML
CımbızSiMPoreK6TWZR
Vakum pompasıWelch847-676-8800
Vakum hortumuGraingerZUSA-HT-4037
SEM yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon, M., Van Alst, N., Vollertsen, J. Quantification of microplastic mass and removal rates at wastewater treatment plants applying focal plane array (fpa)-based fourier transform infrared (ft-ir) imaging. Water Res. 142, 1-9 (2018).
  2. Da Costa Filho, P. A., et al. Detection and characterization of small-sized microplastics (≥ 5 µm) in milk products. Sci Rep. 11 (1), 24046(2021).
  3. Koelmans, A. A., et al. Microplastics in freshwaters and drinking water: Critical review and assessment of data quality. Water Res. 155, 410-422 (2019).
  4. Fendall, L. S., Sewell, M. A. Contributing to marine pollution by washing your face: Microplastics in facial cleansers. Mar Pollut Bull. 58 (8), 1225-1228 (2009).
  5. Kwon, J. -H., et al. Microplastics in food: A review on analytical methods and challenges. Int J Env Res Public Health. 17 (18), 6710(2020).
  6. Mahon, A. M., et al. Microplastics in sewage sludge: Effects of treatment. Environ Sci Technol. 51 (2), 810-818 (2017).
  7. Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: A review of the methods used for identification and quantification. Environ Sci Technol. 46 (6), 3060-3075 (2012).
  8. Ragusa, A., et al. Plasticenta: First evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  9. Schwabl, P., et al. Detection of various microplastics in human stool. Ann Intern Med. 171 (7), 453-457 (2019).
  10. Leslie, H. A., et al. Discovery and quantification of plastic particle pollution in human blood. Environ Int. 163, 107199(2022).
  11. De Frond, H., et al. Monitoring microplastics in drinking water: An interlaboratory study to inform effective methods for quantifying and characterizing microplastics. Chemosphere. 298, 134282(2022).
  12. Nutrition and Food Safety (NFS), Standards & Scientific Advice on Food Nutrition (SSA). Dietary and inhalation exposure to nano-and microplastic particles and potential implications for human health. , https://www.who.int/publications/i/item/9789240054608 (2022).
  13. Fries, E., et al. Identification of polymer types and additives in marine microplastic particles using pyrolysis-GC/MC and scanning electron microscopy. Environ Sci: Processes Impacts. 15 (10), 1949-1956 (2013).
  14. Primpke, S., et al. Critical assessment of analytical methods for the harmonized and cost-efficient analysis of microplastics. Appl Spectrosc. 74 (9), 1012-1047 (2020).
  15. Carter, J., et al. Comparative evaluation of filtration and imaging properties of analytical filters for microplastic capture and analysis. Chemosphere. 332, 138811(2023).
  16. Van Mourik, L., et al. STOTEN's minimum requirements for measurement of plastics in environmental samples. Sci Total Environ. 912, 168465(2024).
  17. Käppler, A., et al. Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both. Anal Bioanal Chem. 408, 8377-8391 (2016).
  18. Mikoliunaite, L., et al. The substrate matters in the Raman spectroscopy analysis of cells. Sci Rep. 5 (1), 13150(2015).
  19. Madejski, G. R., et al. Silicon nanomembrane filtration and imaging for the evaluation of microplastic entrainment along a municipal water delivery route. Sustainability. 12 (24), 10655(2020).
  20. Romanick, S. S., et al. Assessment of household settled dust via silicon nanomembrane analysis pipeline (SNAP). Environ Technol Innov. 38, 104106(2024).
  21. Cowger, W., et al. Microplastic spectral classification needs an open source community: Open specy to the rescue. Anal Chem. 93 (21), 7543-7548 (2021).
  22. Kooi, M., Koelmans, A. A. Simplifying microplastic via continuous probability distributions for size, shape, and density. Env Sci Technol Lett. 6 (9), 511-564 (2019).
  23. SpectraBase. , John Wiley & Sons, Inc. SpectraBase. https://spectrabase.com/spectrum/1uoQJ4M5hxj (2025).
  24. Erni-Cassola, G., Gibson, M. I., Thompson, R. C., Christie-Oleza, J. A. Lost but found with nile red: A novel method for detecting and quantifying small microplastics (1 mm to 20 µm) in environmental samples. Environ Sci Technol. 51 (23), 13641-13648 (2017).
  25. Shim, W. J., Song, Y. K., Hong, S. H., Jang, M. Identification and quantification of microplastics using Nile Red staining. Mar Pollut Bull. 113 (1-2), 469-476 (2016).
  26. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  27. Cai, B., Andino, F. D. J., Mcgrath, J. L., Romanick, S. S., Robert, J. Ingestion of polyethylene terephthalate microplastic water contaminants by Xenopus laevis tadpoles negatively affects their resistance to ranavirus infection and antiviral immunity. Environ Pollut. 356, 124340(2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microplastics AnalysisDrinking Water MicroplasticsSilicon NanomembraneMultimodal Particle AnalysisRaman SpectroscopyScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive X RayNile Red StainingParticle QuantificationSample Preparation

Related Articles