Otomatik Örnek Değiştiren Robot Kullanılarak Yüksek Verimli Seri Tomografi

Summary

Elmas Işık Kaynağı (DLS) I13-2 Görüntüleme ışın hattındaki otomatik örnek değiştirme robotu kullanılarak senkron tabanlı X-ışın tomografisi için uygulama detayları ve veri toplama prosedürü burada sunulmakta ve tartışılmaktadır. Bu, ışın hattının veri toplama verimliliğini ve veri toplama verimliliğini büyük ölçüde artırır.

Abstract

Bu el yazması, örnek alışverişi için robotik kol kullanan ve veri toplama verimliliğini önemli ölçüde artıran otomatik veri toplama iş akışını tanımlar. Elmas Işık Kaynağı (DLS) I13-2, Görüntüleme ışın hattı ile senkrotron X-ışını görüntüleme için uygulanan bu kurulum, yüksek verimli seri tomografi (3D) veya görüntüleme (2D) sağlamak için bir robot kullanır. Şu anda birçok deneyde, manuel örnek değişimi ve hizalama süresi, tomografi taramasının süresiyle karşılaştırılabilir veya hatta ondan daha fazladır. Mevcut ışın zamanının verimli kullanımını en üst düzeye çıkarmak ve deneysel verimliliği artırmak için örnek değişimi ve hizalanmanın otomatikleştirilmesi gereklidir. Robotun örnek değiştirici olarak kullanılması, seçilen piksel boyutuna bağlı olarak manuel işlemlere kıyasla en az 4-10 kat aktarım kapasitesini artırabilir. Diamond II makinesi ve I13L ışın hatlarıO perando Coherent TOmografi ile Ptikografik Ibüyü (OCTOPI) yükseltmeleriyle, artan X-ışını akısı deneysel tarama sürelerini daha da azaltacak ve sistemi daha da verimli hale getirecek. Ayrıca, otomasyon, kullanıcılar için isteğe bağlı bir posta yoluyla gönderme hizmeti de dahil olmak üzere uzaktan veri toplama imkanı sağlar. Otomatik örnek merkezleme, tamamen gözetimsiz taramaya olanak tanır ve bu tarama uzaktan gerçekleştirilebilir. Bu, sistemin benzersiz ve yenilikçi bir özelliğini temsil eder. Bu el yazması, örnek hazırlama, özel tutuculara montaj, ışın hattına taşıma ve robotik numune değişimi için özel tepsilere yerleştirme dahil olmak üzere tüm prosedürü tanımlar. Otomatik numune merkezleme prosedürü ve ardından gelen tomografi yeniden yapılandırma boru hattı sunulmaktadır.

Introduction

Otomasyon, ağır imalat endüstrilerinde onlarca yıldır yaygın olarak kullanılmaktadır ^1,2,3. Ancak, robotik donanım ve yazılım geliştirme, genom dizileme, hastanelerde tıbbi ameliyatlar yapmak veya kimya deneylerinin yürütülmesine yardımcı olmak gibi çok hassas işleri yapabilecek kadar olgunlaşmıştır 4,5,6,7. Otomasyon sadece insan hatalarını ortadan kaldırmakla kalmaz, aynı zamanda verimliliği ve verimliliği de^{artırır 4}.

Bir senkrotron X-ışını kaynağı, kızıızıltesinden sert X-ışınına kadar geniş spektral aralıkta son derece parlak ve yüksek tutarlı elektromanyetik radyasyon üretir. Bu kaynaklar, çok kısa tarama süreleri ve yüksek istatistiklerle yüksek verimlilik ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme deneylerini mümkün kılar. Kısmi uyum, polimerler veya doku örnekleri gibi zayıf emici yumuşak malzemeler için laboratuvar tabanlı X-ışını kaynaklarına kıyasla daha iyi kontrast sağlamak için^{kullanılabilir.} Gerçek 3D olarak görselleştirilmesini sağlayan tam bir X-ışını tomografi veri seti – örneğin farklı açılardan projeksiyonlarının alınmasını gerektirir. Kaynak parlaklığı, deneysel donanım ve kontrollerdeki gelişmeler, veri toplama sürelerinin onlarca saniyeden^{dakikaya kadar olmasına olanak tanır 8}. Sonuç olarak, örnek yükleme ve hizalama, tomografi taramasından daha fazla zaman alıcı^{hale geldi 11,12}. Bir senkrotron tomografi deneyinde numunelerin manuel olarak değiştirilmesinin (tarama süresine kıyasla) önemli bir zaman alabileceğini belirtmek önemlidir; çünkü deneysel kaba girip kapatırken radyasyon güvenliği prosedürü uygulanmalıdır. Bu işlem genellikle birkaç dakika sürer. Ayrıca, örnek hizalanması da birkaç dakika sürebilir.

Bu örnek değiştirme ve örnek hizalanması süreci otomatikleştirilirse, önemli miktarda zaman kazanır. Bu nedenle, DLS senkrotron tesisinin I13-2 Görüntüleme ışın hattında bir örnek değiştirici robot uygulanmıştır. Bu el yazması, I13-2 Görüntüleme ışın^hattı 11,12'de bir örnek değiştirici robot kullanılarak birden fazla örnekle yapılan bir sinkrotron X-ışını mikro-tomografi deneyinin tam protokolünü tanımlar. Bu uygulama, deneysel sürenin verimliliğini artırmakla kalmaz, aynı zamanda deneylerin uzaktan yapılmasına da olanak tanır. Alternatif olarak manuel veya yarı otomatik çalışma uygulanır; ikisi de oldukça yavaştır. Burada yarı otomatik, robotun sadece numune değişimi için kullanılması, örnek hizalanması olmadan kullanılması anlamına gelir.

Otomasyonun önemi, diğer senkrotron görüntüleme ışın hatlarındaki otomasyon projeleri tarafından vurgulanmaktadır; en benzer projeler APS^13'ün 2BM ışın hattı, SLS TOMCAT ışın^{hattı 14}, PETRA^{III 15'teki} EMBL P14 ışın hattı ve Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü (KIT) Işık^{Kaynağı 16'daki} IMAGE ışın hattı. 2-BM APS'de, robotla tarama gerektiren örnekler, aynı anda maksimum 60 örnek kapasiteli bir örnek değiştirici tepsiye yerleştirilen standart kinematik montaja monte edilir. Bir tutucu kol numuneyi alır ve döner aşamaya monte eder. Ancak, örnek hizalanması stereoskop kullanılarak çevrimdışı yapılır. SLS'deki TOMCAT ışın hattına benzer bir sistem kurulmuştur, ancak burada süreç tamamen otomatiktir; örnek yükü boşaltma, hizalama, doğru ilgi alanı tarama ve yeniden yapılandırma işlemlerini gerçekleştirebilir. Aynı anda taranabilecek toplam örnek sayısı 60'tır. Son zamanlarda, PETRA III^15'teki P14 ışın hattı, yaklaşık 1 mm boyutunda yumuşak biyolojik örnekleri işleyebilen bir örnek değiştirme sistemi kurulmuştur. Konumlandırma ve merkezleme üç tıklamalı merkezleme işlemiyle yapılır. KIT'teki IMAGE ışın hattında, yüksek verimli görüntüleme/tomografi son istasyonu iki gün içinde 1.500'e kadar örnek ölçülmesini^{sağlar 16}. Yukarıda bahsedilen robot sistemlerinden farklı olarak, I13-2 Görüntüleme ışın hattı sistemi şu anda 8 mm çapına kadar örnekleri işleyebiliyor ve sekiz saatlik vardiyada, insan müdahalesi olmadan, otomatik numune merkezleme dahil olmak üzere 112 numuneye kadar ölçü alabiliyor.

I13-2'deki mevcut tomografi düzeni, Diamond-Manchester Imaging ışın hattı,¹⁷ numaralı yayında bildirilmiştir. Tamlık için, tomografi deneylerinin temel yönleri burada özetlenmiştir; lütfen ayrıca Şekil 1'e de bakınız. Tomografi aşama yığını, örnek manipülasyonu ve dönme ekseni eğim hizalanması için bir hexapod (PI miCos) içerir. Hexapodun üzerine hava taşıyıcılı bir dönme aşaması monte edilmiştir. Dönme aşaması mükemmel sallanma (<2.4 μrad) ve eksenel hata (<100 nm) hareketlerine sahiptir. Tomografi dedektörü sistemi dört farklı büyütme (veya görüş alanı) ile donatılmıştır. Mevcut çalışma için 1,25× (2,6 μm etkili piksel boyutu ve 6,7 mm x 5,6 mm görüş alanı) ve 4× (0,81 μm etkili piksel boyutu ile 2,1 mm x 1,8 mm görüş alanı) objektif kullanılmıştır. 1.25× hedefin 500 μm LuAg:Ce scintillatöru varken, 4x neslette 100 μm LuAg:Ce scintillator (Crytur) vardı. Bir sCMOS dedektörü (pco.edge 5.5), büyütülmüş scintillasyon ekran görüntüsünü ek olarak 2x fotoğraf okulluk ile kaydeder (tüm mikroskop optikleri Olympus'tan alınmıştır). Etkili pikseller 2.6 μm ile 0.33 μm arasında değişir; en yüksek büyütmede yaklaşık 1 μm çözünürlük kullanılır. Dedektör çipi, 6,5 μm piksel boyutuna sahip 2560 x 2160 boyutlarından oluşur ve piksel dizinin maksimum okuma hızı 100 Hz'dir.

Protocol

NOT: Bu çalışma, karşılaştırmalı fenotipik analiz için Londra Doğa Tarihi Müzesi'nden (NHM) alınan böcek örneklerini kullanmaktadır. Örnekler, Doğa Tarihi Müzesi tarafından, örneklerin yasal olarak toplanıp bağışlandığından emin olmak için standart alım prosedürlerine uyarak elde edilmişti.

1. Deneyin planlanması

1. İlgilendiğiniz örneklemle I13-2 ışın hattında tomografi veya görüntüleme deneyleri yapmanın mümkün olup olmadığını aşağıdaki bağlantıdan ışın hattı personeline ulaşarak kontrol edin: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Planlanan deneyin gerçekleştirilmesi için bir zaman dilimi almak amacıyla aşağıdaki bağlantıyı kullanarak bir teklif gönderin: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Teklif kabul edildikten ve deney planlandıktan sonra ışın hattı personeliyle numune hazırlama ve örnek ölçüm sürecini tartışın. Robot kullanılarak yapılan deneylerin belirli gereksinimleri vardır ve bunlar bir sonraki bölümde (bölüm 2) belirtilmiştir.
4. Örnek boyutları ve bileşimi ışın hattı personeliyle görüşerek deneyin ışın hattında başarılı bir şekilde yapılabileceğini doğrulayın.
5. Web sitesindeki talimatları takip ederek deneysel ziyarete önceden hazırlık yapmaya başlayın (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Deneysel oturumdan önce güvenlik eğitimini tamamla.

2. Numune hazırlama (robot deneyleri için)

1. Numune montajı için SPINE uyumlu^{örnek tabanları 18'i} hazırlayın. Her örneği, otomatik örnek takibi mümkün kılmak için Veri Matrisi barkodu ile donatılmış SPINE tarzı standart örnek tabanına monte edin.
2. Örneği tabana iki konfigürasyondan birini kullanarak bağlayın. Pin montajı: Örneği SPINE tarzı bir örnek pinine sabitleyin (bkz. Şekil 1C, damar). Konteyner veya doğrudan montaj: Örneği uyumlu bir kap, örneğin mikro-santrifüj tüpü/poliimid tüpünün içine veya doğrudan örnek tabanının üzerine yerleştirin.
3. Robot tutucu ile boyutsal uyumluluğu kontrol edin, monte edilen örnekin izin verilen boyut zarfları içinde olduğunu doğrulayarak güvenli robotik kullanımın sağlanmasını sağlar ( bkz. Şekil 2):
   Seçenek A: 8 mm çapında x 20 mm yüksekliğinde bir silindirin içine sığır.
   Seçenek B: 3,5 mm çapında x 33 mm yüksekliğinde bir silindirin içine sığır.
4. Her iki konfigürasyonun da örnek tabanına odaklandığından emin olun. Seçilen konfigürasyona bağlı olarak toplam yüksekliğin (örnek + montaj + taban) 27 mm veya 40 mm'yi geçmediğinden emin olun.
5. Örnekleri SPINE örnek pinlerine monte ederken, numunenin pimin üzerinde konumlandırıldığından ve pin milinin hiçbir kısmının gizlenmesinden emin olun. Numune, robot kavramaçıyla temas kurmayı önlemek için pin tabanına dikey ve merkezi olarak monte edilmelidir. Bu özellikle, protokol bölüm 2.3'te tanımlanan Seçenek B montajı ve örnek pinlerinin üzerine monte edilen uzun örnekler için önemlidir.
6. Kablar veya tüpler içine monte edilirken, numuneyi nakliye veya robotik işlem sırasında kaymaması için kabın içine sıkıca sabitleyin. Kabın kendisinin örnek tabanında dikey olarak hizalandığından emin olun.
7. Seçilen montaj elemanını (pin veya kap) örnek tabanına güvenli ve dikey olarak sabitleyin, böylece deney boyunca konumsal stabiliteler sağlanır.
8. Nakliye sırasında ayrılmayı önlemek için güvenilir bir yapıştırıcı veya sabitleme yöntemi kullanın ve otomatik manipülasyon için, çünkü her iki süreç de mekanik gerilmelere yol açabilir.
   NOT: Yaygın yapıştırıcılar arasında siyanoakrilat (süper yapıştırıcı), parafin mumu ve sıcak eritme yapıştırıcı bulunur. Malzeme uyumluluğundan emin değilseniz ışın hattı personeline danışın.
9. Tüm örneklerin kabın üst kenarından veya örnek pinine kadar tutarlı bir yükseklikte konumlandırıldığından emin olun. Konteynerlerin içine monte edilen örneklerde, konteyner duvarından yan mesafenin tüm örnekler boyunca aynı olduğundan emin olun.
   NOT: Güvenilir otomatik hizalama için tutarlı konumlandırma gereklidir. Görüş alanına göre daha küçük örnekler daha fazla tolerans sağlar.
10. Veri analizi sırasında doğru örnek tanımlanmasını sağlamak için her numuneyle ilişkili Veri Matrisi kodunu belgeleyin.
11. Her örnek adını örnek veri matrisi koduyla ilişkilendirmek ve tomografi taramaları için ilgili parametreleri aktarmak için samples.csv bir dosya oluşturun.

3. Numune paketleme ve teslimat

1. Deneysel oturumdan en geç 15 iş günü öncesinde deneysel risk değerlendirmesini (ERA) sunmalı ve tüm örnekleri orada bildirmeli. Bu ERA, örneklerin sahaya gönderilmesine veya getirilmesine izin verilmeden önce DLS sağlık ve güvenlik (HSE) grubu tarafından onaylanmalıdır.
2. Evrensel örnek tabanını, örnek pinine monte edilmiş kombinasyon depolama ve/veya nakliye konteyneri ile kullanın; bu konteyner Uni-puck olarak da adlandırılır. Bu, posta yoluyla gönderiyorsanız oldukça önemlidir.
3. Eğer örnekler, 3.2. adımda belirtilen depolama konteynerinin örnek yuvalarına sığmazsa, lütfen örnek tabanına uyan manyetik koruyucu kapaklar kullanarak örnekleri doğrudan ölçüm için getirerek alternatif montaj düzenlemeleri yapın.

4. Deneysel kurulum

1. Numunede kontrastı maksimize etmek için X-ışını kaynak parametrelerini ayarlayın. Bunu başarmak için tüm spektrumu kaydırın ve/veya X-ışını spektrumunu filtreleyin.
2. Kamerayı, X-ışını spektrumuna ve belirli bir örnek için istenen faz kontrast derecesine göre örnekleme mesafesine göre optimize edin.
3. Örnek boyutuna ve gerekli görüş alanına göre mikroskop büyütmesini seçin ve ilgili mikroskop hedefini seçin.
4. Kameranın yatay konumunu (laboratuvarda x-ekseni) X-ışını ışınına göre hizala.

5. Örnek yükleme ve hizalama

1. Her deney oturumunun başında numuneleri ve numune montajını hasarlı veya gevşek montajlı gibi görünen örnekler için dikkatlice kontrol edin. Kullanıcıları bu tür örnekler hakkında bilgilendirin.
   NOT: Şu anda, ışın hattı 7 puck'a kadar montajlarla donatılmıştır ve her disk 16 numuneye kadar tutabilir. Tek bir robot çalışması sırasında toplam 112 örnek ölçülebilir. Lütfen puck'un yuvası (pin) pozisyonlarının nasıl belirleneceğini gösteren Ek Şekil 2'ye bakınız.
2. samples.csv dosyasında tanımlanan ilgili puck ve puck-slotlara (pinlere) örnekleri monte edin. Robotun çalıştığını test etmek ve örneklerin gerekli spesifikasyonlarda olduğundan emin olmak için birkaç örnek üzerinde robot numune değişim prosedürünü kuru bir deneme işlemi yapın.
3. Döndürme aşamasının dönme ekseni dedektörün merkezine yatay yönde hizalamak için örnek pimi (örnek olmadan) bir örnek tabanı kullanın.
4. Pimin üst kısmını X-ışını kamerasının ortasına taşıyın (Şekil 3A). Fotoğrafta (Şekil 3) gösterildiği gibi, ışına 90° konumlanmış teleskop kamerasını (TC) görüş alanının (FOV) merkezinde hizala. Bu konumun koordinatlarını TC piksel koordinatlarında belirleyin.
5. Örnek hizalamasını yöneten betikte örnek hedef konumunu güncelleyin.
6. Temsilci bir örnek yerleştirin. Örneği TC'de dönme merkezine yerleştirmek için otomatik örnek hizalama betiklerini çalıştırın. Script bağlantısı Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
7. İlgi alanının (ROI) X-ışını kamerasının görüş alanında (FOV) merkezlenip merkezlenmediğini kontrol edin.
8. Eğer yatırım getirisi FOV'da merkezli değilse, 5.5'ten 5.7'ye kadar olan adımları tekrarlayın ve hedef konum koordinatlarını değiştirerek örnek hizalamasını iyileştirin.
   NOT: 4. ve 5. bölümler yerel irtibat tarafından yapılmaktadır, ancak bölüm 4.2 hariç.

6. Veri toplama kurulumu

1. DLS dosya sisteminde ham verileri, meta veri dosyalarını ve analiz sonuçlarını depolamak için gerekli dosya/klasör yapısının oluşturulduğundan emin olun.
2. samples.csv dosyasını 6.1. adımda belirtilen klasöre kopyalayın.
3. Kamera pozlama süresini ve samples.csv içinde elde edilecek projeksiyon sayısını, örnek yapısına ve istenen kontrasta göre güncelleyin.
4. Yükleme Pozisyonu (LP) ve Tarama Pozisyonu (SP) olarak adlandırılan iki motor pozisyon grubu tanımlanır. LP, aşamaların örnek yükleme için optimize edildiği ve SP'nin numunenin tomografi taraması için optimize edildiği setdir.
   NOT: Bölüm 6, yerel iletişim tarafından yapılır veya DLS sistemleri tarafından otomatik olarak oluşturulur.

7. Veri toplama

1. Tüm örnekleri samples.csv dosyasında talimatlara uygun puck ve pin pozisyonlarına monte edin.
2. Veri toplama için, DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html) tarafından geliştirilen açık kaynaklı bir yazılım olan Genel Veri Toplama (GDA) çalışma tezgahını kullanın. DLS'de deneyleri kontrol etmek ve veri toplamak için kullanılan Java tabanlı bir sistemdir. Bir ekran görüntüsü Ek Şekil 1'de sağlanmıştır.
3. GDA'da otomatik örnek değişimi, örnek hizalanması ve tomografi ölçümü için tomomatik adı verilen bir nesne kullanın.
4. Tomomatic.load komutunu ver (/dls/i13/data/year/... samples.csv) ile GDA terminalinde dosyayı yüklemek için kullanılır. Sonra tomomatik ver. komutu çalıştırmak için tarama () yapın.
5. Robot önce yükleme tepsisinden örneği alır ve lazer barkod okuyucuya götürür. Barkod okunduktan sonra, numuneyi tomografi aşamasına taşıyor ve monte ediyor. Tüm sürecin sorunsuz ilerlediğinden emin olun.
   NOT: Burada, kendi geliştirdiği flexure gripper'a sahip bir Yaskawa robotu kullanılıyor.
6. Örnek yüklemesi tamamlandıktan sonra, aşamalar SP pozisyonuna geçer. Daha sonra, tomomatik betik içindeki autoCentrePin fonksiyonu yürütülür ve örnek Dönme Merkezine (COR) yerleştirilir. Robot örnek değiştirici ile X-ışını tomografisi ölçümü artık yapılmaya hazırdır.
   NOT: Lütfen tomomatik alfabesinin sözde kodu için Ek Dosya 1'i kontrol edin.
7. Tomografi ölçümü için TomoFlyscan fonksiyonunu gerçekleştirin. Bu fonksiyon önce X-ışını ışını olmayan 40 projeksiyon görüntüsünü toplar; buna karanlık görüntü (DI) denir, ve X-ışını ışını ile örnek olmayan 40 görüntü toplar; buna düz alan görüntüsü (FI) denir. Bu görüntüler, veri yeniden yapılandırması sırasında görüntü normalizasyonu için kullanılacaktır.
8. samples.csv dosyasında belirtildiği gibi, numune ışındaki döküntü açısı aralıklarında örnekle birlikte projeksiyon görüntüleri (PI) toplayın. Mevcut durumda 3001 PI görüntüsü vardır.
   NOT: 7.5'ten 7.8'e kadar olan tüm adımlar insan müdahalesi olmadan birer ardına ilerler.

8. Verilere ve analizlere erişim

1. Kaydedilen verilere uygun dosya sistemi ve klasöre göz atarak erişin. Önceki bölümde bahsedilen taranan veriler, *.nxs ile *.hdf dosyası ve *.hdf dosyası ile *.hdf dosyasında (örneğin: 123456.nxs ve 123456.hdf) olmak üzere kaydedilir. NXS tarama için meta verileri içerirken, HDF tüm projeksiyon görüntü verilerini (NXS'den bağlantılı veriler) içerir.
2. Projeksiyon görüntülerinden 2B dilimler oluşturmak için Savu yeniden yapılandırma^{boru hattı 19'u} kullanın.
3. AVIZO/ImageJ gibi 3D render yazılımları kullanarak yeniden oluşturulan görüntülere erişin ve görselleştirin.
   NOT: 7. ve 8. bölümlerin tamamlanması, hem kullanıcıların hem de yerel bağlantıların koordineli eylemlerini gerektirir ve her biri tarafından ayrı alt adımlar gerçekleştirilir.

Results

Şekil 1 , Diamond I13-2 Görüntüleme ışın hattına monte edilmiş Yaskawa GP7 örnek değiştirici robotu göstermektedir. Şekil 1A , robotu (1) ve kendi tasarımını yapan esnek tutucu (2) göstermektedir. Bu tutucu, çapı ≤ 8mm olan bir örneği tutabilir. Şekil 1B, tomografi verilerinin alınmasında kullanılan robot (1) ve optik/X-ışını kamera sistemi (4) ve (6) gösterilmektedir. Robot kavramacı, örnek tepsisinden (3) örneği seçer; bu tepsi her birinde 16 örnek bulunan 7 uni-puck tutabilir, Şekil 1C'de gösterildiği gibi. Örnekler alüminyum dübel (5) üzerine monte edilir ve tomografi veri toplama işlemi dedektör sistemi (6) ile yapılır. (5) ve (6) maddelerinin detayları giriş bölümünün son paragrafında verilmiştir. Şekil 1B'deki kırmızı kırık çizgi, X-ışını ışınının yönünü gösterir.

Örnek montaj şeması ve esneklik kavramacı tasarımının detayları Şekil 2'de gösterilmiştir. Şekil 2A , örnek tabanına yapıştırılmış 3D baskı ile üretilmiş silindirik plastik bir örneği göstermektedir. Numunenin sınırı, maksimum örnek yüksekliği ve çapının zarfını temsil eder. Kırmızı oklar, fleksör kavramanın örnek tabanını tutarak numune tepsisinden tomografi aşamasına ve tam tersi olarak hareket ettirdiği konumu gösterir. Bükülme kavramanın 3D tasarımı Şekil 2B'de gösterilmiştir. Kavramanın parmakları pnömatik olarak kontrol edilen bir tahrik borusu tarafından çalıştırılır (Şekil 1B, madde 2). Gripper'daki orta alanın çapı 8,9 mm'dir; Şekil 2C'de gösterildiği gibi, maksimum örnek boyutu 8 mm ve ~1 mm marj elde edilir. Şekil 2D , tomografi aşamasının üst kısmının resmini göstermektedir. İki ortogonal aşamanın üzerine bir alüminyum dübel ve örnek tabanının altındaki girintiye tam olarak uyacak şekilde tam çapta bir manyetik disk monte edilir. Bu disk manyetik olduğu için, tomografi ölçümleri sırasında monte edilen örnek tabanını sıkıca yerinde tutar.

Bu temsilci deney için, Londra'daki Doğa Tarihi Müzesi (NHM) tarafından sağlanan 64 böcek örneği seçilmiştir. Örnekler, kavramanın boyut kısıtlamalarına uyarak artropopod fenotiplerini temsil etmek üzere seçildi. Özellikle böcekler olmak üzere eklemboklar, bilinen tür çeşitliliğinin büyük çoğunluğunu oluşturduğundan, 1 milyondan fazla adı verilen türle birlikte, fenotipin karşılaştırmalı çalışmaları için örneklemek özellikle zordur. Bu nedenle mevcut örnek, üç sınıf düzeyinde artropodlu kladını örnekleyerek (Arachnida, Entognatha ve Insecta) ve böcekler içinde daha ince örnekler alarak yedi sınıfta varyasyonları yakalayarak, günümüzde yaşayan en tür açısından zengin dört takımı da dahil olmak üzere göstermektedir. Örnekler yapıştırıcı ile kartlara sabitleniyordu. Kartlar daha sonra örnek pinlerine monte edildi. Örneklerin (böceklerin) doğrudan örnek pinlerine monte edilmesi kaçınılır; çünkü kirişte düşük emilimli örneklerle yüksek emici bir yapı, yeniden yapılandırma sırasında çizgi artefaktları yaratır ve bunları örnek pinlerine güvenli şekilde monte etmek zordur. Tablo 1, kullanıcının tomografi için gerekli parametrelerle dolduracağı şablon samples.csv dosyayı (A, B, C, E, F, G, H, K sütunları) gösterir. Her bir sütunun açıklaması tabloda verilmiştir. input_file içindeki D, I, J ve L sütunları, ışın hattında tomografi parametrelerinin hizalanması ve optimizasyonu yapıldıktan sonra doldurulur. Tüm 64 örnek, önce optimize edilmiş bir X-ışını yayılım mesafesinde (örnekten detektöre kadar) 1,25x objektif (FOV 6,7 mm x 5,6 mm) ile ölçüldü ve daha sonra aynı örnekler kendi optimize parametreleriyle 4x bir objektif ile ölçüldü. Örnekler numune tepsisine yüklendikten ve deneysel kabin güvence altına alındıktan sonra, tarama GDA ile başlatılır.

Numunenin otomatik hizalanması Python ile yazılmış bir betik ile gerçekleştirildi (Dosyanın GitHub'daki konumu: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). İlk olarak, örnek hizalanması örnek tabanı ve örnek pin kombinasyonu kullanılarak oluşturulur, örnek olmadan yapılır. Şekil 3, yan teleskop kamerasında görüldüğü gibi örnek pinini göstermektedir (kamera, X-ışını ışınına 90° konumlanmış- Şekil 1B, madde 4), standart hizalama örneği olarak kullanılır. Teleskop kamera görüntüsü, örnek arka plandan tespit edilebilmesi için ikili hale getirilmiştir. Örneklemin kenarları belirlenir ve Şekil 3'te gösterildiği gibi beyaz sınır olarak işaretlenir. Örnekin referans koordinat konumu, Şekil 3A'nın iç kısmında beyaz bir daire olarak işaretlenmiş pimin üst kısmıdır. X-ışını görüntüsüne bakıldığında, örneğin ROI'si COR üzerinde konumlandırılır ve gerekli hedef koordinat konumu, kırmızı noktalı mavi çift başlı ok çaprazı olarak işaretlenmiş (Şekil 3B) yan kamerada belirlenir. Bu hedef pozisyon ayarı, örneğin sadece COR'a değil, gerekirse birkaç mm yukarı/daha aşağı veya biraz merkezden farklı bir konuma da yerleştirilmesini sağlar. Örnek tomografi aşamasına yüklendikten sonra otomatik merkezleme fonksiyonu yürütülür. Script önce örneği hedef konumuna (Şekil 3B) taşır ve 0°'ye gider. Sonrasında, örneği 90°'ye (Şekil 3C) hareket ettirir ve örneği dönme merkezine (COR) yerleştirmek için ne kadar hareket ettirilmesi gerektiğini belirler. Bu genellikle yaklaşık 15-20 saniye sürer. Örnek şimdi COR'da (Şekil 2D) ve COR zaten kameranın merkezi ile hizalanmıştır. Sistem artık tomografi alımı için hazırdır.

Bu NHM böcek çalışmasında, insan müdahalesi olmadan 128 tomografi taraması yapıldı. Ölçüm toplamda 17 saat sürdü. Her tarama yaklaşık 8 dakika sürdü. Robot kullanılmadan böyle bir deney, tomografi taraması için yaklaşık 20-25 dakika sürerdi. Bu, robotlarla yapılan tomografi taramalarının, mevcut durumda manuel taramadan 3-4 kat daha hızlı olduğu anlamına gelir. Tablo 2, robot toplu taramasının sonunda oluşturulan tipik bir günlük dosyasını gösterir ve her tarama numarasını ilgili örneğine bağlamak için gereken parametreleri içermektedir. Ek detaylar Tablo 2 yazısında verilmiştir.

Şekil 4, yukarıda bahsedilen tomografi deneyi sırasında 1,25x ve 4x büyütme ile görüntülenen örneklerden biri olan bir böceğin (Sınıf – Insecta, sıra – Coleoptera) normalize projeksiyon görüntülerini göstermektedir. Üst satır, Şekil 4A-C, 1.25x ile görüntülenmiş bir örnek gösterir ve ardından aynı örnek 4x ile görüntülenmiştir, yani Şekil 4D-F. Şekil 4 A–F, 0°, 90° ve 180° olarak alınan projeksiyon görüntülerini gösterir. Sarı dikdörtgen, 4x objektif ile alınan yakınlaştırılmış projeksiyon görüntülerinin FOV'unu gösterir. Örnekler Şekil 1C'de gösterilen tepsiye yüklendikten sonra tüm süreçlerin insan müdahalesi olmadan ilerlediği önemli bir durumdur. Lütfen bu iki taramanın ~8,5 saat arayla alındığını unutmayın. Bu, kurulumun istikrarını ve tekrarlanabilirliğini gösterir.

Şekil 5, Şekil 4'te belirtilen örnekin tomografi rekonstrüksiyon dilimleri setinden yatay veya enine dilimleri göstermektedir. Hem 1.25x (Şekil 5A) hem de 4x (Şekil 5B) dilimleri görüntüler kırpılmadan çizilir ve 2510 x 2510 piksel içerir. Dilimler FOV içinde iyi merkezlenmiştir; bu da daha yüksek büyütme ile bir bölgeye yakınlaştırmanın fiziksel müdahaleye gerek kalmadan mümkün olduğunu gösterir.

Burada sunulan sonuçlar, sinkrotron mikro-tomografi deneylerinde örnek değişimi için robotik bir sistemin uygulanmasının birkaç önemli avantaj sağladığını göstermektedir. Bunlar arasında artan verimlilik, gelişmiş operasyonel verimlilik ve insan müdahalesi gerektirmeden birden fazla büyütme (yakınlaştırma) taraması yapabilme yeteneği yer alıyor. Burada sunulan NHM çalışması gibi taraması gereken örnek sayısı göz önüne alındığında, manuel tarama ile istatistiksel olarak sağlam ve tutarlı sonuçlar elde etmek imkansız olur.

Şekil 1: Robotun ve I13-2 ışın hattına monte edilmiş tomografi deney sisteminin fotoğrafı. (A) Kendi tasarımı flexure kavramasına sahip robot (2). (B) Numune yükleme tepsisi (3) ve tomografi aşaması (5). Optik kamera (Teleskop kamerası), (4) olarak gösterilir, örnekleri COR'a hizalamak için kullanılır. Ölçüm için kullanılan dedektör sistemi (6), görüş alanını otomatik olarak değiştirmek için birden fazla motorlu hedef ve bir pco.edge 5.5 dedektör içerir. Kırmızı kesik ok, X-ışını ışınının yönünü gösterir. (C) 7 puck'tan oluşan örnek yükleme tepsisinin resmi ve her puck, örnek tabanı ve örnek pinlerinin kombinasyonuna monte edilmiş 16 numune tutabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek montaj şeması ve bükülme kavrama tasarımının detayları. (A) Bir örnek tabanına monte edilmiş 3D baskılı plastik sahte örnek fotoğrafı, bükülme kavramacı tarafından işlenebilen maksimum örnek zarfını temsil eder. Kırmızı oklar, tutucunun örnek tabanını tuttuğu konumu gösterir. (B) Flexure gripper'ın 3D tasarımı. Kavramanın parmakları örnek tabanını tutmak veya serbest bırakmak için harekete geçirilir. (C) Kavramaçının boyutlarıyla dikey kesit çizimi. Merkezdeki maksimum açıklık 8,9 mm'dir; bu nedenle, izin verilen maksimum örnek boyutu 8mm≤dir. (D) Tomografi aşamasının üst kısmının fotoğrafı. İki ortogonal aşamanın üstüne mavi ok ile gösterilen bir Alüminyum dübel monte edilir. Numune tabanının (örnekle birlikte) bulunduğu dübenin üstüne manyetik bir disk sabitlenir; bu taban tutucu tarafından konumlandırılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yan teleskop kamerası kullanılarak COR hizalama prosedürünün video grafiğinden anlık görüntüler. (A) Hizalama rutini başlamadan hemen önce hizalama pininin fotoğrafı. Mavi çift başlı çapraz ve ortasında kırmızı nokta bulunur; bu konum tomografi rotasyon aşamasının COR'u ile örtüşür. Giriş, tespit edilen örnek merkezinin hem yükseklik hem genişlik olarak pimin üst kısmının yakınlaştırılmış görüntüsünü gösterir. (B) Pim hedef konumuna 0° hizalanır. (C) Pim 90°'ye dönmüş ve hedef pozisyonundan sapmıştır. (D) Pim hedef pozisyonuna 90° hizalanmış. Şimdi pin her iki dik yönde hizalanmıştır; bu nedenle, örnek kameranın ortasında dönecektir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 1.25x ve 4x objektif ile toplanan normalize edilmiş bir böcek projeksiyon görüntüleri. Bu böcek, Coleoptera tarikatı olan Insecta sınıfına aitti. Bu, 128 tomografi taramasından ikisini temsil ediyor. Böcek bir kağıda yapıştırıldı ve örnek iğnesine takıldı. 1.25x objektif projeksiyon görüntüleri (A) 0°, (B) 90°, (C) 180° ve 4x ile (D) 0°, (E) 90° ve (F) 180° konumlarındadır. 1,25x ve 4x tomografi taramaları seti insan müdahalesi olmadan tek bir seansta toplandı. 1.25x boyutlu bir görüntü seti örneklemin tam görünümünü sağlarken, 4x görüntü seti yakınlaştırma yeteneğini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. İki farklı görüş alanı kullanılarak elde edilen aynı tomografik dilimin karşılaştırılması. (A) 1.25x ve (B) 4x büyütmeler için Şekil 4'te gösterilen projeksiyon görüntülerinin tomografisinden tek bir yeniden oluşturulmuş kesim. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kullanıcının tomografi parametrelerini içeren tipik samples.csv dosyası. Bu dosya, veri toplama için kullanılan tomomatik Python betiği tarafından okunur. A (örneklemin açıklaması), B (puck ID), C (puck'taki slot), E (tomografi dönüş adımı), F (FI sayısı), G (DI sayısı), H (büyütme kullanılacak) ve K (slot önceliği) sütunları kullanıcı tarafından doldurulur. D (pozlama süresi), I (örnek ile kamera arasındaki X-ışını yayılma mesafesi), J (COR'u kameranın merkezine yerleştirmek için ışın üzerinde kamera hareketi) ve L (örnek tabanının barkodu) sütunları hizalama ve ön optimizasyondan sonra doldurulur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Tüm örnekler tarandıktan sonra Output_file.txt olarak kaydedilen tipik çıktı log dosyası. Dosya tüm giriş parametrelerini bildirir ve ayrıca taranan örnek barkodunu (sütun M), taranan meta veri ve görüntü dosyalarına giden yolu (sütun N) ve FI toplamak için kullanılan motorun konumunu (O sütunu) sağlar. Temelde, bu çıktı dosyası verilerin yeniden inşası ve analizi için gerekli bilgileri sağlar. Giriş dosyasının A sütununda girdi sağlanmadığından, bu sütun taramanın mevcut sayısı, puck ve pin numaralarıyla doldurulur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Robotu örnek değiştirici olarak çalıştırmak için kullanılan betikleri tanımlayan sözde kod. Dosya, otomatik örnek montajı, Veri Matrisi kod okuma, otomatik örnek hizalanması ve tomografi taramasının gerçekleştirilmesi için rutini özetlemektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Genel Veri Toplama GUI'nin ekran görüntüsü. Bu arayüz, temel kamera parametrelerinin ayarlanmasını, örneğin canlı görselleştirilmesini ve tomografi alımlarının başlatılmasını sağlar. Taramalar, ekran üzerindeki düğme kullanılarak (sadece manuel tarama) veya ekran görüntüsünün alt ortasındaki sarı dikdörtgenle belirtilen komut satırı arayüzü üzerinden başlatılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: SPINE standartı Puck (solda) ve Puck Cap'in (sağda) fotoğrafı. Kırmızı renkle gösterilen ve örnek tabanların monte edildiği pin pozisyonları, merkezi tutma direğindeki çentikin karşısındaki konumdan başlayarak numaralandırılmıştır. 7267 numarası (beyazla işaretlenmiş) puck tanımlama numarasıdır. Puck Cap, numuneleri taşıma veya depolama sırasında korumak için diske monte edilebilir. Lütfen kapağı takmaya çalışmadan önce örnek boyutlarının uyumlu olduğundan emin olun. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Numune hazırlama ve örnek hizası, otomatik örnek değiştirici robotun doğru ve etkili çalışması için iki kritik^{adımdır 11}. Örneklem büyüklüğü ve montaj gereksinimleri Bölüm 2'de (Protokol) verilmiştir. Temelde, örnek çapı 8 mm veya daha az olmalı ve örnek^{tabanı 12'ye} iyi merkezlenmiş olmalıdır. Bu kısıtlama, kavrama boyutları tarafından belirlenir. Ayrıca, tek bir ölçümdeki tüm örneklerin aynı yükseklikte olması gerekir ki örneklerin dönüş merkezindeki konumu tüm örnekler arasında tutarlı olsun. Robot bir deney için hizalanmışsa, örnek değiştirici robotla başka bir deney yapmak tamamen otomatiktir, sadece örnek için ilgi alanı belirlenir. Bu, temsil eden sonuçlar bölümünde, Şekil 3'te açıklanmıştır. Ayrıca, bunun ışın hattı personeli (yerel temas) tarafından gerçekleştirilen hizalama sürecinin bir parçası olduğunu belirtmek önemlidir. Bu ayarlandıktan sonra, tüm örnek ölçümleri insan müdahalesi olmadan yapılır. Kullanıcı açısından ölçümler tamamen otomatiktir. Bugüne kadar yalnızca Molecular Dimensions Ltd'den örnek tabanları ve örnek pinleri kullanılmaktadır; ancak MiTeGen ve Hampton Research gibi SPINE tarzı örnek tabanları ve numune pinleri üreten başka sağlayıcılar da vardır.

12 mm çapına kadar örnekleri tutabilmek üzere tasarlanmış daha büyük örnek tutucuları şu anda geliştirilme ve test aşamasındadır. Bu, robotun mikrosantrifüj tüplerinin içine yerleştirilen ve örnek tabanına monte edilmiş örnekler gibi daha büyük örnekleri işletmesini sağlar. Geliştirilmiş bir kavrama tasarımı, numuneye yan taraftan yaklaşan bir mekanizmayı içerebilir ve böylece örneklem büyüklüğündeki mevcut kısıtlamaları ortadan kaldırabilir. Ayrıca, ışın hattının yükseltilmesiyle veri verimini bir kat artıracak ve günde 3.000'den fazla örneğin taranmasını mümkün kılacak. Bu da ışın süresinden sonraki 10 gün içinde yaklaşık 30.000 örnekten oluşan istatistiksel olarak önemli veri setlerinin toplanmasına olanak tanıyacaktır. Yakın gelecekte, HTTomo adı verilen yeni bir tomografi yeniden yapılandırma boru hattı uygulayacağız.

Tışın yayılım mesafesi (örnekten dedektöre mesafe), pozlama süresi, projeksiyon sayısı gibi parametrelerin, diğer tüm sinkrotron X-ışını tomografi deneylerinde olduğu gibi, önceden optimize edilmesi gerektiği belirtilmelidir. Bir diğer kısıtlama, deneye dahil olan 6 eksenli örnek manipülasyonu, tomografi aşamaları ve kamera manipülasyon aşamaları gibi aşamaların örnek yükleme ve boşaltma için belirli bir konumda olması gerektiğidir. Bu, örnek yükleme ve boşaltma sırasında aşamaların ileri geri taşınması gerektiği anlamına gelir.

Sonuç olarak, yüksek verimli tomografi örnek değiştirme robotunun yardımıyla yapılabilir; bu da süreci en az 4-10 kat hızlandırır ve manuel kullanıma kıyasla ölü zamanı azaltır veya ortadan kaldırır. Robotlarla deneysel otomasyon, ölçümleri yapmak için daha az kişi gerektiğinden personeli daha verimli şekilde görevlendirmemizi sağlıyor. İstatistiksel olarak anlamlı veri setlerinin ölçülmesi, bilimsel vakayı ele almak için güvenilir ve yeterli veri hacmine ihtiyaç duyulduğu birçok bilimsel alan için önemlidir. Robot kullanmak bu tür görevlerde büyük ölçüde yardımcı olabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Tomografi rotasyon sahnesi
AVIZO	ThermoFisher scientific		Ticari veri görselleştirme ve analiz yazılımı
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Alternatif CryoCap tedarikçisi
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Alternatif CryoCap tedarikçisi
Cryocaps( MD7-401) ve Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Numune montajı için kullanılır
Dedektör Optikleri	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objektiv ve Foto-göz merceği
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Genel Veri Toplama yazılımı
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	Tomografi hizalama ve numune manipülasyonu için 6 eksenli sahne
ImageJ	National Institutes of Health, University of Wisconsin tarafından geliştirilmiştir	https://imagej.net/ij/	Açık kaynaklı görüntü işleme ve görselleştirme yazılımı
pco.edge 5.5 sCMOS kamera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Tomografi görüntüleme için kullanılan X-ışını kamerası
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Tomografi yeniden yapılandırma boru hattı
Scintillatorlar	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Scintillator optikleri
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Numuneler robotun almak için Uni-puck üzerine monte edilir