Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

RNA-Seq, Radyasyona Bağlı Beyin Hasarının Bir Mekanizması Olarak Th17 Hücre Farklılaşma Yolunu Ortaya Çıkardı

561 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, radyasyona bağlı beyin hasarı olan farelerde Th17 hücre farklılaşma yolunun aktivasyonunu araştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

Radyoterapi, baş ve boyun maligniteleri için yaygın bir tedavi yöntemidir; bununla birlikte, her zaman normal serebral dokuda radyasyona bağlı hasara neden olur ve radyasyona bağlı beyin hasarı (RBI) ile sonuçlanır. Radyasyona bağlı nöroinflamasyon üzerine yapılan kapsamlı araştırmalara rağmen, RBI ile Th17 hücre farklılaşma yolu arasındaki ilişki yeterince anlaşılamamıştır. C57BL / 6 fareleri, RBI modelini geliştirmek için tek bir 30 Gy kraniyal ışınlama uygulamasına tabi tutuldu. Kognitif işlev, Morris su labirenti (MWM), açık alan testi, yeni nesne tanıma testi ve rotarod testi ile değerlendirildi. Beyin dokusundaki histopatolojik değişiklikler hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması kullanılarak analiz edildi. Mikroglia (IBA-1) ve astrositlerin (GFAP) aktivasyonunu değerlendirmek için immünofloresan boyama kullanıldı. Diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için RNA dizilemesi yapılırken, Th17 hücre farklılaşmasında yer alan anahtar sinyal moleküllerini incelemek için Simple Western ve qPCR kullanıldı. RBI fareleri, özellikle uzamsal öğrenme ve hafızada tutmada belirgin bilişsel eksiklikler gösterdi. Histolojik inceleme, ışınlanmış farelerin korteks ve hipokampusu içindeki mikroglia ve astrositlerin aktivasyonunu gösterdi. RNA dizileme analizi, RBI grubunun korteksinde Th17 hücre farklılaşma yolunun önemli bir zenginleşmesini tanımladı. Simple Western ve qPCR analizleri yoluyla daha fazla doğrulama, RBI farelerinin korteksinde TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 ve P-STAT3'ün yukarı regülasyonunu doğruladı. Bu bulgular, Th17 hücre farklılaşma yolunun radyasyona bağlı beyin hasarının patogenezinde çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Th17 hücrelerinin aracılık ettiği nöroinflamasyon, radyasyonun neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun altında yatan kritik bir mekanizma olabilir.

Giriş

Radyoterapi hem primer hem de metastatik baş ve boyun tümörleri için çok önemli bir tedavi yöntemidir, ancak radyasyona bağlı beyin hasarı (RBI), merkezi sinir sistemi hasarı ile karakterize ciddi bir komplikasyon olarak ortaya çıkabilir. RBI insidansı tümör tipine ve tedavi yöntemine göre değişmekle birlikte, meningiomlar için stereotaktik radyoterapi sonrası %28-%50 arasında değişen oranlar1,3, nazofaringeal karsinom için %1.9-%52,3, düşük dereceli gliomlar için %1-24 4,5 ve beyin metastazları için %8-%20 6,7 arasında bildirilmiştir. RBI, akut, erken gecikmeli ve geç gecikmeli tipler olarak sınıflandırılır, bilişsel işlev bozukluğu, özellikle hafıza bozukluğu ve öğrenme eksiklikleri geç gecikmeli formda belirgindir. Baş ve boyun kanserlerinden uzun süre kurtulanların %50-90'ını etkileyen radyasyona bağlı bilişsel işlev bozukluğu (RICD), yaşam kalitesini önemli ölçüde etkilemektedir8, ancak patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır ve etkili önleyici ve terapötik stratejiler eksiktir.

Nöroinflamasyon, RBI'nin önemli bir patolojik özelliğidir, kan-beyin bariyeri bozulmasını şiddetlendirir ve hipokampusta nörojenezi engeller. Proinflamatuar sitokin IL-179'u ürettiği bilinen CD4+ T hücrelerinin bir alt kümesi olan Th17 hücreleri, multipl skleroz ve Parkinson hastalığı10,11 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu hücreler, belirli enflamatuar koşullar altında, kan-beyin bariyerini geçebilir ve nöroinflamasyonakatkıda bulunabilir 12. 2005 yılında keşfedilmelerinden bu yana, Th17 hücreleri, hem patojenlere karşı bağışıklık tepkilerindeki rolleri hem de enflamatuar hastalıklara katılımları nedeniyle dikkat çekmiş ve bu da onları RBI ve ilgili bilişsel işlev bozukluğu mekanizmalarını incelemek için potansiyel bir hedef haline getirmiştir13.

Bu çalışmada sadece erkek fareler kullanıldı. Dişilerin dışlanması, progesteron seviyeleri döngünün farklı aşamalarında on kata kadar değişebileceğinden, östrus döngüsü ile ilişkili nöroinflamatuar dalgalanmalardan kaynaklanan potansiyel karıştırıcı etkilerden kaçınmayı amaçlamıştır14. Ayrıca, deneysel modelimiz, hastaların yaklaşık% 72'sinin erkek olduğu baş ve boyun kanseri radyoterapisinin klinik bağlamını yansıtacak şekilde tasarlanmıştır15. Bununla tutarlı olarak, radyasyona bağlı beyin hasarı (RBI) mekanizmalarını araştıran yayınlanmış çalışmaların çoğu, temel patolojik özellikleri belirlemek için erkek kemirgenleri kullanmıştır16.

RBI'yi incelemek için çeşitli modeller kullanılmış olsa da, histopatolojik boyama ve basit Western blotlama gibi geleneksel metodolojiler duyarlılık, verim ve doğruluk açısından sınırlamalarla karşı karşıyadır17. RNA dizilimi (RNA-Seq) ve yüksek verimli proteomik gibi son gelişmeler, RBI18'in altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında daha sağlam bilgiler sağlamıştır. Bu teknolojiler, gen ekspresyonu değişikliklerinin ve protein değişikliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına olanak tanıyarak önceki yöntemlerden daha kesin veriler sağlar19. Özellikle Simple Western, kılcal elektroforezin avantajlarını kemilüminesans yoluyla protein tespiti ile birleştiren, minimum numune hacmi ve artan tekrarlanabilirlik ile yüksek verimli analizi kolaylaştıran yeni ve otomatik bir tekniktir20. Geleneksel Western blotlama ile karşılaştırıldığında, Simple Western, membran transferi ihtiyacını ortadan kaldırır ve kantitatif protein ekspresyon verileri sağlar, özellikle düşük bollukta protein tespitinde duyarlılık ve tekrarlanabilirlik açısından çeşitli avantajlar sunar 21,22.

RNA ekstraksiyonu ve hazırlanması için pratik yönergeler, yüksek kaliteli dizileme ve miktar tayininin başarısı için çok önemlidir. Optimum RNA ekstraksiyonu için, yüksek kaliteli RNA izolasyon kitlerinin kullanılmasını ve bozulmayı önlemek için konsantrasyonun 100-1000 ng/μL aralığında olmasını ve RNA bütünlük sayısının (RIN) 7.0'ın üzerinde olmasını sağlamanızı öneririz. Simple Western kullanılarak protein analizi yapılırken, protein numunelerinin uygun şekilde denatüre edildiğinden ve kılcal damar başına yaklaşık 1-5 μg'lık bir konsantrasyonda yüklendiğinden emin olmak önemlidir. qPCR doğrulaması için, en az 1 μg RNA'dan sentezlenen yüksek kaliteli cDNA kullanın ve tutarlı ters transkripsiyon koşulları sağlayın. Genomik DNA ile kontaminasyon veya RNA bozunması gibi RNA hazırlığındaki yaygın tuzaklardan, RNA bozunmasını önlemek için RNAz içermeyen ekipman kullanılarak ve faz ayrımı derhal gerçekleştirilerek kaçınılmalıdır.

Bu çalışma, bu yöntemleri bir araya getirerek, Th17 hücre farklılaşma yolağının RBI'nin murin modellerinde aktive edilip edilmediğini ve radyasyonun neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada yürütülen deneysel prosedürler, ARRIVE yönergelerine (Hayvan Araştırmaları: İn Vivo Deneylerin Raporlanması) sıkı sıkıya bağlıdır. Pekin Radyasyon Tıbbı Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden onay alındı (Onay No. AF/SC-08/02; Tarih: 25 Şubat 2024).

1. Fareler kraniyal ışınlama

  1. Çalışmada 6-8 haftalık toplam 10 erkek C57BL / 6 fare kullanın, beş hayvanı RBI grubuna ve beşini kontrol grubuna tahsis edin, burada kontrol grubu RBI almayan boş kontrol farelerinden oluşur. Fareleri, düzenlenmiş sıcaklık, nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü dahil olmak üzere kontrollü çevresel koşullar altında koruyun. Deneye başlamadan önce fareleri 1 hafta boyunca alıştırın.
  2. 50 mg / kg vücut ağırlığında% 1 pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu kullanarak hayvanları uyuşturun. Sıkı bir pençe tutamına refleks yanıt olmadığını kontrol ederek uygun anesteziyi onaylayın. Kornea kurumasını önlemek için anestezinin başlamasından hemen sonra her iki göze de veteriner oftalmik merhem sürün.
  3. Özel bir ahşap bağlama cihazı kullanarak hayvanları yüzüstü yönde konumlandırın ve lokalize ışınlamayı sağlamak için vücudun hedeflenmeyen bölgelerini 3 mm kalınlığında kurşun (Pb) koruyucu plaka (%99,9 saflıkta) ile örtün.
  4. 2 x 2cm2 ışınlama alanını doğal filtrasyonla (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu) çarpıştırın. Entegre lazer artı işaretleriyle (λ = 635 nm ± 0,5 mm hassasiyetle) alanı kraniyal orta hatta hizalayın ve entegre CMOS kamera sistemi ve IR arka aydınlatma ile gerçek zamanlı konumlandırmayı doğrulayın. Aşağıdaki parametreler altında bir X-RAD 320 sistemi kullanarak 1.325 Gy / dk'da tek bir 30 Gy X-ışını dozu ile kraniyal bölgeyi ışınlayın: 320 kVp / 12.5 mA, SSD = 50 cm.
  5. İzomerkezde konumlandırılmış izlenebilir bir iyonizasyon odası kullanarak haftalık doz kalibrasyonu yapın. 1,325 Gy/dk'lık bir doz oranı elde etmek için ışın parametrelerini 3,2 mm Cu HVL filtrasyonu ile 320 kVp/12,5 mA'da koruyun (%3'lük bir varyasyon ±). Gafchromic EBT3 film kullanarak ışın homojenliğini günlük olarak doğrulayın (> alanda %95).
  6. Ameliyat sonrası ağrıyı yönetmek için 3 gün boyunca günde bir kez meloksikam (deri altından 1-2 mg / kg) uygulayın. Hayvanları önceden ısıtılmış bir toparlanma odasına yerleştirin ve tam bilinçlerini geri kazanana ve sternal yaslanmayı sürdürebilene kadar sürekli olarak izleyin. İyileşme döneminde hayvanları gözetimsiz bırakmayın.
  7. Çalışma boyunca tüm farelerin vücut ağırlığını haftalık olarak kaydedin. Fareleri 1 hafta iklimlendirme ve ışınlama sonrası 3 hafta olmak üzere toplam 4 hafta boyunca gözlemleyin.

2. Hayvan davranış analizi

  1. RBI'den 3 hafta sonra davranışsal deneyler yapın.
  2. Morris su labirenti
    1. Dairesel bir havuzu (çap: 120 cm, yükseklik: 50 cm) opak su (20-22 °C) ile doldurun ve batık platformu gizlemek için süt tozu kullanın. Sabit bir kadranda su yüzeyinin 1 cm altına gizli bir platform (çap: 10 cm) yerleştirin.
    2. Denemelerden önce fareleri en az 30 dakika test odasına alıştırın. Eğitim aşamasına, her bir fareyi sözde rastgele seçilen dört başlangıç noktasından (N, S, E, W) suya yerleştirerek başlayın.
    3. Gizli platformu bulmak için farenin 60 saniyeye kadar yüzmesine izin verin. Fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, onu platforma yönlendirin ve 15 saniye orada kalmasına izin verin.
    4. Denemeler arası 15 dakikalık bir aralıkla fare başına günde dört deneme yapın. Hipotermiyi önlemek için denemeler arasında her fareyi ılık bir havluyla iyice kurulayın. Öğrenme kazanımını değerlendirmek için art arda 5 gün eğitime devam edin.
    5. Prob deneme gününde, platformu çıkarın ve farenin 60 saniye boyunca serbestçe yüzmesine izin verin. Hedef kadranda geçirilen süre, platform geçişleri ve yüzme yolları gibi parametreleri kaydedin.
    6. Deneycilerin grup tahsisine kör olduğu otomatik bir video izleme sistemi kullanarak tüm denemeleri izleyin ve analiz edin.
  3. Açık alan testi
    1. Deneyden önce fareleri en az 30 dakika test odasına alıştırın. Opak plastikten yapılmış bir açık alan aparatı (50 cm x 50 cm x 40 cm) kullanın. Güçlü gölgelerden kaçınmak ve stresi en aza indirmek için arenayı eşit şekilde (tipik olarak 25-30 lüks) aydınlatın.
    2. Koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için her bir hayvanı test etmeden önce arenayı %70 etanol ile temizleyin. Teste başlamak için fareyi yavaşça açık alanın ortasına yerleştirin. Farenin arenayı 10 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin.
    3. Otomatik bir izleme sistemi kullanarak lokomotor aktivitesini ve konumunu kaydedin. Merkezi bölgeyi, toplam alanın iç %20-%25'i olarak tanımlayın. Merkezi bölgede geçirilen süreyi ve kat edilen toplam mesafeyi ölçün.
    4. Seanstan sonra fareyi ev kafesine geri koyun ve cihazı iyice temizleyin.
  4. Yeni nesne tanıma testi
    1. Deneyden en az 30 dakika önce fareleri test odasına alıştırın. Düzgün aydınlatmalı (20-30 lüks) açık bir alan arenası (50 cm x 50 cm x 40 cm) kullanın. Koku alma ipuçlarını ortadan kaldırmak için arenayı hayvanlar arasında% 70 etanol ile iyice temizleyin.
    2. Her fareyi boş alana yerleştirin ve 10 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin. Bu aşamada herhangi bir nesne koymayın.
    3. 24 saat sonra, arenanın zıt köşelerine (duvarlardan en az 8 cm uzakta) iki özdeş nesne (A ve A") yerleştirin. Fareyi yavaşça arenanın ortasına yerleştirin ve 10 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
    4. Otomatik bir video sistemi kullanarak nesne etkileşimini kaydedin. Nesne keşfini, farenin burnunun nesneye doğru yönlendirilirken nesnenin 2 cm yakınında olması olarak tanımlayın.
    5. Denemeden sonra fareyi ev kafesine geri koyun ve arenayı ve nesneleri temizleyin.
    6. 1 saatlik bir tutma aralığından sonra, bir tanıdık nesneyi (A) ve bir yeni nesneyi (B) aynı konumlara yerleştirin. Fareyi arenaya geri koyun ve 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
    7. Daha önce olduğu gibi aynı kriterleri kullanarak her bir nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı kaydedin. Tanıma indeksini şu şekilde hesaplayın:
      Tanıma İndeksi (%) = [Roman nesnesinde geçen süre / (Roman üzerinde geçen süre + tanıdık nesne)] x 100
  5. Rotarod testi
    1. Testten önce fareleri en az 30 dakika test odasına alıştırın. Çubuk çapı ~3 cm ve tabandan yüksekliği ~30 cm olan motorlu bir rotarod aparatı kullanın.
    2. Dönüş modunu hızlanma hızına ayarlayın (5 dakikada 4 rpm'den 40 rpm'ye). Her fareyi yerleştirmeden önce çubuk yüzeyini %70 etanol ile temizleyin.
    3. Fareyi yavaşça dönen çubuğun ortasına, öne bakacak şekilde yerleştirin. Döndürmeyi başlatın ve hemen zamanlamaya başlayın.
    4. Sistem tarafından otomatik olarak düşmek için gecikmeyi kaydedin. Yaralanmayı önlemek için düştükten sonra fareyi güvenli bir şekilde yakalayın. Yorgunluğu önlemek için denemeler arasında en az 15 dakikalık bir dinlenme süresi tanıyın.
    5. Fare başına günde 3 ardışık deneme yapın ve nihai sonuç olarak gecikmenin ortalamasını alın. Tüm testlerin kör deneyciler tarafından tutarlı koşullar altında yapıldığından emin olun. Testten sonra fareyi ev kafesine geri koyun ve cihazı iyice dezenfekte edin.

3. Hayvan ötenazisi ve numune hazırlama

  1. RBI'den 5 hafta sonra doku örnekleri toplayın.
  2. Sodyum pentobarbital (100 mg / kg) ve steril bir şırınga hazırlayın. Sodyum pentobarbitali intraperitoneal olarak enjekte edin. Farenin nefes almayı bırakmasını ve kalp atışının durmasını ve ölümü onaylamasını bekleyin.
  3. Oksipital kavşakta hızla dekapitasyon yapın ve ince makas kullanarak kraniyal sütürleri sagittal olarak kesin, ardından nöral bağlantıları kesmeden önce meningeal bütünlüğü korurken bilateral kraniyal flepleri kavisli forsepslerle dikkatlice yükseltin.
  4. Steril tıraş bıçakları kullanarak midsagital bisection için sağlam beyni 60 saniye içinde önceden soğutulmuş bir matrise aktarın. Hassas enstrümantasyonla anteroposterior boyutları (8.2 ± 0.3 mm), mediolateral genişliği (4.5 ± 0.2 mm) ve doku kütlesini (112 ± 8 mg) hemen kaydedin.
  5. Kortikal ve hipokampal dokuları buz üzerinde inceleyin. RNA dizilimi, qPCR ve Simple Western için sol yarımküreyi sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
  6. Histoloji için sağ hemisferi %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. Sabit beyinleri kademeli etanolde %70'ten %100'e kadar kurutun ve her adım 30 dakika sürer.
  7. Beyinleri 2 saat boyunca ksilen içinde temizleyin. Erimiş parafin ile dokulara 60 ° C'de 4 saat boyunca sızın. Temizlenmiş beyinleri parafin bloklarına gömün ve oda sıcaklığında katılaşmalarına izin verin. Bir mikrotom kullanarak koronal bölümleri 5 μm kalınlığında kesin.

4. Hematoksilen ve eozin boyama

  1. Slaytları 5 dakika, 3 kez ksilene batırarak doku kesitlerini deparafinize edin. Bölümleri kademeli bir etanol serisiyle yeniden sulandırın: %100, %95, %70 ve damıtılmış su, her biri 5 dakika.
  2. İstenilen boyama yoğunluğuna bağlı olarak bölümleri 5 dakika boyunca Hematoksilen ile boyayın. Fazla Hematoksilen'i çıkarmak için bölümleri akan musluk suyunda 5 dakika durulayın.
  3. İstenilen kontrastı elde etmek için etanol içindeki% 1 hidroklorik asit içindeki bölümleri birkaç saniye ayırt edin. Akan musluk suyunda 5 dakika tekrar durulayın. Bölümleri Eosin ile 1 dakika boyayın.
  4. Bölümleri damıtılmış suda kısa bir süre durulayın. Bölümleri kademeli bir etanol serisiyle kurutun: %70, %95 ve %100, her biri 5 dakika.
  5. Ksilen içindeki bölümleri 5 dakika, 3 kez temizleyin. Bölümleri bir montaj ortamı kullanarak bir lamel ile monte edin. 20x objektifli bir Nikon Eclipse Ni-U mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin.

5. İmmünofloresan

  1. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA'ya batırarak dokuyu sabitleyin. Fazla PFA'yı çıkarmak için slaytları fosfat tamponlu tuzlu su içinde (PBS) 5 dakika, 3 kez yıkayın.
  2. Slaytları PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek dokuyu geçirgen hale getirin. Slaytları oda sıcaklığında% 5 normal serum ile 1 saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
  3. Antikor özelliklerine bağlı olarak, 1:2000 seyreltmede bloke edici tampon içinde seyreltilmiş birincil antikorlar IBA-1 ve GFAP ile inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bağlanmamış primer antikoru çıkarmak için slaytları PBS'de 5 dakika, 3 kez yıkayın.
  4. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1: 1000'de seyreltilmiş, Alexa Fluor 488'e konjuge edilmiş Keçi Anti-Tavşan IgG ikincil antikoru ile inkübe edin. Fazla ikincil antikoru çıkarmak için slaytları PBS'de 5 dakika, 3 kez yıkayın.
  5. Kızakları DAPI içeren bir antifade montaj ortamı ile monte edin. Lameli şeffaf oje ile kapatın.
  6. 20x objektifli konfokal mikroskop sistemi kullanarak floresan görüntüleri yakalayın.
  7. ImageJ kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün. 50-200 μm2 (mikroglia) ve 100-500 μm2 (astrositler) boyut eşiklerine sahip ImageJ'in Parçacıkları Analiz Et aracını kullanarak nicel analiz gerçekleştirin. Rolling Ball algoritmasını kullanarak arka planı çıkarın (yarıçap = 50 piksel).

6. qPCR analizi

  1. Bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak dokudan toplam RNA'yı çıkarın. Homojenizasyon, lizis ve RNA saflaştırması için üreticinin protokolünü takip edin.
  2. Konsantrasyonu ölçmek ve saflığı değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanarak ekstrakte edilen RNA'yı ölçün (A260/A280 oranı). RNA konsantrasyonunun cDNA sentezi için uygun olduğundan emin olun (100-500 ng/μL).
  3. Bir biyoanalizör kullanarak RNA'nın kalitesini değerlendirin. RNA'nın bozulma göstermediğinden (18S ve 28S rRNA için keskin bantlar) ve 7'nin üzerinde bir RNA bütünlük numarasına (RIN) sahip olduğundan emin olun.
  4. 1 μg RNA, ters transkripsiyon tamponu, oligo-dT, dNTP'ler, RNaz inhibitörü ve ters transkriptaz ile 20 μL'lik bir reaksiyon karışımı hazırlayın.
  5. cDNA'yı sentezlemek için 42 ° C'de 60 dakika inkübe edin. Ters transkriptazı etkisiz hale getirmek için 85 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  6. cDNA, ana karışım, ileri astar, ters astar (Tablo 1) ve nükleaz içermeyen suyu 96 oyuklu bir PCR plakasında birleştirin. 20 μL reaksiyon başına 2 μL cDNA kullanın ve 200 nM'lik bir nihai primer konsantrasyonu sağlayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı optik bir yapışkan filmle kapatın.
GenAstar Sırası (5'-3', İleri/Geri)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17A SerisiTCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tablo 1: qPCR dizi primerleri.

  1. Reaksiyon plakasını gerçek zamanlı bir PCR cihazına yerleştirin ve termal döngüleyiciyi programlayın. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanın: 3 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 15 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü ve 30 saniye boyunca 60 ° C.
  2. Hedef genlerin ekspresyonunu GAPDH'ye normalleştirin. ΔΔCt yöntemini kullanarak göreceli ifade seviyelerini hesaplayın ve verileri kontrol grubuna kıyasla kat değişiklikleri olarak sunun.

7. RNA dizileme analizi

  1. Kurumsal hayvan bakım protokollerini takip ederek fareyi uyuşturun ve ötenazi yapın. Dolaşımdaki kanı çıkarmak için hemen soğuk PBS ile perfüze edin.
  2. Beyni buz üzerinde inceleyin. Steril diseksiyon aletleri kullanarak serebral korteksi izole edin. RNA bütünlüğünü korumak için diseksiyon süresini en aza indirin.
  3. Kortikal dokuyu sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. RNA ekstraksiyonu hemen yapılmazsa -80 °C'de saklayın.
  4. Donmuş korteksi (30-50 mg) 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde motorlu bir homojenizatör kullanarak görünür parça kalmayana kadar homojenize edin.
  5. Kloroform faz ayrımı yapın. 200 μL kloroform ekleyin, 15 saniye kuvvetlice çalkalayın, oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin, ardından 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  6. Üst katmanı yeni bir tüpe aktarın, eşit hacimde %70 etanol ekleyin ve silika sütunu bazlı bir kit kullanarak RNA saflaştırmasına devam edin.
  7. RNA saflaştırması sırasında genomik DNA'yı çıkarmak için sütun üzerinde DNaz sindirimini kullanın. Toplam RNA'yı 30-50 μL'de toplayın ve hemen kullanım için buz üzerinde tutun.
  8. RNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. A260/A280 oranını ~2.0 olarak onaylayın. Bir Biyoanalizörde 1 μL RNA'yı analiz edin. Sıralama için RIN'in 8.0'dan büyük olduğundan emin olun.
  9. Bir poli(A) seçim protokolü ve çok telli bir kitaplık hazırlık kiti kullanın. 300-400 bp kitaplıkları oluşturmak için üreticinin protokolünü izleyin. Kitaplıkları ticari bir kit ile arındırın.
  10. Parça boyutunu doğrulamak ve bir havuz kitaplığı ile eşit olarak ölçmek için bir Biyoanalizör kullanın. Bir Illumina platformu kullanarak eşleştirilmiş uç dizileme (2x, 150 bp) gerçekleştirin.
  11. Trim Galore kullanarak adaptörleri kırpın, FastQC ile kaliteyi değerlendirin, STAR kullanarak okumaları fare genomuna (GRCm39) hizalayın ve featureCounts ile gen ekspresyonunu ölçün. DESeq2 kullanarak diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlayın.
  12. DESeq2'den elde edilen çıktıyı kullanın ve önemli ölçüde diferansiyel olarak ifade edilen genler DEG'leri filtreleyin (ayarlanmış p değeri 0.05 ve |log2FC| > 1<). Hipergeometrik teste dayalı olarak Phyper kullanarak GO ve KEGG yol zenginleştirme analizi gerçekleştirin. Düzeltilmiş P değeri 0.05 ≤ olan yolları istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlayın.

8. Basit Batı analizi

  1. Fare serebral korteksini proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile RIPA tamponunda homojenize edin, ardından kalıntıları gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Bir BCA testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
  2. Protein numunelerini, numune tamponu ile karıştırarak ve tam denatürasyonu sağlamak için 95 ° C'de 5 dakika inkübe ederek denatüre edin.
  3. 3 μL denatüre protein örneklerini Basit Batı kılcal damarlarına yükleyin. Taşmayı önlemek için numunelerin düzgün şekilde yüklendiğinden emin olun. Kılcal damarları Simple Western enstrümanına yerleştirin.
  4. Ayrılan proteinleri p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 ve IL-17 dahil olmak üzere 1:50 seyreltilmiş birincil antikorlarla 30 dakika inkübe edin.
  5. Bağlanmamış primer antikorları çıkarmak için kılcal sistemi her biri 5 dakikalık üç yıkama için yıkama tamponu ile yıkayın. Bloke edici tamponda seyreltilmiş HRP konjuge ikincil antikoru ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
  6. Fazla ikincil antikoru çıkarmak için her biri 5 dakikalık 3 yıkama tamponu ile yıkayın. Kemilüminesans kullanarak proteinleri otomatik olarak tespit etmek için Simple Western sisteminde algılama programını çalıştırın.
  7. Compass for Simple Western yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Elektroferogramdaki nispi tepe alanlarını karşılaştırarak protein ekspresyonunu ölçün. Verileri GAPDH proteinine normalleştirin.

9. İstatistiksel analiz

  1. GraphPad Prism 9.0.0'ı açın. yazılım. Veri yüklemek için Dosya > Verileri İçe Aktar'a tıklayın. Verileri SD ± ortalama olarak sunun. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için eşleşmemiş t-testini kullanın.
  2. Shapiro-Wilk testini kullanarak normalliği değerlendirin. Normallik ihlal edilirse (p < 0.05), gruplar arası karşılaştırmalar için Mann-Whitney U testini uygulayın. Normallik sağlanmışsa (p ≥ 0.05), grup farklılıklarını değerlendirmek için bağımsız bir örneklem t-testi yapın.
  3. Sonuçları p değerleri ile raporlayın. p < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. Aşağıdaki gösterimi kullanın: önemli değil için n.s, p < 0.05 için **, p < 0.005 için **, p < 0.0005 için *** ve p < 0.0001 için ***.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

RBI farelerinde bilişsel bozukluk
30 Gy tüm beyin ışınlamasına maruz kaldıktan sonra, farelerin vücut ağırlığı haftalık olarak izlendi. Kognitif fonksiyon 4. haftada değerlendirildi (Şekil 1A). İlk ölçümler, kontrol ve RBI gruplarının vücut ağırlıklarının benzer olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, ışınlamadan 1 ila 3 hafta sonra, RBI grubu vücut ağırlığında önemli bir azalma gösterdi (Şekil 1B), bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protokol içindeki kritik adımlar
Bu protokol, farelerde RBI'nin indüksiyonunu ve ardından nöroinflamasyon ve Th17 hücre farklılaşma yolunun kapsamlı değerlendirmelerini içerir (Şekil 6). Kritik bir adım, RBI1 için iyi bilinen bir model olan 30 Gy dozu ile C57BL / 6 farelerinin kraniyal ışınlamasıdır. İyonizasyon odaları kullanılarak yapılan doğru doz kalibrasyonu, tekrarlanabilirliği sağlar28

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma için destek Pekin Radyasyon Tıbbı Enstitüsü tarafından sağlandı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12-230 kDa Ayırma Modülü, 8 x 25 kılcal kartuşSimpleWesternProteinSimpleSM-W004
ProteintechHRP-60004için 1:500 seyreltme/antikor
Abcamab7260için 1:2000 seyreltme/antikor
Abcamab178846İmmünofloresan
anti-IL-17 A / F antikoruThermoMA5-23748için 1:10 seyreltme / antikor
; antikorCST12242için 1:50 seyreltme/antikor
SimpleWesternAnti-Fare Algılama
SimpleWesternDM-002ikincil antikoru
ThermoMA5-15193için 1: 2 seyreltme/antikor
SimpleWesternanti-RORDM-001ikincil antikor
; t antikoruThermo14-6988-82için 1:5 seyreltme/antikor
SimpleWesternanti-TGF7100771:20 seyreltme/antikor
; beta;-1,2,3 antikorThermoMA5-23795için 1:10 seyreltme/antikor
ThermoA55860protein testleri
EZ Standart Paket 1 12-230 kDaSimpleWestern Keçiiçin ProteinSimplePS-ST01EZ-8
LAbcamab1500771:1000 İmmünofloresan RNeasy Kiti için seyreltme / antikor
Qiagen74134RNA Ekstraksiyonu
SuperScript IV Birinci İplikli Sentez SistemiThermo Fisher Scientific18091050Ters Transkripsiyon
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
TRİUzol Reaktifiİnvitrojen15596026RNA Ekstraksiyonu
anti-GAPDH antikoru için SimpleWestern anti-GFAP antikoru İmmünofloresan anti-IBA-1 antikoru için 1:2000 seyreltme / antikor SimpleWestern anti-IL-1 ve beta SimpleWestern anti-IL-6 antikoru Modülü için Thermo MA5-23800 1:5 seyreltme/antikor anti-P-STAT3 (Try705) antikoru için ProteinSimple SimpleWestern Anti-Tavşan Tespit Modülü ve gama için ProteinSimple SimpleWestern anti-STAT3 antikoru için Thermo SimpleWestern BAC testi Anti-Tavşan IgG H &

Kaynaklar

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA DizilemeN roinflamasyonKognitif DisfonksiyonMikroglia AktivasyonuAstrosit AktivasyonuMorris Su LabirentiSimple WesternqPCR Analizi
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.