Tavşan Modellerinde Meme Kanserinin Önlenmesi için İntraduktal Etanol Bazlı Ablatif İnfüzyonun X-ışını Görselleştirmesi

Özet

Bu protokol, tavşan meme bezinin duktal ağaç sistemine görüntü kılavuzluğunda infüzyon için bir prosedür sunar. Floroskopi gerçek zamanlı görüntüleme ile X-ışını kontrast maddesi içeren etanol bazlı ablatif solüsyonun tüm meme açıklıklarına kontrollü infüzyonunu gösteriyoruz.

Özet

Meme kanseri, kadınlarda kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir. Ortalama riskli kadınlar için çok az proaktif müdahale olsa da, profilaktik mastektomi yüksek riskli kadınlar için en etkili, risk azaltıcı müdahaledir. Bununla birlikte, profilaktik mastektomi, çevredeki stroma, yağ dokusu ve/veya kas sistemi ile birlikte tüm meme epitel hücrelerini çıkaran invaziv bir prosedürdür. Genel araştırma hedefimiz, tüm duktal ağacı ablatif bir solüsyonla doldurarak meme epitel hücrelerini lokal olarak öldüren, invazif olmayan bir intraduktal (ID) uygulama prosedürü geliştirmektir. Daha önce, ablatif bir çözelti olarak etanolün ID iletiminin kemirgen modellerinde (fareler ve sıçanlar) etkili olduğunu göstermiştik. Bu protokol, tavşan meme bezinin çok kanallı ağaç sistemine bir X-ışını kontrast maddesi olarak ioheksol (90-300 mg / mL) içeren% 10-70 etanol çözeltisinin bir ID iletimini sunar. Çok kanallı bir sisteme sahip bir tavşanın (Oryctolagus cuniculus) meme bezi, diğer büyük hayvanlardan (örneğin inekler, koyunlar) daha çok insan göğsüne benzer. Bu tavşan protokolü, büyük hayvanlı bir ara modelde ölçeklenebilirlik, gerçek zamanlı görüntüleme ve çok kanallı bir ağaç sistemine kimlik teslimi gibi teknik zorlukları ele alır. Bu protokol, klinikte doğrudan uygulanabilecek aletler, malzemeler ve reaktiflerle floroskopi kılavuzluğunda çok kanallı bir ID iletimi oluşturur. Doku analizi, meme kanserinin birincil önlenmesi için bu ablatif prosedürün gelecekte insanda ilk kez değerlendirilmesi için bir başlangıç noktası olarak maksimal epitel ablasyonu ve minimum kollateral doku hasarı için etanol konsantrasyonunun optimize edilmesini sağlar.

Giriş

Meme kanseri (BC), Amerika Birleşik Devletleri'nde kadınlar arasında en yaygın ve ikinci en yüksek kansere bağlı ölümdür. 2025 yılı tahminleri 316.950 yeni meme kanseri olacağını ve 42.170 kadının BC^1'den öleceğini tahmin ediyor. Günümüzde bilateral profilaktik mastektomi BC'yi önlemede en etkili prosedürdür. Bununla birlikte, bu, meme karsinomunun ortaya çıktığı epitel hücrelerinin ve çevresindeki dokunun tamamen çıkarılmasını içeren oldukça invaziv bir prosedürdür. İnvazivliğinin yanı sıra bu prosedürün psikolojik ve sosyal etkisi nedeniyle, yüksek riskli kadınların %50'sinden azı risk azaltıcı mastektomi geçirmektedir². Biz ve diğerleri, mevcut önleme ve tedavilere alternatif olarak kemirgen modellerinde ^2,3 meme kanserinin birincil önlenmesi ve/veya lokal tedavisi için intraduktal (ID) dağıtım prosedürleri geliştirdik. Etanol (EtOH), iyi kurulmuş ve venöz malformasyonların tedavisi için sklerozan ajanlar ve bazı kanserlerin lokal tedavisi için ablatif bir ajan olarak kullanılan düşük bir toksisite ve güvenlik profiline sahiptir³. Tipik olarak, bu klinik prosedürlerde birkaç mililitre EtOH infüze edilir veya %90-100 konsantrasyonda verilir. Önceki çalışmamızda, %70 EtOH'nin doğrudan fare ve sıçan modellerinin duktal ağaç sistemine verilmesi, bitişik normal dokuya sınırlı hasar vererek meme epitel hücrelerinin kimyasal olarak kesilmesinde ve meme tümörü oluşumunun önlenmesinde etkili olmuştur 4,5,6,7. Bu prosedür, daha büyük bir lümen hacmi/lümen epitel hücre yüzey alanı oranına sahip bir tavşanın daha büyük duktal ağaç sistemine ölçeklendirildiğinden, daha düşük bir EtOH yüzdesine (%10 ila %70) sahip bir çözeltinin ablatif özelliklerini araştırıyoruz. Klinik çeviriye dikkat ederek, epitel hücrelerini ablasyonda etkili olan en düşük etanol yüzdesinin en iyi tolere edilen ve en iyi güvenlik profiline sahip olacağını düşünüyoruz.

Ablatif solüsyonun meme epitel hücreleri ile doğrudan temas ettiğini garanti etmek için tam duktal ağaç dolgusunun doğrulanması gereklidir. Kemirgen modellerinde daha önce yaptığımız çalışmalarda, işlemden sonra mikroBT görüntüleme ile infüze edilmiş duktal ağaç(lar)ın X-ışını görselleştirmesi kullanılmıştır. Hayvanı görüntüleme için uyuşturmak, aktarmak, ayarlamak ve konumlandırmak için gereken zaman aralığı nedeniyle, FDA onaylı Omnipaque (iohexol) veya benzeri iyot içeren hızlı yayılan kontrast maddeler, kemirgenlerde^duktal ağaç görselleştirmesi için uygun değildi ^6,8. Nanopartikül bazlı kontrast maddelerinin, özellikle tantal oksit nanokristali içerenlerin, daha yavaş yayıldığını ve kemirgenlerde^duktal ağaç görselleştirmesi için daha uygun olduğunu bulduk 6,7,8,9. Bununla birlikte, mikroCT görüntüleme ile yapılan bu posteriori doğrulama, infüze edilen hacim miktarını izlememize veya kontrol etmemize izin vermez ve duktal ağaç görselleştirmesi için duktografi^10,11 gibi klinik olarak belirlenmiş tanı prosedürlerinden sapar. Bu nedenle, bu ID prosedürünü insanlara çevirmenin teknik fizibilitesini oluşturmanın önemli bir adımı, meme bezlerinin artan boyutu ve karmaşıklığına sahip bir hayvan modelinde aşılanmış duktal ağacın gerçek zamanlı floroskopi görselleştirmesini göstermektir. Bu protokol, bu ablatif prosedürü kemirgenlerden ^4,5'ten tavşan modellerine kadar ölçeklendirir. Evrimsel, anatomik ve fizyolojik olarak, tavşan meme bezleri, kemirgenlerden veya inekler ve koyunlar gibi diğer büyük hayvan modellerinden daha çok insan göğüslerine benzer ^12,13,14. Dişi tavşanlar, her biri dört duktal ağaç içeren dört çift meme bezine sahipken, kemirgenlerde meme bezi başına sadece bir duktal ağaç bulunur. Tavşan meme uçları, insanda ilk klinik araştırmalarda klinik duktografide kontrast maddenin ID uygulamasına benzer bir prosedür kullanılarak^{kanüle edilebilir 15,16}. Bu nedenle, tavşanlar, bu ID ablatif prosedürünün insanlara translasyonel uygulaması için pratik ve ilgili bir ara büyük hayvan modeli sağlar. Bu protokol, kemirgen modellerinde ele alınamayan çok kanallı bir ağaç sisteminin kimlik teslimi ve in vivo görüntülemesinin teknik zorluklarını ele almaktadır. Bu protokol, duktal ağaçların görselleştirilmesi için mevcut klinik uygulamalarla uyumlu aletler, reaktifler ve materyaller kullanır. Bu nedenle, ioheksol içeren etanol bazlı ablatif solüsyonun floroskopi kılavuzluğunda infüzyonu için tarif edilen prosedür, insanda ilk klinik çalışmalarda kolayca uygulanabilir ve değerlendirilebilir.

Bu yöntem, bir tavşanda bir veya daha fazla meme bezinin dört duktal ağacının tümünü tek seansta kontrast madde içeren etanol bazlı ablatif bir solüsyonla başarılı bir şekilde kanüle etmek ve sırayla infüze etmek için laboratuvarımızda uygulanmıştır (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3). Bu yöntem, ablatif solüsyonun bir floroskopi masasında 27 G'lik küt uçlu bir tavşan iğnesi (4 aylık bakire) ile doğrudan kanüllü meme açıklığına infüze edilmesini içerir. Bu prosedür, genel anestezi (izofluran) altında, işlem öncesi ve sonrası antiinflamatuar tedavi (ketoprofen, steroid olmayan antiinflamatuar ilaç) ile birlikte bir hayvana gerçekleştirilir. Floroskopi görüntüleme, duktal ağacın dolumunu gerçek zamanlı olarak izlememize, dağıtılan hacmin hızını ve miktarını kontrol etmemize ve/veya her bir ağaç sisteminde kimlik dağıtımının ne kadar başarılı olduğunu belirlememize olanak tanır (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3). Bu floroskopi tekniği, ablatif tedavinin görüntü rehberliği için amaçlanan klinik uygulamaya daha yakındır ve hastaya uygulanan genel radyasyon dozunun sınırlandırılmasına yardımcı olabilir. Bu protokol, FDA onaylı Omnipaque'ın (iohexol) tavşan duktal ağacının ilk dolumunu görselleştirmek için uygun bir kontrast madde olduğunu göstermektedir (Şekil 3). Brüt inceleme ve histolojik analiz ile yapılan gözlemler, %70'lik bir etanol konsantrasyonunun duktal ağacın içinde ve dışında ve meme bezi yapısının ötesine uzanan hızlı doku hasarına neden olduğunu göstermektedir (Şekil 3). %10-40 aralığındaki etanol konsantrasyonu, %70 etanole göre daha düşük kollateral doku hasarı ile yeterli epitel hücre ablasyonu sağlar (Şekil 4). İnsan hastalarda klinik değerlendirmesi için ablatif solüsyonun optimal parametrelerini belirlemek için ablatif solüsyon başına uygun şekilde güçlendirilmiş grup büyüklüğü ve zamanlanmış doku koleksiyonları ile bu prosedürü kullanan boylamsal çalışmalar gerekecektir.

Protokol

Açıklanan tüm deneyler, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında gerçekleştirildi. Tavşanlara (Oryctolagus cuniculus), AAALAC onaylı bir tesiste Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve USDA Hayvan Refahı Yasası uyarınca bakıldı.

NOT: Bu yöntem, ticari kaynaklardan elde edilen yaş (4 ay ila > 1 yıl) ve ağırlık (2,6 ila 4,2 kg) arasında değişen bakire (nullipar) ve emekli damızlık (multipar) Yeni Zelanda Beyaz hayvanlarında gerçekleştirilmiştir. Deneyimlerimize göre, ağırlığa göre belirlenen hayvanın boyutu, meme uçlarının boyutunu tahmin etmek için hayvanın yaşından daha güvenilirdir. Genellikle 3,3 kg'dan daha ağır olan hayvanlar, kanülasyon için uygun meme uçları ile başvururlar. Aşağıda açıklanan protokol, uzun vadeli etkinlik, yara iyileşmesi, toksisite ve güvenlik çalışmaları için daha uygun olduklarından, 4-5 aylık ve ağırlığı 3,3 kg'dan fazla olan bakire hayvanlara odaklanmaktadır.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Hayvanları, özellikle kurtarma prosedürleri ve uzun vadeli çalışmalar için tasarlanan hayvanlar için, varışta en az 1 hafta boyunca yeni tesiste iklimlendirin. Bu ilk hafta boyunca, tavşanları günlük olarak izleyin/kontrol edin ve alışma sürecine yardımcı olmak için kurumsal yönergelerin önerdiği şekilde besin zenginleştirmesi olan ikramlar sağlayın.
2. Tavşanı (~ 4 aylık Yeni Zelanda Beyazı) onaylı barınma tesisinden alın. İşlemden önce vücut ağırlığını kaydedin.
   NOT: Anestezi için gerekli hesaplamaları hazırlamak için işlemden bir gün önce vücut ağırlığı kaydedilebilir. Emekli yetiştiriciler (> 1 yaşında, > 3,5 kg) daha büyük meme uçlarına sahip oldukları ve bireysel kanalların daha kolay kanülasyonuna izin verdikleri için de kullanılabilir (Şekil 3). Bu nedenlerden dolayı, emekli yetiştiriciler, intraduktal prosedüre aşina olmak ve optimize etmek için ilk deneylerde kullanılabilir.
3. Hayvanı sakinleştirmek için izofluran uygulamasından 20 dakika önce kas içine 35 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg ksilazin enjekte edin.
   NOT: Anestezi tavşanın ağırlığına göre uygulanır ve her ilaç için aralıklar aşağıdaki gibidir: ketamin için 15-35 mg / kg ve ksilazin için 2-5 mg / kg. Epilasyon ve entübasyona geçmeden önce hayvanın sakinleştirildiğinden emin olun. Bu, hayvanların ve personelin refahı ve güvenliği içindir. Sedasyonun onaylanmasından sonra, tavşan daha sonra görüntüleme/ameliyat masasına dorsal olarak yerleştirilebilir.
4. Klinik sedasyon belirtileri gösterildikten sonra analjezi için deri altına 5 mg / kg ketoprofen enjekte edin (ör., sessiz tavır ve kısmen kapalı ve pembe renkli gözler).
   NOT: Analjezi tavşanın ağırlığına göre uygulanır ve ketoprofen aralığı 2-5 mg / kg'dır.
5. Tavşanı uygun ekipmanla entübe edin (ör., endotrakeal tüp veya supraglottik hava yolu cihazı) ve tavşanı uyuşturmak için yeterince test edilmiş ve onaylanmış bir izofluran makinesine (% 1-2 izofluran, 1.0 L / dak oksijen) bağlayın. Anestezinin izofluranın% 1-2'sinde tutulduğundan emin olmak için hayvanın solunumunu dikkatlice izleyin. İşlem boyunca tavşanı SpO₂ yoluyla oksijen doygunluğu, kalp atış hızı, solunum hızı ve sıcaklık açısından izleyin.
   NOT: Entübasyon tüpünün boyutu tavşanın ağırlığına ve boyutuna bağlıdır. Bununla birlikte, boyut aralığı her zaman doğru değildir, bu nedenle hangisinin o tavşana en uygun olduğunu görmek için çeşitli boyutlara sahip olmak yararlıdır. Anestezi amacıyla endotrakeal tüp yerine bir burun konisi maskesi de kullanılabilir¹⁷, bu maskenin hayvanın entübasyon ile sağlanan hava yolunun korunmasını sağlamadığının farkında olarak. Tavşanın vücut ısısını korumak için 37°C'ye ayarlanmış ılık su sirkülasyon battaniyeleri (ısıtma battaniyeleri) havluların altına yerleştirilir.
6. Acil ilaç uygulamasına izin vermek için marjinal kulak damarına 25 G'lik bir venöz kateter yerleştirin ve sabitleyin.
   NOT: Tavşan damarının boyutuna bağlı olarak 24 ila 26 arasında bir ölçü aralığı kullanılabilir.
7. Oküler tahrişi ve kornea kurumasını önlemek için her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın.
8. İkinci ve üçüncü meme uçlarının etrafındaki tüyleri elektrikli bir tıraş makinesiyle tıraş edin. Tüy dökücü kremi meme ucuna yaymak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Kremin bölgeye 15 saniye temas etmesine izin verin.
   NOT: Tıraş bıçağı ile herhangi bir meme ucuna zarar vermemek için çok dikkatli olunmalıdır. Temiz bir prosedür alanının korunmasına yardımcı olmak için kablosuz bir elektrikli süpürge de kullanılabilir.
9. Bir gazlı bezi steril tuzlu su ile ıslatın ve 15 saniye tüy dökücü krem uygulamasından sonra kremi durulamak ve hayvanın tüylerini gevşetmek için kullanın. Kürkün çıkarıldığı meme ucu alanına iyi görüş ve erişim sağlayın. Gerekirse tekrarlayın.
   NOT: Krem, 10 - 30 s arasında mümkün olan en kısa aralıkta tavşan üzerinde kalmalı ve ciltte kimyasal yanıkları önlemek için tamamen çıkarılmalıdır.

2. İntraduktal İnfüzyon

1. Bir BSL2 doku kültürü başlığında steril koşullar altında stok çözeltilerden uygun hacimleri karıştırarak ablatif bir çözelti hazırlayın.
   NOT: İohexol (350 mg İyot / mL), ışık hassasiyeti nedeniyle karanlık bir alanda saklanmalıdır. Bu deney sırasında bir dizi EtOH konsantrasyonu kullanıldı. Diğer EtOH yüzdelerini test etmek için, stok çözeltileri gerekli ablatif çözelti konsantrasyonuna seyreltin. Farklı yüzdelerde EtOH içeren ablatif çözeltide aynı İyot konsantrasyonunu korumak için, hacim farkını doldurmak için PBS veya steril su kullanılabilir.
2. Bu örnek için, 5 mL'lik bir tüpte %10 EtOH, 280 mg İyot/mL iyoheksol, %1 gıda boyasından oluşan taze bir ablatif çözelti hazırlayın. 5 mL'lik son hacim için 4 mL ioheksol stoğu (350 mg İyot/mL), 500 μL %100 EtOH (200 kanıt), 450 μL PBS, 50 μL stok mavi gıda boyası ekleyin.
   NOT: Her duktal ağaç 400 μL'ye kadar doldurulabilir, ancak 3,5 kg'ın altındaki hayvanlar için tipik olarak 250-350 μL ile doldurulabilir. Gıda boyası yerine %0,2'ye kadar Evans Blue kullanılabilir. İnfüzyon(lar)dan hemen sonra tüm montaj veya diğer doku analizleri yapılması amaçlanıyorsa Evans Blue tercih edilen bir seçenek olabilir.
3. Duktal açıklıkları kaplayan ölü deriyi ince sivri forseps ile temizleyin.
   NOT: Tavşanlar, çıkarılmadığı takdirde başarılı kanülasyonu önleyebilecek meme ucundan çıkıntı yapan keratinize bir tıkaç olabilir. Enjeksiyon bölgesi çevresindeki tahrişi en aza indirmeye yardımcı olmak için meme ucunun etrafına topikal lidokain de uygulanabilir (Tablo 1).
4. İnfüzyon bölgesini klorheksidin gazlı bezle silin.
   NOT: Klorheksidin, kanülasyondan önce enjeksiyon bölgesini dezenfekte etmek için bir temizlik maddesi olarak kullanılır (Tablo 1).
5. 28 G'lik bir iğnenin eğimini (uzunluk: 12,7 mm) meme ucuna yerleştirin ve 200 μL/dak hızında yavaşça 200 μL %0,9 salin enjekte edin. Bu, duktal açıklıkların daha iyi görüntülenmesini sağlar.
   NOT: 200 μL salinin tamamının meme ucuna enjekte edilmesi gerekmeyebilir; Bir veya daha fazla duktal açıklıktan salinin çıktığını gördüğünüzde enjeksiyonu durdurun.
6. 1 mL Luer kilitli şırınga kullanarak 1 mL hazırlanmış ablatif çözeltiyi aspire edin. Şırıngayı 12 inçlik erkek-dişi uzatma hattının dişi, "kanatlı" ucuna takın. 27 G'lik küt uçlu bir iğneyi (uzunluk: 12,7 mm) uzatma hattının erkek ucuna dikkatlice takın. Çözelti ile çizgiyi astarlayın. İğneyi alkollü gazlı bezle silerek temizleyin. Ayrıca, hava kabarcıklarının oluşmasına neden olabileceğinden, şırıngayı ablatif solüsyonla doldurmamaya dikkat edin.
   NOT: Bunlar, duktal ağaç(lar)ı tamamen doldurmayı amaçlayan önerilen hacimlerdir: her ağaçta 300 μL'ye kadar ve servikal ve / veya kasık meme bezleri başına 1,2 mL'ye kadar (1^{. ve 4.} çiftler), her ağaçta 400 μL'ye kadar ve torasik ve / veya abdominal meme bezleri başına 1,6 mL'ye kadar (2^{. ve 3. çiftler).} Diğer uygulamalar için, duktal ağacın aşırı doldurulmasını önlemek için deneysel gereksinimlere ve/veya floroskopi rehberliğine bağlı olarak daha küçük veya daha büyük hacimlerin kullanılması uygun olabilir. Uzatma hattı, akış hızının daha fazla kontrol edilmesini ve eş zamanlı infüzyon ve canlı floroskopi görüntülemeyi sağlar. Karşılaştırma için, 9-12 haftalık fare modellerinde önerilen intraduktal infüzyon hacimleri⁴ şunlardır: servikal ve kasıkta 30 μL'ye kadar ve torasik ve abdominal meme bezlerinde 50 μL'ye kadar ve sıçan modelleri⁵: servikal ve kasıkta 100 μL'ye kadar ve torasik ve abdominal meme bezlerinde 300 μL'ye kadar.
7. Duktal açıklıkların yerini belirlemeye yardımcı olması için 10x büyüteçli bir lamba kullanın. Emziği parmaklarınızla nazikçe tutun ve iğneyi duktal açıklığa kanüle edin. 27 G küt uçlu iğneyi, uç tamamen meme ucunun içine girene kadar yavaşça sokmaya devam edin. İğneyi meme ucuna yerleştirmek için, iğneyi meme ucuna doğru itmek yerine meme ucunu iğneye doğru getirin. Duktal açıklığın yolunu takip etmeye dikkat edin.
   NOT: Bazı tavşanlarda, iğneyi meme açıklığına/açıklıklarına sokmaya çalışırken direnç hissedebilirsiniz. Üst epitel hücre tabakasını kırmak için dikkatlice hafif bir baskı uygulayın. Deneyimlerimize göre, kanülasyon için duktal açıklığı net bir şekilde tanımlamak için bir büyütme cihazı gereklidir. Bu bir büyüteç, mercek, büyüteç veya benzeri bir cihaz olabilir.
8. İğne tamamen yerleştirildikten sonra 300 μL çözeltiyi yaklaşık 200 μL/dak'lık sabit bir hızda yavaşça infüze edin. İğneyi kanüllü ağaçtan çıkarmak için infüzyondan sonra 30 saniye bekleyin; Bu, enjekte edilen hacmin duktal ağaç içinde kalmasını sağlar ve sızıntı olasılığını azaltır.
   NOT: Tipik olarak, iğneyi kanüle eden ve tutan bir araştırmacı bulunurken, ikinci bir araştırmacı şırıngayı tutar ve pistonu istenen hızda iter. İnfüzyon hızındaki ani değişiklikler kanal ağaçlarını patlatabileceğinden veya zarar verebileceğinden, daha kontrollü bir akış hızına sahip olmak için bir şırınga pompası kullanılabilir.
9. Görüntülerde yabancı kontrast solüsyonunu önlemek için dökülen solüsyonu nemli gazlı bez veya EtOH mendille temizleyin.

3. Floroskopi görüntüleme

1. Her duktal ağaç infüze edildikten sonra floroskopi görüntüleri alın. Floroskopinin parametreleri şunlardır: Bir floroskopi X-ışını cihazında 30 fps, 67 kV ve 17.3 mA. Ancak bunları deney ve görüntüleme ihtiyaçlarına göre ayarlayın.
2. Duktal ağacı tamamen doldurmak için ek hacim gerekip gerekmediğini belirlemek için floroskopi görüntülerini kullanın.
   NOT: Floroskopi görüntüleme, ablatif solüsyonun infüzyonu ile aynı anda canlı olarak gerçekleştirilebilir. Personeli zararlı X-ışınlarından korumak için görüntüleme yapılırken emziği tutmak için metal veya plastik pensler kullanılabilir. Bu, duktal ağaç(lar)ın dolumunun izlenmesine izin verir. Canlı floroskopi, alveol uçlarındaki artan hacme bağlı olarak infüzyonun ne zaman durdurulacağına rehberlik edebilir. İnfüzyondan sonra floroskopi, duktal ağacın tamamen dolu olup olmadığını veya bir miktar sızıntı olup olmadığını doğrulayabilir. Doğrulayıcı bir floroskopi tipik olarak aynı meme bezi içindeki her kanalın infüzyonundan sonra gerçekleştirilir.

4. Ameliyat sonrası bakım ve iyileşme

1. Son intraduktal infüzyondan sonra izofluran akışını durdurun.
2. 0.5 mg / kg atipamezole kas içine enjekte edin.
   NOT: İyileşme süresi hayvanlar arasında değişir, ancak tavşan enjeksiyondan 5-20 dakika sonra iyileşme belirtileri göstermeye başlamalıdır.
3. Anesteziden tamamen kurtulana kadar hayvana bir ısıtma battaniyesi üzerinde sürekli ısı desteği sağlayın. Anesteziden çıkarmadan önce oksijen akışını 5 dakikaya kadar koruyun.
   NOT: İyileşme belirtileri arasında çiğneme, öksürme, burun seğirmesi ve/veya göz hareketi gibi ağız hareketleri yer alır. Tavşanlar bir düzeltme refleksine sahip olmalı ve kurtarma taşıyıcısına geri yerleştirilmeden önce kendilerini sternal pozisyonda tutabilmelidir. Geri kazanım ajanı, tavşanın ağırlığına göre 0.1-1 mg/kg atipamezol aralığında uygulanır.
4. Deri altına 5 mg/kg ketoprofen enjekte edin.
5. Tavşan kendini sternal pozisyonda tutabildiğinde intravenöz kateteri çıkarın. Aşırı kanamayı durdurmak için kateterin çıkarıldığı yere bir gazlı bez tutun.
   NOT: Kateterin çıkarılması, tavşan taşıma taşıyıcısındayken gerçekleşebilir.
6. Tavşanı uygun barınma tesisine geri taşıyın.
7. İşlemden sonra en az 3 gün boyunca deri altından 5 mg/kg ketoprofen enjeksiyonlarına devam edin.
8. İşlemden sonra en az 3 gün boyunca tavşanı günde bir kez rahatsızlık, sıkıntı, ağrı ve kendine zarar verme belirtileri açısından izleyin. Tavşan bu klinik belirtilerden herhangi birini gösteriyorsa, ketoprofen ile tedavi uzatılabilir. Anoreksiya belirtilerini değerlendirmek için vücut ağırlığını kaydedin ve izleyin.
   NOT: Ketoprofen, tavşanın ağırlığına göre 2-5 mg / kg aralığında uygulanır. Enflamasyonu azaltmak ve yara izini en aza indirmek için intraduktal infüzyondan sonra 5 güne kadar her 24 saatte bir uygulanabilir. Cilt ülseri veya yara iyileşmesi ile ilgili diğer sorunların olumsuz olaylarını en aza indirmek için, lidokaini enjeksiyon bölgesine topikal olarak uygulayın. Ketoprofen tedavisinden sonra kalıcı rahatsızlık, sıkıntı, ağrı veya yaralanma belirtileri gösteren herhangi bir hayvana ötenazi yapılmalıdır.

5. Doku analizi

1. Ötenazi çözeltisini (pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum) intravenöz olarak 100 mg / kg olarak uygulayın. 60 saniye sonra ayak parmağı/kulak sıkışması, solunum veya kalp atışı belirtileri, kornea refleksi ve/veya göz bebeği uyarımı ile yaşam belirtilerini kontrol edin.
2. Meme bezi dokusu elde etmek için bir otopsi yapın ve 24-36 saat sonra %10 Nötr Tamponlu Formalin^18'de rutin parafin gömme prosedürü için işlem yapın. Ardından, istenen analiz okumalarına yardımcı olmak için standart Hematoksilen ve Eozin (H&E) boyama ve/veya hücre tipine özgü işaretleyici ile immünohistokimyasal boyama yapın¹⁸. Karkası uygun imha protokolü (örn. yakma) yoluyla bertaraf edin.
3. Bir patoloğa danışarak meme bezi dokularını analiz edin. Ablasyon oranının ve kollateral doku hasarının ölçülmesine yardımcı olması için bir bilgisayar yazılım programı kullanın.
   NOT: 4 aylık Yeni Zelanda Beyaz tavşanları üzerinde QuPath Open Software for Bioimage Analysis (https://qupath.github.io/) infüzyonlarından sonraki bir saat içinde doku analizi yapıldı (Şekil 4). Bu analiz sadece H&E boyalı dokulara dayanmaktadır. QuPath veya benzeri bir bilgisayar yazılımı, bir patolog tarafından girdi ve kalibrasyon gerektirir. Bazı hücreler sadece morfolojik özellikler kullanılarak yanlış sınıflandırılabilir (Şekil 4). Sitokeratinler ve α-düz kas aktini gibi hücre tipine özgü belirteçlerin kullanımı, bilgisayar destekli sınıflandırmayı geliştirmek için kullanılabilir⁶. Sonuçta hücre sınıflandırma analizinin bir patolog tarafından düzenlenmesi ve doğrulanması gerekir.

Sonuçlar

Dişi bir tavşanın 8 meme bezinin her biri, bağımsız meme deliklerinde açılan 4 duktal ağaç içerir (Şekil 2). Kemirgenler arasında meme bezi başına düşen duktal ağaçların boyutu ve sayısı farkı nedeniyle (meme bezi başına sadece 1 kanal), tavşanlar insan çevirisi için iyi bir ara modeldir. 4 aylık Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarının herhangi bir meme bezinin tüm duktal ağacını doldurmak için 400 μL'ye kadar% 10-70 EtOH çözeltisi infüze edebiliriz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ^4,8,9). Tek seansta 8 meme bezine kadar 4 duktal ağaca ablatif solüsyon aşılayabiliyoruz. Tipik bir deneysel tasarım, tek bir meme bezi içindeki 2-3 duktal ağacın, 4 meme bezine kadar İyot bazlı X-ışını kontrast maddesi içeren özel bir ablatif çözelti ile aşılanmasından oluşur (Şekil 2,  Şekil 3). İoheksil içeren (90-300 mg İyot / mL) ablatif çözelti için, her duktal ağacın kısmi veya tam miktarda infüze edilmiş çözelti ile infüze edilmesinin bireysel başarısını belirlemek için her infüzyon sırasında ve / veya sonrasında floroskopi yapılır (Şekil 2, Şekil 3). Meme bezi dokusunun toplanması, formülasyondaki değişikliklerin meme epitel hücrelerinin yıkımını nasıl etkilediğinin değerlendirilmesini sağlar (Şekil 4). Bu görüntüleme analizleri, çevredeki doku hasarını en aza indirirken maksimum ablasyona ulaşmak için en uygun çözümü anlamak için bilgi sağlar. EtOH solüsyonunun, daha yüksek oranda EtOH içeren ablatif solüsyonlarla karşılaştırılabilir bir ablatif oran sağladığını belirledik (Şekil 4).

Şekil 1: İntraduktal prosedürün iş akışı. Kimlik prosedürünün temel adımları vurgulanmıştır. Daha fazla ayrıntı için lütfen videoyu izleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İntraduktal kanülasyon ve infüzyonun temel adımları. (A) Kanülasyon için duktal açıklıkları genişletmek için meme ucuna dik salin enjeksiyonu (medyan düzlem görünümü). (B) Bir duktal ağacın (D1) kanülasyonu ve doldurulması, ablatif solüsyonda (medyan düzlem görünümü) mavi boya ile izlenebilir. (C) Gerçek zamanlı floroskopi görüntüleme, ablatif solüsyonda (dorsal düzlem görünümü) ioheksol ile duktal ağaç dolgusunun (D1) hassas ve yüksek çözünürlüklü izlenmesini sağlar. Duktal ağaç açıklıkları, üst kadrandan (D1, sol üst kadran) başlayıp alt kadranda (D4, sağ alt kadran) bitecek şekilde soldan sağa numaralandırılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Emzik boyutu ve ablatif solüsyonun birden fazla kanala başarılı bir şekilde verilmesi. Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarında meme boyutlarının tipik sunumu. Meme ucu boyutu tavşanın ağırlığına ve yaşına göre değişir. Meme bezleri sol üstten (L1, sol servikal) sağ alta (R8, sağ kasık) doğru numaralandırılmıştır. Tüm görüntüler dorsal düzlemde gösterilir. (A) Daha küçük meme uçlarına sahip, kanüle edilmesi zor 2,8 kg bakire tavşan (üstte), kanülasyon için uygun meme uçlarına sahip 3,5 kg bakire tavşan (ortada) ve daha büyük meme uçlarına sahip 4,1 kg multipar tavşan (altta), kanüle edilmesi çok daha kolaydır. (B) İnfüze edilen çözeltideki mavi gıda boyası, intraduktal doğum ve duktal ağaç dolgusunun in vivo kanıtı olarak kullanılabilir. Başarısız infüzyon kırmızı bir çerçeveyle (yağ yastığı dağıtımı, üstte) ve başarılı infüzyonlar mavi bir çerçeveyle (intraduktal dağıtım, orta ve alt) gösterilir. p'lik bir EtOH solüsyonu, infüzyondan dakikalar sonra (koyu mavi, orta panel) 'luk bir solüsyona (açık mavi, alt panel) kıyasla cilde (eritem) daha fazla zarar verir. (C) Floroskopi, intraduktal doğumun in vivo kanıtını sağlar. Başarısız infüzyon (yağ yastığı iletimi, üst panel). Önce D1 duktal ve ikinci olarak D2 duktal ağacının başarılı ardışık infüzyonu (sol alt panel). Canlı floroskopi, D3 duktal ağacının (sağ alt panel) doldurulması (beyaz oklar) için görüntü rehberliği sağlar; ioheksol içeren ablatif solüsyon ile doldurulmuş uzatma hattı ve meme başını tutmak için forseps de görülebilir. Ölçek çubukları, farklı büyütme oranlarındaki görüntülerde 1 cm'ye karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarında etanol bazlı ablatif solüsyon ile intraduktal işlem sonrası meme bezlerinin doku analizi. (A-B) Ablatif tedavi olmaksızın 4 aylık bir hayvanın sağ kasık meme bezinin temsili H&E boyaması, başka bir hayvanın sağ kasık meme bezine EtOH ablatif tedavi ile karşılaştırıldığında. Doku dilimleri medyan düzlem boyunca kesilir, böylece D1 ve D3 (sol duktal ağaçlar) aynı doku kesitlerinde temsil edilir. Tüm doku görünümü (A) ve yüksek büyütme görünümü (B), EtOH ablasyonunun H&E boyama (üst paneller) üzerindeki morfolojik ve kromatik etkilerini gösterir ve bilgisayar destekli eğitimli sınıflandırıcıya (alt paneller) dayalı olarak epitel ve stromal hücre sınıflarını çıkarır. Siyah ölçek çubuğu A'da 1 mm'ye ve beyaz ölçek çubuğu B'de 100 μm'ye karşılık gelir. (C) Grafik çubuğu, farklı konsantrasyonlarda EtOH ile muamele edilen veya tedavi edilmeden bırakılan duktal ağaçlarda (grup başına n > 4) hücre sınıfı dağılımını gösterir. Yıldız işaretleri şunu gösterir: p değeri eşleştirilmemiş Welch'in t-testi EtOH ile tedavi edilen gruptaki eşleşen hücre sınıfına kıyasla grup başına her hücre sınıfının (* <0.05, ** < 0.01, **** <0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Önceki çalışmalarımızda, %70 EtOH'lik bir ID iletiminin, kemirgenlerde^çevre dokuya minimum hasara neden olurken meme epitel hücrelerini ablasyona uğrattığını göstermiştik ^6,7. Bu prosedürde, ablatif bir çözeltinin ID infüzyonunun bir tavşan modeline ölçeklendirilebileceğini gösterdik. Özellikle, çok kanallı bir ağaç sistemine sahip bu daha büyük modelde, bir meme bezi içindeki tüm kanalların sıralı infüzyonunun başarılı bir şekilde infüze edilebileceğini gösteriyoruz. Bu, bu ablatif prosedürün yüksek riskli bireylerde birincil korunma için profilaktik mastektomiye uygun bir alternatife dönüştürülmesinde bir sonraki aşamayı temsil eder.

FDA onaylı İyot bazlı X-ışını kontrast maddesi Omnipaque (iohexol), duktal ağaç boyunca çözelti dağıtım sürecinin canlı görselleştirilmesi yoluyla infüzyonun başarısını değerlendirmemize olanak tanır. İnfüze edilen meme bezini görselleştirmek için floroskopi kullanmak, bu görüntü kılavuzluğunda prosedürü kliniğe getirmek için kullanılan ekipman ve aletlerle yakından örtüşür^10,11. Bu görüntüleme yöntemi, infüzyonu ne zaman durduracağımızı bilmemizi sağlayacak ve böylece canlı floroskopiyi bu ablatif prosedürün klinik uygulamasının önemli bir bileşeni haline getirecektir. Bu prosedürün kemirgenden tavşan duktal ağaçlarına kadar ölçeklenebilirliğini belirledik, ancak bu daha büyük hayvan modelinde çevredeki doku hasarını en aza indirirken meme epitel hücrelerini en iyi şekilde kesen EtOH yüzdesini belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu protokol, işlemden hemen sonra intraduktal infüzyon ve doku analizinin fizibilitesine odaklandı. Sorun giderme stratejileri ve faydalı ipuçları Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokolün ana odak noktası etanol bazlı ablatif çözümler sunmak olsa da, bu protokol diğer uygulamalarda diğer görüntüleme reaktiflerini, CRISPR/Cas9 gibi gen değiştirici sistemleri, lentiviral vektörleri, siRNA'ları, büyüme faktörlerini ve/veya kanserojenleri lokal olarak iletmek için kullanılabilir ^2,3 tavşanlarda meme bezi gelişimi ve onkogenezin diğer yönlerini incelemek için.

Sonuç olarak, bu protokol, farklı ablatif çözümlerin lokal ve sistemik etkilerinin sistematik ve boylamsal bir çalışmasını gerçekleştirmek için gereken araştırma araçlarını sağlar. Bu bilgi, bu prosedürün güvenliğini belirleyecek ve insanda ilk kez yapılan klinik çalışmalarda daha fazla geliştirme ve klinik değerlendirme ile ilgili endişeleri belirleyecektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Işıklı ve kelepçeli 10X büyüteç, büyük boynu	Amazon	B0D982JCZ2	Meme ucu görselleştirmesi için
Exel Uluslararası İnsülin Şırıngaları	Fisher Bilimsel	14-841-31	Periduktal salin enjeksiyonu için
Toplu kör iğneler ölçer 27 uzunluk 0.5	SAI İnfüzyon Teknolojileri	B27-50 100 Dökme	İntraduktal kanülasyon için
Evans mavisi	Sigma	E2129-50G	Meme bezi görselleştirmesi için
Floroskopik X-ışını görüntüleme sistemi	GE Sağlık Hizmetleri	DT-C31-01	Floroskopi görüntü alımı için
HotDog veteriner ısıtma battaniyesi	Hotdog	WC71V	İntraduktal prosedür/ameliyat öncesi hazırlık için
Erkek-dişi uzatma hatları, uzunluk 12 inç	SAI İnfüzyon Teknolojileri	HARİCİ-12	İntraduktal prosedür için
Omnipaque 500 mL (350 mg İyot/mL)	GE Sağlık	0407-1414-72	X-ışını görselleştirmesi için kontrast madde (floroskopi)
Steril mavi gıda boyası	Mccormick	930641	Meme bezi görselleştirmesi için
Steril fosfat tamponlu salin (PBS)	Termo Fisher	14190250	Çözelti hazırlama için
Şırınga	BD	309659	İntraduktal infüzyon için
V-jel	Docsinnovent	D30001 - 30006 Serisi	Entübasyon için (katalog numarası V-jel boyutuna bağlıdır)
Ketoprofen	Koyu Renkli	#005488	Analjezi için
ketamin	Koyu Renkli	71069	Analjezi için
Topikal lidokain	Covertus	70859	Analjezi için
ksilazin	Koyu Renkli	80907	Anestezi için
Euthasol	Koyu Renkli	#009444	Ötenazi için
Göz Yağlayıcı	Koyu Renkli	75848	Anestezi için
atipamezole	Koyu Renkli	82124	Anestezi için
Muz Cipsi	Biyo-Serv	#F7161	İklimlendirme için
Furity Taşları	Biyo-Serv	#F5136-1	İklimlendirme için
Yoğurt Damlaları	Biyo-Serv	#F7200-1	İklimlendirme için