Ana hatlarıyla belirtilen protokol, yalnızca Escherichia coli'deki bu eksojen DNA'lar üzerinde mutasyonlar üretirken herhangi bir eksojen DNA'yı tanımak için kolaylaştırılmış yöntemleri açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ana hatlarıyla belirtilen protokol, yalnızca Escherichia coli'deki bu eksojen DNA'lar üzerinde mutasyonlar üretirken herhangi bir eksojen DNA'yı tanımak için kolaylaştırılmış yöntemleri açıklar.
Mutajenez teknolojileri, varyasyon ıslahı, yönlendirilmiş evrim ve protein mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çoğu yöntem yalnızca kontrol edilemeyen rastgele genomik DNA mutasyonlarını indükleyebilir, bu da deformitelere ve hatta ölümcül etkilere yol açabilir. Burada, üç sistemin füzyonundan yararlanarak: sitozin baz editörü (CBE), mavi ışıkla indüklenebilir p-Mag/n-Mag elementleri ve bölünmüş T7 RNA polimeraz, bu ana hatlarıyla belirtilen yöntem, mavi ışıkla kontrol edilebilir, DNA bölgesine özgü, yarı rastgele bir mutajenez sistemi içerir.
Bu sistem, T7 promotöründen başlayan ve T7 sonlandırıcısında biten DNA'lar üzerinde sitozini timine mutasyona uğratabilir. T7 promotörün aşağı akışındaki herhangi bir eksojen gen potansiyel olarak mutasyona uğrayabilir. Bu araçlar ayrıca sistemi mavi ışıkla kontrol edilebilir hale getirmek için iki parça halinde tasarlanmıştır. İlk kısım, CBE'nin n-Mag ve N-terminal-T7 RNA polimeraz geni ile kaynaştırılmasıyla oluşturuldu. İkinci kısım, p-Mag'in C-terminal-T7 RNA polimeraz ile kaynaştırılmasını içeriyordu. Mavi ışık altında, bu iki parça, T7 promotörü ve T7 sonlandırıcısı arasındaki DNA'lar üzerinde bir mutasyon jeneratörü olarak işlev görecek şekilde birleştirildi. Mavi ışık olmadan, p-Mag, n-Mag'den ayrılır ve CBE'nin DNA'yı düzenlemesini serbest bırakır.
Bu protokolün amacı, mavi ışık kontrolü ile Escherichia coli'de bölgeye özgü rastgele mutasyonlar oluşturmak ve mutasyona uğramış plazmitleri daha fazla doğrulamaktır. Sistem, ilgilenilen genin işlevinin seçilebildiği ve daha fazla çalışma için istenen mutasyonların toplanabildiği bir in vivo evrim sistemine uyarlanabilir.
Rastgele mutasyon ve doğal seçilim, türler arasında büyük genetik çeşitlilik yaratan evrimi yönlendiren temel güçlerdir. Evrimsel süreç, optimize edilmiş veya yeni işlevlere sahip proteinleri tasarlamak için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır1. DNA replikasyonundan kaynaklanan doğal mutasyon oranlarının, çoklu prokaryotlarda ve ökaryotlarda hücre bölünmesi başına yaklaşık 109 bazda bir olduğu tahmin edilmektedir2. Düşük doğal mutasyon oranları, laboratuvarlarda büyük genetik çeşitlilik oluşturmayı pratik hale getirir. Çalışmalar, belirli bir gende makul bir süre içinde mümkü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Aşağıdaki protokol, CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenez sistemi kullanılarak eksojen DNA mutajenez tasarımının nasıl gerçekleştirileceğini özetlemektedir (Adım 1). Eksojen DNA plazmidi oluşturulduktan sonra, izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek E. coli BL21 suşunda CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenezini eksprese etmek için iki plazmitin transformasyonu için adımlar açıklanmaktadır ve ardından mutajenezi başlatan mavi ışıkla ışınlama (Adım 2-9.2). GFP veya eksojen DNA'da kaç mutasyon üretildiğini değerlendirmek için kalite kontrol adımları, Sanger dizilemesi kullanılarak gerçekleştirildi (Adım 9.3-11.2).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokolde özetlenen yöntemler, bölünmüş bir CBE-Mag-T7 RNA polimeraz mutasyon jeneratörü kullanılarak eksojen DNA üzerinde mutasyonların oluşturulması içindir. CBE-Mag-T7 RNA polimeraz mutasyon sistemini oluşturmak için genler ve mutajenez için hedef genin tümü pET-11a plazmit omurgasına dahil edilmiştir. Başarılı transformasyon ve mavi ışık ışınlaması, bakteri genomik DNA'sına herhangi bir zarar vermeden gerçekleştirildi, LB-agar üzerindeki normal ve karşılaştırılabilir koloni sayıları ile gösterildi (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Polimeraz kılavuzlu baz düzenleme aracı ilk olarak Cravens ve ark. 2021'de bir protein füzyon stratejisi17 kullanılarak. Dört DNA nükleotidi üzerindeki mutasyonlar, bp başına 10-4 mutasyondan daha yüksek oranlarda başarıyla dahil edildi. Bununla birlikte, araştırmacılar18 tarafından ek kontrol olmaksızın T7 promotor ve sonlandırıcı arasında sürekli olarak mutasyonlar ortaya çıktığından, "iyi" mutasyonlar devam eden düzenlemeden k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL Konik Santrifüj Tüpleri | Doğan | CLS352070 | |
| Ampisilin | Thermo Scientific Kimyasallar | J60977.14 | |
| Mavi ışıklı ışınlayıcı | Thorlab'lar | LIU470A | |
| DNA Montaj Klonlama Kiti | NEB | E5520S | |
| DNA/Prmers sentezi | BGI Genomik | ||
| EndoFree Plazmid Midi Kiti | CWBIO'nun | CW2106S | Tampon P1: yeniden süspansiyon tamponu, Tampon P2: lizis tamponu, Tampon E3: dengeleme tamponu, Tampon PS: nötralizasyon tamponu, Tampon PW: yıkama tamponu, Endo-Free Tampon EB: DNA saflaştırma tamponu, RNase A Endo-Remover FM: endotoksin giderme tamponu, Toplama Tüplü Spin Kolonları DM |
| Gliserol | Fisher Kimyasal | G33-4 | |
| Kuluçkalanmış Çalkalayıcı | Termo Bilimsel | SK2001CPKG | |
| IPTG (izopropiltiyo-β-galaktosit) | Davetli | 15529019 | |
| Mikroplaka Okuyucu | Termo Bilimsel | Varioskan LUX | |
| Mikroskop | Leica | DMI 4000B | |
| Çoklu Skan FC | Thermo Scientific Kimyasallar | ||
| Tek Atış BL21(DE3) Kimyasal Olarak Yetkin E. coli | Davetli | C600003 | |
| PureLink Hızlı Düşük Endotoksinli Midi Plazmid Saflaştırma Kiti | Davetli | A36227 Serisi | |
| Pyrex Fenolik vidalı kapaklı ve kauçuk astarlı ağır hizmet tipi yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleri | Corning 8422 | CLS8422100 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında