Yöntem makalesi

Periferik Kan Kök Hücrelerinin Korunması için Yeni Düşük DMSO Kriyoprotektan Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, çok düşük konsantrasyonda dimetil sülfoksit içeren bir hematopoietik kök hücre kriyoprotektan kullanır ve hematopoietik kök hücrelerin korunmasında klinik güvenliğini ve etkinliğini göstererek klinik otolog kök hücre naklinde hematopoietik kök hücre kriyoprezervasyonu için yeni bir strateji sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik kan hematopoetik kök hücre (PBHSC) kriyoprezervasyonu, otolog kök hücre nakli (ASCT) için kritik öneme sahiptir, ancak %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren geleneksel kriyoprotektif ajanlar (TCPA'lar) toksisite riski nedeniyle güvenlik endişelerine yol açmaktadır. Bu çalışma, sıvı nitrojen depolama ihtiyacını ortadan kaldırarak -80 °C'de PBHSC koruması için yeni bir düşük DMSO kriyoprotektif ajanı (CPA, %2 DMSO) doğrulamayı amaçladı. Altı bağışçıdan alınan PBHSC'ler CPA ve TCPA gruplarına ayrıldı. CPA, PBHSC'lerle (1:1 hacim/hacim) karıştırıldı ve doğrudan -80 °C'de saklandı. TCPA (%10 DMSO + %5 insan albümini) kademeli soğutma (1 °C/dk) ve sıvı nitrojen depolamasına tabi tutuldu. 1 ay sonra her iki grup da 37 °C su banyosunda çözüldü. Hücre canlılığı, hücre iskeleti bütünlüğü (mikrofilamentler/mikrotübüller), mitokondriyal aktivite ve koloni oluşturma kapasitesi karşılaştırıldı. Çözüldükten sonra, PBHSC sağkalımı CPA (% 91.29) ve TCPA (% 90.07) arasında karşılaştırılabilirdi. Bununla birlikte, CPA, hücre canlılığı testlerinde TCPA'dan daha iyi performans gösterdi (CPA: %89.38'e karşı TCPA: %79.55; p < 0.05). Hücre iskeleti analizi, CPA ile korunmuş hücrelerde bozulmamış mikrofilamentler ve mikrotübüller ortaya çıkardı ve yapısal berraklık TCPA'yı aştı. CPA ile tedavi edilen hücrelerdeki mitokondriyal aktivite, TCPA'dan %8.5 daha yüksek aktivite sergileyen taze PBHSC'leri yansıttı (p < 0.05) ve mitokondriyal kompleks sayılarını artırdı. Koloni oluşturan tahliller, indüksiyon sonrası daha yüksek koloni sayıları ile CPA'nın üstünlüğünü daha da doğruladı. CPA, ultra düşük DMSO (%2) kullanarak -80 °C'de güvenli, uygun PBHSC kriyoprezervasyonu sağlayarak sıvı nitrojen bağımlılığını ortadan kaldırır. Gelişmiş hücre canlılığı ve mitokondriyal korunması, infüzyon toksisitesi risklerini azaltarak klinik avantajlar sağlar. Bu protokol, ASCT için güvenliği ve operasyonel verimliliği optimize eden dönüştürücü bir strateji sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otolog hematopoietik kök hücre nakli (ASCT), lösemi, lenfoma ve multipl miyelom dahil olmak üzere çeşitli hematolojik maligniteler için iyi bilinen bir tedavi seçeneğidir ve yoğun kemoterapi veya radyoterapi sonrası hematopoezi yeniden yapılandırmak ve bağışıklık yeterliliğini geri kazandırmak için birinci veya ikinci basamak tedavi olarak hizmet eder 1,2,3,4,5,6,7 . Başarılı ASCT sonuçları kritik olarak, hematopoietik ve immün sulandırma için fonksiyonel kapasiteyi koruması gereken dondurularak korunmuş periferik kan hematopoietik kök hücrelerinin (PBHSC'ler) yaşayabilirliğine bağlıdır 8,9,10,11,12. Hematopoetik kök hücre depolama, ASCT'de kritik bir adımdır, çünkü otolog hematopoietik kök hücre toplanmasından sonra, hastalar tipik olarak tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için radyasyon, kemoterapi ve diğer tedavilere tabi tutulur. Hematopoetik kök hücre depolamasının kalitesi, hematopoetik ve immün rekonstitüsyonun başarısı veya başarısızlığı ile doğrudan ilişkilidir 13,14,15,16,17,18. Kriyoprezervasyon sonrası hematopoietik kök hücrelerin canlılığını sağlamak için, klinik uygulamalar genellikle CPA olarak insan kan albümini ve dimetil sülfoksit (DMSO) ilavesini içerir. Bu ajanlar, kriyoprezervasyon işlemi sırasında ve sonrasında hücre aktivitesini korumak için çok önemlidir. Tipik olarak, kullanılan DMSO konsantrasyonu %5 ila %10 (h/h) arasında değişir. Çalışmalar, en az %3,5 ila %10 (h/h) arasında bir DMSO konsantrasyonunun korunmasının hematopoietik kök hücre kriyoprezervasyonunun etkinliğini artırabileceğini göstermiştir19,20. Bununla birlikte, DMSO'nun klinik uygulaması, doza bağlı toksisite nedeniyle sorunlu olmaya devam etmektedir ve nakil alıcılarının %30-60'ı bulantı, kusma ve hipotansiyon gibi olumsuz etkiler bildirmiştir21,22. %5-%10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren geleneksel kriyoprotektif ajanların (CPA'lar) sınırlamalarını ele almak için bu çalışma, ultra düşük DMSO konsantrasyonları (%2 v/h) kullanarak -80 °C'de güvenli ve verimli PBHSC kriyoprezervasyonu sağlayan yeni bir CPA geliştirmeyi amaçlamaktadır, böylece DMSO ile ilişkili toksisiteyi azaltırken karmaşık sıvı nitrojen protokollerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır.

Trehaloz bazlı veya polimerle güçlendirilmiş CPA'lar gibi ortaya çıkan alternatifler, klinik öncesi umut vaat etmektedir, ancak düzenleyici engeller veya standart çözdürme protokolleriyle uyumsuzluk nedeniyle klinik çeviride engellerle karşılaşmaktadır23. Buna karşılık, CPA'mız, sitoproteksiyonu artıran optimize edilmiş katkı oranları sunarken, HSA-DMSO sistemlerinin yerleşik güvenlik profilini temel alır. Bu yöntem özellikle sıvı nitrojen altyapısına sahip olmayan veya hızlı iş akışları gerektiren klinik merkezler için uygundur. Bununla birlikte, uzun süreli depolama için (>2 yıl), sıvı nitrojen tercih edilir olmaya devam etmektedir24. Klinisyenler, hematopoetik kök hücre naklinde güvenliği ve operasyonel verimliliği en üst düzeye çıkarmak için bu stratejinin özel olarak uygulanmasını sağlayarak, protokol basitliğini DMSO'ya karşı bireysel hasta toleransı ile dengelemelidir.

Bu çalışmada, azaltılmış DMSO içeriğine sahip kriyoprotektanların kullanılması, ilişkili toksisiteyi en aza indirirken hematopoietik kök hücre kriyoprezervasyonunun etkinliğini aynı anda korumak için çok önemli bir stratejiyi temsil etmektedir. Periferik kan hematopoietik kök hücrelerinin (PBHSC'ler) korunması için yeni geliştirilen hematopoietik kök hücre CPA'nın etkinliği, güvenilirliği ve rahatlığı değerlendirildi. Geleneksel kriyoprezervasyon protokollerinden kaçınarak yeni CPA'yı kullanan basit, doğrudan bir dondurma yöntemi uygulandı. Bulgular, düşük konsantrasyonlu DMSO CPA kullanılarak -80 °C'de hücre süspansiyonlarının tek adımlı dondurularak saklanmasının, geleneksel CPA'ya (TCPA) kıyasla üstün koruma etkileri elde ettiğini göstermektedir. Bu yaklaşım, hematopoetik kök hücre naklinin (HKHT) klinik sürecini kolaylaştırmak için yeni stratejiler sunabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ASCT uygulanan hematolojik onkoloji hastaları, Haziran 2020'den Haziran 2022'ye kadar Shenzhen Kanser Hastanesi hematoloji bölümünde işe alındı. Ortanca yaşı 53 yıl ve 35 ila 61 yıl arasında değişen iki akut miyeloid lösemi (AML) vakası, iki Hodgkin lenfoma (HL) vakası, bir kutanöz gerçek histiyositik lenfoma (CGHL) vakası ve bir primer mediastinal B hücreli lenfoma (PMBL) vakası dahil olmak üzere HKHT için nakil mobilizasyonundan önce ve sonra kan hücresi örnekleri alındı. Çalışma, hastalardan bilgilendirilmiş onam ve Shenzhen Kanser Hastanesi etik inceleme komitesinden AF-SC-07-2.0 etik onay belge numarası ile onay almıştır. Tüm hayvan deney prosedürleri, Deney Hayvanları Etik Kurulu, Kanser Hastanesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi tarafından onaylanmıştır (Onay No. NCC2018A073) ve hayvan araştırmaları için uluslararası yönergelere uymuştur.

1. Hematopoetik kök hücre örneklerinin alt paketlenmesi ve dondurularak saklanması

  1. Aseptik bir iş istasyonunun hazırlanması
    1. Ellerinizi iyice yıkayın ve steril maske ve eldiven giyin. Elleri, bilekleri ve dirsekleri %75 etanol kullanarak dezenfekte edin.
    2. Tüm yedek aletleri (pipetler, kanama durdurucular) otoklav veya UV ışınlaması ile sterilize edin. Biyogüvenlik kabinine aşağıdaki malzemeleri yerleştirin: 1 mL steril pirojensiz pipet uçları (2 kutu), 1000 μL pipet, steril 1,8 mL kriyoprezervasyon tüpleri, 50 mL santrifüj tüpleri ve kriyoprezervasyon tüpü saklama kutusu (programlanabilir dondurma kutusu).
  2. Etiketleme ve hücre-CPA karıştırma
    1. Kriyoprezervasyon tüplerini numune kimliği, tarih, hücre sayısı ve bağışçı adı ile etiketleyin.
    2. 180-200 mL hematopoietik kök hücre içeren hematopoietik kök hücre torbasını, steril bir infüzyon tüpü kullanarak 100 mL yeni düşük DMSO kriyoprotektan içeren CPA içeren torbaya bağlayın.
    3. Tüpün orta noktasını steril bir hemostat ile sıkıştırın. Bir ucunu hücre-CPA karışım torbasına ve diğer ucunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne takın.
  3. Doldurma ve kriyoprezervasyon
    1. Hücre-CPA karışımının santrifüj tüpüne kontrollü akışını sağlamak için kanama durdurucuyu serbest bırakın.
    2. Bir pipet kullanarak santrifüj tüpünden 1 mL alikotları aspire edin. Alikotları önceden etiketlenmiş kriyotüplere (30 tüp/numune) aktarın. Kapakları sıkın ve tüpleri saklama kutusuna yerleştirin.
  4. Depolama ve nakliye
    1. Saklama kutusunu hemen -80 °C'lik bir buzdolabına aktarın. Taşıma için, kriyotüpleri sıcaklık izlemeli kuru buzda (-78,5 °C) paketleyin.

2. PBHSC'lerin dondurularak saklanması ve geri kazanılması

  1. CPA ve TCPA hazırlama ve karıştırma
    1. Bir buz platformunu 2-8 °C'ye kadar önceden soğutun. Hematopoietik kök hücre CPA ve TCPA'yı üretici yönergelerine göre çözün (CPA / TCPA bileşimleri için Tablo 1'e bakınız).
    2. CPA ve TCPA'yı buz platformunda 1:1 hacim oranında altı PBHSC numunesi ile karıştırın. Hücre süspansiyonunu steril kriyoviyallere aktarın.
  2. EBM kriyoprezervasyonu
    1. Kriyovialleri doğrudan -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Süspansiyondaki nihai DMSO konsantrasyonunun %2 (h/v) olduğundan emin olun. Numuneleri 1 ay boyunca saklayın.
  3. TCPA Kriyoprezervasyon (karşılaştırmalı kontrol)
    1. % 5 insan kanı albümini ve% 10 DMSO ( v / v) içeren TCPA'yı hazırlayın. PBHSC süspansiyonlarını kriyoviyallere yükleyin ve programlanabilir bir dondurucu kullanarak 1°C/dk'da -80 °C'ye soğutun.
    2. Kriyovialleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. Numuneleri 1 ay boyunca saklayın.
  4. Hücre resüsitasyonu
    1. Kriyovialleri 1 ay sonra alın. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hafif çalkalama ile (≤ 5 dakika) çözdürün.
    2. Artık CPA / TCPA'yı çıkarmak için 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Aşağı akış tahlilleri için önceden ısıtılmış RPMI 1640kültür ortamında 1 mL hücreyi yeniden süspanse edin.

3. Hücre canlılığı testi

  1. Görüntü tabanlı hücre sayımı
    1. 10 μg/mL akridin portakalı (AO) ve 10 μg/mL propidyum iyodür (PI) içeren karışık bir boyama solüsyonu hazırlayın.
    2. Steril bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL hücre süspansiyonunu 100 μL boyama solüsyonu (1: 1 oranında) ile karıştırın.
    3. Lekeli numuneden 10 μL'yi otomatik hücre sayacına yükleyin. Entegre yazılımı kullanarak hücre canlılığını analiz edin:
      canlılık = canlı hücreler / toplam hücreler x %100
  2. Akış sitometrisi doğrulaması
    1. Annexin V-FITC (5 μL) ve PI'yi (5 μL) 100 μL bağlayıcı tamponda karıştırarak Annexin V-FITC/PI boyama solüsyonunu hazırlayın.
    2. Boyama çözeltisine 300 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve karanlıkta 15 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
    3. Karışımı 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi25 kullanarak canlılığı analiz edin.

4. Koloni oluşturan test

  1. Hücre süspansiyonu hazırlığı
    1. Hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın ve canlı / ölü hücreleri ayırt etmek için 3 dakika inkübe edin. Canlı hücre yoğunluğunu belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanarak yinelenen sayımlar gerçekleştirin (%> canlılığı sağlayın). Hücre süspansiyon hacmini hedef konsantrasyona (1 x 106 hücre/mL) ayarlayın ve tek hücreli dağılımı sağlamak için 40 μm'lik bir süzgeçten süzün. Agregaları çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir steril hücre süzgecinden süzün.
  2. Orta karıştırma
    1. 15 mL konik bir tüpte (1:10 v/v) 1 mL hücre süspansiyonunu 9 mL ticari fare kolonisi oluşturan birim ortam ile birleştirin.
    2. Homojenliği sağlamak için karışımı 1.500 rpm'de 30 saniye boyunca vorteksleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için 10 saniye boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
  3. Hücre tohumlama ve nem kurulumu
    1. 1,5 mL kabarcıksız karışımı 35 mm'lik steril bir Petri kabına dağıtın. Nemi korumak için tabağın çevresel bir oluğuna 3 mL steril damıtılmış su ekleyin (veya tabak kapağının içine ayrı bir steril kap yerleştirin).
    2. Çanağı nemlendirilmiş bir odada kapatın (≥% 95 nem).
      1. Hazneyi hazırlamak için, kapaklı plastik bir kaba (örn. 15 cm Petri kabı) iki kat steril emici kağıt yerleştirin. Kağıdı doyurmak için 10 mL steril deiyonize su ekleyin. Lekeli kültür kabını, çanak ile ıslak kağıt arasında doğrudan temas olmadığından emin olacak şekilde haznenin ortasına yerleştirin. Hava geçirmez sızdırmazlık için şeffaf filmi kapak-kap bağlantısının etrafına 3 kez sarın. Alternatif olarak, kapak kenarlarını laboratuvar bandı ile sabitleyin. Nemi% 95'≥ dengelemek için kapalı odayı 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Koloni yetiştiriciliği ve sayımı
    1. Hücreleri 16 gün boyunca% 5 CO2 altında 37 ° C'de inkübe edin. 40x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hematopoietik kolonileri (küme başına ≥ 50 hücre) sayın. 1 x 104 tohumlu hücre başına koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) hesaplayın.

5. Mitokondriyal aktivite tespiti

  1. Rhodamine 123 ile hücre boyama
    1. PBHSC'leri 1 mL RPMI1640 ortamda 1 x 106 hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Rhodamine 123 boyasını 5-10 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Hücreleri %5CO2 içinde 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    2. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL taze RPMI1640 içinde yeniden süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
  2. Konfokal mikroskopi analizi
    1. Tozu veya kirleticileri temizlemek için temiz bir cam slaytı tüy bırakmayan kağıtla silin.
    2. Sinyallerin çakışmasını önlemek için PBS'deki lekeli PBHSC'leri uygun bir yoğunluğa yeniden askıya alın. 10-20 μL hücre süspansiyonunu pipetleyin ve yavaşça slaytın ortasına dağıtın.
    3. Lameli 45° açıyla eğin, bir kenarını damlacığa hafifçe dokundurun ve hava kabarcıklarını en aza indirmek için kademeli olarak indirin. Hücrelerin tek tabaka halinde eşit şekilde yayılmasını sağlamak için hafifçe bastırın.
    4. Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için slaydı karanlıkta 5 dakika boyunca yatay olarak yerleştirin. Hemen konfokal mikroskopi analizine geçin.
    5. Lekeli hücreleri bir cam slayt üzerine monte edin. Konfokal mikroskop kullanarak mitokondriyal dağılımı gözlemleyin (ex/em: 488/525 nm).
  3. Akış sitometrisi miktar tayini
    1. Bir akış sitometresi (FL1 kanalı) kullanarak Rhodamine 123 floresan yoğunluğunu analiz edin. Pozitif kontroller26 olarak hidrojen peroksit ile muamele edilmiş PBHSC'leri (1 mM, 1 saat) kullanın.

6. PBHSC'lerin hücre iskeleti boyaması

  1. Mikrofilament boyama (Actin Tracker Green-488)
    1. 5 U / mL'lik bir nihai konsantrasyonda PBS içinde çözülmüş AF488 konjuge phalloidin floresan probunu hazırlayın. Stok çözeltisini (metanol içinde 200 U / mL) 5 μL stoğu 195 μL PBS (1:40 seyreltme) ile karıştırarak seyreltin. Homojenliği sağlamak için 10 saniye boyunca iyice sarın.
    2. PBHSC'lere hazırlanan Actin Tracker Green-488 çalışma solüsyonundan (5 U / mL) 200 μL ekleyin. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
    3. Hücreleri 2x'i 1 mL immünoboyama yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Karanlıkta 25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 μL DAPI (1 μg / mL) ile çekirdekleri lekeleyin.
  2. Mikrotübül boyama (Tubulin Tracker Red)
    1. 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda PBS içinde çözülmüş kızılötesi konjuge bir paklitaksel floresan probu hazırlayın. 990 μL PBS'ye (1:100 seyreltme oranı) 10 μL stok ekleyerek stok çözeltisini (DMSO'da 100 μM) seyreltin. Homojenliği sağlamak ve ışıktan korumak için karışımı 10 saniye boyunca vorteksleyin.
    2. Tubulin Tracker Red çalışma solüsyonunu tam ortamda 250 nM'lik bir nihai konsantrasyonda hazırlayın. 997.5 μL ortama (1:400 seyreltme oranı) 2.5 μL stok ekleyerek stok çözeltisini (DMSO'da 1 mM) seyreltin. Karışımı 10 saniye boyunca vorteksleyin ve PBHSC'lere 200 μL ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
    3. Hücreleri 1 mL immün boyama yıkama tamponu ile 2x yıkayın. Karanlıkta 25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 μL DAPI (1 μg / mL) ile çekirdekleri lekeleyin.
  3. Montaj ve mikroskopi
    1. Lekeli hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın. Lekeli hücreleri 1: 1 hacim oranında% 90 gliserol-PBS çözeltisi (% 90 gliserol ve% 10 PBS, v / v) ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini bir cam slayt üzerine pipetleyin. Lameli 45° eğin ve hava kabarcıklarını önlemek için kademeli olarak indirin.
    2. Bir floresan mikroskobu kullanarak aktin / mikrotübül morfolojisini analiz edin (Aktin Yeşili için 488 nm uyarma; Tübül Kırmızısı için 561 nm). Pozitif kontrolleri dahil edin: Aktin bozulması için sitokalasin B ile muamele edilen PBHSC'ler (5 μM, 2 saat) ve mikrotübül depolimerizasyonu için Kolşisin ile muamele edilen PBHSC'ler (10 μM, 3 saat).

7. CPA güvenlik değerlendirmeleri

  1. Hemoliz testi
    1. EDTA ile antikoagüle edilmiş taze kan kullanarak% 2 tavşan kırmızı kan hücresi süspansiyonu hazırlayın.
    2. Cam tüplerde 2.5 mL hücre süspansiyonuna CPA (0.1-0.5 mL) ve fizyolojik salin (2.0-2.4 mL) ekleyin.
    3. Negatif kontrol olarak tuzlu su ve pozitif kontrol olarak sterilize su kullanın. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin ve mikroskop altında hemoliz / pıhtılaşmayı gözlemleyin.
  2. Sistemik alerji testi
    1. Hayvan hazırlama
      1. 4-5 haftalık 36 SPF Hartley kobay (%50 erkek, 271-307 g; %50 dişi, 270-301 g) kullanın. Aşağıdaki muhafaza koşullarını koruyun: Sıcaklık: 16-26 °C (günlük ± 4 °C dalgalanma), Nem: %40-%70, Havalandırma: 8-10 hava değişimi/saat, Işık döngüsü: 12 saat aydınlık/karanlık
    2. Duyarlılık aşaması
      1. CPA'yı periton boşluğunun sol alt çeyreğine 2, 6 ve 3. günlerde 3 mL / kg (yüksek) veya 5 mL / kg (yüksek) olarak enjekte edin. Düşük doz (2 mL / kg) klinik maruziyet seviyelerini simüle ederken, yüksek doz (6 mL / kg), sistemik alerji testi için OECD Yönergesi 406'yı takiben doza bağlı aşırı duyarlılığı değerlendirmek için 3x güvenlik marjını temsil eder27,28.
      2. İnsan serum albümini (pozitif kontrol) ve salin (negatif kontrol) kullanın.
    3. Meydan okuma aşaması
      1. CPA'yı 19. ve 26. günlerde marjinal kulak damarından 4 mL / kg (düşük) veya 12 mL / kg (yüksek) intravenöz olarak uygulayın. Meydan okuma dozları (2x duyarlılaştırma dozları), kriyoprotektan biyouyumluluk29 ile ilgili önceki çalışmalarda doğrulandığı gibi, önceden duyarlılaştırılmış kobaylarda anafilaksiyi provoke etmek için yerleşik protokollerle uyumludur.
      2. Enjeksiyondan sonra 1 saat boyunca anafilaksi semptomlarını (solunum sıkıntısı, konvülsiyonlar) izleyin.
    4. Deney sonrası işleme
      1. Gine domuzlarını 72 saat gözlem için veteriner bakımına geri koyun. İzofluran anestezisi altında abdominal aort ekskanguiasyonu kullanarak ötenazi yapın.
  3. Akut sistemik toksisite testi
    1. Fare enjeksiyonu
      1. 10 erkek ICR faresinin (32.0-37.1 g, 6 haftalık) kuyruk damarına 50 mL / kg CPA enjekte edin. Salin enjekte edilen fareleri negatif kontroller olarak kullanın (n = 10).
    2. Gözlem protokolü
      1. Enjeksiyondan 4, 24, 48 ve 72 saat sonra sağkalımı, toksisite belirtilerini ve ağırlığı izleyin. Muhafaza koşullarını koruyun: Sıcaklık: 20-25 °C (günlük ± 3 °C), Nem: %40-%70, Havalandırma: 10-20 hava değişimi/saat.
    3. Ötanazi
      1. Fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun. Abdominal aort ekskanguiasyonu ile ötenazi yapın.
  4. Vasküler irritasyon testi
    1. Tavşan yönetimi
      1. 6 erkek Yeni Zelanda tavşanı (3.65-4.36 kg, 7-8 aylık) kullanın. Haftada sağ kulak damarına 5 mL / kg CPA enjekte edin (toplam 3 doz). Negatif kontrol olarak sol kulağa salin enjekte edin.
    2. Doku değerlendirmesi
      1. 18-19. günlerde enjeksiyon bölgelerini eritem, ödem veya nekroz açısından inceleyin. Eritem, ödem ve nekroz şiddetine bağlı olarak enjeksiyon bölgesi tahrişini puanlayın. ISO 10993-12 puanlama sistemini 0 (reaksiyon yok) ile 4 (şiddetli nekroz) arasında değişen derecelerle uygulayın30,31.
    3. Deney sonrası işleme
      1. Tavşanları tiletamin-zolazepam (5 mg / kg, IM) ile uyuşturun. Hızlı karotis arter kan alımını kullanarak ötenazi yapın.

8. PBHSC nakli

  1. Hasta kaydı ve mobilizasyonu
    1. Transplantasyon kriterlerini karşılayan altı hastayı kaydedin: Mononükleer hücreler ≥ 5 x 108 hücre/kg
      CD34+ hücreleri ≥ 2 x 106 hücre/kg23. <18 veya >65 yaş arası hastaları, aktif enfeksiyonları, ciddi organ fonksiyon bozukluğu, hamilelik / emzirme, son immünosupresif tedavi (4 hafta içinde) veya kontrolsüz psikiyatrik bozuklukları olanları hariç tutun.
    2. Granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) kullanarak hematopoietik kök hücreleri kemik iliğinden periferik kana mobilize edin. Hematopoietik kök hücreleri, granülosit koloni uyarıcı faktörü art arda 5 gün boyunca günde 10 μg / kg'lık bir dozda deri altından uygulayarak (Kesin doz kişiden kişiye değişir) kemik iliğinden periferik kana mobilize edin.
  2. PBHSC'lerin toplanması ve kriyoprezervasyonu
    1. Kan akış hızı 40 mL / dak olarak ayarlanmış ve antikoagülan-tam kan oranı 1:12 olan bir aferez cihazı kullanarak mobilize PBHSC'leri toplayın. 180-200 mL PBHSC konsantresi elde etmek için seans başına 15-16 L tam kan işleyin. Numuneyi iki alikota bölün ve her poşetin kapasitesi 90-100 mL'dir.
    2. Klinik transfüzyon için ilk alikotu %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ve %5 insan serum albümininde yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınmış alikotu -1 °C/dk ila -80 °C soğutma hızına sahip programlanabilir bir dondurma kabına yerleştirin. Kriyotorbayı hasta kimliği ve dondurma parametreleri (örn. parti numarası, tarih) ile etiketleyin. Canlılık testi için ikinci alikotu %5 DMSO ve %10 fetal sığır serumunda hazırlayın.
  3. Çözülme ve reinfüzyon
    1. Dondurularak saklanmış PBHSC'leri 37 °C su banyosunda (≤ 2 dakika) çözdürün. Kemoterapi / radyoterapi koşullandırmasından sonra çözülmüş hücreleri intravenöz olarak uygulayın. Hücreleri, 3-5 mL / dk'da bir şırınga pompası kullanarak çözülmeden sonraki 30 dakika içinde merkezi venöz kateter yoluyla intravenöz olarak uygulayın.
  4. Transplantasyon sonrası izleme
    1. Günlük kan sayımına göre hematopoietik iyileşmeyi takip edin: Nötrofil başarı eşiği: ≥ 0.5 x 109 hücre / L; trombosit başarı eşiği: ≥ 20 x 109 hücre/L32.
    2. Lenfosit alt kümesi analizi ile immün sulandırmayı izleyin. EDTA tüplerinde 5 mL periferik kan örneği toplayın. Karanlıkta 15 dakika boyunca CD3, CD4, CD8, CD19 ve CD56'ya karşı floresan antikorlarla hücreleri boyayın. Bir akış sitometresi ve standartlaştırılmış bir geçit stratejisi kullanarak lenfosit alt kümelerini analiz edin. Yorumlama için mutlak sayıları (hücreler/μL) yaşa uygun sağlıklı referans aralıklarıyla karşılaştırın.

9. PBHSC'lerin alt popülasyon analizi

  1. Antikor boyama
    1. Dondurulmuş PBHSC'leri (CPA/TCPA grupları) hazırlayın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
    2. Floresan antikorları olan hücreleri etiketleyin: CLP: CD45-CD34 + CD10 + (HI30 + 4H11 + HI10a klonları); MEP: CD45-CD38 + CD135-CD45RA- (HIT2 + 4G8 + 5F3 + HI100 klonları); GMP: CD45-CD38 + CD135 + CD45RA + (Şekil 1). Kriyoprezervasyon ajanlarını çıkarmak için santrifüj edilmiş PBHSC'leri 5 dakika boyunca 300 x g'da çözdürün. % 2 fetal sığır serumu içeren PBS'de hücre konsantrasyonunu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
    3. Üretici tarafından önerilen titrelerde CLP için HI30 / 4H11 / HI10a ve MEP / GMP için HIT2 / 4G8 / 5F3 / HI100 klonlarını kullanarak antikor kokteylleri hazırlayın. Hücreleri antikor karışımları ile karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir hafif girdap ile inkübe edin. Lekeli hücreleri 2 kez soğuk PBS +% 0.1 sodyum azid ile 200 x g'da 3 dakika santrifüjleme kullanarak yıkayın. Akış sitometrisi analizinden önce canlılık kapısı için hücreleri 1 μg / mL DAPI ile 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
    4. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. % 1 BSA içeren PBS ile 2 kez yıkayın.
  2. Akış sitometrisi kurulumu
    1. Lekeli hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir akış sitometresi kullanarak alt popülasyonları analiz edin: Lazerleri (488 nm, 640 nm) ve filtreleri (FITC, PE, APC) yapılandırın. Örnek başına 10.000'≥ fazla olay toplayın.
    2. İleri/yan saçılma ve floresan yoğunluğuna dayalı kapı popülasyonları (Şekil 1).
  3. Veri karşılaştırması
    1. FlowJo v10.8 yazılımını kullanarak CLP/MEP/GMP yüzdelerini hesaplayın. Student'ın t-testini kullanarak EBM ile TCPA gruplarını karşılaştırın (α = 0.05). Prism 9.0 (SEM ile çubuk grafikler) kullanarak farklılıkları görselleştirin33.

10. İstatistiksel analiz

  1. T testini kullanarak normal dağılıma uyan sürekli sayısal değişkenlerin ortalamalarını ki-kare varyansla karşılaştırın ve normal dağılıma uymayan sürekli sayısal değişkenler için bunları parametrik olmayan bir şekilde test edin.
  2. Sürekli değişkenler için verileri ortalama ± standart sapma veya medyan ile üst ve alt dörttebirler olarak raporlayın. İki grup arasındaki oranları karşılaştırmak için Fisher'ın kesin testini kullanın.
  3. SPSS 26.0 ve GraphPad Prism 9 yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve çizim yapın. İki kuyruklu testlerdeki tüm farklılıkları p < 0.05 ise istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün. Verilerin bir kısmı istatistiksel açıklamalar şeklinde sunulmaktadır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek adımlı kriyoprezervasyon ve sıvı nitrojen kriyoprezervasyon yöntemlerinin karşılaştırılması
Dondurularak saklanmış PBHSC'lerin iyileşme sonrası canlılığı, AO / PI testleri kullanılarak değerlendirildi. Şekil 2A'da






figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

figure-results-8

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, PBHSC'lerin dondurularak saklanması için yeni bir CPA'yı değerlendirdik. Sonuçlar, CPA'nın TCPA'ya kıyasla PBHSC'lerin korunmuş canlılığını artırdığını göstermektedir. Spesifik olarak, CPA ile korunan PBHSC'lerin kurtarma canlılığı, TCPA'nınkini %10'dan fazla aştı. Kök hücrelerde, hücre iskeletinin bütünlüğü, kök hücrelerin aktivitesinin ve farklılaşma fonksiyonunun sürdürülmesi için temel gerekliliktir35,36. Hücresel düzeyde, CPA ile korunan PBHSC'lerdeki hem mikrofilament hem de mikrotübül yapılarının, TCPA grubuna göre daha sağlam olduğunu ve özellikle daha net mikrotübül yapılarına sahip olduğunu gözlemledik. Mitokondri, hücrelerin enerji fabrikasıdır. Mitokondri, hücre aktivitesini sürdürmek için gerekli organeller olan hücre solunumu, metabolizması ve diğer yaşam aktivitelerinde doğrudan rol oynar37. Mitokondriyal aktivite, kriyoprezervasyon ve iyileşmeyi takiben hematopoietik kök hücre fonksiyonunun çok önemli bir göstergesidir. Mitokondriyal aktivite açısından, CPA grubu taze PBHSC'lerle benzerlikler sergiledi. Mitokondriyal komplekslerin doğrudan gözlemlenmesi, CPA grubundaki sayılarının TCPA grubundakini aştığını ortaya koydu. Ayrıca, her grupta korunmuş mitokondriyal aktiviteyi kantitatif olarak değerlendirmek için akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, CPA ve taze hücre grupları arasında anlamlı bir fark göstermedi, ancak CPA grubunda aktivite, TCPA grubuna kıyasla% 8.5 daha yüksekti. Mitokondriyal aktivite verilerinin bu karşılaştırması, hücre geri kazanım canlılık bulgularını doğrulamaktadır. Ek olarak, koloni oluşumu deneyleri, CPA ile korunan PBHSC'lerin farklılaşma potansiyellerini koruduğunu göstermiştir. CPA grubu, indüksiyon sonrası daha fazla sayıda koloni sergiledi ve bu da CPA'nın üstün koruma etkinliğini daha da doğruladı.

Bu çalışmanın amacı, koruma sonrası PBHSC'lerin aktivitesini iyileştirmek ve transplantasyonun başarı oranını sağlamak için CPA'yı klinik HSCT'ye uygulamaktır. CPA'yı klinik araştırmalara uygulamadan önce, deney hayvanlarında güvenlik değerlendirmeleri yapıldı ve klinik uygulamada CPA'nın güvenliği için veri desteği sağlandı. Önceki çalışmalar, bazı yeni CPA'nın endotel hücreleri (MHECT-5) ve embriyolar için en iyi kriyoprezervasyon teknolojisi olarak tanımlandığını göstermiştir38,39. PBHSC'lerin korunması için bir CPA'nın klinik uygulamasında, HSCT için altı hastadan PBHSC'leri başarıyla dondurduk. Özellikle, CPA kullanan tek adımlı kriyoprezervasyon yöntemi, numune koruma sürecini önemli ölçüde kolaylaştırdı. Bu yöntem, hematopoietik kök hücreler için daha önce bildirilen tek aşamalı kriyoprezervasyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, klinik uygulamalar için önemli bir ilerleme olan daha düşük bir DMSO konsantrasyonu kullanmıştır. Altı hastadan beşi başarılı bir şekilde transplantasyon geçirdi. Kalan hastaya hastalığın tekrarlaması nedeniyle alternatif tedavi uygulandı. Transplantasyonu tamamlanan beş hasta için fonksiyonel rekonstrüksiyon döngüsünün istatistiksel bir değerlendirmesini yaptık. Enfeksiyon nedeniyle rekonstrüksiyon döngüsünün uzadığı bir vaka dışında, hematopoetik ve immün fonksiyonların yeniden yapılandırılması için ortalama süre 11 gündü ve bu, önceki literatürde belirtilen 12.5 günden daha hızlıydı. En önemlisi, nakil işlemi sırasında herhangi bir toksisite gözlenmedi. Bu sonuç, CPA yöntemindeki nihai DMSO konsantrasyonunun, TCPA yönteminde kullanılan %10 (h/h) konsantrasyona kıyasla sadece %2 olduğu düşünüldüğünde özellikle dikkat çekicidir. Yan etkileri en aza indirmek için CPA'da daha düşük bir DMSO konsantrasyonunun bu başarılı kullanımı stratejimizi doğrular ve klinik etkinlik için hayati önem taşır.

Çalışmamızda gözlenen hızlandırılmış fonksiyonel sulandırma ışığında, transfüzyon yapılan CD34 + hücre sayılarındaki potansiyel farklılıkları daha fazla araştırdık. İstatistiksel analiz, transfüzyon yapılan CD34 + hücre sayısının ortalama olarak 2.4 x 106 hücre / kg olduğunu ortaya koydu, bu da önceki literatürde bildirilen rakamlardandaha düşük 40. Bu, CPA'nın hematopoietik ve immün rekonstitüsyon için çok önemli olan PBHSC'ler içindeki belirli alt popülasyonlara üstün koruma sağlayabileceğini varsaymamıza neden oldu. Bu hipotezi araştırmak için, hem CPA hem de TCPA ile korunan PBHSC'lerde CLP, GMP ve MEP alt popülasyonlarının ayrıntılı bir analizini yaptık. Sonuç, CPA ile korunan PBHSC'lerdeki CLP ve MEP alt popülasyonlarının, TCPA ile korunanlara kıyasla arttığını, GMP'nin alt popülasyonunda ise anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. CLP, insan vücudunda T hücreleri, B hücreleri ve NK hücrelerine farklılaşabilir; artan bir CLP dozu bağışıklık sistemini hızlandırabilir33. MEP, eritrositlere ve trombositlere farklılaşabilir41. CPA'daki sodyum gliserofosfat, gliserofosfat mekiği yoluyla mitokondriyal ATP sentezini artırarak kriyoprezervasyonun neden olduğu enerji eksikliklerini giderir. Bu, lenfoid farklılaşma için glikolize dayanan CLP hücreleri için kritiktir42. Ek olarak, TCPA canlılığının yüksek standart sapması, CPA'nınkinden daha yüksekti (7.47'ye karşı 2.72, Şekil 3), bu da kararsız donma koşullarından kaynaklanabilecek TCPA sonuçlarının değişkenliğini gösteriyor. Bu nedenle, CLP ve MEP'in daha iyi korunmasının, hematopoietik ve immün fonksiyon için iyileşme süresini kısaltmada kritik bir faktör olabileceğini öneriyoruz. CPA'nın CLP ve MEP alt grupları üzerindeki üstün koruyucu etkileri, klinik transfüzyon tedavileri sırasında daha hızlı fonksiyonel rekonstrüksiyonu kolaylaştırıyor gibi görünmektedir. Bu sadece terapötik sonuçları iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda transplantasyon geçiren hastalar için tedavi süresini ve maliyetini de azaltır. Özünde, yöntemimiz HSCT için daha ekonomik bir yaklaşım sunarak hasta bakımının hem klinik hem de ekonomik yönlerini optimize eder.

DMSO'nun yerini alabilecek maddeleri belirlemek için devam eden araştırma çabalarına rağmen, alternatif arayışı zorlu olmaya devam etmektedir. Bu alanda ortaya çıkan yeni teknolojilerin ve maddelerin raporları olmasına rağmen43,44, bu yeni bileşikler için titiz in vitro güvenlik gösterileri hala eksiktir. Benzer şekilde, özellikle safsızlıkların incelenmesi ile ilgili olarak, klinik kullanım için güvenliklerini ve etkinliklerini doğrulamak için yeterli kanıt yoktur. Bu nedenle, ortaya çıkan bu maddeler, klinik ortamlarda uygulanmadan önce kapsamlı bir doğrulama gerektirir. Bu bağlamda, DMSO kullanımını optimize etmenin, etkili hücre korumasını sağlarken, klinik uygulamalar için en uygun strateji olmaya devam ettiğine inanıyoruz. Önceki çalışmalar, ATP üretiminde ve hücreler içindeki mitokondriyal aktivitenin düzenlenmesinde gliserofosfat geçişinin rolünü vurgulamıştır45,46. Bu anlayışa dayanarak, sodyum gliserofosfatın CPA'ya dahil edilmesinin, geleneksel olarak TCPA'da ozmotik bir koruyucu ajan olarak kullanılan DMSO'nun önemli bir bölümünün yerini almak için etkili bir strateji olarak hizmet edebileceğini öneriyoruz. Düşük dimetil sülfoksit alternatifleri üzerine son araştırmalardan söz edilmiyor, bu da bu yöntemde bazı yenilikler olduğunu gösteriyor.

Genel olarak, kriyoprezervasyon protokolümüzdeki önemli adımlar şunları içerir: (i) %2 (h/h)'de hassas DMSO konsantrasyon kontrolü, (ii) -1 °C/dk'lık kontrollü soğutma hızı ve (iii) 37 °C'lik bir su banyosunda hızlı çözdürme. Bu adımlar minimum ozmotik stres ve buz kristali oluşumunu sağlar. Özellikle, azaltılmış DMSO konsantrasyonu, geleneksel% 10 DMSO çözeltileri47 ile ilişkili sitotoksisite endişelerini doğrudan ele alır. Kontrollü soğutma, mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyonunda48 doğrulandığı gibi hücre içi buz hasarını önlerken, hızlı çözülme, çözülme sonrası canlılık için kritik bir faktör olan mitokondriyal fonksiyonu korur49. Üç yönü optimize ettik: (i) Karıştırma yöntemi: İlk denemeler, CPA ilavesi sırasında hücre agregasyonunu ortaya çıkardı; 500 rpm'de girdap ile damla damla karıştırmaya geçmek, topaklanmayı ortadan kaldırdı. (ii) Boyama protokolü:% 0.05 Tween-20 içeren PBS ile ön yıkama hücreleri, antikor penetrasyon verimliliğini% 18 artırdı. (iii) Çözülme tutarlılığı: Standartlaştırılmış bir 120 s çözülme penceresinin uygulanması, geri kazanım oranlarındaki değişkenliği önledi (pilot çalışmalarda %2'ye karşı %± ± %7). Düşük koloni sayımları, MethoCult orta hacminin 2 mL/çanak'a çıkarılması ve nem kontrolü (%>95) gibi yaygın sorunlar için bu sorunu çözdü ve hematopoietik progenitör kültür standartları50 ile uyumlu hale geldi. İki sınırlama dikkat gerektirir: (i) Alt popülasyon yanlılığı: CPA, CLP ve MEP alt kümelerini etkili bir şekilde korurken, CD34 + CD38-CD90 + uzun vadeli HSC'ler gibi nadir popülasyonlar, yeni kontrollere göre% 12 daha düşük iyileşme gösterir (p = 0.03). (ii) Nitel görüntülere dayanan hücre iskeleti bütünlüğünün değerlendirilmesi için, bazı nicel metrikler (örneğin, floresan yoğunluğu, yapısal skorlar) daha güvenilir analizlere dahil edilmelidir. CPA yöntemimiz mevcut uygulamaları şu yollarla ilerletmektedir: (i) Güvenlik geliştirmesi: Çözülme sonrası 24 saat sonra hemoliz oranları %8,2'den (TCPA) %1,5'e (CPA) düşmüştür (p < 0,001). (ii) Fonksiyonel üstünlük: CPA ile korunan hücreler, çok soylu aşılama için kritik olan TCPA'ya kıyasla %23 daha yüksek CFU-GEMM koloni oluşumu gösterdi51. (iii) Klinik verimlilik: 2.4 x 106 CD34 + hücre / kg ile nakil başarısı (literatür standardı ≥ 4 x 106'ya kıyasla) potansiyelin arttığını göstermektedir. Bu teknoloji aşağıdakiler için umut vaat ediyor: (i) Gen modifiye HSC depolama: CPA'nın mitokondriyal koruması, kriyoprezervasyon52 sırasında CRISPR ile düzenlenmiş hücreleri stabilize edebilir. (ii) Organoid bankacılık: Ön veriler, CPA ile korunan bağırsak organoidlerinde %89 canlılık gösterirken, TCPA'da %54 (n=3). (iii) Küresel dağıtım ağları: Daha düşük DMSO içeriği, faz değiştiren malzemeler53 kullanılarak ortam sıcaklığında taşıma denemelerine olanak tanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Nanshan Bölgesi Tıbbi Anahtar Disiplini İnşaat Mali Destek Projesi, Shenzhen Nanshan Bölgesi Sağlık Sistemi Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi (No. NSZD2023018) ve NHC Nükleer Teknoloji Tıbbi Dönüşüm Anahtar Laboratuvarı (Mianyang Merkez Hastanesi; Hibe No.2023HYX033).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm hücre kültürü kabıLABSELECT12111
Akridin Portakal/PROPIDIUM İYODÜRCountstarGMS10139.10
Aktin-İzleyici Yeşil-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Masaüstü Otomatik Görüntü SitometresiCountstarRigel-S2
Hücre Koruma Çözümü XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
KolşisinPekin Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Konfokal Lazer Tarama MikroskobuZeissLSM880
Cytochalasin BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI Boyama KitiBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Akış SitometresiBDFACSLSRFortessa
Gliserolü   AMRESCO854
İnsan albüminiSenBeiJia Biyolojik Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Hidrojen peroksitSigma-AldrichH1009
İmmün Boyama Yıkama TamponuBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Ters MikroskopNikon CorporationECLIPSE Ti Invitrogen
Tubulin Tracker Koyu KırmızıThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL teknolojileri4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Fizyolojik tuzluPekin Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Propidyum İyodürBDBDB556463
Rhodamine 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 İnkübatörüThermo Fisher Scientific371
Vorteks KarıştırıcıNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Periferik Kan K k H creleriK k H cre KriyoprezervasyonuOtolog K k H cre TransplantasyonuH cre Canl l k AnaliziMitokondriyal AktiviteKoloni Olu turma AnaliziSitoskeletal B t nl kS v Azot ile DondurmaDimetil S lfoksit Toksisitesi
Video yakında

İlgili makaleler