Yöntem makalesi

Endotel ve β Hücre Etkileşimlerinin 3D Çalışması İçin Yeni Adacık Modeli: Sitoprotektif Ajanların Taraması İçin Önemi

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare pankreas adacıklarının stabil sferoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedür ve küçük boyutlarına uyarlanmış 3D boyama, temizleme ve montaj yöntemleri sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, pankreas adacıklarının 3D modelinde endotel ve insülin üreten β hücreleri etkileşimlerinin incelenmesi için küçük stabil sferoidlerin üretimi, kültürü ve 3D görüntüleme için optimize edilmiş bir yöntemi detaylandırmaktadır. En düşük adacik boyut aralığını yansıtan 150-200 μm sferoidler, 1 adaca içi endotel hücresi (MS-1 hücresi) ile 20 insülin salgılayan hücre (β-TC-6) birleştirilen seçilmiş bir orandan hazırlanmıştır. Küçük kürelerin boyama, temizleme ve montaj zorlukları ile düşük erime noktasına sahip agaroz ile CUBIC temizleme tekniği kullanılarak ele alınması ayrıntılı olarak ele alınmak, ayrıca farklı problarla 3D yapının verimli analizi için önemli noktalar detaylandırılmıştır. Veriler, NTPDASE-ektonükleotidase 3'ün sferoid modelde insülin ile kolokalize olmadığını göstermektedir; bu da β-TC6'nın olgunluk ve fonksiyonel seviyelerinin değişken olduğunu ve tüm prosedürün izole pankreas adacıklarına da uygulanabileceğini, adacik içi damarların net bir şekilde problanmasını sağlar. Bu bulgular, 3D görüntüleme protokolünün adacık modelindeki karmaşık pankreas hücresi organizasyonu ve etkileşimlerini ortaya çıkarma etkinliğini vurgulamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas adacığı nakli, genellikle anında kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR) ile karmaşıklaşır; bu reaksiyon, adacık içi endotel hücrelerine (IEC) önemli ölçüde zarar verir ve greft perfüzyonu ile fonksiyonunu etkiler. Uzun vadede, nakil sonrası 4 yıl sonra hastalarda fonksiyonel adacığın azalması ve insülin bağımsızlığının kaybıtanımlanmıştır 1. Isciğik nakli için fare veya fare modelleri geliştirilmiş olsa da, IBMIR tarafından indüklenen sitokin kaynaklı greft hasarı bağlamında özellikle önemli olan adacıkların ön koşullandırılması için farmakolojik hedefleri araştırmak içinstandartlaştırılmış modeller eksiktir 2. Gerçekten de, bir sferoid yapı, yeni farmakolojik hedeflerin belirlenmesi ve sitokin kaynaklı hücre işlevsizliğine karşı sitoprotifektif moleküllerin değerlendirilmesi için özellikle uygundur. Ayrıca, tip 1 diyabet ve adacığı nakli hayvan modellerinin kullanımını sınırlamak için alternatif bir yaklaşım sunar.

Bir adacık büyüklüğündeki küçük küreler için uygun boyama, optik temizleme ve montaj koşullarını bulmak hâlâ zordur. Literatürde, küçük kürelerin işlenmesini ve temel yapısal özelliklerini tanımlayan çok az çalışma vardır. Zorluk ayrıca, doku nüfuzu, sinyal koruma ve yapısal bütünlüğü dengelerken, bu minyatür 3B hücre yapılarının hassas doğasını koruma ihtiyacından da kaynaklanmaktadır. Ayrıca, geleneksel boyama yöntemleri genellikle kürelerin eşit şekilde etiketlenmesini sağlamakta zorlanır. Bu sorun, yoğun hücresel organizasyon nedeniyle daha da kötüleştirilir; bu da antikor ve boyaların sınırlı nüfuzu nedeniyle reaktiflerin yayılmasınıengelleyebilir. 3,4. Son olarak, ışık saçılma arka planını azaltmak ve görüntüleme derinliğini artırmak için kritik olan optik temizleme süreci, küre yapısının bozulmaması veya biyolojik özelliklerin değişmemesi için dikkatlice optimizeedilmelidir.

3D mikroskopi için küçük küreleri monte etmek başka bir zorluk daha getiriyor. Geleneksel montaj ortamları, bu hassas yapılara yeterli destek sağlamayabilir ve görüntüleme sırasında deformasyona veya çökmeye yol açabilir. Ayrıca, optimal görüntüleme kalitesi için gerekli kırılma indisi eşleşmesi, sferoid 6,7 derinliğinde doğru görselleştirme sağlamak için hassas şekilde kontrol edilmelidir. Küçük sferoidlere özel protokollerin geliştirilmesi, sferoid kültürlerde kullanılan hücre tiplerinin çeşitliliği ve deneysel koşullar nedeniyle daha dakarmaşıklaşmaktadır 3. Son olarak, boyama ve temizleme süreçleri boyunca birden fazla hücre popülasyonunun bütünlüğünü korumak için özel yaklaşımlara ihtiyaç duyulması hücre yanıtlarının değerlendirilmesi için kritik öneme sahiptir.

IBMIR aracılı adacığı stresinin özel zorluklarını ele almak için, 2000 hücrelik bir sferoid model tasarlandı; bu model, mare IEC ve β hücrelere insülin salgılayan bir cihaz birleştirildi; bu oran pankreas adacığında gözlemlenenle benzer bir IEC'β hücre oranı ile 1:20 oldu. Ayrıca, önceki deneyler yapının 96 saat boyunca uygulanabilirliği koruduğunu ortaya koymuştur; böylece kısa (saat aralığı) veya daha uzun stres kaynaklı hücre yanıtlarının (günler) gözlemi ve bunların farmakolojik modülasyonu için fizyolojik olarak ilgili bir 3B model sağlamıştır. Sferoid model, MS-1 sare içi adacığı endotel hücreleri, adacığı mikrovaskürün özellikleri ve hücreler β salgılayan insülin β-TC-68'den oluşur. Pankreas adacıklarının en küçük boyut aralığını (çapı 50-200 μm) ve ortalama hücresayısı 9'u yakından taklit edecek şekilde tasarlandı.

Küçük sferoidlerin işlenişi için özel olarak optimize edilmiş yeni bir hasat ve boyama metodolojisi (çapı 150-200 μm) rapor edilmiştir; bu yöntem, floresan boyalar ve antikorların küre yapısı boyunca optimal nüfuz etmesini ve minimal arka planı mümkün kılar. Protokol, hassas sferoidler için nazik yapısal destek sağlamak ve optimal kırılma indisi eşleşmesini sağlamak için düşük erime noktası agarozu (LMPA) kullanan bir montaj prosedürünü içerir. LMPA, jelleşme (yaklaşık 27 °C) ve erime sıcaklığı (yaklaşık 65 °C) azaltılmış, gömüleme sırasında örnek bütünlüğünü koruyan ve minimum otofloresans 4,6 ile optik olarak net bir matris oluşturan modifiye edilmiş bir agaroz türüdür. Son olarak, optik temizleme için net ve engelsiz beyin/vücut görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz (CUBIC)10 yöntemi kullanılarak iç yapıların maksimum görselleştirilmesi ve hassas hücre-hücre etkileşimlerinin bütünlüğünün korunmasısağlanmaktadır 5,6,10.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pankreas dokusunun kullanımı ve tüm deneysel protokoller, Fransız hükümetinin Yükseköğretim ve Araştırma Bakanlığı (Araştırma ve İnovasyon Genel Müdürlüğü, Biyoetik Birimi) tarafından onaylanmış ve DC-2019-3439 numarasıyla kaydedilmiştir. Tüm konunun yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Sferoid hazırlığı

NOT: Sferoid kültür için yeterli hücre miktarı elde etmek amacıyla fare IEC hattı MS-1 ve fare β-pankreas hücre hattı β-TC6, eşzamanlı olarak kültürlendi. MS-1, nemli atmosferde 37 °C'de 4,5 g/L glukoz içeren DMEM Yüksek Glukoz ortamında T75 yapışkan hücreli şişelerde kültürlendi; %5 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin ile birlikte kullanıldı. Geçişler, ayrıldıktan sonra birleşme noktasında (2 gün kültür) gerçekleştirildi; Trypsin EDTA 1x ve Hank Dengeli çözelti (HBSS) içinde üç yıkama kullanıldı. β-TC6, 4,5 g/L glukoz içeren DMEM Yüksek Glukoz ortamında zor yapışkan hücreler için T75 içinde kültürlendi; %15 fetal sığır serumu ve %1 Penisillin/Streptomisin ile birlikte nemli atmosferde 37 °C'de kullanıldı. Geçişler, Trypsin EDTA ile ayrıldıktan sonra 1x ve Hank Dengeli çözelti (HBSS) ile 3 yıkamadan sonra β-TC6 birleşiminde (10 günlük kültür) gerçekleştirildi.

  1. Küre kültürü tabağını hazırla
  2. Plakayı, üretici tarafından sağlanan 500 μL anti-yapışma yıkama çözeltisi ile yıkayarak hücre yapışmasını önleyin ve sferoid oluşumunu teşvik edin.
  3. Plakayı 1.300 x g hassasiyetinde, oda sıcaklığında plaka tutucuları bulunan sallanan bir kovalı rotorda 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  4. Mikro kuyruklarda baloncuk kalmadığından emin olmak için plakayı ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Eğer öyleyse, 1.300 x g ile ikinci kez 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Anti-yapışma durulamayı atın ve kuyuyu 1 mL sıcak HBSS ile 3 kez yıkayın.
  6. HBSS'yi bırakın ve yerine 500 μL sıcak sferoid ortam koyun: DMEM Yüksek Glukoz, 4,5 g/L glukoz, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin/streptomisin içerir.
  7. Plakayı nemli atmosferde 37 °C'de tutun ve küre süspansiyonunu hazırlayın.
  8. MS-1 ve β-TC6'yı tripsin çözeltisiyle eşzamanlı olarak kuluçka edinin ve her hatttaki canlı hücreleri sayın.
    NOT: Tohumlama sırasında, sferoidler pankreas adacıklarına özgü 1 IEC ile 20 β hücre oranı kullanılarak oluşur. Her kuyu 300 mikrokuyu içeren ve 2000 hücreden oluşan bir sferoid barındırabilecek 24 kuyruklu bir sferoid kültür plakası kullanın; toplamda her kuyu başına 600.000 hücre var. Bu araştırmada, ölçümler, 48 saatlik sferoid kültürden sonra seçilen β-TC6 ve MS1 hücre hatlarının işgal ettiği aynı sferoid hacimleri ortaya koydu.
  9. İki hücre hattını 24 kuyu için 1'e 20 oranına uyacak şekilde karıştırın ve ardından 24 mL sferoid ortamda askıya alın.
    NOT: Süspansiyonu homojenleştirmek için 10 mL veya 25 mL pipetleri e-emme akışı hareketinde kullanın.
  10. Her kuyu için 1 mL pipet yapın ve hücre süspansiyonunu kuyunun içinde eşit dağıtmak için emiş akışı hareketiyle ilerleyin.
  11. Plakayı 130 x g sıcaklığında, oda sıcaklığında plaka tutucuları bulunan sallanan bir kovalı rotorda 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  12. Plakayı mikroskop altında gözlemleyerek hücrelerin mikro kuyular arasında eşit dağıldığını kontrol edin.
    NOT: Bu santrifüj aşamasında, yüksek ivme ve yavaşlama hızları kullanın (ivme ve yavaşlama ölçeklerinin %70-90'ı), aksi takdirde hücre kümeleri mikro kuyunun yanına kayacaktır.
  13. Plakayı 37 °C, %5CO2 sıcaklığında inkübe edin.
  14. Sferoid oluşumu ve büyümesini ışık mikroskobu ile izleyin.
    NOT: β-TC6 / MS-1 küreleri 24 saat kültür sonrası oluşmaya başlamalı, 48 saat sonra küre şekline ulaşmalıdır. Çift örneklerde tripsin tarafından sferoid bozulmadan sonra trypan blue ile canlılık izlenebilir ve 96 saat (%80-%90) boyunca korunmuştur.

2. Sferoid hasadı ve boyama

  1. Küreleri bir P1000 pipetiyle nazikçe tekrar askıya alın.
  2. Sferoidleri 15 mL'lik bir Falcon'da küçük hacimlere fırlatın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 130 x g seviyesinde santrifüj yapın
  3. Ortamı nazikçe aspire ederek sferoidleri içeren peletten kaçının.
  4. Pelleti 2 mL HBSS ile iki kez nazikçe yıkayın, böylece kürelerin ayrışmasını önleyin ve 130 x g üzerinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Kimyasal bir başlık altında, HBSS'yi atın ve sferoidleri gece boyunca 4 °C'de 1 mL %4 PFA çözeltisiyle yeniden süzülerek fiksasyonla yerleştirin.
  6. Tüpü 130 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj edin, %4 PFA çözeltisini atın ve laboratuvar kalitesinde ultrasaf suda hazırlanmış 2 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  7. 2.5 mL HBSS ile tekrar süzülür.
  8. Küre süspansiyonunu 6 kuyu bir plakaya dağıtın.
  9. Dürbün büyüteciğin altında, P200 pipetiyle 20 ila 30 sferoidi elle seçip 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    NOT: Her 1,5 mL tüp, 20 ila 30 sferoid içeren bir boyama durumudur. 20 hasat edilen kürelerin altında, onları tekrar askıya alındıklarında görmek zorlaşır.
  10. 1,5 mL'lik tüplerin hacimlerini dengeleyin ve 800 x g gençlikte 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    NOT: Bu noktadan itibaren, tüm çözelti aspirasyon adımları büyüteç yardımıyla gerçekleştirilir. Yapay ışık altında küreleri görmek çok zordur. Gündüz saatlerinde, tüpleri gün ışığına karşı tutarak her zaman aşağıdaki adımları yapın. Tüm çözeltiler P1000 uçlu ve ucunda P10 ucu ile aspirasyonludur.
  11. Küreleri tekrar askıya almadan mümkün olduğunca çok HBSS'yi kaldır.
  12. Sferoidleri 400 μL söndürme çözeltisine (0.5 M glisin, 1x PBS (pH 7-7.4)) ile yeniden askıya alın, böylece PFA fiksasyonundan kalan aldehitlerin gelecekteki arka plan gürültüsünü önler. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
  13. 800 x g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve söndürme çözeltisinden pipetleyin.
  14. 400 μL penetrasyon tamponu (%0,2 Triton X-100, 0,3 M glisin, %20 DMSO, 1x PBS) ile yeniden süzülür. Bu, antikorların ve nükleer probların nüfuzunu artırmaya yardımcı olacaktır. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
    NOT: Bu aşamadan itibaren küreler kendi kendine yerleşir ve artık tüp duvarına yapışmazlar. Hacimler sferoid pelleti rahatsız etmeden nazikçe aspirasyon edilirse santrifüjleme artık gerekli değildir. Gerekirse, 800 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  15. Penetrasyon tamponunu atın ve 400 μL bloklayıcı tamponda (%0,2 Triton X-100, %1 BSA, %10 DMSO, %5 keçi serumu 1x PBS'de) gece boyunca 37 °C'de inkübe yapın.
  16. Bloklayıcı tamponu atıp 300 μL birincil antikor çözeltisi (%0,2 Tween 20, %1 BSA, %5 DMSO, %5 keçi serumu 1x PBS) içinde 37 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
    NOT: Kullanılan birincil antikorlar şunlardır: anti-CD31 (nihai konsantrasyon 2,2 μg/mL), anti-Integrin β1 (1,43 μg/mL), anti-İnsülin (0,66 μg/mL) ve anti-fare NTPDaz311 (seyrelme 1:1000) (bkz. Malzeme Tablosu). İlgili aynı izotiplere sahip kontrol IgG'leri, floresan mikroskopi ile pozitif etiketleme belirlemek için aynı yapı üzerinde doğrulanmalıdır.
  17. Birincil antikor çözeltisini atın ve 400 μL yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın (%0,2 Tween 20, %1 BSA 1x PBS). Yıkamalar arasında 5 dakika çalkalayın.
  18. İkincil antikor çözeltisi 300 μL'yi (DAPI (2 μg/mL), %0,2 Tween 20, %1 BSA, %5 DMSO, %5 keçi serumu 1x PBS) gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Tüpleri alüminyum folyo ile koruyun.
    NOT: DAPI her zaman boyama koşullarına eklenmelidir, çünkü bu mikroskopik görüntülemede sferoidleri bulmayı kolaylaştırır ve farklı floroforların/boyaların ağartılmasına yardımcı olur. Tüm ikincil antikorların nihai konsantrasyonu 2 μg/mL'dir ( bkz. Malzeme Tablosu).
  19. İkincil antikor çözeltisini atın ve 400 μL ikinci yıkama tamponuyla 3 kez yıkayın: %0,2 Tween 20, %1 BSA 1x PBS'de. Son yıkamayı tutun ve tüpleri 37 °C'de tutun, sonra aynı gün montaj yapılacak.

3. Çözelti hazırlığı

  1. Optik temizleme çözeltisi hazırlama
    NOT: Optik temizleme çözümü CUBIC10 prosedürünü takip eder ve Gunasingh veark. 4 tarafından önerildiği şekilde hazırlanmıştır. Bileşen oranları, nihai çözelti ağırlığının (w/w) yüzde oranları olarak verilir, çünkü Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroksipropil) etilenediamin pipet için çok viskozdur ve tartılmalıdır.
    1. Bir cam şişede %9 (w/w) N,N,N′-Tetrakis(2-Hidroksipropil) etilenediamin, %22 (w/w) urea, %44 (w/w) sukroz, %0,1 (w/w) Triton X-100 ve %24,9 (w/w) laboratuvar kalitesinde ultra saf su bulunuyor.
      NOT: 24 kuyruklu bir plakayı temizlemek için yaklaşık 60 g çözelti gereklidir.
    2. Şişenin çapına göre uyarlanmış bir manyetik çubuk ekleyin.
    3. Çözeltiyi ısıtın ve 56 °C'ye kadar karıştırın. Aynı plakada su dolu bir kontrol cam şişesi bulundurarak sıcaklık artışını izleyin.
    4. Karıştırma hızını kontrol ederek pürüzsüz bir sıvı girdap tutun ve çözeltiyi tüm bileşikler tamamen çözünene kadar karıştırın. Çözelti tamamen sıvı ve berrak olmalıdır. Bu 1 saate kadar sürebilir.
    5. Oda sıcaklığında, ışıktan korunarak sakla.
      NOT: Temizleme çözeltisi, optik temizlemeden en az 24 saat önce hazırlanmalıdır; böylece çözelti gazdan dolup çıkabilir ve içinde olabilecek kabarcıkları ortadan kaldırabilir. Baloncukların oluşmasını önlemek için, çözeltiyi bir daha asla sarstırmayın. Asla soğuk depoda saklama.
  2. %2 LMPA çözelti hazırlığı
    1. 0.5 g LMPA hassas bir denge ile tartın ve 100 mL'lik Erlenmeyer şişesine yerleştirin.
      DIKKAT: Daha küçük hacimli Erlenmeyer almayın, taşması durumunda yanık riski vardır.
    2. Oda sıcaklığında 25 mL 1x PBS içinde çözün.
    3. Erlenmeyer termosunu nazikçe karıştırarak tozu 1x PBS'ye iyice dahil edin.
      DIKKAT: Bir sonraki adımda, koruyucu ekipman kullanmak şarttır: gözler ve yüz için eldiven ve maske, sıçramalara ve yanıklara karşı koruma sağlamak.
    4. Erlenmeyer termosunu mikrodalgada ısıtın.
    5. Çözeltinin kaynamaya başladığını (sıvıda kabarcıkların bulunması) gözlemleyin ve kaynamadan hemen önce çıkarın.
    6. Erlenmeyer'i nazikçe karıştırarak pudra karıştırın.
      DIKKAT: Çok sert karıştırmayın, çünkü sıvı taşabilir/kaynayabilir ve sıçratabilir.
    7. Erlenmeyer'i mikrodalgaya geri döndürün, LMPA tamamen çözülene kadar tekrarlayın.
    8. Erlenmeyer'i çıkarın ve LMPA katılaşmadan önce hızlıca 1 mL %2 LMPA çözeltisini 1,5 mL tüplere aliquot yapın. Oda sıcaklığında sakla.
      NOT: Bu süreç zaman alıcıdır. Çözeltiyi önceden hazırlayın ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.

4. Montaj ve optik temizleme

  1. Plaka santrifüjünü 40 °C'ye kadar önceden ısıtın, örnek plakasını hazırlamak için uzun bir döngü çalıştırın.
    NOT: LMPA jelleri 30 °C'de olur. Santrifüjü 40 °C'nin altına çalıştırmayın. Santrifüj izin verirse, sıcaklığı 50 °C'ye çıkarın.
  2. %2 LMPA'lı aliquotları 70 °C'de su banyosu veya tüplü ısıtıcıda 5 ila 10 dakika sıvılaştırın.
  3. %2 LMPA'nın sıcaklığını 55 °C'de düşürün ve korun.
  4. Görüntüleme plakasını plaka ısıtıcısına nazikçe yerleştirin, önceden 50 °C'ye ısıtılmış.
    NOT: Kuyular için taban olarak kullanılan kırılgan polimeri kırmamaya veya çizmemeye dikkat edin.
  5. %2 LMPA eklemeden önce plakanın sıcak olmasına dikkat edin. Bu aşamada uyum sağlamamalı.
  6. Her kuyuya 200 μL %2 LMPA pipet koyun. Desteğin tüm altını kaplayarak ilk sıvı baz elde edin; böylece kürelerin daha akışkan dağılımı sağlanır.
  7. Tüplerden yıkama tamponunu atın, küreleri %2 LMPA olan 300 μL ile tekrar askıya alın ve doğrudan kuyruklarına pipetleyin. Baloncuklardan kaçınmak için her zaman nazik bir süspansiyon yapın.
  8. Floroforları korumak için plakayı alüminyum folyo ile kaplayın.
  9. Alüminyum folyo olmadan plakayı hızlıca tartın ve plaka ısıtıcıya geri getirin.
  10. 24 kuyu için bir plaka hazırlayın, denge için su ekleyin.
  11. İkincil antikorlara bağlı floroforları korumak için alüminyum folyo plakayı plaka ısıtıcısından hızla çıkarın. Elinizde tutun, soğuk bir yüzeye koymayın.
  12. Alüminyum folyoyu çıkarın ve plaka santrifüjüne yerleştirin.
  13. 1000 x g sıcaklıkta, 40 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Rotorun sıcaklığını kontrol edin, oda sıcaklığında olmalı.
  14. Santrifüj sırasında bir buz tepsisi hazırlayın: buzu düzleştirin ki plaka düz bir yüzeye konabilsin.
  15. Tabağı çıkarın ve buzun üzerine koyun, tepsi veya tabağı alüminyum folyo ile kaplayın. Tabağı 10 dakika buzda bırakın.
  16. Plakayı buzdan çıkarın ve alüminyumda bırakın, oda sıcaklığında 20 dakika stabil hale getirin.
  17. Her kuyu başına 1 ila 1,5 ml temizleme çözeltisi pipetleyin, alüminyum folyo ile örtün ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında en az 48 saat optik olarak berrak bırakın.
    NOT: Plakayı asla 4 °C'de saklamayın. LMPA kasılabilir, kuyunun dibinden ayrılabilir ve temizleme çözeltisinde yüzebilir. Temizlendikten sonra bir hafta içinde görüntü.

5. Görüntüleme

  1. Konfokal dönen disk mikroskobu kullanın, en azından 30x nesnesini seçin.
  2. Temizleme çözümlerini koruyun, çünkü bunlar kırılma indekslerini homojenleştirir ve 3D görüntülemeyi kolaylaştırır.
  3. Diğer floroforların ağartılmasını önlemek için DAPI kanalını seçerek sferoidleri bulun.
  4. Z-stack fonksiyonunu kullanarak görüntü alın. Kürelerin üst ve alt kısımlarını seçin ve optik dilimleri 10 μm aralıklarla ayırın.
    NOT: Görüntü alımı ve görüntü analizi, CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra'nın Görüntüleme Platformunda gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etiketleme ve optik temizlemenin etkinliğini değerlendirmek için, birkaç model aynı protokole tabi tutuldu ve sonrasında sabitlendi (Şekil 1). 1 IEC'ye 20 β-hücre ve 1 IEC'ye 50 β-hücre oranına sahip sferoidler yukarıda anlatılan yöntemle kültürlendi. Dikkat çekici bir şekilde, 1 IEC'ye 20 β hücre oranı, insan pankreas adacığına yaklaşık olarak benziyor. Tripan mavisiyle bozulmuş sferoidleri boyamak, onların 96 saat boyunca canlı hücreleri (%80-90 canlı hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS-1 fare IEC ve mare β hücrelerini β-TC6 içeren bir sferoid model geliştirilmiştir; bu model pankreas adacıklarının üç boyutlu yapısını taklit etmektedir. Bu model, 72 saat boyunca stres kaynaklı IEC disfonksiyonunun analizi ve bunun β hücre canlılığı ve fonksiyonu üzerindeki etkisi için uygundur; ayrıca adacığı nakli araştırmalarıyla ilgilidir. Önemli olarak, fare hücrelerinden oluşan sferoid doğası gereği homojendi ve ilgili bir adacik içi endotel hattına sahipti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını belirtiyor

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, PICSTRA görüntüleme platformundan Pascal Kessler'e, spinning disk mikroskopisi ve Z yığınından ham etiketleme verilerinin çıkarılması konusunda uzman yardımı için minnettardır. Yazarlar, Avrupa Diyabet Araştırma Merkezi'nden (CEED, Strasbourg, Fransa) Dr. W. Bietiger, Dr. A. Langlois ve Dr. K. Bouzakri'nin arındırılmış insan adacığını takdir etmek isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
µ-plaka 24 kuyu Siyah ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 (24 kuyuyu)KökHücre34815
Anti-Yapışma Durulama Çözeltisi KökHücre7010
Anti-CD31 antikor [P2B1]abcamAB24590Son konsantrasyon 2.2&mikro; g/mL
Anti-Integrin & Beta; 1 Antikor, klon MB1.2MerckMAB1997 Son konsantrasyon 1.43 ve mikro; g/mL
Hücre kültürü şişesi, T-75, yüzey, yüzey : Hücre+, filtre kapağıSarstedt83.3911.302β-TC6 kültürü
Hücre kültürü şişesi, T-75, yüzey: Standart, 2 pozisyonlu vida kapakSarstedt83.3911.02MS-1 kültürü
DAPI dihidroklorürTermobalıkçı,D1306Son yoğunlaştırma 2&mikro; g/mL
Dimetil Sülfoksit SigmaD8418-250ML
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX™ Takviye, piruvatThermofischer scientific31966047
Dulaglutide
DulaglutideLillyTrulicity 1,5 mg kalem
Fetal Sığır SerumuBiowestS1810-500
GlisinSigmaG7126-1KG
Keçi anti-koy domuzu IgG (H+L) Yüksek çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21435Son yoğunlaştırma 2&mikro; g/mL
Keçi Fare Karşıtı IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 488Thermofischer  A-11029Son yoğunlaştırma 2&mikro; g/mL
Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 633ThermofischerA-21071Son yoğunlaştırma 2&mikro; g/mL
Keçi Anti-Fare IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21434Son yoğunlaştırma 2&mikro; g/mL
Keçi serumuSigmaS26-100ML
KALSIYUM ve Hap Kullanımı magnezyum  & Fenol kırmızıCorning21-022-CV
İnsülin (C27C9) Tavşan mAbHücre sinyalizasyonu3014SSon konsantrasyon 0.66 ve mikro; g/mL
İzole insan pankreas adacığı Centre Europé en d'Étude du Diabete (CeeD)Dr. Karim Bouzakri'den nazik bir hediye. Klinik derece, yönergelere göre izole edilmiştir.
Düşük jelleşme sıcaklığı AgaroseMerckA9414-10G
MS-1 hücreleriATCCCRL-2279
Paraformaldehit Çözeltisi, PBS 1x'te %4Fischer bilimsel15670799
PBS 10xEuromedexET330-ALaboratuvar kalitesinde ultrasaf suda 1 kez seyreltildi
Penisillin-StreptomisinPAN BiotechP06-07100
Poliklonal kobay, fare karşıtı NTPDaz3 antikorları mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpSulandırma 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroksipropil) etilenediamin Sigma122262-1L
Dönen disk Olympus IXplore SPIN Olympus Bilimsel Çözümleri
Moleküler biyoloji için sukrozSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Biyokalite Laboratuvar SınıfıEuromedex2000-A
Tripsin/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
Tween-20Euromedex//
UreaSigmaU-5128
β-TC6 hücreleriATCCCRL-11506

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adac k Sferoid ModeliEndotelyal H cre Etkile imiBeta H cre Etkile imi3B G r nt lemePankreatik Adac klarSitoprotektif TaramaSferoid K lt rCUBIC effafla t rmans lin Salg layan H crelerD k Erime Noktal Agaroz

İlgili makaleler