Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In Vitro H5N1'e Özgü Ördek T Hücreleri için Kültür ve İntrahücre İçi Sitokin Boyama Yöntemi ile İmmün Yanıtların Saptanması

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68291

⸱

30 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Protokol, enfekte ördeklerden bellek T hücrelerini izole ederek kuş T hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için bir yöntemi açıklar ve yüksek oranda saflaştırılmış spesifik ördek T hücrelerinin üretilmesine izin verir. Ek olarak, ördek T hücrelerinde IFN-γ sekresyonunu doğru bir şekilde ölçmek için hücre içi sitokin boyama (ICS) yöntemi oluşturulmuştur.

Özet

T hücrelerinin in vitro kültürü, immün yanıtları, viral enfeksiyonları ve potansiyel terapötik stratejileri incelemek için kritik bir yöntemdir. Bununla birlikte, kuş T hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için bugüne kadar belirlenmiş bir protokol bildirilmemiştir. Bu çalışmada, yüksek patojenik kuş gribi (HPAIV) H5N1 virüsünü model olarak kullanan bir protokolü ilk kez sunuyoruz. Burada, 4 haftalık ördekler virüsle enfekte edildi ve hafıza T lenfositleri, enfeksiyondan 28 gün sonra H5N1'e özgü ördek T lenfositlerini kültürlemek için izole edildi ve H5N1 virüsüne karşı spesifik bağışıklık tepkisinin araştırılmasını sağladı. Protokoldeki temel adımlar, enfekte ördeklerden bellek periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izole edilmesini, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) 6 saat boyunca optimal bir enfeksiyon çokluğu (MOI = 5) ile aktive edilmesini ve rekombinant IL-2 ve diğer spesifik katkı maddeleri ile desteklenmiş T hücre kültürü ortamının hazırlanmasını içerir. T hücresi proliferasyonu, sitokin sekresyonu ve sitotoksik aktivite süreç boyunca yakından izlendi. Ek olarak, ördek T hücrelerinde IFN-γ sekresyonunu ölçmek için hücre içi bir sitokin boyama protokolü oluşturduk. Bu, ördek IFN-γ'ye özgü IgG3κ antikorlarını eksprese eden bir hibridoma hücre hattının oluşturulmasını ve ardından başarılı antikor saflaştırılmasını içeriyordu. Saflaştırılmış antikor 1:10 oranında seyreltildi ve IFN-γ sekresyonunu hassas bir şekilde ölçmek için akış sitometrisinde uygulandı. Bu yöntem, ördek T hücresi yanıtlarını değerlendirmek için güvenilir bir araç sunar ve kuş viral immünolojisine yönelik gelecekteki araştırmalar için temel oluşturur.

Giriş

T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu, farklılaşması ve bellek T hücrelerine dönüştürülmesi süreci, antijene özgü bağışıklık tepkilerinin merkezinde yer alır1. Başlangıçta, T hücreleri, T hücresi reseptörleri (TCR), antijen sunan hücrelerin (APC'ler) yüzeyinde majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülleri tarafından sunulan antijenik peptitleri tanıdığında aktive edilir 2,3. Bu aktivasyon işlemi sadece TCR'nin MHC moleküllerine bağlanmasını değil, aynı zamanda T hücresi fonksiyonlarını tam olarak aktive etmek için çok önemli olan yardımcı uyarıcı sinyallerin koordinasyonunu da gerektirir4. Aktive edildikten sonra, T hücreleri hızla proliferasyon fazına girer ve orijinal T hücresi ile aynı antijen özgüllüğünü paylaşan çok sayıda klon üretir. Bu proliferasyon fazı sırasında, T hücreleri, işlevlerine bağlı olarak, öncelikle CD8 + T hücrelerine ve CD4 + T hücrelerine5 farklılaşır. Bu farklılaşmış hücreler sırasıyla sitotoksik öldürmeye aracılık eder ve bağışıklık tepkilerine yardımcı olur. İlk enfeksiyonu takiben, aktive edilmiş T hücrelerinin bir kısmı uzun ömürlü hafıza T hücrelerine dönüşür6. Bu bellek T hücreleri, bağışıklık sisteminde uzun süre kalabilir ve yeniden maruz kalma üzerine aynı patojene hızla yanıt verebilir. Sonuç olarak, konakçı için uzun süreli bağışıklık koruması sağlayarak daha güçlü ve daha verimli bir bağışıklık tepkisi oluştururlar7. Tüm bu süreç, aşı etkinliğini ve dayanıklılığını artırmaya yardımcı olduğu için T hücresi aşılarının tasarımı için kritik öneme sahiptir8.

Bu bağlamda, antijene özgü T hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi zorunlu hale gelir. Bu protokol, kuş bağışıklık sistemi için gerekli adaptasyonlarla birlikte insan T hücrelerinin in vitro kültürü için yerleşik yöntemlere dayalı olarak geliştirilmiştir9. Araştırmacılar, bu hücreleri vücudun dışında büyüterek, aktivasyon, proliferasyon, farklılaşma ve hafıza oluşumu gibi farklı bağışıklık durumları altında T hücresi tepkisini inceleyebilirler10. Bu in vitro yaklaşım, T hücrelerinin bağışıklık tepkilerinde oynadığı rolleri anlamak için paha biçilmezdir. Ayrıca, in vitro kültür koşulları altında, sitokinlerin (IFN-γ gibi) T hücreleri tarafından salgılanması izlenebilir11,12. Bu izleme, bağışıklık tepkilerinin kalitesini, yoğunluğunu ve kalıcılığını değerlendirmenin yanı sıra T hücreleri ile diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için çok önemlidir. Ek olarak, antijene özgü T hücrelerinin in vitro genişlemesi, büyük ölçekli zenginleştirmeyi mümkün kılar, algılama hassasiyetini artırır ve T hücresi yanıt seviyelerinindeğerlendirmesini geliştirir 13. Bu nedenle, antijene özgü T hücrelerinin in vitro kültürü, kanatlı T hücrelerinin immün tepkilerdeki rolünü daha iyi anlamak için güçlü bir araç olarak hizmet eder, bu da tespit hassasiyetini arttırır ve T hücresi yanıt seviyelerinin değerlendirmesini geliştirir. Benzer in vitro yöntemler memeli sistemlerinde iyi kurulmuş olsa da, bu tür tekniklerin kuş türlerinde uygulanması sınırlı kalmaktadır. Bu, özellikle T hücresi tepkilerini analiz etmek için araçların az gelişmiş olduğu kümes hayvanı immünolojisi ile ilgilidir. Özellikle ördekler, çeşitli kuş gribi virüsleri için doğal rezervuar görevi görür, ancak antijene özgü T hücresi bağışıklıkları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, kanatlılarda hem temel araştırmaları hem de uygulamalı immünolojiyi ilerletmek için kuş sistemlerine uyarlanmış standartlaştırılmış bir in vitro T hücre kültürü protokolü geliştirmek esastır.

Bu işlemlerde yer alan önemli bir sitokin, esas olarak CD8 + T hücreleri, tip 1 CD4 + T hücreleri ve NK hücreleri14 tarafından üretilen bir tip II interferon olan IFN-γ'dir. IFN-γ, viral replikasyonu inhibe etmede ve bağışıklık tepkilerini düzenlemede çok önemli bir rol oynar15. IFN-γ'nin ekspresyon seviyesi, bağışıklık durumunu yansıtır ve T hücresi aktivasyonu için bir belirteç görevi görür ve araştırmacıların16,17 ifadesi aracılığıyla T hücresi yanıt seviyelerini değerlendirmelerini sağlar. Bağışıklık hücrelerinde sitokin ekspresyonunu tespit etmek için yaygın bir yöntem, hücre içi sitokin boyamadır (ICS)18,19. Bununla birlikte, deneysel materyal ve tekniklerdeki sınırlamalar nedeniyle, ördekler üzerinde yapılan araştırmalar memelilerinkinin gerisinde kalmıştır5. Şu anda, birçok araştırmacı IFN-γ ekspresyon seviyelerini ölçmek için qPCR'ye güvenmektedir, ancak bu yöntemin belirli sınırlamaları vardır11. Laboratuvarımızda, ördek IFN-γ için akış sitometrisi ile uyumlu bir antikoru başarıyla geliştirdik. Bu başarıya dayanarak, bu çalışmada, ördek T hücrelerinde IFN-γ protein ekspresyonunu tespit etmek için bir ICS yöntemi oluşturduk ve ördek T hücresi tepkileri üzerinde daha fazla çalışma için güvenilir bir araç sağladık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mevcut tüm kuş gribi A (H5N1) virüsleri ile yapılan tüm deneyler, Güney Çin Tarım Üniversitesi (CNAS BL0011) protokollerine göre bir hayvan biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarında ve hayvan tesisinde gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan araştırma projeleri, Güney Çin Tarım Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (kimlik kodu 2021f154, 29 Temmuz 2021) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri, bu komite tarafından belirlenen düzenlemelere ve yönergelere ve hayvan refahı için uluslararası standartlara göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, vücut ağırlıkları 500 ila 600 g arasında değişen, hem erkek hem de dişi olmak üzere 4 haftalık evcil yeşilbaş ördeklerdi (Anas platyrhynchos domestica).

1. Ördek PBMC'lerin izolasyonu ve tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması

  1. Her ördeğin şah damarından 2 mL heparinize kan toplayın ve her bir ördeğin pıhtılaşmasını önlemek için EDTA içeren tüplere aktarın
  2. Lenfosit izolasyon kitinden veya PBS'den sağlanan örnek seyrelticiyi kullanarak kanı seyreltin. Bir Pasteur pipeti ile pipetleyerek nazikçe karıştırın. Kanın seyreltici için normal seyreltme oranı 1:1'dir.
  3. Seyreltilmiş kan olarak eşit hacimde lenfosit ayırma solüsyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Kan süspansiyonunu lenfosit ayırma çözeltisinin üzerine dikkatlice yerleştirin. Karışımı 400 x g, 25 °C'de 15 dakika santrifüjleyin ve düşen ivmeyi 1'e ayarlayın.
    NOT: Lenfosit ayırma çözeltisinin miktarı 4 mL'den az olmamalıdır. Lenfosit ayırma solüsyon kitinin bileşenleri Malzeme Tablosunda bulunabilir.
  4. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpündeki dört farklı katmanı yukarıdan aşağıya doğru gözlemleyin. Üst tabaka numune seyrelticidir, ardından halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakası, daha sonra ayırma çözeltisi ve alt tabaka kırmızı kan hücrelerinden oluşur.
  5. İkinci katmanı, halka şeklindeki süt beyazı lenfosit katmanını toplamak için dikkatlice bir pipet kullanın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelerle karıştırmak için 10 mL temizleme solüsyonu ekleyin.
  6. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından hücre sayımı için hücre peletini 10 mL RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
  7. İsteğe bağlı) Numuneyi daha da saflaştırmak için, 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjledikten sonra, kalan karışık kan hücrelerini çıkarmak için kırmızı kan hücresi lizis tamponu kullanın.

2. İn vitro H5N1 AIV'ye özgü T hücre kültürü

  1. Bir ördek çiftliğinden 2 haftalık sağlıklı yeşilbaş ördekler (Sheldrake) satın alın ve onları negatif basınçlı izolatörlerde barındırın. Deneyden önce hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) deneylerini kullanarak ördeklerin AIV için negatif olduğunu onaylayın. 4 haftalık ördekleri H5N1 AIV 1 x 106 ile,% 50 yumurta enfeksiyöz dozu [EID50] / 0.2 mL intranazal olarak enfekte edin.
  2. Bellek PBMC'lerini enfeksiyondan 28 gün sonra H5N1 ile enfekte olmuş ördeklerden 1. adımda açıklanan yöntemi izleyerek izole edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında% 0.08 tripan mavisi ile seyreltin ve canlı (boyanmamış) hücreleri bir ışık mikroskobu altında manuel olarak sayın.
    NOT: Daha önce yayınlanmış çalışmamız20 tarafından desteklendiği gibi, enfeksiyondan 28 gün sonra izole edilen periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) hafıza T hücreleri açısından zenginleştirilmiş olduğu düşünülmektedir. Bu aşamada, efektör faz azalmıştır ve hafıza hücresi popülasyonları baskındır.
  3. Konsantrasyonu 3 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve 48 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL ortam eklendiğinden emin olun.
  4. İzole edilmiş PBMC'leri APC olarak hizmet etmek için H5N1 kuş gribi virüsü (AIV) ile birlikte enfekte edin. Viral doz MOI = 5'tir. PBMC'leri 37 ° C'de 1 saat boyunca virüsle birlikte kültürleyin. Her 15 dakikada bir elinizle hafifçe sallayın.
  5. Enfeksiyondan 1 saat sonra, bağlanmamış viral partikülleri çıkarmak için hücreleri 2x PBS ile yıkayın. Yıkanmış PBMC'leri 1 mL T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve ayrıca askıdaki hücreleri 37 ° C'de 5 saat inkübe edin.
  6. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, inkübe edilmiş antijen sunan hücreleri (APC'ler) 100 μL T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve bunları efektör hücrelere ekleyin. Antijen sunan hücrelerin efektör hücrelere oranı 1:5 olmalıdır.
  7. Hücreleri 14 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde inkübe edin. Her 2 günde bir, eşit dağılımı sağlamak için dikkatlice pipetleyerek hücre kültürü süpernatantının yarısını taze T hücresi ortamıyla değiştirin. Hücreleri içeren ortamın yarısını atın, ardından eşit hacimde yeni ortam ekleyin.
  8. 7. günde, hücreleri 100x'te optik mikroskop altında gözlemleyin.
  9. Uyarılmamış kontrol grubu olarak PBS ile muamele edilmiş bellek PBMC'lerini kullanın.

3. T hücresi proliferasyonunu izlemek için karboksi floresein Diasetat Süksinimidil Ester (CFSE)

  1. Hücre yoğunluğunu 0.5-1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın ve 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjlemeden sonra hücreleri 5 mL PBS ile yeniden süspanse edin.
  2. 5 mL önceden soğutulmuş PBS ile 10 mM stoğu 1 μM CFSE'ye seyreltin; karanlıkta çalışın.
  3. İki santrifüj tüpünü 45 ° 'de eğin, CFSE seyreltmesini bir Pasteur pipeti ile hücre süspansiyonuna ekleyin, iyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
  4. Hücreleri,% 5 FBS içeren 10 hacim önceden soğutulmuş PBS içinde seyrelterek, 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleme ile çökelterek yıkayın ve süpernatanı atın. Yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
  5. Adım 2'ye göre in vitro olarak CFSE ile etiketlenmiş hücreleri uyarın. Proliferasyon testinin tamamlanmasının ardından, hücreleri hasat edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.

4. CD8 + T ve CD4 + T hücrelerinin proliferasyonu için akış sitometrik analizi

  1. 7 günlük kültürden sonra, her bir oyuktan tüm hücreleri toplayın ve analiz için iki akış tüpüne bölün.
  2. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  3. 100 μL antikor kokteyli (fare anti-ördek CD8, 1:50 veya fare anti-ördek CD4, 1:50) ekleyin ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  5. 100 μL antikor kokteyli (FITC konjuge Keçi Anti-Fare IgG2b, 1:50) ekleyin ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Hücreleri 1 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek 4 mL PBS ile bir kez yıkayın. FlowJo yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Geçit stratejisi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir.

5. qPCR kullanılarak imza gen ekspresyonu testleri ile T hücresi yanıtı

  1. T hücresi kültürünün sonunda hücreleri sayın, 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın.
  2. RNA ekstraksiyonu
    NOT: Ekstraksiyon, RNA kontaminasyonunu önlemek için çeker ocakta veya ultra temiz tezgahta gerçekleştirilebilir.
    1. Üreticinin talimatlarına göre kitte verilen lizis tamponunu kullanarak hücreleri parçalayın. Parçalanmış numuneyi gDNA-Filtre Kolonlarına (toplama tüplerine önceden yerleştirilmiş) aktarın, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin, kolonları atın ve süzüntüyü toplayın. Süzüntüye 0.5 hacim mutlak etanol ekleyin. İyice karıştırın.
      NOT: Etanol ilavesinden sonra bulanık bir çözelti veya çökelti normaldir. Sallayın ve bir sonraki adıma geçin.
    2. Karışımı RNA kolonlarına aktarın, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın, 700 μL Tampon RW1 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.
    3. Süzüntüyü atın, 700 μL Tampon RW2 (mutlak etanol ile) ekleyin ve santrifüjleyin. Süzüntüyü atın, 500 μL Tampon RW2 (mutlak etanol ile) ekleyin ve 2 dakika santrifüjleyin. Filtrattan kontaminasyonu önlemek için sütunu tüpten dikkatlice çıkarın. Aşağı akış reaksiyonlarında paraziti önlemek için tüm durulama çözeltilerinin çıkarıldığından emin olun.
    4. Sütunu yeni bir RNaz içermeyen toplama tüpüne aktarın, 50-200 μL RNaz içermeyen ddH2O ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika bekletin, ardından RNA'yı elüte etmek için 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. RNA saflığını ve konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Daha fazla verim için RNaz içermeyen ddH2O'yu 65 °C'ye önceden ısıtın ve gerekirse ikinci bir elüsyon gerçekleştirin.
  3. Kit talimatlarını izleyerek cDNA'yı sentezleyin. cDNA zincirini üreticinin talimatlarına göre sentezleyin ve 5 kat daha fazla ters transkriptaz ekleyin. 37 °C'de 15 dakika, ardından 85 °C'de 5 saniye ters yazıya dökün ve 4 °C'ye soğutun.
  4. PCR reaksiyonunu üreticinin protokolüne göre ayarlayın.
    1. Bir qPCR tüpünde, 20 μL'lik bir karışım yapmak için 10 μL 2x PCR reaksiyon enzim karışımı, 0.4 μL primer 1, 0.4 μL primer 2, 1 μL cDNA şablonu ve 8.2 μL ddH2O'yu birleştirin.
    2. Aşağıdaki programla PCR'yi gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazında çalıştırın:
      Aşama 1: 30 sn boyunca 95 °C, Tekrar x 1
      Aşama 2: 3 sn için 95 °C, 30 sn için 60 °C, Rep x 35
      Aşama 3: 15 sn için 95 °C, 60 sn için 60 °C, 15 sn için 95 °C, Rep x 1

6. Hücre İçi Sitokin Boyama (ICS)

NOT: Bu protokol, ördeklerde hücre içi IFN-γ sekresyonunu tespit ederek H5N1'e özgü CD8+ T hücrelerinin efektör yanıtını değerlendirmek için geliştirilmiştir.

  1. H5N1'e özgü T hücrelerini in vitro olarak adım 2'de açıklanan prosedürü takiben kültürleyin. Kültürün başlamasından 7 gün sonra tüm hücreleri (her kuyudan) hasat edin.
  2. Antijen sunan hücreleri (APC'ler) adım 2'de belirtildiği gibi inkübe edin. İnkübe edilmiş APC'leri ve Brefeldin A'yı (1: 1.000) efektör hücrelere ekleyin ve 39 ° C'lik bir inkübatörde 6 saat birlikte inkübe edin.
  3. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. Hücrelere 100 μL antikor kokteyli (fare anti-ördek CD8, 1:50) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek yıkayın ve 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir antikor kokteyli (FITC konjuge Keçi Anti-Fare IgG2b, 1:50) ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek tekrar yıkayın. Süpernatanı atın, hücreleri 100 μL fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.
  7. Hücreleri 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj ederek bir kez daha yıkayın. 1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin ve hücreleri 2x 440 x g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın.
  8. Süpernatanı atın, hücreleri 100 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikoru (Fare Anti-Ördek IFN-γ, 1:10) hücrelere ekleyin. Fiksasyon ve membran geçirgenliğinden sonra, hücre-antikor karışımını karanlıkta 30 dakika inkübe edin, inkübasyon sırasında ara sıra 4 ° C'de çalkalayın.
    NOT: Geçirgenleştirme/Yıkama solüsyonu 10x stok solüsyonudur ve kullanılmadan önce PBS ile seyreltilmelidir.
  9. Hücreleri bir kez daha 1 mL PBS ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek yıkayın. 100 μL antikor kokteyli (PE konjuge Keçi Anti-Fare IgG3, 1:250) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  10. FlowJo yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, ördeklerde antijene özgü T hücresi efektör yanıtlarının tespiti üzerine daha önceki bir çalışmaya dayanarak geliştirilmiştir20. Deneyin ilk adımı, sonraki efektör yanıt çalışmaları için temel teşkil eden virüse özgü T hücrelerinin in vitro kültürünü içerir. Başlangıçta, APC'ler inkübe edildi ve efektör hücrelerle birlikte kültürlendi. Morfolojik gözlemler, proliferasyondan sonra hücrelerin küme büyümesi sergilediğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, ördek antijenine özgü T hücrelerinin in vitro kültürü için etkili bir yöntem sağlar ve ayrıca ördekler için T hücrelerinin efektör yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilecek bir hücre içi sitokin boyama protokolü oluşturur. Şu anda, ördek T hücreleri için in vitro kültür protokolleri hakkında yayınlanmış bir rapor bulunmamaktadır. Öncelikle insan antijenine özgü T hücreleri için protokollere atıfta bulunduk, ancak APC'ler için inkübasyon koşullarını o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32473060 ve 32461120064) tarafından desteklenmiştir (MD ve ML'ye); Guangzhou Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Projesi (2025A04J5445) (MD'ye); Yangtze Nehri Akademik Profesör Programının Genç Akademisyenleri (2024, Manman Dai); ve "Guangdong Özel Destek Planı"nın Genç Peal Nehri Bilgini (2024, Manman Dai). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL MİKRO-Santrifüj tüpleriBiosharpCat#BS-15-M
15 mL Santrifüj tüpleriLabselectCat#CT-002-15A
2-merkaptoetanol (55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48 Kuyucuklu doku kültürü plakası (İşlem görmemiş, düz tabanlı)BiofilCat#TCP000048
50 mL Santrifüj tüpleriLabselectKedi # CT-002-50A
96 kuyulu Eteksiz qPCR PlakalarıLabselectKedi # PP-96-NS-0100
BD Cytofix / Cytoperm kitiBD BiyobilimKedi # BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BiyobilimKedi # 347688
Hücre kültürü CO2< / sub> inkübatörThermo FisherHeracell 150i GP
SantrifüjEppendorf5810R
CFSE etiketleme kitiAbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazymeCat#Q341-02
Ördek periferik kan lenfosit izolasyon kitiTbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixDoğru BiyoteknolojiCat#AG11706
FastPure Hücre/Doku Toplam RNA İzolasyonu Kit V2VazymeKedi # RC112-01
Fetal Sığır SerumuGibcoKedi # 10437-028
Akış sitometresiBeckman CoulterBA43347
Akış TüpüBeyotimeKedi # FFC005
FlowJo v10.8.1Ağaç Yıldızhttps://www.flowjo.com
Keçi Anti-Fare 488, 1:50 seyreltmeAbbkineKedi # A23210
Keçi Anti-Fare IgG2b, FITC, 1:50 seyreltmeGüney BiyoteknolojiKedisi # 1091-31
Keçi Anti-Fare IgG3, PE, 1:250 seyreltmeGüney Biyoteknoloji ve nbsp;Kedi # 1100-09S
GraphPad prizma 8.0.2GraphPad Yazılımıhttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV suşu DK383Zoonoz Önleme ve Kontrol Medicamen Ulusal ve Bölgesel Ortak Mühendislik LaboratuvarıA / Duck / Guangdong / 383/2008
L-glutamin (200 mM)GibcoCat # 25030081
MikroskobuMoticAE2000
Fare Anti-Ördek CD4, 1:50 seyreltmeBio-RadCat #MCA2478
Fare Anti-Duck CD8α, 1:50 seyreltmeGeneTex Kedi # GTX41834
Fare Anti-Ördek IFN -& gama, 1:10 seyreltmeLaboratuvarımızda hazırlanmıştır NA
, NanoDrop Bir SpektrofotometreThermo Fisher, NEAA AZY1603209
(gerekli olmayanGibcoCat # 11140-050
PBSGibcoCat # 10010023
PCR Termal DöngüleyiciBiometra BiometraTone 96G
Penisilin-streptomisin çözeltisiGibcoCat # 15070063
Gerçek Zamanlı PCR sistemiUygulanan BiyosistemlerABI7500
rekombinant insan IL-2 (10 & mu; g)USCNKKedi#RPA111Ga01
Kırmızı Kan Hücresi Lizis TamponuTbdscienceKedi#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoKedisi#11875-119
Sodyum piruvat (100 mM)GibcoKedisi#11360-070
Tripan MaviSigma-AldrichKedisi#93595
İki haftalık yeşilbaş ördekler (Sheldrake)bir ördek çiftliği GuangzhouKuzey Amerika
,

Kaynaklar

  1. Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation. Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).
  2. Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents. Cancer Genom Proteom. 11 (6), 267-277 (2014).
  3. Mazza, C., Malissen, B. What guides MHC-restricted TCR recognition. Semin Immunol. 19 (4), 225-235 (2007).
  4. Nel, A. E. T-cell activation through the antigen receptor. Part 1: signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse. J Allergy Clin Immunol. 109 (5), 758-770 (2002).
  5. Dai, M., Xu, C., Chen, W., Liao, M. Progress on chicken T cell immunity to viruses. Cell Mol Life Sci. 76 (14), 2779-2788 (2019).
  6. Deng, G., et al. The role and therapeutic strategies for tissue-resident memory T cells, central memory T cells, and effector memory T cells in psoriasis. Immunology. 173 (3), 470-480 (2024).
  7. Corrado, M., Pearce, E. L. Targeting memory T cell metabolism to improve immunity. J Clin Invest. 132 (1), 148546(2022).
  8. Liu, X., Li, H., Li, S., Yuan, J., Pang, Y. Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design. Front Immunol. 14, 1100741(2023).
  9. Zanker, D., et al. An optimized method for establishing high purity murine CD8+ T cell cultures. J Immunol Methods. 387 (1-2), 173-180 (2013).
  10. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-Cell Differentiation In Vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  11. Jiao, W., et al. Revealing novel CD8(+) T-cell epitopes from the H5N1 avian influenza virus in HBW/B1 haplotype ducks. Vet Res. 55 (1), 169(2024).
  12. Faulkner, L., et al. The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs. Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).
  13. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  14. Masuda, Y., et al. Biological effects of chicken type III interferon on expression of interferon-stimulated genes in chickens: comparison with type I and type II interferons. J Vet Med Sci. 74 (11), 1381-1386 (2012).
  15. Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway. Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).
  16. Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation. Front Immunol. 13, 759188(2022).
  17. Yu, E. D., et al. Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors. Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).
  18. Grant, E. J., et al. Broad CD8(+) T cell cross-recognition of distinct influenza A strains in humans. Nat Commun. 9 (1), 5427(2018).
  19. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  20. Dai, M., et al. Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro. J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).
  21. Jabbari, A., Harty, J. T. The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses. J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).
  22. Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)). Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).
  23. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  24. Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications. J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).
  25. Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).
  26. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).
  27. Chen, L., et al. A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans. Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

H5N1 VirüsüPeriferik Kan Mononükleer HücreleriAntijen Sunan HücrelerSitokin SalınımıAkış SitometrisiIFN-Gama TespitiT Hücresi Proliferasyonu
In Vitro H5N1'e Özgü Ördek T Hücreleri için Kültür ve İntrahücre İçi Sitokin Boyama Yöntemi ile İmmün Yanıtların Saptanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.