Yöntem makalesi

Kardiyomiyosit Hizalamasındaki Değişiklikleri Yönlendirmek için Mikro Desenli Manyeto-Reolojik Elastomerler

DOI:

10.3791/68271

⸱

10 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gömülü demir parçacıkları içeren ultra yumuşak bir silikon elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) kullanılarak üretilen dinamik ve geri dönüşümlü bir sertlik test platformu sunuyoruz. Bu yeni tahlil, temas rehberliği de dahil olmak üzere hücre fenotiplerinde ortaya çıkan zamana bağlı fiziksel değişiklikleri incelemek için uygundur. Burada, manyetikler kullanılarak matriks sertleşmesi üzerine yenidoğan sıçan kardiyomiyosit hizalamasını ölçüyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik ve topografik gibi substratla ilişkili ipuçları, hücresel yanıtı derinden etkiler. Bununla birlikte, temel araştırmaların çoğu statik veya izole etkiler kullanır. Ortaya çıkan hücresel tepkiler üzerindeki bu mekanik etkilerin yönü ve zaman ölçeği büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmıştır. Zamanla değişen substratla ilişkili uyaranların fizyolojik ve patolojik süreçleri nasıl yönlendirdiğini inceleyen araçlar, bir sonraki mekanobiyolojik içgörü seviyesinin kilidini açabilir. Burada, harici bir manyetik alana yanıt olarak hızla sertleşebilen ve yumuşayabilen mikro desenli manyetorheolojik elastomerler (MRE'ler) kullanıyoruz, bu da mekanik (sertlik) ve temas kılavuzlu (topografik) stimülasyonun yenidoğan sıçan kardiyomiyosit oryantasyonu ve hizalaması üzerindeki etkilerinin daha titiz bir şekilde araştırılmasına olanak tanır. Zamansal olarak ayarlanabilen ve tersine çevrilebilen mekanik sertliğin dinamik kontrolünü entegre ederek, (1) aynı koşullar altında ön koşullandırma ve (2) miyokard enfarktüsü gibi klinik olarak ilgili fenomenolojiyi taklit etmek için in vitro biyomekaniği akut olarak değiştirerek yükün etkilerini titizlikle test edebiliriz. Bu yaklaşım, yükün hücresel tepkiler üzerindeki etkisini daha gerçekçi ve kontrollü bir şekilde incelememizi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalbin kanı verimli bir şekilde pompalama yeteneği, koordineli kasılma ve genel işlev için hücrelerin ve dokunun hassas organizasyonunun gerekli olduğu miyokardının mimarisine ve mekanik özelliklerine (sertliği) dayanır. Miyokard esas olarak, yetişkinlerde, hücrenin uzunluğu boyunca hizalanmış sarkomerler (CM'lerin kasılma birimi) ile uzun, neredeyse çubuk benzeri bir morfoloji sergileyen kardiyomiyositlerden (CM'ler) oluşur. Buna karşılık, fetal veya indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı CM'ler yetişkin CM'lerden önemli ölçüde farklıdır. Daha yuvarlak bir şekle, tek bir çekirdeğe, düzensiz veya hizalanmamış bir sarkomerik yapıya ve düzensiz bir vuruş frekansına sahip olma eğilimindedirler. Miyokardın in vivo organizasyonunun yapısal benzerliği, kasılma ve kuvvet iletiminin senkronizasyonuna izin verir; Bu, doğal miyokardın in vitro bir model aracılığıyla özetlenmesi için kritik ve esastır. Olgun miyokard'a benzer yapısal özelliklere sahip CM'ler üretmek için, önceki çalışmalar, substrat sertliğini 1,2 manipüle etmek, mekanik gerinim3 uygulamak, temas rehberliğini 4,5 kullanmak veya elektrik pacing 6,7 kullanmak dahil olmak üzere olgunlaşmayı artırmak için başarılı stratejiler göstermiştir.

Hücre dışı ortamın sertliğinin hücreleri etkilediği uzun zamandır anlaşılmıştır. İnsan vücudunda, beyindeki yüzlerce paskaldan (Pa) ve kemikteki onlarca gigapaskala (GPa) kadar çok çeşitli sertlikler vardır 8,9,10. Gelişim sırasında dokuların sertliğini değiştirdiği ve bu değişikliğin hücresel seviye farklılaşmasını ve normal fonksiyon için gerekli olan yetişkin fenotiplerine olgunlaşmayı düzenlediği bulunmuştur 11,12,13,14. Sertlikteki değişiklikler ayrıca hastalık durumları ve spesifik patolojilerin ilerlemesi ile de ilişkilendirilmiştir 15,16,17,18. Spesifik olarak, miyokardın sertliği hastalıkların gelişmesi ve ilerlemesi ile değişir; örneğin, sağlıklı bir miyokard, 35-70 kPa veya daha fazla elastik modüle sahip olan başarısız bir kalbin aksine, ~ 10 kPa'lık bir elastik modüle sahiptir19. Ek olarak, çok sayıda in vitro çalışma, doğal miyokard sertliğine benzer bir substrat üzerinde kültürlenen kardiyomiyositlerin daha iyi sarkomer organizasyonuna20 sahip olduğunu, optimal kasılma 1,19 oluşturduğunu ve en uzun aksiyon potansiyeli süresine21 sahip olduğunu bildirmiştir.

Ek olarak, hücrelerin in vivo olarak mikro çevrelerinde biçim ve işlevi yönlendiren karmaşık çeşitli topografik ipuçlarına maruz kaldığı daha iyi kabul edilmiştir. Bu topografik ipuçları, integrinlerin moleküler düzeyde rastgele düzenlenmesinden kas dokularındaki hücrelerin mikron düzeyinde hizalanmasına kadar çeşitli boyut ve geometrilerde gelir22,23. Diğer mekanik düzenleyicilere benzer şekilde, topografya, yayılma, uzama, hizalama, motilite, farklılaşma ve apoptoz gibi hücre morfolojisi için önemlidir 24,25,26. Sentetik kültür substratlarının piyasaya sürülmesiyle, hücre ve doku kültürü için kontrollü yüzey topografyası oluşturmak için yöntemler geliştirilmiştir 27,28,29. Örneğin, memeli hücreleri için temas rehberliği sağlamak için mikro desenli nano ve mikro oluklar kullanılmıştır, böylece hücreler, kültür substratının topografik yapılarını takip etmek için hücre iskeletlerini yönlendirir ve yeniden şekillendirir.

Burada, manyetik alanın 17,30,31,32 gücü ayarlanarak sertleştirilebilen veya yumuşatılabilen ayarlanabilir bir malzeme olan desenli bir manyetorolojik elastomer (MRE) alt tabaka kullanarak hem yapısal (temas işareti) hem de mekanik (sertlik) kılavuzluğunu entegre eden bir in vitro kültür yöntemi sunuyoruz. Mıknatısları kültür substratının yakınına yerleştirerek, numune ile mıknatıs arasındaki mesafe değiştirilerek sertleşme derecesi değiştirilerek sertlik artırılabilir. Tersine, mıknatıs tamamen çıkarılarak sertlik azaltılabilir. Bu yaklaşım, in vivo benzeri mekanik koşulları çoğaltmak için sağlam, dinamik ve kontrol edilebilir bir yöntem sağlarken, yüzey mikro modelleme, daha fazla biyomimetik 2D hücre kültürü substratının oluşturulmasını sağlayan anizotropiyi ortaya çıkarır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Desenli PDMS damgasının hazırlanması

NOT: Bir PDMS damgası, desenli MRE yüzeyini hazırlarken kolay manipülasyon ve hassas temas sağlayan esnekliği için gereklidir. Damganın esnek yapısı, desene zarar vermeden MRE PDMS katmanından zahmetsizce çıkarılmasını sağlayarak hem doğru desen transferini hem de MRE yüzeyinin korunmasını sağlar.

  1. 10 g 10:1 (baz: sertleştirici) 184 PDMS hazırlayın.
  2. 5 g 184 PDMS'yi 35 mm'lik bir Petri kabına dökün ve tüm kabarcıklar dağılana kadar ~5-10 dakika boyunca bir kurutucuda gazdan arındırın.
  3. 184 PDMS'nin 60 °C'de 30 dakika fırında kısmen kürlenmesine izin verin.
  4. 184 PDMS'nin kısmen kürlenmesi için 5 dakika kaldığında, kırınım ızgarasına ince bir ekstra 184 PDMS tabakası ekleyin ve ~5 dakika boyunca desikatördeki gazı alın.
  5. Kısmen kürlenmiş 184 PDMS ile 35 mm'lik tabağı fırından çıkarın.
  6. PDMS'li kırınım ızgarasını 35 mm'lik bir tabakta kısmen kürlenmiş 184 PDMS'ye çevirin.
    NOT: Kırınım ızgarasının, 184 mm'lik çanaktaki kısmen kürlenmiş 35 PDMS'ye baktığından emin olun.
  7. Küçük bir miktar 184 PDMS ızgarayı çevreleyene kadar kırınım ızgarasına hafifçe bastırın.
  8. Kürleme sırasında yerinde kalmasını sağlamak için ızgarayı çevreleyen tabağı doldurmak için kalan kürlenmemiş 184 PDMS'yi kullanın.
  9. Kırınım ızgarasını içeren kabı 60 °C'de 1,5 saat fırına koyun.
  10. 184 PDMS tamamen kürlendikten sonra, kırınım ızgarası ile 35 mm'lik kabı fırından çıkarın.
  11. Bir neşter ile kırınım ızgarasının etrafını çizin.
  12. Kırınım ızgarasının altına nüfuz etmesi için az miktarda izopropil alkol (IPA) uygulayın.
  13. Izgarayı 184 PDMS'den desenlere paralel yönde çekin.
  14. Fazla 184 PDMS'yi çıkarın, sadece desenli bölümü bırakın.
  15. 184 PDMS damgasını gereken boyuta kesin.
    NOT: Bu çalışmada cihazlar için 1 cm × 1 cm'lik bir damga kullanılmıştır.

2. PDMS damgasının yüzey kaplaması

NOT: Silan işlemi, damgalama sırasında PDMS katmanları arasında istenmeyen yapışmayı önleyen, düzgün ayırma sağlayan ve desen aktarımının kalitesini koruyan bir yüzey kaplaması oluşturur.

  1. Silan tedavisi (tercih edilen yöntem)
    1. Fabrikasyon 184 PDMS damgasını, desenli yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir O2 plazma temizleyiciye yerleştirin. PDMS yüzeyine 30 saniye boyunca 45 W O2 plazma uygulayın.
      NOT: Plazma temizleyiciden çıkarıldıktan sonra, temizlenen damgaların üzerine birikmediğinden emin olmak için damgaların üzerine hemen bir kapak (veya kapak) yerleştirin.
    2. 184 PDMS damgasını çeker ocaktaki bir kurutucuya yerleştirin.
    3. Bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını yırtın.
    4. Mikrosantrifüj tüpü kapağını, desikatördeki 184 PDMS damgasının yanına yerleştirin.
    5. Mikrosantrifüj tüpü kapağına 20 μL trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan ekleyin.
      DİKKAT: Bu kimyasal sağlık için tehlikelidir ve bu nedenle yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır.
    6. Kurutucuyu kapatın ve bir vakum çekin.
    7. Silanın pulları 1 saatten bir geceye kadar kaplamasına izin verin.

3. Manyetorheolojik elastomerlerin hazırlanması

NOT: Ayarlanabilir ve tersine çevrilebilir MRE'ler oluşturmak için, bir manyetik alanın uygulanmasıyla birlikte karbonil demir parçacıklarının ve elastomerin kesin bir oranı, sertliğin bir dizi değerde ayarlanmasını sağlar. Parçacık fraksiyonunu, baz elastomer modülünü ve manyetik alan kuvvetini değiştirerek, malzemenin sertliği belirli gereksinimleri karşılayacak şekilde ince bir şekilde ayarlanabilir.

  1. Daha yumuşak dinamik aralık MRE hazırlığı (örneğin ağırlıklar için Tablo 1'e bakın)
    1. İstenilen miktarda silikon tiner ve Eko elastomer B parçasını ölçün ve 2500 rpm'de hızlı bir karıştırıcıda 1 dakika karıştırın.
    2. Çözeltiye Eko elastomer kısım A ve karbonil demir parçacıklarını ekleyin ve 2500 rpm'de bir hızlı karıştırıcıda 1 dakika karıştırın.
      NOT: İstenen polimerizasyon zamanlamasını sağlamak için karıştırma sırası kritik öneme sahiptir.
    3. Ucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak, 35 mm'lik yeni bir Petri kabına 5 g MRE ekleyin ve bir kurutucuda ~5 dakika gazdan arındırın, ardından 60 °C'de ~10 dakika fırında kısmen kürlenmeye bırakın.
      NOT: Fırının ve desikatörün uygun şekilde hizalandığından emin olmak, görüntüleme kolaylığı için kritik olan düz bir numune elde etmek için çok önemlidir.
    4. 5 dakika kaldığında, 184 PDMS damgasının yüzeyini kaplamak için ekstra kürlenmemiş MRE eklemek için bir transfer pipeti kullanın. Kaplanmış damgayı 5 dakika boyunca gazdan arındırmak için kurutucuya yerleştirin.
      NOT: Çok fazla MRE kullanmamaya dikkat edin, çünkü damganın kenarlarını kaplarsa, MRE tamamen kürlendikten sonra damgayı çıkarmayı zorlaştıracaktır. Ayrıca, damgayı MRE'den çıkarırken desenlere paralel yönde çekilebilmesi için her adımda desenin yönünü belirttiğinizden emin olun.
    5. MRE'yi fırından çıkarın ve kaplanmış damgayı dikkatlice hareket ettirmek için bir çift forseps kullanın. Kısmen kürlenmiş MRE'nin üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde çevirin ve hafifçe bastırın. MRE'yi ve kaplanmış damgayı 60 °C'de 25 dakika daha fırına koyun.
    6. Tamamen sertleştikten sonra, MRE'yi damganın altında, desenlere dik olarak puanlamak için bir neşter kullanın.
    7. Damganın etrafındaki kesim alanına az miktarda IPA uygulayın.
      NOT: IPA kesimin içine sızmalı ve damganın altında hareket etmeye başlamalıdır.
    8. Forseps kullanarak, damgayı MRE'den desenlere paralel yönde çekin.
  2. Daha sert dinamik aralık MRE hazırlığı (örneğin ağırlıklar için tabloya bakın)
    1. 30:1 184 PDMS hazırlayın.
      NOT: Fazladan yapın çünkü bazıları karıştırma kabına yapışmış kalacaktır.
    2. İstenilen miktarda 527 PDMS kısım A ve kısım B, ardından karbonil demir parçacıkları ve 30:1 184 PDMS'yi tablodaki örneğe göre oranlarda ekleyin.
    3. 2500 rpm'de hızlı bir karıştırıcıda 1 dk karıştırın.
    4. Ucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak, 35 mm'lik yeni bir petri kabına 5 g MRE ekleyin ve bir kurutucuda ~5 dakika gazdan arındırın, ardından 60 °C'de ~40 dakika fırında kısmen kürlenmesine izin verin.
    5. 5 dakika kaldığında, PDMS damgasının yüzeyini kaplamak için ekstra kürlenmemiş MRE eklemek için bir transfer pipeti kullanın. Kaplanmış damgayı 5 dakika boyunca gazdan arındırmak için kurutucuya yerleştirin.
      NOT: Çok fazla MRE kullanmamaya dikkat edin, çünkü damganın kenarlarını kaplarsa, MRE tamamen kürlendikten sonra damgayı çıkarmayı zorlaştıracaktır. Ayrıca, damgayı MRE'den çıkarırken desenlere paralel yönde çekilebilmesi için her adımda desenin yönünü belirttiğinizden emin olun.
    6. MRE'yi fırından çıkarın.
    7. Kaplanmış damgayı dikkatlice hareket ettirmek için bir çift forseps kullanın, yüzü aşağı bakacak şekilde kısmen kürlenmiş MRE'nin üzerine çevirin ve hafifçe bastırın.
    8. Üst raftaki kaplanmış damgalı MRE'yi gece boyunca 60 °C'de fırına koyun.
    9. Tamamen sertleştikten sonra, MRE'yi damganın altında, desenlere dik olarak kesmek için bir neşter kullanın.
    10. IPA'yı damganın etrafındaki kesim alanına uygulayın.
      NOT: IPA kesimin içine sızmalı ve damganın altında hareket etmeye başlamalıdır.
    11. Forseps kullanarak, damgayı MRE'den desenlere paralel yönde çekin.
Sertlik AralığıMalzemeÖrnek Ağırlık
Yumuşak10–80 kPaEko (A+B)11,25 g (A)11,25 g (B)
Silikon Tiner22,5 gr
Demir Parçacıkları45 gr
Sert60–120 kPa527 PDMS (A+B)18,75 g (A)18,75 g (B)
Demir Parçacıkları37,5 gr
184 PDMS (Baz + Kür)14,5 g (Taban)0.5 g (Kür)

Tablo 1: Hem daha yumuşak hem de daha sert MRE'lerin imalatı için tüm malzemelerin örnek ağırlıkları. Tablodaki ağırlıklar toplam 90 g MRE malzemesi yapmak içindir. Daha az hazırlama, tüm bileşenlerin tablodaki örnek ağırlıklarla aynı oranlarda karıştırılmasıyla gerçekleştirilebilir.

4. Hücre kültürü hazırlığı

NOT: Hücre kültürü hazırlama, uygun hücre hattının seçilmesini, gerekli besinler ve büyüme faktörleri ile kültür ortamının hazırlanmasını ve kontaminasyonu önlemek için steril koşulların sağlanmasını içerir. Hücreler kültür kaplarında kaplanır ve optimal koşullarda (genellikle kontrollü CO2 ile 37 ° C) inkübe edilir. Sağlıklı hücre büyümesini sürdürmek için düzenli izleme, ortam değişiklikleri ve pasaj yapılır.

  1. MRE'nin yüzeyini 3 kez% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin ve üçüncü yıkamanın 20 dakika oturmasına izin verin.
  2. MRE yüzeyini steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3 kez yıkayın, kabı tamamen kaplayacak kadar hacim ekleyin ve ardından tüm sıvıyı aspire edin.
  3. Cihaza hücre yapışmasını teşvik etmek için MRE'nin yüzeyini fibronektin (10 μg/mL) ile PBS'de 37 ° C'de 1 saat kaplayın.
  4. MRE yüzeyini adım 4.1.2'ye benzer şekilde PBS ile 3 kez yıkayın.
  5. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerini 20.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın.
  6. Hücre kültürü sırasında matrisi sertleştirmek için cihazlara geçici olarak mıknatıslar ekleyin.
    NOT: Mıknatıslı cihazları inkübatöre yerleştirirken dikkatli olun. Mıknatısların etkileşime girmemesini garanti etmek için cihazların birbirinden uzağa yerleştirilmesi gerekir. Bu çalışma, daha az etkileşim olduğu için bakır kaplı inkübatörler yerine paslanmaz çelik kaplı inkübatörlerin kullanılmasını önermektedir.

5. Boyama ve görüntüleme

  1. Sabit hücreli görüntüleme
    NOT: Sabit hücreli görüntüleme, belirli hücresel bileşenleri görselleştirmek için birkaç temel adımı içerir. İlk olarak, hücreler yapılarını korumak için sabitlenir. Daha sonra, hücre zarı, leke penetrasyonuna izin vermek için geçirgenleştirilir, ardından antikorların veya lekelerin diğer proteinler veya hücresel kalıntılar gibi istenmeyen bölgelere spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bir engelleme adımı uygulanır. Hücreler daha sonra belirli molekülleri hedef alan boyalar veya antikorlarla boyanır ve fazla leke yıkama yoluyla çıkarılır. Son olarak, lekeli hücreler, hücresel yapıların analizi için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir.
    1. Tabağı tamamen kaplayacak kadar hacim ekleyerek 1x PBS ile bir kez yıkayın ve ardından tüm sıvıyı aspire edin.
    2. 10 dakika boyunca %4 (h/h) paraformaldehit kullanarak hücreleri sabitleyin.
    3. 1x PBS ile üç kez yıkayın (adım 5.1.1'e benzer).
    4. % 0.1 Triton X (1x PBS'de) ekleyin ve geçirgenleşmesi için 5 dakika inkübe edin.
    5. 1x PBS ile üç kez yıkayın (adım 5.1.1'e benzer).
    6. NH4Cl (1x PBS'de 50 mM) ekleyin ve söndürmek için 15 dakika inkübe edin.
    7. 1x PBS ile üç kez yıkayın (adım 5.1.1'e benzer).
    8. Engelleme tamponu ekleyin (1x PBS'de %5 BSA) ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
    9. Primer Anti-α-Aktinin primer antikorunu 1:200'de %5 BSA'ya (1x PBS'de) birleştirin.
      NOT: Antikoru iyice karıştırın.
    10. Numuneye birincil antikor çözeltisini ekleyin.
      NOT: Numunenin tamamını kaplayacak kadar ekleyin.
    11. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Çözeltilerin karışmasına yardımcı olmak için numuneyi külbütöre yavaş bir hızda yerleştirmeyi düşünün.
    12. 1x PBS ile üç kez yıkayın (adım 5.1.1'e benzer).
    13. İkincil antikoru (555 Alexa Fluor keçi faresi önleyici) 1x PBS'de (1:2000) seyreltin.
      NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlıdır (floroforlar). Doğrudan kullanılmadıkları zaman, üzerinin örtüldüğünden ve ışıktan uzak olduğundan emin olun.
    14. İkincil antikor çözeltisini numuneye ekleyin.
    15. RT'de 2 saat inkübe edin.
    16. 1x PBS ile üç kez yıkayın (adım 5.1.1'e benzer).
    17. DAPI (sterilize deiyonize suda 1 μg/mL) ekleyin ve karanlıkta 5-10 dakika inkübe edin.
    18. Hücreleri 20x daldırma lensli dik bir mikroskopla görüntüleyin.
    19. Cihaz başına 50 fotoğraf çekin.
    20. Directionality adlı bir ImageJ eklentisi kullanarak görüntüleri işleyin.
      NOT: Yönlülük seçenekleri: Bu çalışmada, sarma etkisini önlemek için 0° ile 176° arasında değişen n = 45 kutu kullanılmıştır. Kullanılan yöntem yerel gradyan yönlendirmesiydi ve ekran tablosu seçildi. Yön çıktısı, ortalama vektör açısına (hizalama açısını gösterir) karşılık gelirken, iyilik çıktısı ortalama vektör uzunluğunu (hizalama derecesini gösterir) temsil eder.
  2. Canlı hücre görüntüleme
    NOT: Canlı hücre görüntüleme, hücreleri doğal, canlı durumlarında tutarken dinamik hücresel süreçlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Bu teknik, hücrelerin büyüdükleri, bölündükleri veya uyaranlara tepki verdikleri sırada yüksek çözünürlüklü görüntülerini veya videolarını yakalamak için bir inkübasyon odası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanmayı içerir. Zaman içinde hücresel davranış ve etkileşimlerin incelenmesini sağlamak ve hücresel işlev ve dinamikler hakkında değerli bilgiler sağlamak.
    1. Hücreleri SiR-aktin 1:1000 oranı ile kültür ortamı ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Medyayı aspire edin ve 1:2000 (SiR-actin: Media) ile değiştirin.
      NOT: Bu seyreltme, uzun süreli canlı görüntüleme için hücre toksisitesini azaltmak içindir.
    3. İnkübasyon odası, otomatik tabla ve 20x daldırma lensli dik bir mikroskopta 5 saat boyunca her 15 dakikada bir immünofloresan görüntüleri toplayın.
      NOT: Canlı hücre görüntüleme deneyi için, MRE canlı görüntüleme sistemine yerleştirilir yerleştirilmez mıknatıs eklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultra yumuşak silikon bazlı manyetorolojik elastomerler (MRE'ler), bir manyetik alan uygulanarak hassas bir şekilde ayarlanabilen elastik modüllere sahiptir. Bu, değişikliklerin hem hızı hem de büyüklüğü üzerinde hassas kontrol ile fizyolojik bir aralıkta hızlı, çift yönlü ayarlamalara izin verir (Şekil 1). Jel mekaniği, daha önce tarif edildiği gibi elastik modülün ölçülmesiyle değerlendirildi ve daha yumuşak dinamik aralık MRE için ortalama elastik modülün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknik titizlikle test edilmiştir, ancak başarılı bir deney için birkaç adıma dikkat etmek şarttır.

Bu protokolde, desenleme için ana kalıp olarak ticari bir kırınım ızgarası kullanıyoruz. Bununla birlikte, farklı boyutlarda çok çeşitli desenler oluşturmak için silikon veya SU8 mikro üretim kalıplar gibi alternatif desenli kalıplar da kullanılabilir33,35. Piyasada bulunan bazı PDMS malzemeleri, meka...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen Delaware Kas-İskelet Araştırmaları Merkezi COBRE (P20 GM139760) tarafından, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti'nden Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. Kompozit Malzemeler Merkezi'nden (CCM) Sagar Doshi'ye ve Delaware Üniversitesi Dhong laboratuvarından Ashika Singh'e, lazer konfokal mikroskoplarını kullanmamıza izin vermedeki paha biçilmez destekleri ve malzemelerimizin yüzey karakterizasyonu için gerekli uzmanlığı sağladıkları için içten şükranlarımızı sunarız. Onların katkıları işimizin kalitesini önemli ölçüde artırdı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
555 Alexa Fluor keçi anti-fare karşıtı ikincil antikor ThermoFisher ScientificA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
20x dip-in lensZeiss421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
35 mm ÇanaklarThermoFisher Scientific130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
Anti-alfa aktinin primer antikorabcamEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
Karbonil Demir Tozu Mikrosferlerichemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
DAPI lekesiThermoFisher ScientificD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
KurutucuFisher Scientific08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
Kırınım ızgarasıThor LabsGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Jel A & Kısım BSmooth OnEcoflex  GELhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
Genişletilmiş masa üstü plazma temizleyiciSigma AldrichZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
Sığır plazmasından fibronektinSigma AldrichF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer FlacktekDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ YazılımıNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
İzopropil AlkolAmazonhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto..V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se& hvadid=598724400239
& hvdev=c& hvlocphy=9007460& hvn
etw=g& hvqmt=e& hvrand=1609157
209668794739& hvtargid=kwd-3203
62094308& hydadcr=5273_13
227703& anahtar kelimeler=izopropil+alkol+
amazon& mcid=9f9d3252906531
3ea89ab7766d9c244c& qid=1740
675756& sr=8-1-spons& sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1
MıknatısCMS ManyetikleriND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
Nikon Eclipse 80i dik mikroskopNikonEclipse 80i
FırınFisher Scientific15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
Silikon İnceleyiciSmooth OnSilikon İnceleyicihttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
SiR Aktin LekesiSitoskeletonCY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
Sylgard 184 PDMS (Baz + Kürleyici ajan)Ellsworth Yapıştırıcıları2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
Sylgard 527 PDMS bölüm A & BEllsworth Yapıştırıcıları1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
Transfer PipetleriFisher Scientific13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMMD& searchType=
RAPID& matchedCatNo=13
-711-5AMMD
Trikloro -(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil) silan Sigma Aldrich448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Magnetoreolojik ElastomerlerMekanik SertlikMikrodesenli SubstratlarNeonatal S an KardiyomiyositleriDinamik Substrat Sertli iTopografik pu larMekanik Haf zaPDMS DamgalamaFibronektin Kaplama

İlgili makaleler