Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Moleküler ve Hesaplamalı Çalışmalar için Araçlar Olarak Fare Meme Tümörlerinden Kanserle İlişkili Fibroblastlar

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, in vitro/in vivo fonksiyonel tahliller, transkriptomik ve hesaplamalı analiz dahil olmak üzere murin CAF'lerini kültürleme, manipüle etme ve analiz etme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, insan meme kanseri tümörlerinden oluşan bir koleksiyondan lazer yakalama mikro diseke stromal ve epitel bileşenlerinin halka açık transkriptomlarını analiz etmek için geliştirilen web tabanlı bir platformu tanımlar.

Özet

Zorlayıcı bir araştırma grubu, meme kanserinin (BC) büyümesi ve agresifliğinde tümör mikroçevresinin (TME) kritik rolünü doğrulamıştır. TME'nin baskın hücre bileşeni olan kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF), tümör kaynaklı aktive edici sinyallere yanıt olarak kanser ve diğer stromal hücrelerle karmaşık karışma yoluyla davranışını önemli ölçüde etkiler. Murin modelleri, endojen TME'nin değerlendirilmesine ve sinjeneik ksenogreft çalışmaları kullanılarak bağışıklık sistemi tutulumunun değerlendirilmesine izin verdiği için, CAF'ın BC ilerlemesindeki rolünün altında yatan mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, BC'den türetilmiş CAF'leri kültürlemek, gen ekspresyonunu manipüle etmek ve hem in vitro hem de in vivo yaklaşımları kullanarak pro-tümörjenik işlevlerini değerlendirmek için bir dizi yöntem sunuyoruz. Ayrıca, halka açık toplu RNA-seq verilerini kullanarak primer tümörlerde transkripsiyonel imzaları çıkarmak için bir hesaplama prosedürünün yanı sıra CAF gen ekspresyonu profili oluşturma ve transkriptomik analiz protokollerini de açıklıyoruz. Ek olarak, lazer yakalama mikro diseke BC tümörlerinden stromal ve epitel bileşenlerinin transkriptomlarını analiz etmek için kullanıcı dostu, web tabanlı bir araç sunuyoruz. Sonuç olarak, bu yöntemler CAF tümör etkileşimlerini yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir ve yeni terapötik hedefleri belirleme potansiyeline sahiptir.

Giriş

Meme kanseri (MK) kadınları en sık etkileyen malignitedir ve tanı, tedavi kararları ve prognozu yönlendiren farklı moleküler profilleri ile önemli moleküler heterojenite ile karakterizedir. Tümör mikroçevresi (TME) de oldukça heterojendir ve tümör ilerlemesinde, bağışıklıkta ve tedavi sonuçlarında kritik bir rol oynar.

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), TME'de en bol bulunan hücre tipidir ve tümör gelişiminin anahtar düzenleyicileridir. Hücre dışı matris birikimine ve yeniden şekillenmesine, anjiyogeneze, immün kaçışa ve ilaç direncinekatkıda bulunurlar 1,2,3,4,5,6. CAF'ler, tümör büyümesini, invazyonunu ve tedavi direncini 8,9,10 teşvik etmek için doğrudan hücre-hücre teması, hücre dışı veziküllerinsalınması 7 ve çeşitli çözünür faktörlerin 2,5 salgılanması yoluyla tümör hücrelerini etkiler. Gerçekten de, stroma ile ilişkili gen imzaları, BC ilerlemesi ve tedavi yanıtı için öngörücü değere sahiptir ve kemoterapiye direnç ile ilişkilidir 11,12,13,14. Bununla birlikte, CAF'leri çekici bir terapötik hedef olarak gösteren önemli kanıtlara rağmen, bu hücreleri hedef alan klinik çalışmalar büyük ölçüde başarısız olmuştur15. En büyük zorluklardan biri, CAF'lerin tümör davranışını modüle ettiği moleküler mekanizmaların sınırlı olarak anlaşılmasıdır. Tek hücreli ve mekansal transkriptomik analizlerdeki son gelişmeler, BC 16,17,18,19,20,21'deki CAF'lerin karmaşıklığı hakkında daha derin bilgiler sağlayarak, belirli fonksiyonel programlar 16,22 ile farklı CAF alt tiplerinin tanımlanmasını sağlar ve karmaşıklıklarını ve plastisitelerini daha da vurgular23.

Onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin aşırı eksprese edildiği veya inaktive edildiği genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), insan kanserini incelemek için iyi kurulmuş modellerdir 24,25,26,27. Yabani tip farelerde(23,28) tümör hücrelerinin aşılanmasını içeren sinjeneik modellerle karşılaştırıldığında, GEMM'ler BC'nin çok aşamalı ilerlemesini ve kanser hücreleri ile TME arasındaki etkileşimleri daha doğru bir şekilde taklit eder. Bununla birlikte, CAF'lerin GEMM'lerdeki aktivitelerini manipüle etmek, heterojenlikleri nedeniyle zor olmuştur, bu da diğer stromal veya epitelyal bileşenler üzerinde hedef dışı etkiler olmaksızın tüm CAF alt tiplerini hedeflemeyi zorlaştırmaktadır5. GEMM'leri in vitro CAF manipülasyonu gibi tamamlayıcı yaklaşımlarla birleştirmek, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda fonksiyon kaybı deneyleri için hücresel modellerin oluşturulmasına yardımcı olabilir. Bununla birlikte, belirli genlerin işlevsel rollerini keşfetmek için kararlı hücresel modeller geliştirmek, yaşlanmanın hızlı başlangıcı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.

Burada, CAF'lerde stabil fonksiyon kaybı deneyleri için sağlam bir platform açıklıyoruz, ardından fonksiyonel in vitro ve in vivo analiz ve mühendislik hücrelerinin transkripsiyonel profillemesi; bu yaklaşım, meme kanserinde CAF ile eksprese edilen genlerin işlevsel önemini incelemek için mevcut yöntemlere göre özgüllük, tekrarlanabilirlik ve uyarlanabilirlik açısından avantajlarla birlikte kapsamlı bir strateji sunar. Bu yaklaşım aynı zamanda, insan meme tümörlerinden lazer yakalama mikrodiseke stromal ve epitel kompartmanlarının transkriptomlarını keşfetmek, türler arası karşılaştırmaları mümkün kılmak ve insan verilerinden hipotez oluşturmayı kolaylaştırmak için yeni bir web tabanlı araçla tamamlanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, fare kullanımı ve doku örneklemesi ile ilgili tüm kurumsal yönergelere uygundur. Tüm işlemler ulusal ve uluslararası yasa ve politikalara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fareler, 22 ° C'de% 50 nem ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında spesifik patojen içermeyen bir transgenik üniteye yerleştirildi ve ad libitum yiyecek ve su sağlandı. Cerrahi prosedürler, hem prosedür sırasında hem de ameliyat sonrası dönemde uygun anestezi ve analjezi sağlamak için kurumsal veteriner talimatlarına uymalıdır. Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

1. Hücre kültürü

  1. 37 ° C'de% 95 bağıl nem ile% 5 CO2 atmosferinde, DMEM (HEK293T, CAF'ler ve ölümsüzleştirilmiş CAF'lar (iCAF'ler)) veya RPMI ortamında (4T1), 100 U / mL Penisilin, 100 μg / mL Streptomisin (% 1 Pen / Strepto) ile desteklenmiş kültür hücreleri.
    NOT: Komple medya (cDMEM, cRPMI) bileşimi: %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS, açlık ortamı (sDMEM, sRPMI) bileşimi: FBS yok. Hücreler için ortalama iki katına çıkma süreleri: HEK293T ve iCAF'lar 24 saattir; 4T1 hücreleri 12 saattir.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi, fenotipik sürüklenmeyi önlemek için çözüldükten sonra asla 10 defadan fazla olmamak üzere, 1: 5 oranından fazla olmamak üzere% 80 birleşmeye ulaştığında geçiş hücreleri.
    1. Ortamı aspire edin ve 100 mm'lik bir kabın kenarına yavaşça 7 mL PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin, 1 mL tripsin-EDTA ekleyin. 37 °C'de 2-3 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: EDTA, göz tahrişi için kategori 2 tehlike bileşiği olarak listelenmiştir. Uygun KKD giyen biyolojik/çeker ocakta tutun.
    2. Tripsin-EDTA'yı 5 mL cDMEM ile inaktive edin, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın ve 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 5 mL cDMEM'de yeniden süspanse edin. 1:5 bölme için, 9 mL cDMEM içeren 100 mm'lik bir tabakta 1 mL yeniden süspanse hücre tohumlayın.
  3. Hücre sayımı: Bir Neubauer sayma odasının yan tarafındaki adım 1.2.3'ten 10 μL hücre süspansiyonu yükleyin, büyük karelerdeki hücreleri sayın ve 1 mL hücre süspansiyonunda bulunan hücre sayısını hesaplamak için elde edilen sayıyı 1 x 104 ile çarpın.
  4. Kriyoprezervasyon: 100 mm'lik bir tabağın (yaklaşık 3 x 106 hücreli) %50'sini aşağıda açıklandığı gibi 0,5 mL buz gibi soğuk dondurma ortamında (ısıyla inaktive edilmiş FBS'de %10 DMSO) dondurun.
    1. 100 mm'lik bir tabaktan, hücrelerin 1 mL buz gibi soğuk dondurma ortamında yeniden süspanse edilmesi dışında, 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri tripsinize edin.
    2. Her kriyoviyalde 0,5 mL dağıtın ve yaklaşık 1 °C / dak'lık bir soğutma hızı sağlayan bir kaba -80 ° C'de yerleştirin. Her alikot 100 mm'lik bir tabakta çözülebilir.
  5. Mikoplazma kontaminasyon testi: En az 3 gün boyunca kültürlenmiş 1 mL büyüyen hücre ortamı toplayın. 95 °C'de 20 dakika kaynatın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 16200 x g'da döndürün. 45 μL PCR reaksiyon karışımına 5 μL süpernatan ekleyin (0.15 mM dNTP'ler, 1.5 mM MgCl2, 1x Reaksiyon Tamponu, 1 U Taq polimeraz, 0.5 μM primerler A ve B, bakınız Tablo 1). Pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere PCR gerçekleştirin ve bir DNA merdiveni ile birlikte %1'lik bir Agaroz jeli üzerinde PCR ürünlerini ayırın. Mikoplazma ile kontamine olmuş numuneler 600 bp'lik bir bant gösterecektir.

2. CAF'lerin meme tümörlerinden izolasyonu

NOT: Bu adım, 5-10 mm çapındaki ileri evre tümörler için optimize edilmiştir (bkz. referans29 ).

  1. Fareyi servikal çıkık ile feda edin. En az 125 mm'lik meme tümörlerini izole edin3. Tümörü dikkatlice çıkarın, çevredeki cildi, meme dokusunu ve görünür nekrotik alanları çıkarın. Cımbız kullanarak, buzun üzerine yerleştirilmiş 1,5 mL'lik bir mikrotüpte toplayın.
  2. Tümörü hassas bir terazi ile tartın, bir neşter ile 0.1-0.3 g'lık kübik bir parçayı eksize edin, buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş yeni bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Dehidrasyonu önlemek için dokunun suya batırıldığından emin olun.
  3. Buz üzerinde 60 mm çapında bir tabağa aktarın. Yaklaşık 1-2 mm'lik parçalar elde edene kadar 1 mL PBS'yi bir neşter ile ince ince doğrayın.
  4. cDMEM artı 10 μg / mL kollajenazda 0.1 g tümör başına 5 mL içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücre hasarını önlemek için kesik uçlu bir P1000 pipeti kullanarak çanağı aynı ortamdan 1 mL ile durulayın. Sızıntıyı önlemek için kapağı bir sızdırmazlık filmi ile sabitleyin.
  5. Bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 1 saat yatay olarak inkübe edin. 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve homojenatı 10 mL'lik bir serolojik pipet ile aktarın. Numuneyi öğütmek ve filtreden itmek için 5 mL'lik bir şırınga pistonunun arkasını kullanın.
  6. Süzgeçten her şeyi kurtarmak için cDMEM (30 mL son hacmi aşmayan) kullanın. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 129 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
  7. Kırmızı kan hücrelerini (RBC) çıkarmak için 3 mL Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponu ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve ters çevirerek karıştırın. Bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT'de 5 dakika inkübe edin.
  8. 30 mL'lik bir son hacme PBS ekleyerek RBC lizizini durdurun. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 129 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
  9. Hücre peletini 1 mL cDMEM'de yeniden süspanse edin ve 10 μL metilen mavisi kullanarak adım 1.3'teki gibi canlı hücreleri sayın: canlı hücreler boyayı renksiz bir ürüne indirger ve lekesiz hale gelirken, ölü hücreler maviye boyanır.
  10. 5 mL cDMEM'de 5 x 105 hücre / 60 mm'lik bir tabak tohumlayın,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin, yapışmayan hücreleri toplayın ve gece boyunca yeniden plakalayın.
  11. 48 saat veya 72 saat sonra, diferansiyel tripsinizasyon gerçekleştirin. Fibroblastlar epitel ve miyoepitel hücrelerinden30 daha hızlı ayrıldığından, adım 1.2'de tarif edildiği gibi ilerleyin. Ancak mikroskop altında hücre ayrılmasını yakından izleyin. Fibroblast şeklindeki hücreler yuvarlaklaşacak ve epitel hücreleri yapışık kalırken ayrılacaktır.
  12. Tripsini inaktive etmek ve ayrılmış CAF'leri toplamak için cDMEM ekleyin, bunları 5 mL cDMEM'de 60 mm'lik yeni bir tabağa aktarın. Üç pasaj için birincil CAF'ler 1: 3'ü (bkz. adım 1.2) geçin, ardından adım 1.4'te açıklandığı gibi erken pasaj donmuş alikotları hazırlayın.

3. Viral transdüksiyon ile ölümsüzleştirme

NOT: Aşağıdaki adımlardan bazıları, retroviral vektörlerin işlenmesi için uygun bir ortamda gerçekleştirilmelidir (örn., BSL2+); Kurumsal kurallarınızı kontrol edin.

  1. Rekombinant virüsün hazırlanması
    1. Hücreleri HEK293T ve mikoplazma kontaminasyonunu kontrol edin (bkz. adım 1).
    2. 100 mm çapında bir tabağı, RT'de 5 dakika boyunca ddH2O'da 6 mL 0.1 mg / mL poli-L-lizin çözeltisi pipetleyerek kaplayın, aspire edin ve kaputun altında kurumaya bırakın (yaklaşık 10 dakika).
    3. Adım 3.1.2'den itibaren poli-L-lizin kaplı kapta 10 mL cDMEM içinde 3 x 106 HEK293T hücre (düşük geçişli, mikoplazma negatif) tohumlayın (bkz. adım 1.3).
    4. Ertesi gün, 0.75 mL antibiyotik içermeyen transfeksiyon için optimize edilmiş ortam içeren iki tüp hazırlayın. Bunlardan birine 30 μL katyon lipid aracılı transfeksiyon reaktifi (T1) ekleyin. İkincisine 2 μg pCL-Ampho (retroviral paketleme vektörü) ve 2 μg retroviral pBABE-neo largeT cDNA vektörü (T2) ekleyin. T2'yi T1'e ekleyin, hafifçe karıştırın ve 10 dakika inkübe edin.
    5. Antibiyotik içermeyen transfeksiyon için optimize edilmiş ortam +% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile değiştirdikten sonra ortamı hücrelerin üzerine eşit olarak dağıtın. Plakayı Biyogüvenlik seviyesi 2+ (BSL-2+) doku kültürü tesisine taşıyın. Ortamı 6-12 saat sonra cDMEM ile değiştirin ve hücreleri 24-48 saat inkübe edin.
    6. Psödoviral partikülleri içeren ortamı 0.45 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve birkaç gün boyunca 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
  2. CAF'ın viral transdüksiyonu
    1. 60 mm'lik iki tabağın her birine 7.5 x 105 CAF'yi 4 mL cDMEM içinde tohumlayın (bkz. adım 1.3) ve bunları adım 1.1'deki gibi kültürleyin.
    2. Ertesi gün, bir tabağın ortamını adım 3.1.6'dan (dönüştürülmüş CAF'ler) 2 mL psödovirüs içeren ortamla değiştirin, 2 mL cDMEM ekleyin ve 24 saat inkübe edin. Diğer tabağa dokunulmadan bırakın (dönüştürülmemiş CAF'ler).
    3. Ertesi gün, dönüştürülen CAF'lerde 3.2.2 adımını tekrarlayın. 24 saat sonra, her iki kabın ortamını 4 mL cDMEM ile değiştirin.
    4. 24 saat sonra, her iki kabın ortamını 400 μg/mL G418 ile takviye edilmiş cDMEM ile değiştirerek seçime başlayın. G418 içeren ortamı, dönüştürülmemiş CAF'lerin kontrol kabında canlı hücre kalmayana kadar her 2-3 günde bir değiştirin.
      NOT: Transdüksiyonsuz hücreler G418'e duyarlıdır ve 7-10 gün içinde ölecektir, bu da transdüksiyonlu CAF durumunda yalnızca G418'e dirençli transdüksiyonlu hücrelerin hayatta kalacağını gösterir. Her hücre tipi için en uygun antibiyotik konsantrasyonu belirlenmeli ve öldürme eğrileri gerçekleştirilmelidir (7-10 gün boyunca 50 ila 1000 μg / mL G418 konsantrasyonu aralığını test edin ve 10 gün içinde tüm hücreleri öldüren dozu seçin).
    5. BSL tesisinden çıkmadan önce seçilen dönüştürülmüş hücreleri 2x 1:3 oranında geçirin (bkz. adım 1.2). Adım 1.4'teki gibi erken pasajların dondurularak saklanmış alikotlarını hazırlayın.
    6. Hücrelerin birkaç pasaj boyunca yaşlanan bir fenotip göstermeden çoğalmaya devam ettiğini doğrulayın ve fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyona geçin (bkz. adım 4 ve 6-9).

4. Fenotipik karakterizasyon

NOT: Alfa düz kas aktini (α-SMA), caveolin, fibroblast aktive edici protein (FAP), N-kaderin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü beta (PDGFR-β), S100A4 ve vimentin29 gibi CAF belirteçleri RT-qPCR ve Western Blot ile değerlendirilebilir.

  1. RT-qPCR: Referans15'te tarif edildiği gibi monofazik bir fenol ve guanidin izotiyosiyanat çözeltisi ile toplam RNA'yı ekstrakte edin. Üreticinin reaksiyon koşulları için talimatlarını izleyerek 20 μL'lik bir hacimde 2 μg toplam RNA'yı ters çevirin. cDNA 1:20'yi seyreltin ve üreticinin talimatlarını izleyerek RT-qPCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için 3 μL kullanın (primerler için Tablo 1'e bakın).
    NOT: RNA'yı 12 oyuklu bir tabaktan hazırlamanızı öneririz.
  2. Batı lekesi
    1. Adım 1.2.1'de açıklandığı gibi 2x'i PBS ile yıkayın, 0.2 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir kazıyıcı ile ayırın ve29'da tarif edildiği gibi 1.5 mL'lik bir mikrotüpte toplayın. Buz üzerinde 20 dakika bekletin.
    2. Numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün ve süpernatanı toplayın. Proteinleri üreticinin talimatlarına göre kolorimetrik tahlil ile ölçün. Western blot için en az 20 μg protein kullanın (antikorlar için Tablo 2'ye bakınız).
      NOT: Proteinleri bir tabakta en az 6 kuyudan hazırlamanızı öneririz.
  3. Salgılanan proteinlerin analizi
    1. 2 x 106 iCAF'ı (bkz. adım 1.3) 100 mm çapında bir tabakta 10 mL cDMEM'de tohumlayın ve adım 1.1'de açıklandığı gibi kültürleyin.
    2. 24 saat sonra, ortamı çıkarın, 2x'i 10 mL PBS ile yıkayın ve şartlandırılmış ortam (CM) oluşturmak için 10 mL sDMEM ile 48 saat inkübe edin (bkz. adım 1.1).
    3. 48 saat sonra, CM'yi 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden 15 mL'lik bir konik tüpe süzün. Hem şırıngayı hem de tüpü sıkıca tutun ve bir miktar direnç için hazırlıklı olun. CM -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
    4. Konsantre CM (conCM) oluşturmak için üreticinin talimatlarına göre protein yoğunlaştırıcıları kullanarak CM'yi yaklaşık 10 kat konsantre edin. ConCM'yi ölçün, kaynatın ve Western Blot gerçekleştirin (antikorlar için Tablo 2'ye bakınız).

5. Gen yıkım analizi

NOT: Gen ekspresyonuna kararlı bir şekilde müdahale etmek için, iCAF'leri özel olarak tasarlanmış shRNA'ları eksprese eden lentiviral partiküllerle dönüştürüyoruz. Bunlar, hedefleme dizilerinin https://www.addgene.org/protocols/plko/#C'da mevcut olan protokolleri izleyerek pLKO.1-Puro gibi uygun bir lentiviral vektörde klonlanmasıyla elde edilebilir. Spesifik hedefleme dizileri, halka açık shRNA tasarım araçları (yani, Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/. tarafından GPP-Genetik Pertürbasyon Portalı) kullanılarak seçilebilir. Alternatif olarak, önceden hazırlanmış hedefleme vektörleri kümeleri ticari olarak mevcuttur (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Her gene karşı 4-5 farklı shRNA tasarlamanızı ve deneyler için en iyi 2'sini seçmenizi öneririz. Negatif kontroller olarak hedeflemeyen vektörler de oluşturun. Aşağıdaki adımlardan bazıları, HIV türevi virüslerin işlenmesi için uygun bir ortamda atılmalıdır (ör. BSL2+). Kurumsal kurallarınızı kontrol edin.

  1. Lentiviral partiküllerin oluşumu
    1. 3.1.1-3.1.3 adımlarındaki gibi3 x 10 6 HEK293T hücreyi tohumlayın. Ertesi gün, katyon lipid aracılı transfeksiyon reaktifi-DNA komplekslerini, pCMV-R8.74 ve pCMV-VSVG paketleme vektörlerinin sırasıyla 9 μg ve 3 μg ve shRNA içeren pLKO.1 yapısının 7 μg'ını kullanarak 0.75 mL antibiyotik içermeyen transfeksiyon için optimize edilmiş ortamda hazırlayın ve adım 3.1.5 ve 3.1.6'da açıklandığı gibi devam edin.
  2. CAF iletimi
    1. Hücreleri 3.2.1, 3.2.2 ve 3.2.4 adımlarında açıklandığı gibi enfekte edin. 24 saat sonra, enfeksiyon ortamını çıkarın ve cDMEM'de 2 μg / mL puromisin ile seçime başlayın. Optimal konsantrasyonu belirlemek için adım 3.2.5'teki nota bakın.
    2. 48 saat sonra puromisin / cDMEM'i değiştirin. Seçim genellikle 3 gün içinde tamamlanır. Hücreleri adım 3.2.6'daki gibi genişletin ve dondurun. Adım 4.1'de açıklandığı gibi hem RT-PCR hem de Western blot ile knockdown verimliliğini değerlendirin. ve 4.2.

6. Tümör hücrelerinden CM ile iCAF'lerin süper aktivasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, iCAF'lerin pro-tümöral aktivitelerinin in vitro karakterizasyonu için yöntemleri göstermektedir. CAF'lerin pro-tümöral aktiviteleri, aşağıda tarif edildiği gibi fare BC tümör hücrelerinden (süper aktivasyon, s.a.) CM ile inkübe edilerek arttırılabilir.

  1. Adım 1.3'te tarif edildiği gibi 4T1 murin BC hücrelerini sayın ve 10 mL cRPMI'de 100 mm çapında bir tabakta 2 x10 6 hücre tohumlayın (bkz. adım 1.1).
  2. 24 saat sonra, ortamı çıkarın, 2x'i 10 mL PBS ile yıkayın ve CM oluşturmak için 10 mL sRPMI ile 48 saat inkübe edin (bkz. adım 1.1).
  3. Ertesi gün, 100 mm çapında bir tabakta 2 x 106 iCAF'ı 10 mL cDMEM içinde tohumlayın (bkz. adım 1.3) ve bunları adım 1.1'de açıklandığı gibi kültürleyin. CM'yi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden adım 4.3.3'teki gibi 15 ml'lik bir konik tüpe süzün.
  4. Süper aktivasyon (sa.): ortamı iCAF kabından çıkarın, 2x'i 10 mL PBS ile yıkayın ve filtrelenmiş 4T1 CM'yi (8-10 mL) ekleyin. SA iCAF'leri elde etmek için 48 saat kuluçkaya yatırın.

7. Tümör hücresi proliferasyonu

  1. 4T1 hücrelerini, 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3 adımlarında olduğu gibi hazırlanan iCAFs CM ile 48 saat boyunca ön işlemden geçirin.
  2. Bunları tripsinize edin ve sayın, daha sonra adım 1.3'te tarif edildiği gibi 100 μL cRPMI'de 96 oyuklu bir plakanın 4 x 103 hücresi / kuyucuğu tohumlayın ve adım 1.1'deki gibi kültürleyin. Plaka teknik üçlüsü.
    1. Zaman rotasının her günü için 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. Burada önerilen hücre sayısı 4 günlük bir protokol için optimize edilmiştir; Daha uzun süreler için küçültün.
  3. 4 saat sonra veya hücreler bağlanır bağlanmaz, ortamı çıkarın, hafifçe 100 μL ekleyerek PBS ile yıkayın, ucu kuyu kenarına dayayarak, çok kanallı bir pipetle ve steril bir rezervuar kullanarak hücreleri ayırmamaya dikkat edin. PBS'yi çıkarın, ardından benzer şekilde her ikisi de %2 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş 100 μL sDMEM (kontrol) veya iCAF CM ekleyin (bkz. adım 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. 4 saat sonra, 0 plakasını 7.5 noktasında açıklandığı gibi durdurun. Diğer zaman noktaları için, deneyin sonuna kadar ortamı her gün değiştirin.
  5. Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için, 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve oyukları 2x'i adım 7.3'te açıklandığı gibi 100 μL PBS ile yıkayın.
  6. Bir davlumbaz altında, her bir oyuğa 100 μL% 4 Paraformaldehit (PFA) ekleyin ve hücreleri RT'de 10 dakika sabitleyin.
    DİKKAT: PFA ciddi göz hasarına ve cilt tahrişine neden olabilir; Yutulması ve solunması halinde zararlıdır ve genetik kusurlara ve kansere neden olduğundan şüphelenilir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) giyerek çeker ocakta tutun.
  7. Adım 7.3'teki gibi 3x'i 100 μL PBS ile yıkayın ve çeker ocak altında kurumaya bırakın (yaklaşık 10 dakika).
  8. RT'de 10 dakika boyunca% 20 metanol içinde 50 μL% 0.1 kristal viyole ile inkübe edin.
    DİKKAT: Kristal viyole ciddi göz hasarına neden olabilir ve oral akut toksisite için kategori 4 tehlike ve kanserojen olarak kategori 2 tehlike olarak rapor edilir. Uygun KKD giyen bir çeker ocakta tutun.
  9. 3x'i 100 μL ddH2O ile yıkayın, kuyucukları boşaltın ve sıvıyı tamamen çıkarmak için plakayı emici ped veya kağıt havlu üzerine hafifçe vurun.
  10. Kristal viyoleyi RT'de 15 dakika boyunca 100 μL% 10 asetik asit içinde çözün ve boş olarak 100 μL% 10 asetik asit kullanarak bir mikroplaka okuyucuda 600 nm dalga boyunda optik yoğunluğu (OD) ölçün. O gün için OD'yi koşul başına 0 olarak normalleştirin.

8. Göç ve istila

  1. %1 ısıyla inaktive edilmiş FBS, %1 Pen/Strepto ile desteklenmiş 700 μL DMEM'i 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin. Her oyuğa biyolojik olarak aktif matris ile kaplanmış (istila) veya kaplanmamış (migrasyon) 8 μm'lik bir gözenekli transwell eki yerleştirin. Adım 1.3'teki gibi 4T1 hücrelerini toplarken ve sayarken plakayı 37 ° C'de dengelenmesi için inkübatörde bırakın.
  2. Tripsin-EDTA yerine 1 mL 5 mM EDTA kullanarak, 4.3.1, 4.3.2 ve 4.3.3. adımlarda olduğu gibi 100 mm çapındaki bir tabaktan iCAFs CM ile 48 saat boyunca ön işleme tabi tutulmuş 4T1 hücrelerini ayırın.
  3. 5 mL cDMEM ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte hasat edin ve adım 1.2'deki gibi santrifüjleyerek pelet haline getirin. sDMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin, adım 1.3'teki gibi sayın ve 1 x 105 hücre / 100 μL'ye seyreltin.
  4. Transwell'in üst odasına 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Bir kaplama kontrolü olarak, 24 oyuklu bir plakada 100 μL hücreyi, 500 μL cDMEM'de tohumlayın. 16 saat (göç) veya 24 saat (istila) için kuluçkaya yatırın ve deneyi aşağıda açıklandığı gibi durdurun.
    NOT: Farklı hücreler kullanılıyorsa inkübasyon süreleri ampirik olarak belirlenmelidir.
  5. Üst taraflarındaki ekleri ince bir işaretleyici ile etiketleyin ve cımbız kullanarak yıkamak için PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe daldırın. Transwell'in iç kısmını pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin.
  6. Bir çeker ocak altında, numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 700 μL% 4 PFA'da inkübe edin (bkz. adım 7.6).
  7. 3x'i 700 μL PBS ile yıkayın ve kaputun altında kurumaya bırakın (yaklaşık 10 dakika). Ekleri %20 metanol içinde 700 μL %0.1 kristal viyole ile RT'de 10 dakika inkübe edin (bkz. adım 6.10).
  8. Ek parçaları 3x yıkayın, cımbız kullanarak ddH2O ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe daldırın. Transwell'in iç kısmını pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin. Numuneleri RT'de saklayın ve 3 gün sonrasına kadar fotoğraf çekin.
  9. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak, kuyu yüzeyinin çoğunu 10x objektif görüntüleme ile bir resim çekin, ardından 20x objektif ile 5 bağımsız alandan resim elde edin.
  10. Kristal viyoleyi %10 asetik asit içinde aşağıdaki gibi çözün: kuyular için 100 μL asetik asit ekleyin ve RT'de 10 dakika orbital çalkalayıcı üzerinde karıştırın; transwelller için, yüzeyi yukarı gelecek şekilde bir tezgah üzerine koyun, yüzeye 50 μL asetik asit bırakın ve kristal viyole tamamen eriyene kadar pipetleyerek karıştırın.
  11. Yukarıdaki adımdan 50 μL çözünmüş malzeme kullanarak 96 oyuklu bir plakada 600 nm'de absorbansı okuyun. Boş olarak% 10 asetik asit kullanın.
  12. Kaplama kontrolünün optik yoğunluğunu (OD) adım 8.5'ten itibaren normalleştirin ve kontrol koşuluna göre migrasyonu veya istilayı ifade edin.

9. Primer tümör büyümesi ve akciğer metastazı oluşumu

NOT: Aşağıdaki adım, CAF'lerin pro-tümöral aktivitelerinin in vivo karakterizasyonu için yöntemleri göstermektedir. Bu adım, sinjeneik fare modellerinde ko-enjeksiyon yoluyla CAF'lerin in vivo pro-tümörjenik özelliklerini değerlendirmek için optimize edilmiştir. Hem CAF'lar hem de 4T1 hücreleri BALB/c fare arka planından olduğundan, BALB/c fareleri kullanılır.

  1. Enjeksiyondan 2 gün önce, 6 haftalık dişi BALB/c fareleri metal ID kulak küpeleri ile tıraş edin ve 4. meme bezi bölgesini tıraş makinesi ile tıraş edin.
  2. Adım 6'da açıklandığı gibi hazırlanan 4T1 hücrelerini ve sa iCAF'leri toplayın ve sayın. 15 mL'lik konik bir tüpte, en az %20'lik bir fazlalık göz önünde bulundurularak 1 x 105 4T1 hücre ve 3 x 105 s.a. iCAF / fareyi karıştırın. 4T1'i yalnızca kontrol olarak kullanın.
  3. 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin, 50 μL'de yukarıdaki hücre / fare sayısını elde etmek için hesaplanan bir PBS hacminde yeniden süspanse edin, 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.
    NOT: Örneğin, 10 fareyi enjekte etmek için, 1.2 x 106 4T1 hücrelerini 3.6 x 106 sa iCAF'ler, pelet hücreleri ile karıştırın ve 600 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Fare başına 50 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
  4. Laminer akış başlığının yüzeyini temizleyerek ve dezenfekte ederek çalışma alanını hazırlayın. Bir köpük cerrahi tahtasını bir tezgah koruyucu levha ile örtün.
  5. Fareleri kurumsal prosedürlere göre birer birer uyuşturun (intraperitoneal tiletamin bazı/zolazepam bazı + ksilazin 70 mg/kg + 5 mg/kg enjeksiyonu kullanıyoruz). Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Pamuklu bir uç kullanarak cildi povidon-iyot çözeltisi ile dezenfekte edin.
  6. Farelerin uygun anestezi altında olduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testini kullanın. Hipodermik bir iğne ile, 50 μL hücre süspansiyonunu 4. meme yağ yastığına enjekte edin. Meme ucunu referans olarak kullanın ve ipsilateral bacağa doğru yaklaşık 3 mm enjekte edin.
  7. Fareleri enjeksiyondan birkaç saat sonra ve sonraki günlerde inceleyin. Tümörler 4 gün sonra ele gelir hale gelir.
  8. Maksimum ve minimum çapları belirleyerek tümör boyutunu her 48 saatte bir kumpas ile ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak tümör hacmini hesaplayın: (uzunluk x genişlik2)/2.
  9. Enjeksiyondan 10 gün sonra, aşağıda tarif edildiği gibi primer tümörleri cerrahi olarak çıkarın.
    1. Cerrahi alanı adım 9.5'teki gibi hazırlayın. Aletleri otoklavlayarak sterilize edin ve çalışırken steril bir yüzeye yerleştirin. Sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak hayvanlar arasındaki aletleri sterilize edin.
    2. Fareleri adım 9.6 ve 9.7'deki gibi uyuşturun. Bir neşter bıçağı kullanarak, tümöre yakın 5-8 mm'lik bir kesi yapın ve cildi nazikçe çekerek tümöre erişmek için küçük bir cep oluşturun. Diseksiyon sırasında kanamaları önlemek için görünür herhangi bir kan damarını düşük sıcaklıkta koterize edici bir kalemle koterize edin.
    3. Tümörü çıkarmak için neşter kullanın, herhangi bir cildi çıkarmamaya çalışın. Deri fleplerini orijinal konumlarına geri yerleştirin, 17 mm 1/2c iğne ile 5-0 cerrahi iplik kullanarak birbirine dikin ve yarayı tamamen kapatmak için cerrahi yapıştırıcı ekleyin.
    4. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareleri gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren hayvanlar, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına iade edilmez.
  10. Ameliyat sonrası hayvanları yakından izleyin ve takip eden günlerde Kurumsal protokollere göre gerekirse analjezik tedavi uygulayın. Deri altı Carprofen enjeksiyonları (3-5 mg / kg) kullanıyoruz.
  11. Tümörü adım 2.2'deki gibi hassas bir terazi kullanarak tartın. Neşter kullanarak tümörü ikiye bölün. Bir yarısını 1,5 mL'lik bir mikrotüpe koyun, sıvı nitrojen içinde dondurun ve moleküler analizler için -80 ° C'de saklayın. Diğer yarısını, histolojik analiz için 4 ° C'de 24 saat boyunca konik 15 mL'lik bir tüpte 5 mL% 4 PFA'ya sabitleyin.
  12. Enjeksiyondan sonraki 21. günde, fareleri CO2 maruziyeti ile feda edin ve aşağıda tarif edildiği gibi% 4 PFA ile intratrakeal infüzyon üzerine akciğerleri toplayın. Çeker ocak altında çalışın.
    1. Cerrahi makas kullanarak göğüs boşluğunu açın. Trakeayı net bir şekilde ortaya çıkarmak için submandibular bölgeden ve tükürük bezlerinden cildi çıkarın.
    2. % 4 PFA çözeltisi içeren 22 G'lik bir iğne şırıngası hazırlayın. İğneyi fare trakeasına sokun, trakeayı başa doğru sıkıştırırken akciğerlere doğru yönlendirin. Solüsyonu akciğerler şişene kadar (yaklaşık 2 mL) enjekte edin.
    3. Akciğerleri inceleyin ve% 4'lük bir PFA çözeltisi içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirin ve 4 °C'de 24 saat sabitlenmesine izin verin.
  13. Akciğerlerin yarı seri kesitlerini gerçekleştirin ve referans31'de açıklandığı gibi, numune tükenene kadar her 50/100 μm'de bir dilim olmak üzere Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile boyayın.
  14. H & E lekeli bölümlerin mikro fotoğraflarının yazılım rehberliğinde analizi üzerine metastazları puanlayın.

10. Gen ekspresyon imzaları

  1. Aşağıda açıklandığı gibi bir gen imzası tanımlayın.
    1. Deney ortamına ve araştırılan spesifik biyolojik soruya bağlı olarak, çeşitli şekillerde bir gen imzası elde edin. En yaygın olarak, iki durum arasındaki diferansiyel ifadeyi değerlendirin (ör., CAF'lere karşı normal muadilleri veya çeşitli şekillerde tedavi edilir (ör., süper aktive edilmiş veya susturulmuş) ve tedavi edilmez.
    2. Alternatif olarak, analiz edilen örnekler arasında en değişken şekilde ifade edilen veya bilgilendirici genleri tanımlayın (örneğin, bir temel bileşen analizinin ilk bileşenleri üzerinde yüksek varyanslı veya yüksek yüklemeli genler). Burada, örnek olarak STAT3 tarafından düzenlenen bir imza kullanacağız. Bu imza, aşağıda açıklandığı gibi, BC CAFs29'da STAT3 susturulması üzerine aşağı regüle edilen genler olarak tanımlandı. RNA diziliminin kapsamlı bir açıklaması için,32,33 referanslarına bakın.
  2. Adım 4.1.1'deki gibi her numuneden toplam RNA'yı teknik üçlü olarak çıkarın ve RNA bütünlüğünü kontrol etmek için RNA kalitesini değerlendirin (RIN ≥ 9).
  3. 2 μg poli(A) seçilmiş RNA'dan kitaplıklar hazırlayın ve bunları sıralayın. NextSeq 500 platformunu kullandık.
  4. Harita, TopHat v2.0 kullanılarak Mus musculus mm9 referans derlemesine okunur. 1034.
  5. HTSeq paketinden (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html) htseq-count aracını kullanarak gen sayımlarını hesaplayın.
  6. R ve DESeq2 paketini (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html) kullanarak diferansiyel ifade analizi gerçekleştirin. STAT3 imzasını tanımlamak için FDR < 0.05 ile aşağı regüle edilmiş genleri filtreleyin.

11. Primer tümörlerde imza ekspresyonunun tahmini

NOT: Aşağıdaki adımlar, BC primer tümörlerinin kamuya açık transkriptomik verilerinde STAT3 tarafından düzenlenen imza29'un ekspresyonunu hesaplamalı olarak tahmin etmek için bir prosedürü açıklar ve aynı numune setindeki tahmini stromal oran ile ilişkisini test eder.

  1. R (https://cran.r-project.org/) ve RStudio'yu (https://posit.co/products/open-source/rstudio/) yükleyin. Başlatın ve gerekli kitaplıkları yükleyin: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. https://portal.gdc.cancer.gov/'dan TCGA verileri, http://synapse.org/'dan METABRIC verileri (syn1757063) veya Gen İfadesi Omnibus'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) diğer transkriptomik veriler gibi birincil tümör gen ekspresyon verilerini önceden normalleştirilmiş ekspresyon matrisleri olarak indirin. Veriler, satırların genler ve sütunlar örnekler olarak sayısal bir matris olarak biçimlendirilmeli ve platforma bağlı olarak normalleştirilmeli ve 1 uzaklığı kullanılarak günlük ölçeklendirilmelidir.
    1. Biomart'tan fare-insan gen ortologlarının listesini https://www.ensembl.org/biomart/martview/ indirin, veritabanını seçin: ensembl genleri, insan genleri veri setini seçin ve sol sekmedeki öznitelik seçimine tıklayın.
    2. Önceden seçilmiş Özelliklerden, HARİCİ sekmesini açın ve HGNC sembolünü işaretleyin, sayfanın üst kısmındaki kutuda Homologlar'ı seçin ve Fare ortologları / Fare gen adını işaretleyin.
    3. Sol üst köşedeki Sonuçlar düğmesine tıklayın, CSV biçimini seçin ve dosyayı indirmek için GİT düğmesine tıklayın.
  3. Gen ekspresyon imzasını (bir gen kümesi) R'ye yükleyin. Bu durumda, murin CAF'lerinde STAT3 susturulması üzerine aşağı regüle edilen genlerin listesini kullanıyoruz.
  4. Fare-insan gen ortologlarının listesini R'ye yükleyin ve STAT3 imzasını Biomart tablosu aracılığıyla ilgili insan ortologlarıyla eşleştirin.
  5. Primer tümör gen ekspresyon verilerini R'ye yükleyin ve primer tümör verileri ve STAT3 imzasını içeren bir liste dahil olmak üzere bir ssgseaParam nesnesi olarak parametrelerle GSVA fonksiyonunu çağırın.

12. Gen imzasının ekspresyonu ile klinik özellikler arasındaki ilişkiyi test edin

  1. İlgilenilen değişkenleri tanımlayın. Stromal yüzde, tümör stromasına ait dizilenmiş tümör örneğindeki hücrelerin oranını temsil eder. Genellikle omik verilerle ilişkili aşağıdaki klinik özellikleri kullanın: tümör boyutu, evresi, hastanın tanı yaşı, lenf nodu durumu, metastaz durumu vb. TCGA için önceden hesaplanmış stromal yüzde tahminleri mevcuttur.
    NOT: Spesifik olarak, mevcut stromal tahminler şunlardır: EDec İmmün / Stromal = stromal / immün yüzde37'nin Epigenomik Dekonvolüyonu; Bağışıklık Skoru = 141 bağışıklık geninin gen ekspresyon profillerine dayalıssGSEA 38; LUMP = Lökositler Saflık için Unmetilasyon, ortalama 44 metillenmemiş bağışıklığa özgü CpG bölgesi39; Stromal skor = 141 stromal genin gen ekspresyon profillerine dayalıssGSEA 38; IHC = Nationwide Children's Hospital Biosample Core Resource40 tarafından üretilen hematoksilen ve eozin lekeli slaytların görüntü analizi ile tahmin edilmiştir; MUTLAK = somatik kopya sayısı verilerine göre41.
  2. http://genboree.org/theCommons/documents/569'dan EDEc verilerini, https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html'dan Stromal ve Bağışıklık skorlarını (RNASeqV2) ve TCGAbiolinks'ten Tümör saflık verilerini (LUMP, IHC, ABSOLUTE) indirin. Diğer veri kümeleri için, GSVA paketini kullanarak stroma yüzdesini hesaplayın, Yoshihara ve ark.38'den elde edilen stroma ve bağışıklık imzaları için ssGSEA'yı hesaplayın.
  3. Primer tümör örneklerinde tahmini stromal oranın sayısal vektörü ile STAT3 imza ifadesinin sayısal vektörü arasındaki korelasyonu hesaplayın. Bu, R'deki cor.test fonksiyonu ile elde edilebilir.
  4. Primer tümörlerin transkriptomik veri seti ile ilişkili klinik verileri, örnekler satırlar halinde ve klinik özellikler sütunlar halinde içeren bir tablo olarak indirin.
  5. Klinik verileri R'ye yükleyin ve transkriptomik matristeki ve meta veri tablosundaki örneklerin eşleştirme işleviyle aynı sırada olup olmadığını kontrol edin.
  6. Sayısal değişkenler için (örneğin, tümör boyutu), primer tümör örneklerinde STAT3 imza ifadesinin sayısal vektörü ile klinik özelliklerin değerlerinin vektörü arasındaki korelasyonu cor.test işleviyle hesaplayın.
  7. Kategorik değişkenler için (örneğin, metastaz durumu), iki örnek grubu arasındaki STAT3 imza ifadesindeki farkı test edin (örneğin, metastatik ve metastatik olmayan tümörler) parametrik olmayan Wilcoxon sıralama toplamı testi ile (iki örnek grubunun bağımsız olduğu varsayılarak). Bu, R'deki wilcox.test fonksiyonu ile elde edilebilir.

13. İmza düzenlemesinin tümör stromasında test edilmesi

NOT: Toplu RNA dizilimi yoluyla analiz edilen primer tümörlerde bir stromal imzanın ekspresyonu, ayrıntılı klinik açıklamalara sahip büyük hasta kohortlarına güvenme avantajına sahiptir. Öte yandan, sadece stroma ve epitelin ayrılması, normal doku42 ile karşılaştırıldığında, tümördeki iki hücresel bölmeden herhangi birindeki gen ekspresyon değişikliklerinin tanımlanmasına izin verir. MetaLCM, lazer yakalama mikrodiseke edilmiş meme tümörlerinin transkriptomik veri kümelerinin analizini kolaylaştıran bir ShinyApp'tir. Bu araç aracılığıyla kullanıcı, lazer yakalama mikrodiseke edilmiş meme tümörlerinin transkriptomik veri kümelerinde iki koşul arasında sağlam, diferansiyel olarak ifade edilen genleri arayabilir ve tümör stromasında önceden tanımlanmış gen imzalarının regülasyonunu test edebilir. Aşağıdaki adımlarda MetaLCM'nin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

  1. Bağlantıya https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ uygulamadan erişin. Analizi başlatmak için, karşılaştırılan koşulların özelliklerini seçin.
  2. Karşılaştırma için yönü seçin. Yukarı regüle edilmiş genler seçilerek, koşul 1'de daha yüksek ekspresyona sahip genler gösterilir.
  3. Diferansiyel ifade için p değeri eşiğini seçin ve analizi çalıştırmak için Çalıştır'a basın ve ayarlar her değiştirildiğinde.
  4. Analizi önceden tanımlanmış bir gen listesiyle sınırlamak için, gen sembollerini virgülle ayırarak yazın veya tek bir sütunda gen sembollerini içeren bir CSV dosyasını içe aktarın.
  5. Gen sembollerini içe aktarmak için Gen listesini gönder'e basın. Tüm genleri kullanarak analizi geri yüklemek için Sıfırla'ya basın. Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin listesini kaydedin: bir gen listesi sağlandığında, yalnızca bu genler üzerinde çoklu test düzeltmesi yapılır. Tablo, mevcut her veri kümesindeki diferansiyel ifade için ortalama logFC, daraltılmış p değeri ve ayrı logFC ve p değerlerini içerir.
  6. Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin kat değişikliklerini içeren bir ısı haritası çizin. Isı haritası, veri kümeleri arasında tamamen tutarlı diferansiyel ifade işaretine sahip yalnızca diferansiyel olarak ifade edilen genleri gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CAF'ların faaliyetlerinin in vitro değerlendirmesi
Meme tümörü kaynaklı kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'ler) meme kanserinin (BC) agresif özelliklerine katkısı, adım 3'e göre üretilen ölümsüzleştirilmiş CAF'ler (iCAF'ler) kullanılarak incelenmiştir. iCAF'ler, adım 6'da tarif edildiği gibi süper aktive edildi, daha sonra 4T1 hücrelerini 48 saat boyunca tedavi etmek için kullanılan CM'lerini toplamak için sDMEM'de aç bırakıldı (bkz. adım 7.1). Bu tedaviyi in vitro

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, murin CAF'lerinin ölümsüzleştirilmesi ve pro-tümörjenik aktivitelerinin hem in vitro hem de in vivo olarak karakterizasyonu için optimize edilmiş protokoller sunuyoruz. Marker ifadesine dayalı olarak spesifik CAF alt tiplerini seçici olarak izole etmek yerine, heterojenliği korumak için tüm hücre popülasyonunu korumayı seçtik. Hücreler işlevsel olarak bir bütün olarak karakterize edildi ve çeşitliliklerini yakalamak için gen ekspresyon profilleri analiz ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma İtalyan Kanser Araştırma Derneği (AIRC, IG16930 ve V.P.'ye IG24851) tarafından desteklenmiştir; İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (MIUR PRIN 2017 ve 2022'den VP'ye); Truus ve Gerrit van Riemsdijk Vakfı, Lihtenştayn, V.P.'ye bağış; Piedmont Bölgesi (saptırma). A.S., İtalyan Kanser Araştırma Vakfı (FIRC) doktora sonrası bursu tarafından desteklendi ve LA, Fondazione Umberto Veronesi tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1Kb artı DNA merdiveniThermoFisher Bilimsel10787018
24 kuyucuklu plakaSarstedt833922
96 kuyucuklu plakaSarstedt833924
Asetik asitSigma Aldirch695092
Yaş I-HFNew England BiyolaboratuvarlarıR3552 Serisi-20 °'de saklayın; C
BetadinMeda İlaç23907076
Bü rker Sayım odası VWR40443703
Düşük Sıcaklık Koter FineTip DispKartaltepeAX10339KL
MerkezkaçEppendorf Belediyesi5810R Serisi
Konik tüp 15 mLSarstedt62554502
Konik tüp 50 mLSarstedt62547254
Cryopure 2 mL mikrotüplerSarstedt72380992
Kristal menekşeSigma AldirchC0775 (İngilizce)RT'de saklayın, bir Ocak 
Kültür tabağı 100 mm çapında Sarstedt833902
Kültür tabağı 60 mm çapında Sarstedt833920
ddH20Ev yapımıRT'de saklayın, Biyolojik başlıkta kullanın
Dijital KumpasPreciva02-301-2
Dijital MikroskopLeicaDM6B
Dimetil sülfoksitSigma AldirchD8418 SerisiBiyolojik başlıkta kullanım
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)Gibco119650924 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
EcoRI-HF SerisiNew England BiyolaboratuvarlarıR3101 Serisi-20 °'de saklayın; C
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma AldirchE6758 (İngilizce)RT'de saklayın, Biyolojik başlıkta kullanın
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco160000444 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Filtrelenmiş uçlar 10 µ LSarstedt703010255
Filtrelenmiş uçlar 100 &mikro; LSarstedt703030255
Filtrelenmiş uçlar 1000 µ LSarstedt703060255
Filtrelenmiş uçlar 20 µ LSarstedt703030265
Filtrelenmiş uçlar 200 &mikro; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µ m Sarstedt831826
İnce makas2Biol1406009
Forceps2Biol1102412
GenetikGibco101310354 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Lipofectamine 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher Bilimsel116680194 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
8 &mu ile Matrigel istila odaları; m PET membran Corning354480
Mikroplaka okuyucu (600 nm absorbans)PromegaGM3500 Serisi
Mikrotüpler 1.5 mL Sarstedt7269001
OptimemGibco319850474 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Paraformaldehit (PFA)Sigma Aldirch158127RT'de saklayın, çeker ocakta kullanın
pBABE-neo büyükTcDNA Addgene1780-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
pCL-AmphoNovus Biyolojik 18746853-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
pCMV-R8.74Addgene22036-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
pCMV-VSVG Addgene8454-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
Penicillin-Streptomycin (Pen Strepto, 10,000 μ g/mL) Gibco151401224 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Faz kontrast mikroskobu Olympus BX42 Serisi
Fosfat Tamponlu Salin  (PBS)Ev yapımıRT'de saklayın, Biyolojik başlıkta kullanın
pLKO.1-Puro Addgene10878-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
Poli-L-lizin çözeltisiSigma AldirchP89204 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Puromisin dihidroklorür from  Streptomyces albonigerSigma AldirchP8833
rCutSmart Tampon New England BiyolaboratuvarlarıB6004-20 °'de saklayın; C
Kemirgen tıraş makinesiAesculapGT416 Serisi
Roswell Park Anıt Enstitüsü (RPMI)Gibco618700104 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Yuvarlak Uçlu Susamış SwablarSigma AldirchZ744127
NeşterGima27041
Secura Yarı Mikro TeraziSartoriusSECURA125-1S
Serolojik pipet 10 mL Sarstedt861254001
Serolojik pipet 2 mL Sarstedt861252001
Serolojik pipet 25 mL Sarstedt861256001
Serolojik pipet 5 mL Sarstedt861253001
Dikişler 5-0Etik Simge1866G
Şırınga 10 mLPentafert00202250E14
Şırınga 5 mLPentafert00202250E12
Şırınga Omnican İnsülin 1 mLBraun9151125S
Doku adezifi3M Vetbond1469SB
Transwell ekler 8 µ m gözenek Doğan353097
Transwell Matrigel insertler 8 µ m gözenek Corning354480
Tripsin-EDTA (%0,5), fenol kırmızısı içermezGibco15400054
Vivaspin 20 santrifüj konsantratör MWCO 10,000 Da Sigma AldirchZ614602

Kaynaklar

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tümör MikroçevresiMeme KanseriGen Ekspresyon Profili OluşturmaTranskriptomik Analizİnvazyon DeneyiMigrasyon DeneyiSTAT3 Hedef GenleriLazer Yakalama Mikrodisseksiyonu
Moleküler ve Hesaplamalı Çalışmalar için Araçlar Olarak Fare Meme Tümörlerinden Kanserle İlişkili Fibroblastlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.