Yöntem makalesi

Escherichia coli BL21 Suşunda Spesifik Eksojen DNA Üzerinde Mavi Işıkla İndüklenebilir Yarı Rastgele Mutajenez

DOI:

10.3791/68283

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ana hatlarıyla belirtilen protokol, yalnızca Escherichia coli'deki bu eksojen DNA'lar üzerinde mutasyonlar üretirken herhangi bir eksojen DNA'yı tanımak için kolaylaştırılmış yöntemleri açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutajenez teknolojileri, varyasyon ıslahı, yönlendirilmiş evrim ve protein mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çoğu yöntem yalnızca kontrol edilemeyen rastgele genomik DNA mutasyonlarını indükleyebilir, bu da deformitelere ve hatta ölümcül etkilere yol açabilir. Burada, üç sistemin füzyonundan yararlanarak: sitozin baz editörü (CBE), mavi ışıkla indüklenebilir p-Mag/n-Mag elementleri ve bölünmüş T7 RNA polimeraz, bu ana hatlarıyla belirtilen yöntem, mavi ışıkla kontrol edilebilir, DNA bölgesine özgü, yarı rastgele bir mutajenez sistemi içerir.

Bu sistem, T7 promotöründen başlayan ve T7 sonlandırıcısında biten DNA'lar üzerinde sitozini timine mutasyona uğratabilir. T7 promotörün aşağı akışındaki herhangi bir eksojen gen potansiyel olarak mutasyona uğrayabilir. Bu araçlar ayrıca sistemi mavi ışıkla kontrol edilebilir hale getirmek için iki parça halinde tasarlanmıştır. İlk kısım, CBE'nin n-Mag ve N-terminal-T7 RNA polimeraz geni ile kaynaştırılmasıyla oluşturuldu. İkinci kısım, p-Mag'in C-terminal-T7 RNA polimeraz ile kaynaştırılmasını içeriyordu. Mavi ışık altında, bu iki parça, T7 promotörü ve T7 sonlandırıcısı arasındaki DNA'lar üzerinde bir mutasyon jeneratörü olarak işlev görecek şekilde birleştirildi. Mavi ışık olmadan, p-Mag, n-Mag'den ayrılır ve CBE'nin DNA'yı düzenlemesini serbest bırakır.

Bu protokolün amacı, mavi ışık kontrolü ile Escherichia coli'de bölgeye özgü rastgele mutasyonlar oluşturmak ve mutasyona uğramış plazmitleri daha fazla doğrulamaktır. Sistem, ilgilenilen genin işlevinin seçilebildiği ve daha fazla çalışma için istenen mutasyonların toplanabildiği bir in vivo evrim sistemine uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rastgele mutasyon ve doğal seçilim, türler arasında büyük genetik çeşitlilik yaratan evrimi yönlendiren temel güçlerdir. Evrimsel süreç, optimize edilmiş veya yeni işlevlere sahip proteinleri tasarlamak için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır1. DNA replikasyonundan kaynaklanan doğal mutasyon oranlarının, çoklu prokaryotlarda ve ökaryotlarda hücre bölünmesi başına yaklaşık 109 bazda bir olduğu tahmin edilmektedir2. Düşük doğal mutasyon oranları, laboratuvarlarda büyük genetik çeşitlilik oluşturmayı pratik hale getirir. Çalışmalar, belirli bir gende makul bir süre içinde mümkün olduğu kadar çok bölgeyi kapsayacak şekilde mutasyon oranlarını artıran yöntemler geliştirmeye odaklanmıştır.

Laboratuvar evrim çalışmalarında daha yüksek mutasyon oranları elde etmek için çoklu sistemler geliştirilmiştir 3,4,5,6,7,8,9,10. İn vitro evrim sistemleri, ilgilenilen genlerdeki mutasyonları tanıtmak için hataya açık PCR, bölgeye yönelik doygunluk mutajenezi veya hesaplamalı kütüphane tasarımından yararlanır1. DNA kütüphaneleri, protein ürünlerinin tarandığı veya seçildiği konakçı hücrelere dönüştürülür. İn vitro evrimdeki mutajenez ve seleksiyon adımları, oluşturulabilecek popülasyonların verimliliğini ve ölçeğini sınırlayan bir araya getirilmemiştir11. İn vivo evrim sistemleri, hücrelere mutasyon sistemleri sokarak ve sürekli evrimi sağlamak için mutajenez ve seçilim adımlarını birleştirerek sınırlamaların üstesinden gelmiştir. Daha önce in vivo mutajenez yöntemlerinde kimyasal mutajenler 3,4 ve mutatör suşlar 5,6 kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük mutasyon oranlarından, kontrol eksikliğinden ve dar veya düzensiz mutasyon spektrumundan muzdariptir12. Son çalışmalar, ortogonal hataya eğilimli bir DNA replikasyon sistemi olan OrthoRep ile temsil edilen yeni ve iyileştirilmiş in vivo evrim sistemleri geliştirmiştir 7,8; Sitidin deaminaz ile T7 RNA polimeraz9 arasında bir füzyon olan MutaT7; ve nickase Cas9'un hataya eğilimli DNA polimeraz10'a bir füzyonu olan EvolvR. Bu yöntemler farklı konak hücrelere, hedef bağlama ve uygulama kolaylığına sahiptir.

MutaT7 sisteminin önemli bir bileşeni olan T7 RNA polimeraz (T7 RNAP), sentetik biyoloji alanında kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve tasarlanmıştır. T7 RNAP'ın parçaları, bir kaynak ayırıcı13 oluşturmak için farklı zaman noktalarında farklı seviyelerde birlikte ifade edilmiştir. AND mantık kapısı14'ü oluşturmak için farklı promotör özgüllüğüne sahip C-terminal parçalarına sahip bölünmüş bir T7 RNAP inşa edilmiştir. T7 RNAP fragmanlarının fonksiyonel bir polimerazı yeniden oluşturmak için bir araya gelme yeteneği, T7 RNAP'ın N ve C terminallerinin her birine kaynaşmış etkileşim ortaklarının dimerizasyonunun transkripsiyonel çıktı15 oluşturduğu hafif ve küçük molekülle aktive edilmiş biyosensörlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bölünmüş T7 RNAP, Escherichia coli16'da ışıkla indüklenebilir gen ekspresyon kontrolü oluşturmak için n-Mag ve p-Mag alanlarına da kaynaştırılmıştır. Mavi ışık aktivasyonu üzerine, Mıknatıs alanları dimerize olur ve bölünmüş T7 RNAP'ın iki alanını polimeraz işlevini yerine getirmek için uzamsal olarak yaklaştırır. Bu sistem, düşük bazal ekspresyon ve geniş bir dinamik aralık ile gen ekspresyonunun hassas uzay-zamansal kontrolünü sağlar.

Bu makale, mavi ışıkla kontrol edilebilir, in vivo, yarı rastgele mutajenez sistemi oluşturmak için bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). n-Mag-N-T1 RNAP ile kaynaşmış rAPOBEC7 deaminaz üzerine inşa edilmiştir. Aynı plazmitten p-Mag-C-T7 RNAP'ın birlikte ekspresyonu, polimerazın mavi ışık kontrolünü ve baz düzenleme aktivitelerini sağlar. Sistem, rAPOBEC1'in temel düzenleme kapasitesini ışık kontrollü bölünmüş T7 RNAP ile birleştirir. Hedef gen olarak yeşil floresan proteini (GFP) kullanılarak E. coli'de doğrulanmıştır ve yoğunluğu floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile seçilir. Orijinal MutaT7 sistemi ile karşılaştırıldığında, mavi ışık kontrollü sistemimiz, ışık aralığını modüle ederek hedef gende yarı rastgele mutasyonlar ortaya çıkarır. Hedef gendeki tüm sitozini urasil bazlarına dönüştürmek yerine, ışık kontrolü yoluyla nükleotidlerin bir alt kümesini düzenleyerek daha büyük bir mutasyon profili oluşturur. Sistem, GFP'nin diğer ilgili genlerle değiştirilebildiği ve fonksiyonun hücre uygunluğu veya sağkalımı ile seçilebildiği bir in vivo evrim sistemine kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol, CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenez sistemi kullanılarak eksojen DNA mutajenez tasarımının nasıl gerçekleştirileceğini özetlemektedir (Adım 1). Eksojen DNA plazmidi oluşturulduktan sonra, izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek E. coli BL21 suşunda CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenezini eksprese etmek için iki plazmitin transformasyonu için adımlar açıklanmaktadır ve ardından mutajenezi başlatan mavi ışıkla ışınlama (Adım 2-9.2). GFP veya eksojen DNA'da kaç mutasyon üretildiğini değerlendirmek için kalite kontrol adımları, Sanger dizilemesi kullanılarak gerçekleştirildi (Adım 9.3-11.2).

1. Eksojen DNA tasarlayın ve CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenez sistemini oluşturun

  1. Çevrimiçi araçları (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene veya https://www.uniprot.org/) kullanarak eksojen DNA veya cDNA dizilimini bulun.
    NOT: Burada, sitozin mutajenezi için eksojen bir DNA olarak GFP dizisini kullandık.
  2. Uygun bir klonlama kiti kullanarak gfp DNA'sını ilgilenilen DNA ile değiştirin.
    NOT: DNA kolonisi montaj kitindeki orijinal plazmiddeki gfp DNA'yı çıkarmak için NheI kullanıyoruz. Bir alternatif, DNA sentezi için şirketlerle çalışmaktır. Plazmid dizisi için Ek Dosya 1'e bakın.
  3. CBE-Mag-T7 polimeraz mutajenez sistemi ile birlikte tüm genleri sentezleyin ve bunları ampisilin direnci ile pET-11a omurgasına dahil edin.
    NOT: Bu plazmidi oluşturmak için bir DNA sentez şirketi ile çalıştık ve hedef plazmidimizi içeren gliserol stok bakterileri elde ettik.

2. Bakteriyel suş aktivasyonu

  1. 100 μg/mL ampisilin içeren bir LB agar plakasının kenarına 10 μL gliserol stok bakteri pipetleyin. Steril bir halka kullanarak bakterileri bu noktadan plaka boyunca sürün.
  2. Plakayı bir bakteri inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin.

3. Plazmit amplifikasyonu

  1. Plakadan tek bir koloni seçin ve 100 μg / mL ampisilin içeren 15 mL LB ortamı ile 50 mL konik bir tüpe aşılayın.
  2. Kültürü 37 °C'de, 180 rpm'de 14-16 saat çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin.

4. Plazmit ekstraksiyonu

  1. Gece boyunca 5-15 mL bakteri kültürünü alın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. 18.894 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  2. Bakteri peletini toplayın ve tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Bakteri peletini girdap veya pipetleme yoluyla 500 μL yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. Tüpe 500 μL lizis tamponu ekleyin, tüpü 8-10x ters çevirerek hafifçe karıştırın ve hücreleri parçalamak için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
    NOT: Görünür beyaz topaklaştırıcı malzeme kalmadığından emin olarak tam lizisi onaylayın.
  4. Bir toplama tüpüne yerleştirilen spin kolonuna 200 μL dengeleme tamponu ekleyin. 18.894 × g'da 2 dakika santrifüjleyin ve akışı atın. Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
  5. Bakteri lizatına 500 μL nötralizasyon tamponu ekleyin, beyaz bir çökelti görünene kadar tüpü 8-10x ters çevirerek hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  6. 18.894 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir filtre kolonuna aktarın. Çözeltiyi filtrelemek için 18.894 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  7. Filtrelenmiş çözeltiye 0.3 kat izopropanol ekleyin, ters çevirerek karıştırın. Karışımı dengelenmiş sıkma kolonuna aktarın.
  8. 1 dakika boyunca 18.894 × g'da santrifüjleyin, akışı atın ve sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
  9. Kolonu 750 μL yıkama tamponu ile yıkayın, 18.894 × g'da 1 dakika santrifüjleyin ve akışı atın.
  10. Kalan yıkama tamponunu çıkarmak için sütunu 18.894 × g'da 1 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
  11. Döndürme kolonunu yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Kolon zarının merkezine 100-200 μL elüsyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 2-5 dakika bekletin ve 18.894 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Plazmit DNA'yı -20 °C'de saklayın.

5. Plazmit transformasyonu (E. coli BL21 kimyasal olarak yetkin hücreler)

  1. Buz üzerinde 50 μL çözülmüş BL21 kimyasal olarak yetkin hücre alın. Adım 4.11'den 2 μL plazmit DNA ekleyin ve hafifçe karıştırın. 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  2. 42 °C'de 45 saniye boyunca ısı şoku, ardından tüpü hemen 2 dakika boyunca tekrar buza aktarın.
  3. Her tüpe 500 μL steril LB besiyeri ekleyin. İyileşmeyi sağlamak için 37 °C'de, 180 rpm'de 1 saat inkübe edin.
  4. 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, fazla süpernatanı atın ve yaklaşık 100 μL bırakın. Hücreleri ve plakayı 100 μg / mL ampisilin içeren LB agar üzerine yeniden süspanse edin. Gece boyunca 37 °C'de baş aşağı inkübe edin.

6. CBE-Mag-T7 polimeraz mutasyon üretecinin ifade edilmesi (aktif olmayan form)

  1. 5.1-5.4 adımlarını izleyin. Hücreleri yaymadan önce, ampisilin ile LB agarın yüzeyine eşit şekilde 1 mM IPTG uygulayın. IPTG ile muamele edilmiş gruplarla karşılaştırmak için kontrol olarak deiyonize su kullanın.
  2. Tüm koloniler büyüdükten sonra, fenolik vidalı kapaklı ve kauçuk astarlı 100 mL yuvarlak tabanlı cam tüplerde fenolik vidalı kapaklı ve kauçuk astarlı 1 mL IPTG içeren 5 mL LB ortamında kültüre almak için 10-20 koloni toplayın, 16 ° C'de, 8 saat boyunca 180 rpm'de.
    NOT: Tüm koloniler, 7. adıma geçmeden önce kısa süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.

7. CBE-Mag-T7 polimeraz mutasyon üretecini etkinleştirin

  1. Bakterileri fenolik vidalı kapaklı ve kauçuk astarlı 100 mL yuvarlak tabanlı cam tüplerde toplayın ve 18.894 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  2. Ortamı herhangi bir IPTG olmadan LB ortamı olarak değiştirin.
    NOT: Bu adım, CBE-Mag-T7 polimeraz mutasyon üretecinin kendini düzenleyemediğinden emin olmak için önemlidir. CBE-Mag-T7 polimeraz gen kümelerini korumak için lacI/O sistemini tasarladık.
  3. Önceden belirlenen süre boyunca 37 °C'de kültürleme yaparken plakayı bir mavi ışıklı ışınlayıcı (470 nm, 4 mW/cm2) ile ışınlayın. Mutasyonları doğrulamak için Sanger dizilimi yapın ve daha uzun süre maruz kalmanın mutasyon sıklığını artırıp artırmadığını kontrol edin.
    NOT: Burada mavi ışık pozlamasını 0, 8, 16 ve 24 saat olarak ayarladık.

8. Artan protein fonksiyonu ve devam eden mutajenez için mutasyonların seçimi

NOT: Burada, mutajenez için eksojen bir DNA olarak gfp genini kullanıyoruz ve GFP proteininin floresan yoğunluğunu artırabilecek mutasyonlar arıyoruz.

  1. Kolonileri seçin, pozisyonu bir plaka üzerinde etiketleyin ve toplanan kolonileri 100 μL ddH2O'ya aşılayın.
  2. 100 μL bakteriyel süspansiyonu 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve GFP yoğunluğunu Ex / Em = 488/510 nm'de okuyun.
  3. Bazı belirgin koloniler tanımlanana kadar 6.3 ila 9.2 arasındaki adımları tekrarlayın.

9. Mutajenezi durdurun ve mutasyonları doğrulayın

  1. Birkaç saat mavi ışık ışınlaması yaptıktan sonra, tüm bakterileri 15 dakika daha 4 °C'de karanlık bir yere geri taşıyın.
  2. Adım 4'te açıklandığı gibi aynı plazmit ekstraksiyon adımlarını izleyin.
  3. Sanger dizilimi için ileri ve geri primerleri tasarlayın.
    NOT: Burada, Sanger dizilimi için ileri astar olarak ATGGTGAGCAAGGGCGGAGCTGT ve ters astar olarak TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG kullanıyoruz.

10. Veri analizi ve mutasyon frekansı hesaplaması

  1. .ab1 dosyasını açarak mutasyonu görüntüleyin ve tepe noktalarını manuel olarak kontrol edin.
  2. Çevrimiçi araçları (örneğin, Mutation Surveyor aracı) kullanarak mutasyon sıklığını analiz edin.
  3. Sanger veri dosyasını çevrimiçi araca yükleyin ve mutasyon oranının analizine başlayın.

11. Bakteriyel gliserol stok hazırlama

  1. Tek bir koloniyi 100 μg / mL ampisilin ile 5 mL LB ortamı içeren bir tüpe aşılayın. 37 °C'de, 180 rpm'de 12-16 saat inkübe edin.
  2. Bakteri kültürünü 1:1 oranında %50 gliserol ile karıştırın. 1.5 mL santrifüj tüplerine alikot. -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde özetlenen yöntemler, bölünmüş bir CBE-Mag-T7 RNA polimeraz mutasyon jeneratörü kullanılarak eksojen DNA üzerinde mutasyonların oluşturulması içindir. CBE-Mag-T7 RNA polimeraz mutasyon sistemini oluşturmak için genler ve mutajenez için hedef genin tümü pET-11a plazmit omurgasına dahil edilmiştir. Başarılı transformasyon ve mavi ışık ışınlaması, bakteri genomik DNA'sına herhangi bir zarar vermeden gerçekleştirildi, LB-agar üzerindeki normal ve karşılaştırılabilir koloni sayıları ile gösterildi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimeraz kılavuzlu baz düzenleme aracı ilk olarak Cravens ve ark. 2021'de bir protein füzyon stratejisi17 kullanılarak. Dört DNA nükleotidi üzerindeki mutasyonlar, bp başına 10-4 mutasyondan daha yüksek oranlarda başarıyla dahil edildi. Bununla birlikte, araştırmacılar18 tarafından ek kontrol olmaksızın T7 promotor ve sonlandırıcı arasında sürekli olarak mutasyonlar ortaya çıktığından, "iyi" mutasyonlar devam eden düzenlemeden k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50 mL Konik Santrifüj TüpleriDoğanCLS352070
AmpisilinThermo Scientific KimyasallarJ60977.14
Mavi ışıklı ışınlayıcıThorlab'larLIU470A
DNA Montaj Klonlama Kiti NEBE5520S
DNA/Prmers senteziBGI Genomik
EndoFree Plazmid Midi Kiti CWBIO'nunCW2106STampon P1: yeniden süspansiyon tamponu, Tampon P2: lizis tamponu, Tampon E3: dengeleme tamponu, Tampon PS: nötralizasyon tamponu, Tampon PW: yıkama tamponu, Endo-Free Tampon EB: DNA saflaştırma tamponu, RNase A Endo-Remover FM: endotoksin giderme tamponu, Toplama Tüplü Spin Kolonları DM
GliserolFisher KimyasalG33-4
Kuluçkalanmış ÇalkalayıcıTermo BilimselSK2001CPKG
IPTG (izopropiltiyo-β-galaktosit)Davetli15529019
Mikroplaka OkuyucuTermo BilimselVarioskan LUX
Mikroskop LeicaDMI 4000B
Çoklu Skan FCThermo Scientific Kimyasallar
Tek Atış BL21(DE3) Kimyasal Olarak Yetkin E. coliDavetliC600003
PureLink Hızlı Düşük Endotoksinli Midi Plazmid Saflaştırma KitiDavetliA36227 Serisi
Pyrex  Fenolik vidalı kapaklı ve kauçuk astarlı ağır hizmet tipi yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleriCorning  8422CLS8422100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mavi I k MutajeneziSitozin Baz D zenleyiciT7 Promot r SistemiEksojen DNA MutasyonuProtein M hendisli iY nlendirilmi EvrimB lgeye zg MutajenezIn Vivo Evrim
Video yakında

İlgili makaleler