Yöntem makalesi

Mycobacterium Türlerinin DNA Mikroarray Çip Yöntemi ile Tanımlanması

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 Haziran 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Mycobacterium türlerini tanımlamak için, klinik kullanım için ilgili hastalıkların tanısal doğruluğunu ve verimliliğini artıracak bir DNA mikroarray çip yöntemi sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Mycobacterium türlerinin doğru tanımlanması için tasarlanmış bir DNA mikroarray çip yöntemi sunmaktadır. Asimetrik PCR amplifikasyonu ve hibridizasyon ilkelerinden yararlanan bu yöntem, Mycobacterium tuberculosis kompleksindekiler ve çeşitli tüberküloz olmayan mikobakteriler dahil olmak üzere 17 yaygın mikobakteriyi hedefler. Mikobakteriyel hastalıklardan şüphelenilen hastalardan balgam, irin, bronkoalveoler lavaj sıvısı, beyin omurilik sıvısı ve ponksiyon sıvısı gibi çok çeşitli klinik örneklere uygulanabilir. Test, Mycobacterium genomundaki hedef dizilerin asimetrik PCR yoluyla amplifiye edilmesini ve ardından mikrodizi çipi üzerindeki problarla hibridizasyonun yapılmasını içerir. Benzersiz prob düzenlemesi (12 satır x 10 sütunlu bir mikrodizide 5x tekrarlanır) ve kontrol problarının kullanımı güvenilirliğini artırır. 1.724 örnekle yapılan klinik deneyler yüksek performans gösterdi. Yöntem, tespit kapsamının ötesinde iki nadir tüberküloz olmayan mikobakteriyel örnek dışında, sıralama sonuçlarına kıyasla %100 klinik özgüllük, duyarlılık ve genel uyum elde etti. Bu DNA mikroarray çip yöntemi, geleneksel tanı tekniklerine göre önemli bir gelişme sunarak tanı süresini kısaltır ve daha kapsamlı bir tespit sağlar, böylece mikobakteriyel hastalıkların tanı ve tedavisinde büyük bir potansiyele sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir bakteri cinsi olan mikobakteri, insan ve hayvan sağlığı için önemli etkileri olan çeşitli organizma gruplarını kapsar. Tüberkülozun (TB) etkeni olan Mycobacterium tuberculosis, uzun süredir devam eden küresel bir sağlık belası olmuştur. Önleme ve tedavi konusunda onlarca yıldır devam eden çabalara rağmen, tüberküloz, dünya çapında şaşırtıcı sayıda yıllık ölüm ve yeni enfeksiyonlardan sorumlu olan önemli bir halk sağlığı tehdidi olmaya devam etmektedir 1,2. Tüberküloz dışı mikobakteriler (NTM) de özellikle belirli hasta popülasyonlarında ve çevresel ortamlarda giderek daha önemli patojenler olarak kabul edilmektedir.

Mycobacterium türlerinin doğru tanımlanması, etkili hastalık yönetiminin temel taşıdır 3,4. Geleneksel tanı yöntemlerinin doğal sınırlamaları vardır. Tarihsel olarak güvenilen kültüre dayalı teknikler, herkesin bildiği gibi zaman alıcıdır. Mikobakterileri izole etme ve kültürleme süreci haftalar ila aylar sürebilir, bu süre zarfında hastalar hastalığın ilerlemesi ve başkalarına potansiyel bulaşma yaşayabilir. Ayrıca, bazı mikobakteri türlerinin kültürlenmesi son derece zordur, bu da yanlış negatif sonuçlara ve gecikmiş veya yanlış tedaviye yol açar 5,6.

Yaygın olarak kullanılan başka bir yöntem olan aside hızlı boyama, mikobakterileri renk bozulmasına direnen benzersiz hücre duvarı özelliklerine göre tanımlayabilir. Bununla birlikte, farklı Mycobacterium türleri arasında ayrım yapmak için özgüllükten yoksundur ve mikobakteri varlığının yalnızca geniş bir göstergesini sağlar7. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler yöntemler, bu dezavantajların bazılarının üstesinden gelmek için alternatifler olarak ortaya çıkmıştır. PCR, mikobakteriyel DNA'yı kültür yöntemlerinden daha hızlı tespit ederek daha hızlı tanı sağlar. Bununla birlikte, geleneksel PCR testleri tipik olarak sınırlı sayıda geni hedef alır ve özellikle yakından ilişkili Mycobacterium türleri5 ile uğraşırken kapsamlı tür tanımlaması sunmayabilir.

DNA mikroarray teknolojisi, mikrobiyoloji ve teşhis alanlarında devrim yaratmıştır. Mikrobiyal popülasyonun daha kapsamlı ve ayrıntılı bir görünümünü sağlayarak birden fazla genetik hedefi aynı anda analiz etme yeteneği sunar 8,9. Bu alandaki son araştırmalar, Mycobacterium tanımlaması için ileri moleküler tekniklerin potansiyelini ve önemini daha da aydınlatmıştır. Örneğin, Wang ve ark.10 tarafından yapılan bir çalışma, klinik bir ortamda nadir Mycobacterium türlerini tespit etmede modifiye edilmiş bir DNA mikrodizi çipinin gelişmiş duyarlılığını ve özgüllüğünü göstermiştir. Bulguları, mikroarray teknolojisinin sürekli optimizasyonunun değerini vurguladı. Wang ve meslektaşları11tarafından yapılan bir başka çalışma, DNA mikroarray verilerinin TB hastalarında klinik sonuçlarla entegrasyonuna odaklandı. Sonuçlar, doğru Mycobacterium tür tanımlamasının prognostik değeri ve kişiselleştirilmiş tıp potansiyeli hakkında fikir verdi.

Test prensibi
Bu kit, Mycobacterium türlerinin tanımlanması için asimetrik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu ve hibridizasyon prensipleri ile birleştirilmiş DNA mikrodizi çip teknolojisini kullanır. Kit, bir Mycobacterium tür tanımlama çipi ve asimetrik PCR amplifikasyon reaktifleri içerir. Çip, Mycobacterium türlerinin tespiti ve tanımlanması için türe özgü problarla sabitlenir. Tespit hedefleri, Mycobacterium tuberculosis kompleksi, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae ve Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum gibi klinik olarak yaygın 17 tür veya grubu içerir. Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai ve Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi ve Mycobacterium smegmatis.

Bu 17 Mycobacterium türünün tespiti, doğru klinik tanı ve özel hasta yönetimi için kritik öneme sahiptir. Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC), tüberkülozdaki rolü nedeniyle önceliklidir ve bulaşmayı engellemek ve ilaç direncini ele almak için acil izolasyon ve çoklu ilaç tedavisi gerektirir. Mycobacterium avium-intracellulare kompleksi (MAC) içindeki türler, örneğin M. avium ve M. intracellulare, ağırlıklı olarak bağışıklığı baskılanmış bireyleri (örneğin, HIV / AIDS) veya kronik akciğer hastalığı olanları etkiler ve uzun süreli makrolid bazlı rejimler gerektirir. M. abscessus ve M. fortuitum gibi hızla büyüyen mikobakteriler (RGM'ler) antibiyotik direnci ile ünlüdür ve sıklıkla ciddi cilt, yumuşak doku veya akciğer enfeksiyonlarına neden olur, agresif cerrahi ve hedefe yönelik antibiyotik kombinasyonları gerektirir (ör., amikasin, makrolidler). M. gordonae veya M. smegmatis gibi çevresel türler sık görülen kirleticilerdir, ancak gereksiz tedaviden kaçınmak için dikkatli klinik korelasyon gerektiren belirli bağlamlarda fırsatçı enfeksiyonlara neden olabilir. M. marinum (sucul maruziyet ile ilişkili) ve M. ulcerans (Buruli ülserine neden olan) gibi patojenler, maruziyet geçmişi değerlendirmelerine rehberlik eden farklı epidemiyolojik nişlere sahiptir. Nadir fakat klinik olarak anlamlı türler (örneğin, M. szulgai, M. malmoense) tüberkülozu taklit eder ve türe özgü rejimler gerektirir. Tedavi süresi, ilaç seçimi (örneğin, M. kansasia'da rifampin duyarlılığı ve NTM'lerde intrinsik direnç) ve prognoz büyük ölçüde değiştiğinden, doğru tanımlama çok önemlidir. Moleküler tanı ve antimikrobiyal duyarlılık testi, özellikle bağışıklığı baskılanmış popülasyonlarda veya karmaşık enfeksiyonlarda sonuçları optimize etmek için gereklidir.

İlk olarak, Mycobacterium genomundaki hedef diziler asimetrik PCR ile amplifiye edilir. Daha sonra, amplifiye edilmiş ürünler çip üzerindeki problar ile hibritleştirilir. Numunede hedef Mycobacterium mevcutsa, amplifiye edilmiş ürünler çip üzerindeki ilgili problara özel olarak bağlanacaktır. Son olarak, çip üzerindeki hibridizasyon sinyalleri taranarak, numunedeki Mycobacterium türü belirlenebilir.

Gen çipi mikro dizileme teknolojisi kullanılarak, yukarıda belirtilen genleri tespit etmek için özel problar ve çeşitli kontrol probları substrat üzerine sabitlenir. Her algılama probu ve kontrol probu, 12 satır x 10 sütunlu bir mikro dizi oluşturacak şekilde 5x tekrarlanır. Prob düzenlemesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Her çip dört özdeş mikrodizi içerir ve her mikrodizi bir örneği algılayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Fujian Tıp Üniversitesi'ne Bağlı Quanzhou First Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 2024-K035). Klinik örneklerin toplanmasından önce tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Hastalar, çalışmanın amacı, ilgili prosedürler ve tıbbi bakımlarını etkilemeden herhangi bir zamanda geri çekilme hakları hakkında bilgilendirildi.

1. Örnek gereksinimleri

NOT: Bu kit ile test etmek için klinik olarak şüpheli tüberküloz ve tüberküloz dışı mikobakteri (NTM) hastalıkları olan hastalardan numune toplarken şu adımları izleyin:

  1. Hastalardan balgam, irin veya sekresyonlar, bronkoalveoler lavaj sıvısı, delme sıvısı (beyin omurilik sıvısı, plevral ve periton sıvısı, perikardiyal sıvı, eklem sıvısı ve safra dahil) ve idrar gibi örnekler toplayın.
    1. Balgam örnekleri için:
      1. Hastaya sabahları ağzını temiz suyla çalkalamasını ve ardından derin balgamı steril bir numune saklama kabına öksürmesini, kapatmasını ve test için göndermesini söyleyin.
      2. %4 NaOH hacminin 1-2 katı ekleyin, çalkalayın ve eşit şekilde karıştırın.
      3. 15-20 dakika sonra, eşit hacimde pH 6.8 fosfat tamponu ekleyin ve eşit şekilde karıştırın.
      4. Oda sıcaklığında, 2.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bir pipet ile 1 mL% 0.9 NaCl ekleyin ve iyice karıştırın; Algılama için kullanın.
    2. İrin veya salgı örnekleri için:
      1. Yüzeyi steril normal tuzlu su ile durulayın. İrin veya sekresyon steril bir çubukla toplayın, kapatın ve test için gönderin.
      2. %4 NaOH'nin 3 katı ekleyin ve iyice karıştırmak için iyice çalkalayın.
      3. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin (bu süre zarfında manuel olarak 2 kez sallayın), oda sıcaklığında 2.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Bir pipet ile 1 mL %0.9 NaCl ekleyin ve eşit şekilde karıştırın; Algılama için kullanın.
    3. Bronkoalveoler lavaj sıvısı için:
      1. Korumalı bir bronkoalveoler lavaj (PBAL) tüpünden 10-20 mL normal salin enjekte edin.
      2. Numuneyi negatif basınçlı emme ile steril bir şişede toplayın ve test için gönderin.
    4. Beyin omurilik sıvısı için:
      1. Aseptik teknik kullanarak en az 2 mL numune toplayın.
      2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir pipet ile 1 mL %0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve test için kullanın.
    5. İdrar örnekleri için:
      NOT: Sabahları ilk tam idrar miktarını veya gece ortası ve gece geç saatlerde idrarı kullanmanız önerilir. İdrar kateterizasyon ile de toplanabilir.
      1. Numuneyi steril bir kapta toplayın ve toplanan idrar örneğini 4-5 saat bekletin.
      2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir pipet ile 1 mL %0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve test için kullanın.
  2. Numune depolama
    NOT: Katı ortamdaki numuneler donmuş olarak saklanmamalıdır, çünkü dondurma sonraki işlemleri etkileyebilir.
    1. Sıvı ortamda bulunan numuneleri -70 °C'de en fazla 5 yıl saklayın.
    2. Tüm numuneleri 2-8 °C'de en fazla 2 ay saklayın.
  3. Numune taşımacılığı
    1. Test izolat numunelerini taşırken, yönetmeliklerin izin verdiği koşullar altında biyogüvenlik gereksinimlerini karşılayan kapalı bir kap kullandığınızdan emin olun.

2. Deney hazırlığı

  1. Talaş yıkama solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: Talaş Yıkama Çözeltisi I ve Talaş Yıkama Çözeltisi II'yi talaş sayısına göre hazırlayın. Hacim, talaşların yıkama sırasında tamamen suya batırılabileceği şekilde olmalıdır. Bunları eşit şekilde karıştırın ve oda sıcaklığına (10-30 °C) dengeleyin. SSC'nin nihai konsantrasyonu 2x'tir ve SDS'nin son konsantrasyonu% 0.2'dir.
    1. Talaş Yıkama Çözeltisi I'i hazırlamak için, Talaş Yıkama Çözeltisi I'i hazırlamak için 20x SSC, damıtılmış su (veya arıtılmış su) ve %10 SDS'yi sırayla 10:88:2 oranında karıştırın. Örneğin, toplam 600 mL'lik bir hacim hazırlarken, önce 60 mL 20x SSC ve 528 mL damıtılmış su (veya arıtılmış su) ölçün ve bunları 1 L'lik bir behere koyun ve bir karıştırma çubuğu ile eşit şekilde karıştırın. Daha sonra 12 mL %10 SDS ekleyin ve tekrar eşit şekilde karıştırın.
    2. Talaş Yıkama Çözeltisi II'yi hazırlamak için: SSC'nin nihai konsantrasyonu 0,2x'tir. Talaş Yıkama Çözeltisi II'yi elde etmek için 20x SSC ve damıtılmış suyu (veya arıtılmış suyu) 1:99 oranında karıştırın. Örnek olarak toplam 600 mL'lik bir hacmin hazırlanmasını alarak, 6 mL 20x SSC ve 594 mL damıtılmış su (veya arıtılmış su) ölçün ve bunları 1 L'lik bir behere koyun ve eşit şekilde karıştırın.
      NOT: %10'luk SDS çözeltisinde beyaz topaklaştırıcı çökeltileri gelişirse, 50 °C'de ısıtın, iyice karıştırın ve ardından mikrodizi yıkama tamponunu hazırlayın. Yıkama Tamponu I'de beyaz topaklaştırıcı çökeltiler oluşursa, 50°C'de ısıtın, iyice karıştırın, kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeleyin.
  2. 350 mL buzlu su karışımı hazırlayın.
  3. Damıtılmış suyu (veya arıtılmış suyu) hazırlayın.

3. Alet ve malzemelerin hazırlanması

  1. Enstrüman seçimi ve kurulumu
    1. Mikrodizi çip tarayıcıyı tanımlayın ve hazırlayın, kalibre edildiğinden ve kullanıma hazır olduğundan emin olun.
    2. Nükleik asit ekstraksiyon cihazını kurun, işlevlerini kontrol edin ve gerekli reaktifleri yükleyin.
    3. Hibridizasyon kutusu gen mikrodizi çip hibridizasyon kutusunu uygun yere yerleştirin ve uygun çalışma koşulunu onaylayın.
  2. Pipetleme aletlerinin hazırlanması
    1. 0,1-10 μL, 2-20 μL ve 20-200 μL özelliklerine sahip mikropipetleri, karşılık gelen temiz ve steril pipet uçlarıyla birlikte toplayın. Mikropipetlerin doğru şekilde kalibre edildiğinden ve uçların doğru şekilde takıldığından emin olun.
  3. Yardımcı ekipman düzenlemesi
    1. Sabit sıcaklıkta bir su banyosu hazırlayın ve gerekli sıcaklığa (50 °C) ayarlayın.
    2. 1,5 mL santrifüj tüplerini santrifüjleyebilen mikrosantrifüjü konumlandırın ve denge ve hız ayarlarını kontrol edin.
    3. Santrifüj tüpü raflarında temiz ve steril santrifüj tüpleri (200 μL ve 1,5 mL) ve isteğe bağlı temiz ve steril sekiz kuyulu şeritler (200 μL) düzenleyin.
  4. Numune işleme ekipmanının hazır olması
    1. Sabit sıcaklıklı bir çalkalayıcıyı uygun bir yere yerleştirin ve uygun çalkalama parametrelerini ayarlayın.
    2. Talaşları yıkamak için iki kap ayırın ve temiz ve kuru olduklarından emin olun.
    3. Sürgülü raflar ve bir santrifüj düzenleyin ve elinizde talaşları santrifüjlemek ve kurutmak için bir kap bulundurun.
  5. PCR amplifikatör hazırlığı
    1. PCR amplifikatörünü açın ve amplifikasyon reaksiyonlarını gerçekleştirmeye hazır olduğundan emin olarak deneysel protokole göre programlayın.

4. Nükleik asit ekstraksiyonu

NOT: İşlemi numune hazırlama alanında gerçekleştirin ve şu adımları izleyin:

  1. Hazırlık
    1. Nükleik asit ekstraksiyon tüpüne 80 μL nükleik asit ekstraksiyon solüsyonu ekleyin ve 1 mL %0.9 NaCl ekleyin.
  2. İzolat örneklerinin toplanması
    1. Numune toplamaya başlamak için, ister katı ortamdan ister sıvı ortamdan olsun, numunelerin kaynağını inceleyin.
    2. Katı ortam örneklerini toplamak için, uygun katı ortamdan görünür bir koloni seçmek için steril bir aşılama halkası kullanın. Bakteriler tüm ortamı kaplayacak şekilde büyüdüyse, karşılık gelen miktarda bakteri çimi seçin. Katı ortamı mümkün olduğunca toplamaktan kaçınmaya dikkat ederek, nükleik asit ekstraksiyon solüsyonunu içeren nükleik asit ekstraksiyon tüpüne dikkatlice yerleştirin.
    3. Sıvı ortam numuneleri için, 1 McFarland standardına eşit veya daha büyük bir bulanıklığa sahip 10-20 μL bakteri süspansiyonunu aspire edin. Nükleik asit ekstraksiyon solüsyonunu içeren nükleik asit ekstraksiyon tüpüne enjekte edin.
      NOT: Katı veya sıvı ortamdan numune alındıktan sonra, numuneler sonraki nükleik asit ekstraksiyon işlemi için hazırdır.
  3. Nükleik asit ekstraksiyonu
    1. Yukarıda belirtilen Adım 1.1'den ön işleme tabi tutulmuş numuneleri ekledikten veya numuneleri izole ettikten sonra, nükleik asitleri çıkarmak için nükleik asit hızlı ekstraksiyon aletini kullanın. Ekstrakte edilen nükleik asitleri geçici depolama için -20 °C'ye yerleştirin.
      NOT: Ekstraksiyon verimliliğinin bir göstergesi olarak, otomatik çıkarıcı, viral nükleik asit yükü 100 kopya / mL'den daha büyük olan numuneleri çıkarabilir. Geçici saklama süresi 2 ayı geçmemelidir.

5. PCR amplifikasyonu

  1. PCR reaksiyon sisteminin hazırlanması
    1. Reaktif depolama ve hazırlama alanında, test edilecek numune sayısına göre 200 μL'lik santrifüj tüpleri veya sekiz oyuklu şeritler hazırlayın ve numune numaralarını önceden işaretleyin. PCR amplifikasyon reaktiflerini kitten çıkarın, doğal olarak çözülmelerine ve erimelerine izin verin, hafifçe sallayın ve eşit şekilde karıştırın ve ardından reaktiflerin tüplerin dibinde toplanmasını sağlamak için hızlı bir şekilde santrifüjleyin.
    2. Numune sayısına göre, PCR amplifikasyon reaktiflerini tüp başına 18 μL'lik bir hacimde 200 μL'lik santrifüj tüplerine veya sekiz oyuklu şeritlere ayırın. Tüp kapaklarını sıkıca kapatın ve ardından bunları amplifikasyon reaksiyonu karışımı hazırlama ve amplifikasyon alanına aktarın.
    3. Numune hazırlama alanına 2 μL şablon DNA (test edilecek numunenin DNA'sı (yani, nükleik asit ekstraksiyon tüpündeki süpernatant), pozitif kontrol ürünleri veya negatif kontrol ürünleri) ekleyin. Her bir PCR reaksiyon sisteminin toplam hacminin 20 μL'ye ulaştığından emin olun.
      NOT: Amplifikasyon sırasında her seferinde pozitif kontrol ürünleri ve negatif kontrol ürünleri kullanın. Pozitif kontrol ürünü, PCR amplifikasyon ve hibridizasyon işlemlerinde kalite kontrol için kullanılabilir ve negatif kontrol ürünü, çevreyi ve çalışma sürecini izlemek için kullanılabilir.
  2. Amplifikasyon
    1. Reaktifleri içeren santrifüj tüplerini veya sekiz oyuklu şeritleri PCR amplifikasyon cihazına yerleştirin. Cihazın gerekli sıcaklığa önceden ısıtıldığından emin olun. PCR amplifikasyon reaksiyonunu aşağıdaki termal döngü programına göre gerçekleştirin: 600 s (1 döngü) boyunca 94 ° C'de ilk denatürasyon; 30 saniye boyunca 94 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 60 ° C'de tavlama ve 40 saniye boyunca 72 ° C'de uzatma; 72°C'de 420 s (1 döngü) için son bir uzatma; süresiz olarak 4 °C'de tutun (1 döngü).

6. Çip hibridizasyonu,

NOT: PCR amplifikasyon reaksiyonu sona ermeden önce aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin:

  1. Sabit sıcaklıktaki su banyosunun sıcaklığını 50 °C'ye ayarlayın ve önceden ısıtın.
  2. Cipslerin hazırlanması
    1. Gen mikrodizi çip hibridizasyon kutusunun dibine 200 μL damıtılmış su (veya Şekil 2A'da gösterildiği gibi arıtılmış su) ekleyin. Braketi kutunun içindeki iki konumlandırma sütunu arasına yerleştirin.
    2. Çipi ön tarafı yukarı bakacak şekilde braketin üzerine dikkatlice yerleştirin ve çipi, dört gövdesi aşağı bakacak şekilde kapak kızağı ile kapatın ( Şekil 2B'de gösterildiği gibi).
      NOT: Kapak kaymasının, ucu çipin ucundaki etiketle aynı hizaya gelecek şekilde doğru yerleştirme yönünde olduğundan emin olun.
  3. Hibridizasyon reaksiyon karışımının hazırlanması, denatürasyonu ve soğutulması
    1. Numune sayısına göre 200 μL'lik santrifüj tüpleri veya sekiz oyuklu şeritler hazırlayın ve bunları uygun şekilde etiketleyin.
    2. Hibridizasyon tamponunu kitten çıkarın ve tamamen eriyene kadar 50 °C'de ısıtın. İyice karıştırdıktan sonra, bir mikrosantrifüjde hızlı bir şekilde santrifüjleyin. Hazırlanan her 200 μL santrifüj tüpüne veya sekiz oyuklu şeride 9 μL hibridizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, her tüpe karşılık gelen PCR ürününden 6 μL ekleyin, bu da hibridizasyon reaksiyonu karışımı başına toplam 15 μL'lik bir hacim elde edilmesini sağlar.
    3. Hibridizasyon reaksiyonu karışımını (hibridizasyon tamponu ve PCR ürünü dahil) 95 °C'ye ısıtın (bir PCR cihazında veya bir su banyosunda) ve 5 dakika boyunca denatüre edin. Önceki adımda denatürasyon işlemine tabi tutulan hibridizasyon reaksiyonu karışımını çıkarın ve hemen 3 dakika boyunca bir buzlu su karışımına daldırın.
  4. Hibridizasyon reaksiyonu
    1. Hibridizasyon reaksiyonu karışımını buz banyosundan çıkarın, eşit şekilde karıştırmak için bir mikropipet ile 2 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Beyaz topaklaştırıcı çökelti (varsa) kaybolduktan sonra, kapak kızağının yükleme deliğinden ( Şekil 2C'de gösterildiği gibi) 13.5 μL hibridizasyon reaksiyonu karışımı ekleyin, hibridizasyon kutusunu hızlı bir şekilde kapatın ve kapatın ( Şekil 2D'de gösterildiği gibi). Çip numarasını, mikrodizinin konumunu ve karşılık gelen numune numarasını kaydedin.
      NOT: Her mikrodiziye yalnızca bir örnek eklenebilir.
    2. Sızdırmaz hibridizasyon kutularını hemen yatay olarak 50 °C'ye önceden ısıtılmış sabit sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirin. Tüm hibridizasyon kutuları yerleştirildikten sonra zamanlayıcıyı 120 dakika boyunca başlatın.
      NOT: Yükleme işlemi sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Yüklemenin başlangıcından talaşların kurumasına kadar olan tüm adımlarda, talaş mikrodizileri üzerindeki sıvının uzun süre doğrudan havaya maruz kalmasını önleyin, böylece talaş arka planının kuruma nedeniyle çok yükselmesi ve sonucun yorumlanmasına müdahale edilmesi engellenir.
  5. Cipslerin yıkanması ve kurutulması
    1. Hibridizasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, hibridizasyon kutularını yatay olarak çıkarın, sökün ve talaşları yıkamak için çıkarın. Cipsleri hemen oda sıcaklığına (10-30 °C) dengelenmiş, Talaş Yıkama Solüsyonu I ile doldurulmuş kabın (beher gibi) içindeki sürgülü rafa yerleştirin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda 80-100 rpm hızında yıkayın.
    2. Talaşları, oda sıcaklığına dengelenmiş Talaş Yıkama Solüsyonu II ile 80-100 rpm hızında sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 3 dakika yıkayın.
    3. Cipsleri bir santrifüje koyun ve oda sıcaklığında 100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Kuruduktan sonra tarayın.
      NOT: Talaşların çarpışmasına veya birbirine sürtünmesine izin vermeyin.

7. Çip tarama ve sonuç yorumlama

NOT: Sinyalleri okumak ve sonuçları yorumlamak için mikrodizi çip tarayıcıyı ve ilgili yazılımı kullanın. Ayrıca anormal sonuçlar ve sorun giderme için Tablo 1'e bakın. Çalıştırmak için şu adımları izleyin (tarayıcının ve yazılımın kullanım kılavuzlarına bakın).

  1. Tarayıcıyı ve ilgili yazılımı açın ve ardından 10 dakika önceden ısıtmak için Lazer Kontrol düğmesine tıklayın.
  2. Numune Numarası gibi numunelerle ilgili çeşitli bilgi türlerini girin.
  3. Tarayıcı ön ısıtmayı bitirdikten sonra, Çıkar düğmesine tıklayın ve çipi küçük braket parçasına sabit bir şekilde yerleştirin. Çipi yavaşça ve yatay olarak tarayıcı bölmesinin açıklığına itin ve Yükle düğmesine tıklayın.
  4. Çip numarasını girin, algılama alanını (mikrodizi 1-4) seçmek için tıklayın ve ardından her bir mikrodizi için karşılık gelen örnekleri seçmek için Örnek Seç'e tıklayın. Ardından, tıklayın Algılamayı Başlat çip taraması yapmak için düğmesine basın. Tarama sonuçları ekranda görüntülenecek ve otomatik olarak kaydedilecektir.
  5. Bir çipi taradıktan sonra, sonraki çipi taramak için 7.3 ve 7.4 adımlarını tekrarlayın. Tüm çipler taranana kadar bu prosedürü izleyin.
  6. Veri sorgulama ve yazdırma işlemlerini gerçekleştirmek için Veri Sorgusu sayfasını kullanın.
  7. Tüm işlemleri tamamladıktan sonra önce lazeri kapatın, ardından yazılımdan çıkın ve son olarak tarayıcıyı kapatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olumlu sonuçlar
Mycobacterium cinsi (iç kontrol, IC) ve Mycobacterium tuberculosis probları için pozitif sonuç değerleri Alıcı İşletim Karakteristiği (ROC) yöntemi ile belirlenir. Diğer 16 NTM'yi tespit etmek için kullanılan problar için pozitif sonuç değerleri yüzdelik yöntem ile belirlenir.

Deneysel kalite kontrol
Pozitif kontrol ürününün tespit sonucu "Mycobacteriumtuberculosis kompleksi" olmalıdır ( Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda tanıtılan DNA mikroarray çip yöntemi, tüberküloz ve tüberküloz dışı mikobakteriyoz olduğundan şüphelenilen hastalardan alınan klinik örneklerdeki (balgam, irin, bronkoalveoler lavaj sıvısı, beyin omurilik sıvısı ve delme sıvısı dahil) nükleik asitleri doğrudan tespit edebilir ve doğrulanmış tanı süresini önemli ölçüde kısaltabilir. Bu çalışmada sunulan DNA mikroarray çip yöntemi, Mycobacterium türlerinin tanımlanmasında önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Geleneks...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Fujian İl Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (2024J011521) ve Quanzhou Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2024NY006) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Uygulamalı Biyosistem amplifikasyon aparatıThermo Fisher BilimselVeriti 96 Kuyulu Termal Döngüleyici
CapitalBio Lüks Tarama10K/BBaşkent BiyoLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 Başkent BiyoSlideWasher 24 
  Santrifüj Eppendorf Belediyesi5424R SerisiMaX.speed 15000 dak-1
Hibridizasyon tamponu
HybSet gen mikrodizi çipi ve kapağı
Mycobacterium tür tanımlama kitiBaşkent Biyo301030
Negatif kontroller, pozitif kontroller
Nükleik asit çıkarıcıTIANLONGGeneRotex 96
PCR amplifikasyon reaktifi
pH 6.8 fosfat tamponuŞanghay yuanye BiyoteknolojiR20029-10
Pipetleyiciler ve UçlarTermo Bilimsel0.1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L, ve 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Nükleik asit ekstraksiyon veya saflaştırma kitiTIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSBaşkent Biyo441060
Sodyum hidroksit(NaOH)XILONGS  BilimselXK13-011-00027
SSCBaşkent Biyo441050
Termostatik Su BanyosuSURUIHH-W600 Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Asimetrik PCRHibridizasyon PrensipleriMycobacterium Tuberculosis KompleksiT berk loz D MikobakterilerKlinik rneklerMolek ler TanProb Hibridizasyonu

İlgili makaleler