Yöntem makalesi

Tümör İmmünolojisi ve Tedavisi Çalışmaları için Azoksimetan ve Dekstran Sülfat Sodyum Kullanarak Kolit İlişkili Kolon Kanserini İndüklemek için Optimize Edilmiş Fare Modeli

DOI:

10.3791/68351

⸱

25 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azoksimetan (AOM)/dekstran sülfat sodyum (DSS) ile indüklenen kolit ilişkili kolon kanseri, farelerde kalın bağırsağın otokton tümörlerini modellemek için yerleşik ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır. Güncellenmiş bir protokol sunuyoruz ve cinsiyete özgü DSS doz optimizasyonu için kritik hususları ve mikrobiyomun titizlik, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik için katkısını tartışıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azoksimetan (AOM, DNA'ya zarar veren bir ajan) ve dekstran sülfat sodyum (DSS, kolit teşvik edici bir ajan), yüksek penetranslı farelerin kalın bağırsağında tümörleri indükleyebilir. AOM/DSS tarafından indüklenen murin kolit ile ilişkili kolon kanseri (CAC) modeli, insan CAC klinik özelliklerini özetlemedeki doğruluğu göz önüne alındığında, inflamasyonla ilişkili kolon kanserinin araştırılmasında altın standart olarak durmaktadır. Modelin avantajları arasında endojen dokudan kökeni ve gelişimi, tümör-bağışıklık etkileşimlerinin tam bir repertuarını koruyan bağışıklık yeterliliği, çok sayıda fare suşuna uyarlanabilirlik, 3 aylık gecikme süresi kolaylığı ve nispeten düşük maliyetler yer alır. Bu avantajlara rağmen, çeşitli zorluklar protokolün etkinliğini sınırlamaktadır. Çalışmalar arasında DSS dozajındaki ve tümör penetransındaki değişkenlik tutarsız gözlemlere yol açmaktadır. Ek olarak, bağırsak mikrobiyotasındaki varyasyonlar, istatistiksel gücü olumsuz yönde etkileyerek deneysel değişkenliğin artmasına katkıda bulunur. AOM/DSS'ye yanıt olarak cinsiyet farklılıkları, sonuçların yorumlanmasını daha da karmaşık hale getirir. Ayrıca, DSS'nin partiler arası değişkenliği, bulguların tekrarlanabilirliğini engeller. Bu zorlukların ele alınması, bu modelin klinik öncesi araştırmalarda güvenilirliğini ve uygulanabilirliğini artırmak için çok önemlidir. Bunu çözmek için, C57BL/6J fareleri model olarak kullanarak, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği ve uyumu artırmak için yerleşik protokolü etkili optimizasyon stratejileriyle iyileştirdik. Bunlar, hem erkek hem de dişi farelerde DSS doz titrasyonu için önerileri, kafesten kafese bağırsak florası heterojenliğini azaltmak için her DSS döngüsünden önce mikrobiyota homojenizasyonunun uygulanmasını içerir. Bu adımlar, değişkenliği önemli ölçüde azalttı ve tekrarlanabilirliği iyileştirdi, bu da CAC'nin sağlam bir şekilde indüksiyonu ile sonuçlandı. CAC gelişiminde inflamasyon ve hücresel immün mekanizmaların önemli rolünü kabul eden protokol, ayrıca RNA veya proteinin izolasyonu ve kolon tümörlerinden ve çevresindeki kolon dokusundan inflamatuar sitokinlerin profillenmesi için uygun doku işleme prosedürlerini de tanımlar. Sonuç olarak, bu yöntemin kullanılması daha titiz, sağlam ve tekrarlanabilir bir CAC üretimi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanser (KRK) dünya çapında en sık görülen üçüncü kanserdir ve kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir 1,2. Sporadik KRK ile karşılaştırıldığında, kolit ile ilişkili kolorektal kanser (KAK), inflamatuar barsak hastalığı (IBD) olan hastalarda uzun süreli, tekrarlanan bağırsak hasarının bir sonucu olarak ortaya çıkar3,4, daha yüksek bir malign derece ve daha genç yaşta multifokal prezentasyon eğilimi ile karakterizedir. Bu faktörler nedeniyle, CAC genellikle daha az olumlu klinik sonuçlarla daha agresif tedavi gerektirir5. CAC, en azından kısmen mutasyonların edinilmesinin benzersiz zamanlaması ve inflamatuar immün mekanizmaların ve mikrobiyomun büyük rolü nedeniyle ayrı bir antite olarak kabul edilse de, CAC ve sporadik CRC, genel genomik manzaralar ve patogenetik özellikler açısından birçok benzerliği paylaşır. Genel olarak KRK ve özel olarak CAC anlayışımızı ilerletmek ve terapötik stratejileri geliştirmek için sağlam klinik öncesi modeller gereklidir.

CRC'yi incelemek için kullanılan çeşitli modeller arasında, AOM/DSS kaynaklı CAC modeli en yaygın olarak benimsenen modeldir ve mevcut altın standart 6,7 olarak kabul edilir. AOM tarafından verilen güçlü bir mutajenik hakaretle başlatılan bu model, CAC8 için iyi bilinen risk faktörleri olan Crohn hastalığı ve ülseratif kolit gibi insan IBD'sini yakından taklit eden tekrarlanan DSS'nin neden olduğu kolit nöbetlerine dayanır. AOM/DSS modeli, diğer in vivo yaklaşımlara göre birçok önemli avantaj sunar. Yan ve hatta ortotopik tümörler oluşturmak için ekzojen kanser başlatıcı materyalin enjeksiyonuna dayanan yöntemlerin aksine, AOM / DSS'nin neden olduğu CAC otoktondur, yani tümör başlangıcı endojen olarak gerçekleşir ve kanser ilerlemesi doğal doku mikroçevresinde ortaya çıkar ve biyolojisini ve doğal tarihini daha yakından yansıtır. İnsan hücre hatlarının veya yalnızca bağışıklığı baskılanmış farelerde yetiştirilebilen hastadan türetilmiş materyalin ksenogreftlerinin aksine, kanser-bağışıklık etkileşimlerinin incelenmesini sağlayan immün yetmezliklidir. Spesifik genetik sürücülere sahip tümörler üreten genetik olarak tasarlanmış modellerin aksine, önceden tanımlanmış mutasyonlara karşı agnostiktir ve kanser sinyal yollarının ve bağışıklık eğitim mekanizmalarının daha geniş bir modellemesine izin verir. Son olarak, AOM/DSS modeli birçok farklı fare türüne kolayca uyarlanabilir, bu da uzun üreme planlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak hem zaman hem de maliyet etkin hale getirir. Bununla birlikte, hayvan cinsiyeti, DSS dozu ve bağırsak mikrobiyotasındaki farklılıklar gibi faktörler, tekrarlanabilirliği etkileyen ve translasyonel araştırmalarda uygulanmasını zorlaştıran değişkenliğe neden olabilir.

Kolon iltihabı ve CAC tümörigenezi derecesindeki tutarsızlıkları destekleyen bu faktörlerin etkisini azaltmak için bu protokolü iyileştirmeyi amaçladık. Akut inflamasyon, kolit veya kronik inflamasyonu indüklemek için kullanılan DSS konsantrasyonlarında ve CAC 9,10'da önemli değişkenlik vardır. DSS bir polimerdir ve ortalama moleküler ağırlık, partiler ve üreticiler arasında değişebilir ve bu da deneysel sonuçlardaki değişkenliği etkiler. Bu nedenle, çalışmalar arasında tutarlılığı sağlamak için her bir DSS partisini test etmek önemlidir. Ek olarak, DSS'nin neden olduğu inflamasyonun kapsamı, dünyadaki fare tesisleri arasında ve hatta aynı kurum içindeki farklı tutma yerleri ve koloniler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilen bağırsak mikrobiyomundan büyük ölçüde etkilenir11,12. Mikrobiyal bileşimdeki bu değişkenlik, modelin sonuçlarını etkileyebilir ve tutarsız sonuçlara katkıda bulunabilir13. Farklı deney gruplarından hayvanların birlikte barındırılması, mümkün olduğunda, değişkenliği azaltmak için kritik öneme sahiptir, ancak mikrobiyal topluluklar zamanla stokastik sürüklenmeye uğradığından ve kronik inflamasyon modellerinde kafes etkilerine yol açtığından, bu karışıklığı gidermek için yeterli olmayabilir14. AOM/DSS protokolü, kronik inflamasyonu sürdürmek için uzun süreli tedavi içerdiğinden, AOM/DSS ile tedavi edilen hayvanları barındıran tüm kafeslerdeki yatakları periyodik olarak karıştırarak mikrobiyota homojenizasyonunu uyguladık. Bu uygulama, mikrobiyota ortamının homojenize edilmesine yardımcı olarak deneysel değişkenliğin azalmasına neden olur. Ayrıca, gözlemler, DSS'nin etkilerinin hayvan cinsiyetine15,16 göre değişebileceğini ve potansiyel olarak iltihaplanma ve kanser gelişiminde farklı tepkilere yol açabileceğini göstermektedir. Her iki cinsiyet için uygun bir DSS dozu seçmek için dişi ve erkek farelerde DSS'yi ayrı ayrı titre ederek, daha düzgün sonuçlar sağlayarak ve hem erkek hem de dişi farelerde optimal numune boyutlarını belirlemek için istatistiksel güç hesaplamaları için kritik girdiler sağlayarak mevcut protokolü geliştirdik.

Genel olarak, AOM/DSS modelinin tekrarlanabilirliğini artırmak için, bu kafa karıştırıcı faktörleri hesaba katan ve azaltan standartlaştırılmış bir dizi protokol yönergesinin ana hatlarını çiziyoruz. Mikrobiyom homojenizasyon tekniklerini kullanmanın yanı sıra, daha tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hassas DSS dozaj ayarlamasını tanımlıyoruz, böylece AOM / DSS modelinin faydasını ve farklı çalışmalarda uyumlaştırmayı geliştiriyoruz. Protokolümüz, mikrobiyota ile homojenize edilmiş kafeslerden daha az değişkenlik gösterdiğini göstermesi ile öne çıkıyor ve bu tekrarlanabilirlik uygulamalarının uygulanması için açık, adım adım talimatlar sağlıyor. Sonuç olarak, bu protokol iyileştirmelerinden etkilenen daha düşük grup içi değişkenlik, deney grupları arasındaki farklılıkları tespit etmede istenen istatistiksel gücü elde etmek için gerekli olan örneklem boyutlarında bir azalmaya yol açar. Bu optimize edilmiş protokol, tümör oluşumu mekanizmalarını, terapötik hedefleri incelemek veya bağışıklık hücresi dinamiklerini keşfetmek için suş veya cinsiyet geçmişinden bağımsız olarak AOM/DSS modelini kendi fare modellerine ve deneysel tasarımlarına uyarlamayı amaçlayan araştırmacılar için özel olarak tasarlanmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, insancıl muamele ve etik standartlara bağlılığı sağlamak için kurumsal olarak onaylanmış bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Burada açıklanan çalışmalar Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. DSS dozajlamasının optimizasyonu

  1. Ana deneyde kullanılacak yaş, suş ve kaynağın farelerini, eşit erkek ve dişi dağılımı ile elde edin. Bireysel izleme için her fareyi kulak yumruğu, kuyruk işareti veya onaylanmış başka bir yöntemle etiketleyin. Her hayvanın ilk vücut ağırlığını ölçün ve kaydedin.
    NOT: Erkek fareler sütten kesilmeden önce birlikte barındırılmalı ve kavgayı en aza indirmek için kafesler arasında yeniden dağıtılmamalıdır.
  2. Otomatik sulama kullanılıyorsa, bir deneye başlamadan bir hafta önce, hayvanları su şişelerine geçirin ve aynı anda kafes nozullarını (kafesteki metal yudum tüpleri) steril tapalarla bloke edin.
    NOT: Engellenmiş otomatik içme suyu nozulları gibi su dağıtımındaki herhangi bir değişikliğin, IACUC veya hayvanların insancıl kullanımını denetleyen uygun düzenleyici kurum tarafından onaylandığından emin olun. Hayvan kafesleri, içme suyuna kesintisiz erişim sağlamak için günlük kontroller gerektirebilir.
  3. DSS'yi otoklavlanmış steril içme suyunda %1,5 ila %5 (a/h) arasında değişen konsantrasyonlarda, manyetik bir karıştırma çubuğu ve bir karıştırma plakası kullanarak çözerek DSS çözeltisini hazırlayın. DSS tozunun suda tamamen çözünmesi için oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin. DSS suyunu her hafta taze olarak hazırlayın ve 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.
  4. İki adet 50 mL'lik konik tüpü her konsantrasyonda DSS suyla doldurun (biri erkekler, biri dişiler için) ve sızıntıyı önlemek için otoklavlanmış steril bir içme ağzını güvenli bir şekilde takın.
  5. Dişi ve erkek farelere her konsantrasyonda DSS suyu uygulayın, her kafeste 3 fare aynı konsantrasyonu alır. Negatif kontrol olarak DSS olmadan steril içme suyu kullanın. DSS suyunu iki günde bir değiştirin.
  6. DSS suyunu 7 gün boyunca uygulayın. Her farenin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin.
  7. 8. Günde, tüm hayvanları normal içme suyuna geri döndürün.
  8. 8. Günde,17 ve rekor skorları gibi standart bir puanlama sistemi kullanarak dışkı tutarlılığına dayalı olarak ishalin şiddetini değerlendirin. "1"i yumuşak ama hala oluşmuş dışkı topağı, "2"yi çok yumuşak dışkı peleti ve "3"ü ishal olarak puanlayın.
  9. 8. Günde, 2-3 taze dışkı topağı toplayın ve gizli kan varlığını değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu). Numunede kan olup olmadığını kaydedin.
  10. Dışkı tutarlılığı (0-3) ve dışkıda kan varlığı (0-3) olmak üzere iki puanlama kriterinin bir kombinasyonuna dayanarak bağırsak kanamasını değerlendirin ve toplam puan 0 ile 6 arasında değişir.
  11. 9. günden 12. güne kadar, her farenin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin ve DSS ile tedavi edilen hayvanları önemli vücut ağırlığı kaybı ve şiddetli ishal açısından yakından izleyin. Onaylanmış hayvan kullanım protokolüne ve belirlenmiş etik yönergelere göre karbondioksit (CO2) boğulması veya başka bir uygun yöntemle insani uç noktalara ulaşan veya aşan hayvanları derhal ötenazi yapın.
  12. 13. günden 18. güne kadar, hayvanları izlemeye devam edin ve deney öncesi seviyelere tamamen iyileşene kadar her farenin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin.
  13. Optimal DSS konsantrasyonunu belirleyin, çünkü bu, yumuşak ancak hala şekillendirilmiş dışkı ile birlikte yaklaşık% 20 vücut ağırlığı kaybına neden olur. Optimal DSS dozu erkekler ve dişiler, fare suşları, yaşlar, DSS lotları ve hayvan tesisleri arasında değişebilir.

2. CAC indüksiyonu

  1. Gün 0-6: AOM tedavisi Gün 7-28: DSS tedavisinin 1. döngüsü
    1. AOM stok hazırlama: 10 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için AOM tozunu steril tuzlu su içinde çözün. Çözeltiyi 0.45 μm'lik bir filtreden süzün, 1 mL alikotları 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine dağıtın ve -80 ° C'de bir yıla kadar saklayın.
      NOT: AOM uçucu bir kanserojendir ve üreticinin güvenlik tavsiyelerine uyularak uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile bir biyogüvenlik başlığı altında dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. AOM ve AOM ile kirlenmiş malzemeler, kurumun tehlikeli kimyasal atık bertaraf protokollerine uygun olarak imha edilmelidir. Gerekli çevre sağlığı ve güvenliği onaylarını önceden almak araştırmacının sorumluluğundadır.
    2. Otomatik kafes sulama kullanılıyorsa, deneyin başlamasından 1 hafta önce, otomatik içme suyu ağzını bloke edin ve adım 1.2'deki gibi hayvanları iklimlendirme için su şişelerine geçirin.
    3. 0. Günde, gereken toplam AOM miktarını hesaplamak için her farenin vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Daha sonra, 10 mg / kg'lık bir doz elde etmek için her bir hayvanın ağırlığına bağlı olarak toplam AOM hacmini (1 mg / mL nihai çalışma konsantrasyonu) hesaplayın, ör. 20 g'lık bir fare için 200 μL.
    4. Her kullanımdan önce buz üzerinde gerekli sayıda 10 mg / mL AOM yeni alikotu çözün. 1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için her 1 mL AOM alikotunu 9 mL steril salin ile seyreltin.
    5. AOM'yi intraperitoneal enjeksiyon yoluyla farelere uygulayın. Optimum koruma için çift eldiven ve N95 maskesi gibi uygun KKD'leri giyerken bu prosedürü bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.
      DİKKAT: Kalan AOM solüsyonunu tehlikeli kimyasal atık bertaraf gerekliliklerine uygun olarak atın.
    6. 3. Günde, AOM ile tedavi edilen hayvanları temiz kafeslere aktarın. Koruma için AOM ile kirlenmiş kafesleri ve diğer malzemeleri tutarken uygun KKD giyin.
      DİKKAT: Kirlenmiş kafes yataklarını ve kalan yiyecekleri kurumun onaylı tehlikeli kimyasal atık imha prosedürlerine göre atın.
      NOT: AOM ve metabolitleri, uygulamadan72 saat sonra 18 tamamen atılır, bu noktada kirli kafes yatakları atılabilir.
    7. 7. Günde, kafesten kafese değişkenliği en aza indirmek için bağırsak mikrobiyotası homojenizasyonu gerçekleştirin. Bunu yapmak için, her kafesten yatakların %25'ini örnekleyin, iyice karıştırın ve her kafese geri dağıtın.
      NOT: DSS tedavisinin yapıldığı hafta boyunca ve sonraki beş gün boyunca kafes değiştirmekten kaçının. Gerektiğinde tesisin hayvan kafesi değiştirme servisi ile koordinasyon sağlayın.
    8. Uygun nozullarla donatılmış 50 mL konik tüpler kullanarak içme suyunda DSS sağlayarak kolit indüksiyonunu başlatın. Hayvanların DSS suyuna sınırsız erişimi olduğunu doğrulamak için fareleri günlük olarak kontrol edin. DSS suyunu iki günde bir değiştirin. Her farenin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin.
    9. 14. Günde, DSS suyunu normal içme suyu şişeleriyle değiştirin. Hayvanları ağrı ve sıkıntı açısından yakından izlemeye devam edin.
    10. 14-19. günlerde, her fareyi günlük olarak tartın. Vücut ağırlığının %25'inden fazlasını kaybeden veya bir hayvanın onaylanmış hayvan bakımı ve kullanım protokolünde belirtilen insani uç noktalardan herhangi birine ulaştığı hayvanlara ötenazi yapın. Ek olarak, herhangi bir rektal kanama vakasını izleyin ve kaydedin.
  2. 7-28. Gün: DSS tedavisinin 1. döngüsü
    1. 7. Günde, kafesten kafese değişkenliği en aza indirmek için bağırsak mikrobiyotası homojenizasyonu gerçekleştirin. Bunu yapmak için, her kafesten yatakların %25'ini örnekleyin, iyice karıştırın ve her kafese geri dağıtın.
      NOT: DSS tedavisinin yapıldığı hafta boyunca ve sonraki beş gün boyunca kafes değiştirmekten kaçının. Gerektiğinde tesisin hayvan kafesi değiştirme servisi ile koordinasyon sağlayın.
    2. Uygun nozullarla donatılmış 50 mL konik tüpler kullanarak içme suyunda DSS sağlayarak kolit indüksiyonunu başlatın. Hayvanların DSS suyuna sınırsız erişimi olduğunu doğrulamak için fareleri günlük olarak kontrol edin. DSS suyunu iki günde bir değiştirin. Her farenin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin.
    3. 14. Günde, DSS suyunu normal içme suyu şişeleriyle değiştirin. Hayvanları ağrı ve sıkıntı açısından yakından izlemeye devam edin.
    4. 14-19. günlerde, her fareyi günlük olarak tartın. Vücut ağırlığının %25'inden fazlasını kaybeden veya bir hayvanın onaylanmış hayvan bakımı ve kullanım protokolünde belirtilen insani uç noktalardan herhangi birine ulaştığı hayvanlara ötenazi yapın. Ek olarak, herhangi bir rektal kanama vakasını izleyin ve kaydedin.
  3. 29-49. Gün: DSS tedavisinin 2. döngüsü
    1. Adım 2.2.1-2.2.4'teki prosedürlerin aynısını izleyerek DSS uygulaması ile birlikte mikrobiyota homojenizasyonunu tekrarlayın. İsteğe bağlı: İkinci ve/veya üçüncü DSS döngüsünü takiben, daha önce tarif edildiği gibi kolonoskopi yapın19.
  4. 50-70. Gün: DSS tedavisinin 3. döngüsü
    1. Adım 2.2.1-2.2.4'teki prosedürlerin aynısını izleyerek DSS uygulaması ile birlikte mikrobiyota homojenizasyonunu tekrarlayın. Fareler, DSS'nin üçüncü döngüsünden üç gün sonra en fazla kilo verme eğiliminde olduklarından, tüm hayvanları aşırı vücut ağırlığı kaybı veya bu süre zarfında herhangi bir rektal kanama belirtisi açısından yakından izleyin ve belirtilirse destekleyici bakım için nemli yem sağlayın.

3. Kolit şiddeti ve CAC brüt patolojisinin değerlendirilmesi

  1. 70. Günde, kolit şiddetini değerlendirmek için gizli kan ve/veya lipokalin-220 gibi iltihap belirteçlerinin varlığını test etmek için her fareden 2-3 taze dışkı topağı toplayın. Uygun reaktifler/kitler kullanın (malzeme ve ekipman listesine bakın) ve aşağıda kısaca özetlenen tahlilleri gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarını izleyin.
  2. Enflamasyon belirteci lipokalin-2 seviyelerinin değerlendirilmesi için dışkı örnekleri hazırlamak için, taze dışkı peletlerini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Peletleri, homojen bir çözelti elde edilene kadar bir girdap karıştırıcı kullanarak 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. Çözeltiyi 10.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatant, lipokalin-2 ELISA için hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de saklanabilir.
  3. Fare lipocalin-2 ELISA'yı kit üreticisinin talimatlarına göre gerçekleştirin. Dışkı örneklerinin standartlara göre en uygun seyreltilmesini belirlemek için pilot seri seyreltme deneyleri yapın.
    NOT: Lipokalin-2 seviyelerinin, DSS ile tedavi edilen farelerde, su ile muamele edilen kontrol hayvanlarına kıyasla en az1000 kat artması beklenmektedir 20.
  4. Adım 1.8-1.10'da açıklandığı gibi bir ishal skorlama sistemi17 kullanarak kolit şiddetini değerlendirin.
  5. 70. günde, hayvanları CO2 asfiksiyonu veya onaylanmış başka bir insancıl yöntem kullanarak ötenazi yapın.
  6. Sonraki adımlarda kontaminasyonu en aza indirmek için her hayvanın karın bölgesine% 70 etanol püskürtün.
  7. Cildi ve periton tabakasını kaldırmak için ince cerrahi forseps kullanın. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için makasla yatay bir kesi yapın.
  8. İnce bağırsağı dışarı çekin ve çekumu tanımlayın. Forseps kullanarak çekum ve kolonu nazikçe kaldırın. Mezenteri ve ilgili damar sistemini makas kullanarak keserek, kolonu delmekten veya kesmekten kaçınarak kolonu dikkatlice inceleyin.
  9. Tam distal kolonu ortaya çıkarmak için pelvik kemiği ve rektal-anal bölgeyi çevreleyen cildi kesin. Çoğu tümör tipik olarak bu bölgede meydana geldiğinden, tüm kolonu distal kısım sağlam olarak incelemek önemlidir.
  10. Kesilmiş kolonu temiz bir filtre kağıdı şeridine yerleştirin ve nazikçe düzeltin.
  11. İki nokta üst üste uzunluğunu bir cetvelle ölçün ve bir fotoğrafla belgeleyin. Ölçek için cetveli fotoğrafa dahil edin.
  12. Kolonun dış tarafındaki Peyer yamalarını temizleyin ve dokuyu delmemeye dikkat edin.
  13. Kolonu soğuk steril PBS'de durulayın.
  14. 200 μL'lik bir mikropipet ucunu (filtresiz) parafin film kullanarak 3 mL'lik bir şırıngaya sabitleyin. Şırıngayı steril PBS ile doldurmak, pipet ucunu kolon lümenine yerleştirmek ve dışkı peletlerinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için kolonun içeriğini 2-3 kez nazikçe yıkamak için bu kurulumu kullanın.
  15. Temiz, önceden ıslatılmış bir filtre kağıdı şeridi üzerine iki nokta üst üste nazikçe gerin. Kolonu uzunlamasına kesin ve filtre kağıdının üzerine düz bir şekilde yerleştirin.
  16. Tipik olarak kolon duvarından çıkıntı yapan, iltihaplı, kırmızı bir görünüme sahip belirgin kabarcıklar olarak ortaya çıkan daha büyük tümörleri tanımlayın.
  17. Daha küçük tümörler için, tanımlama sırasında daha fazla dikkat edin. Herhangi bir düzensizlik veya çarpma için kolonun yüzeyini nazikçe araştırmak için steril bir bakteri tohumlama halkası kullanın. Tespit edilen herhangi bir şişliğin, kolon duvarının dışında bulunan lenf nodlarının veya kan damarlarının kalıntıları olmadığını onaylayın.
  18. Her tümörün genişliğini ve uzunluğunu ölçmek için dijital kumpaslar kullanın.
  19. Tümör sayısını ve her tümörün boyutunu ve konumunu önceden basılmış bir kolon haritasına kaydedin.

4. Histoloji değerlendirmesi

  1. Distal kolonun her iki lateral ucunu kavramak için iki çift ince uçlu forseps kullanın. Kolonu distal uçtan proksimal uca kadar başka bir yerde tarif edildiği gibi bir İsviçre rulosu şekline yuvarlayın21. Distal ucun rulonun merkezinde olduğundan ve proksimal ucun en dış katmanı oluşturduğundan emin olun.
  2. İsviçre tarafından haddelenmiş her kolonu 271/2-G iğne kullanarak sabitleyin.
  3. Her güvenli İsviçre haddelenmiş kolonu uygun şekilde etiketlenmiş bir doku kasetine yerleştirin.
  4. İsviçre haddelenmiş kolonları içeren doku kasetlerini steril PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) içine daldırın. Dokuların 24 saat boyunca fiksatifte kalmasına izin verin.
  5. 24 saat sonra dokuları% 70 etanole aktarın. Dokular %70 etanol içinde 4 ° C'de üç aya kadar tutulabilir.
  6. Swiss-roll, konvansiyonel hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, immünohistokimya ve immünofloresan dahil olmak üzere çoklu histopatoloji incelemeleri için kullanılabilir.

5. Tümörlerden ve çevresindeki kolondan protein ve RNA izolasyonu için doku hasadı

  1. Buz üzerinde çalışın ve biyolojik materyalin bütünlüğünü korumak için önceden soğutulmuş tüpler ve reaktifler kullanın.
  2. Tümör değerlendirmesinden sonra, tümörleri inceleyin ve buz üzerinde uygun tampon (aşağıya bakınız) ile önceden soğutulmuş, önceden etiketlenmiş tüplere toplayın. Deneysel tasarıma bağlı olarak, aynı hayvandan alınan tüm tümörleri bir araya getirin veya ayrı ayrı işleyin. İstenirse, benzer şekilde çevredeki tümör olmayan kolon dokusundan ~ 1 cm'lik parçalar toplayın.
  3. Protein izolasyonu
    1. Her bir doku homojenizasyon tüpüne 0.5 mL 800 μm öğütme cam boncukları ve 400 μL lizis tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ile 150 mM NaCl'de %1 NP-40 ve %1 proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin ve kolon/tümör dokusunu her tüpe aktarın.
    2. 30 s boyunca 6 M/S'de boncuk bazlı bir doku homojenizatörü kullanarak kolon/tümör dokusunu homojenize edin, tam homojenizasyon için iki kez tekrarlayın.
      NOT: Mekanik homojenizasyondan kaynaklanan numunenin aşırı ısınmasını önlemek için tüpleri döngüler arasında buzun üzerine yerleştirin.
    3. Homojenizasyondan sonra, 150 μL lizatı (süpernatant) aspire edin ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    4. Çözünmeyen herhangi bir materyali peletlemek için lizatı 4 ° C'de 10.000 g'da döndürün. İsterseniz süpernatanı temiz bir tüpe aktarın.
    5. Bikinkoninik asit (BCA) testi veya başka bir uygun yöntemle toplam protein konsantrasyonunu ölçün.
    6. İstenirse, aynı lizis tamponuna sahip her numune için toplam protein konsantrasyonunu 4 mg / mL'ye ayarlayın.
    7. İmmünoblotlama veya sitokin analizi gibi aşağı akış testleri için hemen protein lizatları kullanın veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
  4. RNA saflaştırması:
    1. Diseksiyondan sonra, kolon / tümörleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin ve 200 μL uygun RNA koruma reaktifine batırın.
      NOT: Duraklama noktası: taze kolon/tümör dokusu sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulabilir ve daha sonraki işlemler için -80°C'de saklanabilir
    2. Kolon/tümör dokusunu buz üzerinde çözün.
    3. Kolonu / tümörü, RNA izolasyonu için uygun 500 μL uygun lizis tamponu ve 200 μL öğütme cam boncukları içeren bir doku homojenizasyon tüpüne aktarın.
    4. Boncuk bazlı bir doku homojenizatörü kullanarak 6 M/S'de 30 saniye boyunca üç kez, her döngü arasında iki dakikalık bir ara verecek şekilde homojenize edin.
      NOT: Mekanik homojenizasyon sırasında RNA bozulmasının aşırı ısınmasından kaynaklanan deformasyonu önlemek için tüpü döngüler arasında buz üzerine aktarın.
    5. 300 μL lizatı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Gerektiği gibi uygun RNA saflaştırma prosedürünü kullanarak toplam RNA'yı izole edin. RNA konsantrasyonunu, saflığını ve kalitesini/bütünlüğünü aşağı akış kullanımı için uygun şekilde ölçün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney koşullarımız için DSS doz optimizasyonu gerçekleştirdik. DSS dozajının her hayvan tesisi, fare suşu, çalışma tasarımı ve DSS lotu için yeniden kalibre edilmesi gerekir. Bu çalışma için, C57BL / 6J fareleri, ad libitum standart ışınlanmış% 18 protein kemirgen diyeti ile havalandırılan kafeslerde spesifik bir patojen içermeyen vivaryuma yerleştirildi. Hem erkek hem de dişi fareler, DSS suyuna yerleştirildikten sonra 5. günden itibaren kilo vermeye başlar ve DSS'nin çekilmesinden üç gün sonra en düşük kilolarına ulaşırlar (Şekil 1A, C). En büyük kilo kaybının olduğu günde, erkek fareler yaklaşık% 15 kilo kaybı gösterirken, dişi fareler yaklaşık% 20 kilo kaybı gösterdi (Şekil 1B, D). Bu sonuçlara dayanarak, spesifik deney koşullarımız için optimal dozun kadınlar için% 3.0 ve erkekler için% 3.25 olduğunu belirledik. AOM / DSS için tedavi programı Şekil 2A'da özetlenmiştir ve kafes etkilerini ve değişkenliğini azaltmak için deney sona erene kadar her DSS tedavi döngüsünün başlangıcında mikrobiyom homojenizasyonu meydana gelir. Deneyin tüm süresi boyunca hayvan kilo kaybı ve geri kazanımının tipik dinamikleri Şekil 2B'de gösterilmektedir. Hayvanlar, DSS uygulamasının kesilmesini takip eden iki hafta içinde orijinal vücut ağırlığına tamamen geri döner. İyi kalibre edilmiş bir DSS kolit modeli, ishal yerine yumuşak ancak yine de oluşmuş dışkı peletleri ile sonuçlanır (dışkı tutarlılık skoru 1-2), dışkıda ara sıra subklinik kanamayı gösteren gizli kan tespiti ve dışkıda az sayıda görünür kan vakası (kan varlığı skoru 1-2)17. Kolitin şiddetini daha fazla değerlendirmek için, inflamatuar belirteç lipokalin-2 seviyelerini analiz etmek için dışkı örnekleri toplandı. DSS ile tedavi edilen hayvanlardan farklı olarak, deney boyunca düzenli içme suyu alan farelerde gizli kan varlığı tespit edilmemiştir (Şekil 2C). Tutarlı bir şekilde, lipokalin-2 seviyeleri, AOM / DSS ile tedavi edilen farelerde, AOM / sadece su kontrollerine kıyasla yaklaşık 1.000 kat artmıştır (Şekil 2D).

Son noktada, kolonları diseke ettik ve bir tümör kayıt haritası kullanarak tümörleri saydık (Şekil 3A). DSS-kolit, AOM / sadece su kontrollerinin aksine, önemli ölçüde daha kısa bir kolon uzunluğu ile sonuçlanır (Şekil 3B). Ayrıca, AOM / DSS ile tedavi edilen hayvanlarda, çoğu distal uçta oluşan görünür kolon tümörleri gelişir (Şekil 3C). H&E ile boyanmış kolon kesitlerinin histolojik incelemesi, AOM / DSS farelerinde önemli epitel hücre erozyonu, immün infiltrasyon ve ülserasyon gösterdi (Şekil 4A). Kolon histopatolojisinin şiddeti, DSS'nin neden olduğu murin CAC için dört parametreye dayalı olarak yerleşik skorlama sistemleri kullanılarak ölçülebilir (Şekil 4B): immün infiltrasyon ve ödem (0-3), ülserasyon (0-3), kolonik epitel morfolojisi (0-4) ve neoplazmlar (0-4)22,23,24. Şekil 4A'daki histoloji örneklerine uygulanan bu tür değerlendirmelerin sonuçları Şekil 4C'de sunulmaktadır. Kolon epitel proliferasyonu, Ki67 boyaması kullanılarak immünohistokimyasal analiz ile değerlendirildi ve DSS tedavisinin kolon epitel hücrelerinin proliferasyonunu desteklediğini gösterdi. Ek olarak, kolon bölümleri, anjiyogenez markörü CD31 gibi çeşitli belirteçlerin immünofloresan boyaması için kullanılabilir (Şekil 4D, E).

Mikrobiyota homojenizasyonunun, her bir hayvanda kolon iltihabının büyüklüğü, vücut ağırlığı kaybı ve kümülatif tümör yükü gibi deneysel uç noktalar üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirdik. Bir grup fare, mikrobiyota homojenizasyonunu sağlamak için 0. günde kirli yatakların karıştırılması ve yeniden dağıtılmasına tabi tutulan kafeslerde barındırıldı ve bu manipülasyonun ihmal edildiği kafeslerde kontrol hayvanları ile birlikte barındırıldı. Her iki gruptaki hayvanlara 7 gün boyunca% 2.5 DSS suyu verildi. 8. günde kafes başına dışkıda inflamatuar belirteç lipokalin-2'nin ortalama seviyeleri gruplar arasında anlamlı farklılık göstermezken (Welch t-testi), mikrobiyota homojenizasyonu uygulanan kafeslerde veri noktaları arasında anlamlı derecede düşük değişkenlik gözlendi (Şekil 5A, varyansları karşılaştırmak için Welch'in F-testi, p<0.0001). Tutarlı bir şekilde, 8. güne kadar, tüm hayvanlar 0. gün taban çizgisine kıyasla benzer derecede vücut ağırlığı kaybı sergiledi. Bununla birlikte, mikrobiyota homojenizasyon grubundaki fareler, kontrol grubuna kıyasla vücut ağırlığı kaybında daha az değişkenlik göstermiştir (Şekil 5B). Ayrıca, her DSS döngüsünden önce (mikrobiyota homojenizasyonu) ve (kontrol) kafes yatağı karışımı olmadan 10 haftalık bir CAC indüksiyon protokolünde (Şekil 2A), fare başına kümülatif tümör yükü, mikrobiyota homojenize edilmiş grupta, önemli ölçüde daha değişken olan kontrollere kıyasla daha tutarlıydı (Şekil 5C). Genel olarak, bu veriler, mikrobiyota homojenizasyonunun AOM/DSS modelinin sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini güçlü bir şekilde geliştirdiğine dair güçlü kanıtlar sunmaktadır.

figure-results-1
Şekil 1. Erkek ve dişi farelerde DSS doz titrasyonu. (AD) Belirtilen DSS konsantrasyonları ile su üzerinde tutulan 14 haftalık erkek (A, B) ve dişi (C, D) C57BL / 6J vahşi tip farelerde 0. güne göre vücut ağırlığı değişimi yüzdesi (% 1.5,% 2,% 2.5, erkekler için% 3 ve% 2,% 3, kadınlar için% 4). (A, C) Hayvanlara 7 gün boyunca DSS uygulandı ve 12 güne kadar vücut ağırlığı kaybı izlendi. B ve D, DSS tedavisinin başlangıcından itibaren 8. günde (B) erkek farelerin ve 9. günde (D) dişi farelerin vücut ağırlığı kaybını gösterir. Veriler SEM ± ortalamalar olarak sunulur; A ve B'de n=3, C ve D'de n=4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. AOM/DSS kaynaklı CAC zaman çizelgesi ve izleme. (A) AOM/DSS kaynaklı CAC deneysel zaman çizelgesi. (B) Deneysel AOM / DSS ile tedavi edilen (kırmızı) veya kontrol (yalnızca AOM, DSS yok, siyah) dişi C57BL / 6J vahşi tip farelerde 0. güne göre vücut ağırlığı. Tüm hayvanlara bir doz AOM (10 mg / kg) verildi ve toplam 70 gün boyunca% 3 DSS (kırmızı) veya normal içme suyuna (kontrol, siyah) üç döngüye randomize edildi. Veriler SEM, n=2 ve 11 ± ortalamalar olarak sunulmuştur. (C) Kontrolden (yalnızca AOM) veya DSS ile tedavi edilen (AOM ve% 1.5 DSS) dişi farelerden yapılan Fekal Hemort testi. (D) 70. günde 6 kontrol (sadece AOM, siyah) veya 35 tedavi edilen (AOM ve% 1.5 DSS, kırmızı) dişi farelerden fekal lipokalin-2 seviyeleri. Veriler SEM ± ortalamalar olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Kolonların makroskopik değerlendirilmesi. (A) Tümör kayıt haritası örneği. (B) 70. günde kontrol (yalnızca AOM) veya DSS ile tedavi edilen (AOM ve% 1.5 DSS) dişi farelerden temsili kolon resimleri. Kolon uzunluğu kısalması, DSS ile tedavi edilen hayvanlarda daha fazla iltihaplanmayı gösterir. Çubuk - 5 mm; , p=0.002, Mann-Whitney sıra toplamı testi; n=12 ve 30'dur. (C) AOM ve% 3 DSS ile tedavi edilen dişi farelerden 70. günde tümörlü kolonların temsili brüt patoloji resimleri (tümörler daire içine alınmış ve siyah üçgenlerle işaretlenmiştir). Çubuk - 5 mm. Belirtme çizgisi - tümörlü distal kolon bölgelerinin genişletilmiş görünümü; çubuk - 1 mm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. CAC histoloji değerlendirmesi. (A) Sağda gösterilen 3 hayvandan genişlemiş distal bölgelerle 70. günde AOM / DSS ile tedavi edilen ve kontrol (yalnızca AOM) farelerinden İsviçre haddelenmiş kolonların temsili H ve E ile boyanmış bölümleri. Kontrol kolonları, sağlam kolonik kript organizasyonunu gösterir. AOM / DSS ile tedavi edilen farelerden elde edilen kolonlar, submukozal kalınlaşma (ok uçları), immün infiltrasyon (oklar), kript mimarisinin bozulması veya kaybı (yıldız), epitel tabakasının erozyonu, epitel hiperplazisi veya adenom ve adenokarsinom oluşumu (noktalı çizgi ile özetlenmiş) ile displastik epitel (daireler) ile karakterizedir. Bar - 500 μm. (B) CAC fenotipinin şiddetini değerlendirmek için kullanılan histopatoloji skorlama sistemi. (C) A'da gösterilen yalnızca AOM veya AOM / DSS ile tedavi edilen farelerden alınan kolon histoloji skorlarının örneği. (D) 1 veya 3 DSS döngüsünden sonra AOM ile tedavi edilen hayvanlardan İsviçre haddelenmiş kolonlarda Ki67 proliferasyon belirteci için temsili immünohistokimya boyama. Çoğalan Ki67 pozitif hücreler (kahverengi) kolonik kriptlerin dibinde lokalize olur, ancak yukarı doğru yayılır ve CAC başlangıcı ve daha ileri patoloji ile kriptlerin içinde istila eder. Çubuk - 100 μm. (E). CD31 endotel belirtecine (kırmızı) dayalı vaskülarizasyonu değerlendiren temsili immünofloresan boyama ve AOM / DSS ile tedavi edilen farelerden kolon kesitlerindeki çekirdekleri (mavi) görselleştirmek için DAPI ile karşı boyanmıştır. Çubuk - 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Mikrobiyota homojenizasyonu kolon iltihabı ve CAC tümör yükündeki değişkenliği azaltır. (A) 8. günde% 2.5 DSS ile tedavi edilen farelerde ortalama fekal lipokalin-2 seviyeleri. İki grup arasında ortalama fekal lipokalin-2 düzeylerini karşılaştırmak için Welch t-testi kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı (p=0.137, n=6 ve 12 kafes). Ek olarak, varyanslar üzerinde bir F-testi yapıldı ve 0.0001'lik bir p değeri verdi ve iki grup arasındaki varyansta önemli farklılıklar olduğunu gösterdi. (B) 8. günde DSS suyu alan AOM / DSS ile tedavi edilen hayvanlarda ortalama vücut ağırlığı kaybı. İki grup arasındaki ortalama vücut ağırlığı kaybı anlamlı olarak farklı olmasa da (Welch t-testi, p=0.194, n=6 ve 12), gruplar arasındaki varyans anlamlı olarak farklıydı (F-testi, p=0.027). (C) 10 haftalık AOM / DSS tedavisinden sonra fare başına tümör yükü. İstatistiksel analiz, gruplar arasındaki ortalama tümör yükü farklılıklarını değerlendirmek için Welch t-testi (p=0.211, n=8 ve 18) ve varyanslar arasındaki farkı değerlendirmek için F-testi (p=0.013) kullanılarak yapıldı. (A-C) Mavi keman grafikleri mikrobiyota homojenizasyonu yapılan grubu gösterirken, yeşil keman grafikleri kontrol grubunu (mikrobiyota homojenizasyonu olmadan) temsil eder, ns - anlamlı değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOM/DSS protokolü ilk olarak 1996 yılında Okayasu ve ark.25 tarafından tanıtılmıştır ve o zamandan beri, Suzuki ve ark.2006 26, özellikle kolon iltihabı bağlamında, kolon kanserinin normal dokudan adenomatöz değişikliklere ve nihayetinde karsinoma başlamasını ve ilerlemesini sadık bir şekilde taklit etmek için mükemmel bir model olarak kabul edilmiştir. Sonraki çalışmalar, AOM ve AOM/DSS'nin farklı fare suşları üzerindeki etkilerinin yanı sıra değişen tedavi sürelerinin tümör fenotipi ve penetransı üzerindeki etkisini değerlendirdi 26,27,28. 2018'de Christopher Williams ve grubu, bu metodolojinin geliştirilmesi için çok önemli bir temel oluşturan güncellenmiş bir protokol29 yayınladı. Son gelişmeler, bağırsak immün infiltratlarının izolasyonu ve akış sitometrisi30 yoluyla immünofenotipleme yöntemlerini entegre ederek mukozal bağışıklık çalışmaları için AOM / DSS modelinin faydasını daha da göstermiştir.

AOM / DSS protokolünün en güçlü yönlerinden biri, hemen hemen her fare türüne kolayca uyarlanabilir olmasıdır ve bu da farklı genetik geçmişlerin etkilerinin araştırılmasını sağlar. Bu nedenle, Suzuki ve ark. kolon adenom penetransını bir okuma olarak kullanarak dört farklı fare suşunda AOM / DSS ile indüklenen kolon karsinogenezine duyarlılığı karşılaştırdı ve aşağıdaki sonuçlarla karşılaştırdı: BALB / c > C57BL / 6N > DBA / 2N = C3H / HeN26. Ek çalışmalar, FVB / N farelerinin, C57BL / 6J ve 129 / SvJ suşlarına kıyasla tekrarlanan AOM tedavisinden sonra daha kolay kolon tümörleri geliştirdiğini buldu27. Özellikle, FVB / N farelerinde 10 haftalık AOM / DSS CAC indüksiyon protokolündeyaklaşık% 100 penetransa sahip iyi diferansiye kolon adenokarsinomunun gelişimi bildirilmiştir 31. Bu bulgular toplu olarak, farklı fare suşlarının AOM / DSS tedavisine eşit derecede duyarlı olmayabileceğini, tümör oluşumundaki değişikliklere katkıda bulunduğunu ve AOM / DSS protokolünün uyumlaştırılması ve fare suşları, barınma tesisleri ve diğer değişkenler arasında tekrarlanabilirlik için tutarlı bir dizi kılavuza olan ihtiyacı daha da vurguladığını göstermektedir. Bunlar arasında, bağırsak mikrobiyomundaki önemli değişkenlik, inflamasyon ve tümör penetransına odaklanan çalışmaların tekrarlanabilirliğini engellemektedir 9,10. Spesifik olarak, Duncaniella muricolitica ve Alistipes okayasuensis türleri de dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, DSS kolit13'ün şiddeti üzerinde çok büyük bir etkiye sahip olabilir. Başka bir çalışma, NLRP3 eksikliği olan farelerin, bakteriyel filum Bacteroidetes (özellikle Prevotellaceae) ve TM710'un artmış varlığı ile karakterize edilmiş alevlenmiş bir kolit fenotipi sergilediğini göstererek CAC indüksiyonunda mikrobiyota bileşiminin önemini vurgulamıştır.

Yöntemin popülaritesine rağmen, mevcut AOM / DSS protokolleri, deney grupları içindeki hayvanlar arasında gözlemlenen önemli yüksek değişkenlik sorununu ele almamıştır32. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, DSS titrasyonu (hayvan cinsiyetini dikkate alarak) ve mikrobiyota homojenizasyonunu uygulayarak protokol optimizasyonu ve uyumlaştırma için bir dizi öneri ortaya koyduk. Yaklaşımımız, AOM/DSS modelinin hayvan suşları, deneysel tasarımlar ve uç noktalar arasında değişkenliğini azaltmayı ve tekrarlanabilirliğini geliştirmeyi amaçlamaktadır. Örneklem büyüklükleri ile ilgili özel önerilerde bulunamasak da, deneysel tekrarların sayısı, belirli çalışma tasarımı ve her deney için beklenen etki büyüklükleri tarafından yönlendirilecektir. Bu iyileştirmelerle elde edilen daha düşük grup içi değişkenlik, bu farklılıkları tespit etmede aynı istatistiksel gücü elde etmek için her koşulda daha az hayvan gerektirir. Bu iyileştirmelerin, hayvanların etik kullanımını, araştırma fonlarının sorumlu bir şekilde yönetilmesini ve işgücünün azaltılmasını daha da teşvik ederek verimliliğin artmasına yol açacağını tahmin ediyoruz.

AOM/DSS modeli, insan koliti ile ilişkili kolorektal kanserin incelenmesinde önemli bir translasyonel değere sahiptir. Karmaşık etiyolojisi nedeniyle insan KRK'sini modellemenin zorlukları göz önüne alındığında, AOM/DSS modelinin sporadik KRK'nin patogenezi hakkında bazı bilgiler sağlayabilmesine rağmen, inflamasyonla ilişkili malignite çalışmaları için en uygun olduğunu vurgulamak önemlidir. Ayrıca, AOM / DSS'nin neden olduğu kanserin metastaz insidansıdüşüktür 33,34 ve bu nedenle metastatik yayılımı incelemek için uygun değildir. Bu sınırlamalara rağmen, AOM/DSS modeli son derece nüfuz edicidir, güvenilirdir, insanla ilgili histopatolojiyi gösterir ve inflamasyondan displaziye ve adenokarsinom'a kadar hastalığın ilerlemesini doğru bir şekilde taklit ederken, tüm bunları maliyet etkin tutar. Bu protokolde, mevcut iş akışlarına dayalı olarak tekrarlanabilir sonuçlar üretmek ve kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için öneriler sunuyoruz 8,35.

Biyolojik bir değişken 16,36,37 olarak hayvan cinsiyetini hesaba katan doz-yanıt pilot deneyleri yoluyla optimal DSS dozajının belirlenmesi, sağlam bir AOM / DSS protokolü oluşturmaya yönelik ilk kritik adımdır (Şekil 1). 7 gün boyunca% 3 DSS ile tedavinin, erkeklere (~% 15) kıyasla kadınlarda (~% 20) vücut ağırlığında daha anlamlı bir azalma ile sonuçlandığını bulduk (Şekil 1B, D). Bununla birlikte, erkek fareler dişilere kıyasla DSS'ye daha fazla, daha az veya eşit derecede duyarlı olabilir. Bu, farklı fare suşlarına ve hayvan tesislerindeki bağırsak mikrobiyom bileşimindeki varyasyonlara atfedilebilir ve her bir spesifik deney setine göre uyarlanmış DSS konsantrasyonunun yeniden ayarlanmasını gerektirir. Optimal DSS konsantrasyonu, tolere edilebilir toksisiteyi aşmadan kolon iltihabını en üst düzeye çıkarmak ile tümör indüksiyonu arasında bir değiş tokuştur. Deneyimlerimize göre, bu denge büyük olasılıkla ilk döngüden sonra yaklaşık% 20'lik vücut ağırlığı kaybıyla sonuçlanan DSS dozlarında elde edilir. Hayvanlar, tedavinin ikinci döngüsünde daha az kilo verme eğilimindedir, ancak DSS'nin üçüncü döngüsünde, potansiyel olarak kolondaki tümör oluşumuna bağlı olarak, vücut ağırlığında daha büyük bir azalma gözlenir. Bu nedenle, %25 vücut ağırlığı kaybı, kurumsal hayvan kullanım protokolleri için insancıl bir son nokta olarak benimsenebilir. Ayrıca, iyi kalibre edilmiş DSS koliti, ishal ve ara sıra pozitif hemokült test yerine yumuşak fakat hala oluşmuş dışkı peletleri ile sonuçlanır, ancak dışkıda az sayıda görünür kan izi vakası ile sonuçlanır ve hayvanların DSS uygulamasının kesilmesini takiben iki hafta içinde tam bir iyileşme göstermesi beklenir.

DSS, moleküler ağırlığı 36.000 ila 50.000 Da arasında değişen bir polimerdir. DSS üretimindeki partiden partiye değişkenlik nedeniyle, ürünün her yeni partisi için DSS doz yeniden kalibrasyon deneylerinin yapılması esastır. Tutarlılığı korumak için, aynı partiden satın alınacak tüm çalışma için gereken toplam DSS miktarını tahmin etmek pratiktir. Ayrıca, bu protokol aynı zamanda CAC indüksiyonu sırasında tüm deneysel fare kohortu boyunca mikrobiyota bileşimini standartlaştırmak ve böylece değişkenliği azaltmak için potansiyel kafes etkilerini azaltmak için adımları açıklar. Kafes etkilerini en aza indirmek için ek bir önlem olarak, farklı deney gruplarından hayvanların mümkün olduğunca birlikte barındırılması önerilir. Belirli deneysel hedeflere ve etik hayvan kullanım politikalarına bağlı olarak, bu hususlar pilot deneylerde yansıtılmalıdır. Mikrobiyota kayması, sızıntı yapan içme şişeleri ile ıslak bir kafesteki yatak değişiklikleri ile de çökelebilir. DSS teslimatı sırasında ve sonrasında beş gün boyunca kafes değişikliklerinden kaçınmak en iyisidir. DSS su uygulaması için 50 mL'lik tüplerin kullanılması, sızıntı riskini azaltır ve DSS israfını en aza indirir. Bu lojistik hususlar, araştırma personeli ile kafes değiştirme ve hayvancılık hizmetleri gerçekleştiren hayvan bakım teknisyenleri arasında yakın işbirliği gerektirebilir.

Bu protokolde, veri toplamanın yanı sıra doku ve hücre hasadı için temel bir iş akışı da sağlıyoruz. Bu, gizli kan varlığının test edilmesini (Şekil 2C) ve tümörlerin haritalandırılmasını (Şekil 3A) içerir. AOM/DSS modeli, immünokompetan fareler için uygundur, bu da onu, ksenogreft yaklaşımlarının aksine, tamamen sağlam bağışıklık sistemi38,39 nedeniyle tümör bağışıklık mikroçevresini keşfetmek için ideal bir sistem haline getirir. Özellikle, hücre tipine özgü gen knock-in/out'ları veya raportör kasetleri için genetik bir Cre-Lox sistemi veya spesifik hücre popülasyonlarının aşılanması veya tükenmesi yoluyla olsun, bağışıklık sisteminin veya stromal bileşenlerin deneysel bozulmasına uygundur. Bir örnek olarak, AOM / DSS modelini kemik iliği nakli ile birleştirerek, daha önce hematopoietik sistemdeki mutasyonların CAC şiddetini ve yükü40'ı nasıl modüle ettiğini araştırdık. Bu tür çalışmalara yardımcı olmak için, immünofenotipleme, fonksiyonel testler ve tek hücreli multi-omikler gibi daha ileri analizler için uygun canlı tümör infiltre eden lökositleri izole etmek için mükemmel yayınlanmış yöntemler vardır41. Son olarak, yüksek penetrasyon ve tutarlı gecikme süresi nedeniyle, AOM / DSS modeli, birincil okuma olarak toplam tümör yükünü kullanan klinik öncesi terapötik çalışmalar için uygundur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen NIH ödülleri R01 DK121831 (OAG) ve R01 AI067846 (DA) tarafından finanse edilmiştir. OAG ayrıca Edward P Evans Vakfı ve Oxnard Aile Vakfı tarafından da desteklendi. DA, Merit Society ödülü tarafından desteklenmektedir. UFHCC, NCI tarafından belirlenmiş bir kanser merkezidir (P30 CA247796).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Azoksimetan tozuSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat # A4586Kolon tümörlerini indüklemek için kanserojen
Tezgah üstü mikrosantrifüjNA  NA: Numune hazırlama için 
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı000664Her özel çalışma için uygun şekilde suş ve yaş
Konik tüpler, 50 mLFisher14955239DSS suyunu uygulamak için
Dekstran sülfat sodyum tuzu, MW ca 40.000Cayman Chemical 23250Kolon inflasyonunu indüklemek için 
Etanol, %70Fisher 43655223Çalışma yüzeylerini ve diseksiyon aletlerini sterilize etmek
için Cam boncukların taşlanması, 800 & m VWR12621-148Kolon / tümör dokusunun homojenizasyonunu kolaylaştırmak için
HemoCue America  Beckman Coulter Hemokült ICT İmmünokimyasal Dışkıda Gizli Kan Test KitiHemoCue America 395065AKatalog No.23280010Dışkıda gizli kanın tespiti için
İnsülin Şırıngası 27GX5/8 1CC BD 3294-12AOM enjeksiyonları için
Lixit blokerNANA Varsa, fare kafeslerine otomatik su dağıtımını engellemek için (hayvan tesisi tarafından sağlanır, steril) 
Manyetik karıştırma çubuğu ve karıştırma plakası NANA DSS'yi çözmek için 
Mikrotüp Boncuk Homojenizatör, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Kolon/tümörü homojenize etmek için
Fare Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& D SistemleriKatalog No.DY1857Dışkı örneklerinden lipokalin-2'yi tespit etmek için
NP-40 çözeltisi, %10Thermo Fisher Scientific85124Lizis tümörü/kolon dokusu için
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Fisher ScientificA65453Toplam doku lizatlarındaki protein konsantrasyonunu ölçmek için veya başka herhangi bir uygun yöntem
Proteaz ve fosfat inhibitörü kokteyli FisherPI78440Sitokin / protein analizi için numune hazırlamak 
RLTplus tamponQiagen1053393RNA'yı veya başka herhangi bir uygun RNA izolasyon yöntemini izole etmek için
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021RNA izolasyonundan önce doku örneklerini korumak için
RNeasy Microprep kiti QIAGEN74004RNA'yı veya uygun şekilde diğer RNA izolasyon ve saflaştırma yöntemini izole etmek için
Kemirgen Su Şişesi Nozulu (30mm)GörüşTipi ESu veya DSS solüsyonu uygulamak için
Steril makas ve forsepsNANA Dokudiseksiyonu için
Şırınga iğneleri, 27G x 1/2in uzunluk (kısa)BD 305109Kolon swiss-roll doku fiksasyonu için 
Şırıngalar, Luer kilidi, 3 mLBD 309657Diseksiyon ve evrelemeden önce kolonları yıkamak için
RNA konsantrasyonu ve kalite/bütünlük değerlendirmesi içinTapeStationAgilent
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Standart kemirgen diyeti, %18 protein, ışınlanmış
Doku kasetiVWR# 87002-472terazisini gömmek üzere numuneyi korumak için
, 0-220 gNANAHayvanları tartmak için
Whatman Kurutma KağıdıVWR InternationalCat# 28298-020Brüt patoloji ve tümör sayımı için disseke kolonları evrelemek için
Üstten yüklemeli laboratuvar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Azoksimetan DSS ModeliFare Kolon Kanserinflamasyonla li kili KanserMikrobiyota HomojenizasyonuDSS Doz TitrasyonuC57BL 6J FarelerSitokin ProfillemesiDoku leme
Video yakında

İlgili makaleler