Yöntem makalesi

Prostat Kanseri ile İlişkili Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

1 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

Bu makalede

Özet

Bu protokol, radikal prostatektomilerden fibroblastları izole etmek, genişletmek ve ölümsüzleştirmek için kapsamlı bir prosedür sağlar. Ayrıca, fibroblast-tümör hücresi karışmasının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için geliştirilen, hem şartlandırılmış ortamla tedaviden hem de birlikte kültürlemeden yararlanan tahlilleri açıklar.

Özet

Tümör stroması, pro-tümörjenik özellikleri benimsemek için tümör hücreleri tarafından aktif olarak şekillendirilebilir ve bu da onu kanser araştırmalarının odak noktası haline getirir. Stromal bileşenler arasında, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler) - genellikle tümör mikroçevresinde (TME) en bol bulunan hücre tipi - tümör hücreleri ve diğer stromal bileşenlerle etkileşimleri yoluyla kanserin ilerlemesini teşvik etmede çok önemli bir rol oynar. Bu etkileşimlerin arkasındaki mekanizmaları aydınlatmak, CAF'leri izole etmek ve karakterize etmek için sağlam yöntemler gerektirir ve bu da yeni CAF hedefli kanser tedavilerinin geliştirilmesinin temelini atabilir. Bu çalışmada, prostat kanseri (PCa) hastalarından elde edilen radikal prostatektomi spesmenlerinin hem tümörden hem de komşu normal bölgelerinden fibroblastların izole edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, CAF'lerin ve normal muadillerinin (NF'ler) aynı bireyden eşzamanlı olarak izole edilmesini sağlayarak eşleştirilmiş bir deney sistemi sağlar. Aşağı akış in vitro analizler için birincil CAF'lerin ve NF'lerin bakımı ve ayrıca uzun vadeli çalışmaları kolaylaştırmak için ölümsüzleştirilmeleri için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır. Ayrıca, CAF'lerin ve NF'lerin proliferasyon, göç ve ankrajdan bağımsız büyüme dahil olmak üzere kanser hücresi davranışları üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için tasarlanmış fonksiyonel tahlilleri de açıklıyoruz. İki tamamlayıcı yaklaşım detaylandırılmıştır: kanser hücrelerinin fibroblast türevi şartlandırılmış ortam (CM) ile tedavisi ve fibroblastların tümör hücreleri ile doğrudan ko-kültürü. Birlikte, bu metodolojiler, yalnızca PCa'da değil, potansiyel olarak bir dizi insan kanserinde de CAF'ler ve tümör hücreleri arasındaki dinamik etkileşimi araştırmak için kapsamlı bir araç setini temsil eder. Ayrıca, bu etkileşimlerin moleküler karakterizasyonu, terapötik müdahale için umut verici hedefler sunan CAF güdümlü onkogenezin anahtar aracılarını ortaya çıkarabilir.

Giriş

Prostat kanseri (PCa), dünya çapında ülkelerin yaklaşık üçte ikisinde erkeklerde en sık teşhis edilen kanserdir. 2022'de yaklaşık 1,5 milyon yeni vaka bildirildi ve bu da dünya çapında 3,97,000 ölümle sonuçlandı. Bu rakamlar PCa'yı erkekler arasında en sık görülen ikinci kanser ve kansere bağlı mortalitenin beşinci önde gelen nedeni yapmaktadır1.

PCa, prognozu ve terapötik yanıtı önemli ölçüde etkileyen önemli intertümöral heterojenite 2,3,4, çeşitli moleküler alt tipler ve değişken klinik sonuçlar 5,6 ile işaretlenmiş multifokal ve biyolojik olarak karmaşık bir hastalıktır7.

Prostat tümörünün başlaması ve ilerlemesinde tümör mikroçevresinin (TME) kritik rolü iyi bilinmesinerağmen 8,9, tümör hücreleri ve çevresindeki stromal kompartman arasındaki moleküler etkileşimler tam olarak anlaşılamamıştır. Prostat tümörü mikroçevresinin (TME) tümör başlangıcı ve ilerlemesinde kritik bir rol oynadığı iyi bilinmesine rağmen, tümör hücreleri ve çevresindeki stroma arasındaki moleküler etkileşimler yeterince tanımlanmamıştır. TME, tümör kaynaklı sinyallere yanıt olarak aktive olan ve daha sonra tümörü teşvik edici işlevler kazanan mezenkimal ve immün kökenli olanlar da dahil olmak üzere çeşitli stromal hücreler içerir10,11. Bunlar arasında, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler) genellikle en bol bulunan stromal popülasyonu temsil eder. CAF'ler hücre dışı matriksin (ECM) yeniden şekillenmesine katkıda bulunur, tümör büyümesini teşvik eder ve kanser hücresi istilasını ve göçünü kolaylaştırır 4,11,12,13. Salgılanan faktörler ve doğrudan hücre-hücre etkileşimleri yoluyla, CAF'ler ayrıca proliferasyonu, invazyonu ve tedavi direncini de etkiler. Özellikle, CAF'ler heterojen bir popülasyondur. Genellikle pro-tümörjenik fonksiyonlarla ilişkili olsa da, bazı alt tipler tümör baskılayıcı roller uygulayabilir14,15. Daha da önemlisi, CAF'ler için benzersiz belirteçlerin olmaması, bunların kesin olarak tanımlanması ve çeşitli rollerinin işlevsel diseksiyonu için zorluklar doğurmaktadır12,16.

CAF'ler ve tümör hücreleri arasındaki fonksiyonel karışmayı araştırmak için sağlam bir yaklaşım, primer CAF'lerin ve eşleşen normal fibroblastların (NF'ler) izole edilmesini ve ardından bunların proliferasyon, göç, koloni oluşumu ve ankrajdan bağımsız büyüme gibi tümör hücresi davranışları üzerindeki ilgili etkilerinin değerlendirilmesini içerir 17,18,19. Bu makale, yüksek riskli PCa hastalarının radikal prostatektomi örneklerinden CAF'leri ve NF'leri izole etmek için rafine, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokolün kritik bir bileşeni, tümör ve tümörsüz bölgelerin uzman bir üropatolog tarafından doğru bir şekilde tanımlanması ve diseksiyonudur ve aynı hastadan CAF'lerin ve NF'lerin türetilmesine izin verir. Bu eşleştirilmiş örnek yaklaşımı, fibroblast fenotiplerini etkileyebilecek intertümöral heterojenliği ve hastaya özgü bireysel değişkenleri kontrol etmeye yardımcı olur20,21,22. Yeterli tümör dokusunun mevcut olduğundan emin olmak için, Gleason skoru ≥7 olan hastalardan alınan örneklere odaklanıyoruz.

İzole fibroblastların güvenilir fenotipik karakterizasyonu, onları diğer hücre tiplerinden, özellikle de örtüşen belirteç ekspresyonunu paylaşabilen epitel hücrelerinden ayırt etmek için çoklu belirteçlerin kullanılmasını gerektirir16. Primer PCa fibroblastları tipik olarak 10-15 pasajdan sonra yaşlanmaya uğradığından ve uzun vadeli analizleri karmaşıklaştırdığından, insan telomeraz ters transkriptazın (hTERT) stabil ekspresyonu yoluyla hücre ölümsüzleştirmesi için bir protokol de sunuyoruz23.

CAF'lerin ve NF'lerin tümör hücreleri üzerindeki fonksiyonel etkilerini keşfetmek için çeşitli deneysel stratejileri test ettik ve optimize ettik. CAF'lerin etkilerini hem salgılanan faktörler hem de doğrudan hücre-hücre teması24 yoluyla uyguladıkları göz önüne alındığında, iki tamamlayıcı tahlil sistemi geliştirilmiştir: (1) kanser hücrelerinin fibroblast şartlandırılmış ortam (CM) ile tedavisi ve (2) fibroblastların ve tümör hücrelerinin doğrudan ko-kültürü. Bu tahliller, proliferasyon, ankrajdan bağımsız büyüme ve göç dahil olmak üzere temel kanser hücresi özelliklerini değerlendirir. Salgılanan faktörlerin etkisini standartlaştırmak için, CAF'lerden ve NF'lerden şartlandırılmış ortam, toplam protein içeriğine dayalı olarak konsantre edildi ve ölçüldü (conCM).

Bu tahliller yoluyla önemli fonksiyonel etkilerin gösterilmesi, CAF güdümlü tümörijenezin kritik aracılarının tanımlanmasını destekleyebilir ve terapötik müdahale için potansiyel hedefler sunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, İtalya'nın Torino kentindeki Città della Salute Molinette Hastanesi Biyoetik Komitesi tarafından onaylanan klinik örneklerin kullanımına ilişkin Kurumsal yönergelere tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm örnekler, katılımcı hastalar tarafından bilgilendirilmiş onam imzasını takiben elde edildi. Aşağıdaki bölüm, kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'ler) ve bunların eşleşen normal fibroblast (NF) muadillerinin izolasyonu için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Protokol, tümörün ve komşu tümör olmayan alanların diseksiyonunu, doku işlemeyi, hücre kültürünü ve izole edilen hücrelerin hem fenotipik hem de fonksiyonel karakterizasyonunu içerir. Tüm işlemler steril koşullar altında, sertifikalı bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreler, aksi belirtilmedikçe,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş,% 5 CO 2 içeren% 5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde kültürlendi. Tüm santrifüj adımları, fren devredeyken gerçekleştirilir. Protokol boyunca kullanılan reaktiflerin, malzemelerin ve ekipmanların kapsamlı bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın. Bu metodoloji, Gleason skoru 4+3 veya daha yüksek olan yüksek riskli prostat kanseri örnekleri için optimize edilmiştir.

1. Cerrahi örnek diseksiyonu

NOT: Bu prosedür, yüksek dereceli prostat kanseri (PCa) olan hastalarda gerçekleştirilen radikal prostatektomi prosedürlerinden25 toplanan cerrahi örnekler üzerinde gerçekleştirildi ve dahili kurumsal kılavuzlara ve yerleşik uluslararası literatüre ve en iyi uygulamalaradayalı olarak standart protokoller izlenerek yönetildi 26,27,28.

  1. Prostat bezini steril bir örtü üzerine biyogüvenlik başlığının altına yerleştirin ve anatomik işaretlere göre yönlendirin.
    NOT: Bu işlem deneyimli bir üropatolog tarafından yapılmalıdır.
  2. Steril bir bıçak kullanarak, ameliyat öncesi biyopsi raporunda neoplastik veya tümör hücresi içermediği belirlenen alanlardan doku dilimleri çıkarın.
  3. DSÖ sınıflandırmasının30 en son baskısının prostat adenokarsinomu için tanı kriterlerine uygun olarak, seçilen bölgelerde tümör hücrelerinin varlığını veya yokluğunu doğrulamak için 2,5 μm kalınlığında doku kesitleri hazırlayarak ve bunları hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyayarak her iki doku örneği üzerinde hızlı bir kriyostatik analiz29 yapın (bkz. Şekil 1A).
    NOT: Tutarsızlıklar ortaya çıkarsa, hem neoplastik hem de neoplastik olmayan alanların histolojik doğrulaması elde edilene kadar örnekleme işlemini tekrarlayın.
  4. Neoplastik ve neoplastik olmayan bölgelerden yaklaşık 10 mm2 numuneyi çıkarın, 7 mL buz gibi soğuk Doku Depolama tamponu içeren 15 mL konik tüplere yerleştirin ve sonraki prosedürler için buz üzerinde tutun.
    NOT: Numuneler bu tamponda 4 °C'de 48 saate kadar saklanabilir.

2. Fibroblast izolasyonu

NOT: Aşağıdaki tüm işleme prosedürleri, aksi belirtilmedikçe 4 °C'de buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Bir şema için Şekil 1 A'ya bakın.

  1. 1. Gün: Doku örneklerini tartın.
    NOT: Ortalama 70-100 mg elde edilir.
  2. 6 cm'lik tabaklara geçin ve her ikisi de 200 U / mL Penisilin, 200 μg / mL Streptomisin (2x) ile desteklenmiş, iki kez 4 mL buz gibi soğuk PBS'de ve iki kez 4 mL buz gibi soğuk cDMEM'de dört ardışık yıkama gerçekleştirin, dokuyu bir tabaktan diğerine aktarmak için steril forseps kullanarak.
  3. 100 U / mL penisilin-G ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM ile buz üzerinde 6 cm'lik bir plakaya yerleştirerek dokuyu mekanik olarak bozun, ardından makas veya bıçak kullanarak küçük parçalar halinde (<1 mm2) doğrayın.
  4. 5 mL buz gibi cDMEM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 754 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı dikkatlice çıkarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve peleti 5 mL buz gibi soğuk cDMEM'de yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 754 x g'da tekrar santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı yukarıdaki gibi çıkarın ve 1 mL / 100 mg doku kullanarak Kollajenaz II'deki (DMEM'de 1 mg / mL) peleti yeniden süspanse edin. 1,5 mL'lik bir mikrotüpe geçin.
    NOT: Kollajenaz partilerinin değişkenliği nedeniyle, farklı partileri test edin ve tahmin edilen tüm izolasyonları gerçekleştirmek için yeterli olduklarından emin olun.
  7. Tüpleri parafin film ile örtün ve sürekli sallanma ile 37 ° C'de O/N (8-12 saat) numunelerini sindirin.
    NOT: 2. Günde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  8. Numuneleri 15 mL konik tüplere aktarın ve kollajenazı inaktive etmek için hücre süspansiyonuna 5 mL buz gibi soğuk cDMEM ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 754 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Kollajenaz, deterjan içeren bir kaba aspire edilerek atılır.
  9. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipet kullanarak aspire edin ve peleti 1 mL %0.05 Tripsin/EDTA içinde yeniden süspanse edin. Ara sıra çalkalayarak 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
  10. Numunelere 1 mL DNaz I ekleyin ve iyice karıştırın. PBS'de taze hazırlanmış 25 mg / mL çözelti kullanın.
    NOT: Bu aşamada DNaz I işlemi, tek hücreli çözeltinin elde edilmesine yardımcı olur.
  11. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 754 x g'da santrifüjleyin.
  12. Süpernatanı aspire etmek için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve peleti 5 mL soğuk cDMEM'de yeniden süspanse edin. 5 dakika 4 °C boyunca 754 x g'de santrifüjleyin.
  13. % 20 FBS cDMEM'de hücreleri yeniden askıya alın. Tabaklayın ve en az 3 gün boyunca 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde inkübe edin. Çanağı hareket ettirmemeye/eğmemeye dikkat edin. 70-100 mg doku için, hücre süspansiyonunu 2 mL ortamda 2 x 3,5 cm'lik tabaklara dağıtın. Gerekirse ölçeği buna göre küçültün.
    NOT: 50 mg'dan az doku, verimsiz hücre türemesine neden olur. Bölme ve dondurma şeması Şekil 1B'de gösterilmiştir.
  14. 3 gün sonra, hücreleri morfoloji / canlılık açısından kontrol edin ve hücre tarafından üretilen büyüme faktörlerini korumak için ortamın 2 / 3'ünü değiştirin. Hücrelerin birleşme noktasına ulaşması yaklaşık 7-10 gün sürecek ve ortamı her gün değiştirecektir.
  15. Bir kez birleştikten sonra, hücreleri %20 FBS cDMEM'de 10 cm'lik bir tabağa geçirin.
  16. Ortamı iki kez,% 15 FBS ortamı kullanarak,% 12,5, sonra% 12,5, sonra% 10 kullanarak her gün değiştirin. FACS analizleri için, RNA ve protein ekstraksiyonu ve stokların dondurulması Şekil 1B'deki şemayı takip eder.
  17. Yaklaşık% 100 birleştiğinde (yaklaşık 10 gün) hücreleri bölün. Her biri 5 dakika boyunca bol PBS ile 2-3 kez yıkayın. % 1 Tripsin / EDTA (2x) ekleyin ve inkübatöre yerleştirin, birkaç dakikada bir hücre ayrılmasını kontrol edin.

3. Kültür koşulu

  1. Hücreleri yalnızca% 100 birleştiğinde, 1: 3'ten fazla olmamak üzere geçirin.
  2. Birleşen 10 cm'lik bir tabağın% 50'sine karşılık gelen alikotları 0,5 mL buz gibi soğuk dondurma ortamında (FBS'de% 10 DMSO) dondurun. Her bir alikotu 10 cm'lik bir tabakta çözdürün.
    NOT: Ortalama ikiye katlama süresi 80-90 saattir.

4. FACS analizi

NOT: Bu protokol, fibroblast popülasyonunun güvenilir bir şekilde karakterizasyonunu sağlar ve epitelyal, endotel veya bağışıklık hücrelerinden kaynaklanan potansiyel kontaminasyonu tanımlar. FACS analizi, Şekil 2A'da gösterildiği gibi bölüm 2'de gerçekleştirilir.

  1. Hücreleri toplayın ve 106 hücre / mL konsantrasyonda FACS tamponunda (PBS artı% 2 FBS) yeniden süspanse edin.
  2. Akış sitometri tüplerini etiketleyin ve her birine 100 μL hacimde 1 x10 5 hücre ekleyin. 4 antikorla boyama için, hem boyamayı hem de kapıyı hesaba katmak için aşağıdaki gibi 11 tüp hazırlayın (Tablo 1)
    NOT: 1 tüp, antikor yok (boyanmamış kontrol), hücre otofloresansını değerlendirmek için, antikor izotip kontrollü 1 tüp, aspesifik bağlanmayı değerlendirmek için, kompanzasyon için her biri tek bir antikora sahip 4 tüp; kompanzasyon boncukları, hücreleri, geçit için 4 Floresan Eksi Bir (FMO) tüpünün, her biri antikorlardan birini, 4 antikorun tümüne sahip 1 tüpün (gerçek numune) yerini alabilir. Aşağıdaki floresan işaretli antikorlar kullanılır (bkz . Malzeme Tablosu): (1) Anti-EpCAM-PE (Epitel hücre belirteci), (2) Anti-CD31-VioBlue (Endotel hücre belirteci), (3) Anti-CD45-FITC (Bağışıklık hücresi belirteci), (4) Anti-CD90-APC (Fibroblast hücre belirteci). Mevcut akış sitometresi filtrelerine göre diğer floroforlara konjuge antikorlar kullanılabilir. Hücre canlılığını korumak için tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
  3. Hücreleri, saflaştırılmış anti-CD16 / CD32 antikorları veya bloke edici tampon (PBS% 1 -% 2 BSA) gibi Fragman Kristalize edilebilir reseptörler (FcR) blokerleri ile inkübe edin. 100 μL hücre süspansiyonu başına 1-5 μL FcR Bloke Edici Reaktif kullanın ve 4 ° C'de 10-15 dakika inkübe edin.
  4. Yıkamadan doğrudan lekelenmeye devam edin. Tablo 1'de belirtildiği gibi tüplere uygun antikor dilüsyonları veya karşılık gelen izotip kontrollerini ekleyin.
  5. Nazikçe karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. 2 mL FACS tamponu ile yıkayın.
  7. 4 ° C'de 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  9. Üreticinin talimatlarına göre canlılık boyası (propidium iyodür) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
  10. Numuneleri bir akış sitometresinde alın.
  11. Ücret matrisini ayarlamak için tek lekeli ücretlendirme denetimlerini kullanın. Veri analizi için, FACS yoğunluk grafiklerine aşağıdaki geçit stratejisini uygulayın:
  12. İleri ve yan saçılma geçidi: FSC-A ve çizim SSC-A ve hücresel kalıntıları dışlamak için ana hücre popülasyonunun etrafında bir bölge tasarlayın.
  13. Çift dışlama için: FSC-A vs. FSC-W (veya FSC-H'ye karşı. FSC-A) ve hücre kümelerini dışlamak için bir bölge tasarlayın, bu da alana göre artan genişlik (veya yüksekliğe göre artan alan) gösterecektir. Tek hücreleri seçin ve aynı prosedürü gerçekleştirin, SSC-A ile çizin. SSC-W (veya SSC-H vs. SSC-A) tek hücre popülasyonunun saflığını artırmak için.
  14. Canlılık boyasını (yani, propidyum iyodür) vs. SSC-A ve negatif canlı hücreleri seçin.
  15. Canlı hücrelerde, CD326 (x ekseni) ile karşılaştırıldığında. CD31 (y ekseni); Kapıları doğru bir şekilde ayarlamak için ilgili FMO örneklerini kullanın. FMO, floresanın diğer floroforların neden olduğu belirli bir kanala yayılmasını hesaba katmasına izin verir.
    1. CD326 FMO örneğine bakarak, sol kadranlardaki tüm hücreleri içeren bir kadran kapısı çizin (yani, CD326 için negatif). Tüm FMO hücrelerinin alt kadranlarda olması için kapıyı ayarlamak için CD31 FMO örneğini kullanarak aynı prosedürü tekrarlayın (yani, CD31 için negatif). Örnekleri analiz etmek için bu kadranı kullanın ve sol alt kadrandaki hücreleri seçin (CD31- CD326-).
  16. CD326 (x ekseni) vs. CD45 (y ekseni), kadran kapısını ayarlamak için CD326 FMO ve CD45 FMO'yu kullanarak. Tüm örnekleri analiz etmek ve sol alt kadrandaki hücreleri seçmek için bu kadranı kullanın (CD45- CD326-).
  17. Arsa CD90 vs. SSC-A ve negatif hücreleri dışlayan ve sadece CD90 + içeren bir bölge ayarlamak için CD90 FMO'yu kullanın. CD90+ hücrelerinin yüzdesini ölçerek tüm örnekleri analiz etmek için bu bölgeyi kullanın. Temsili sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir.

5. Fibroblastların ölümsüzleştirilmesi

NOT: CAF ve NF popülasyonlarının ölümsüzleştirilmesi, hTERT eksprese eden bir retroviral vektör ile stabil transdüksiyon ile elde edilir. Aşağıda, enfektif psödoviral partiküllerin hazırlanması ve hücrelerin transdüksiyonu için protokoller bulunmaktadır.

  1. Retroviral partikül üretimi
    1. 1. Gün, poli-L-lizin kaplama ve hücre kaplaması: 10 cm'lik bir tabağı 6 mL poli-L-lizin çözeltisi (H2O'da 0.1 mg / mL) ile kaplayın, TC kaputunun altında 5 dakika inkübe edin, aspire edin ve 3 x 106 HEK293T hücreyi kaplamadan önce açılan tabağın kaputun altında kurumasını bekleyin.
    2. 2. Gün: 0.75 mL antibiyotik içermeyen lipofeksiyon için optimize edilmiş ortama 30 μL katyon lipid aracılı transfeksiyon reaktifi ekleyin.
    3. Paralel olarak, 2 μg pCL-Ampho Retrovirüs Paketleme Vektörü ve 2 μg pBABE-puro-hTERT plazmitlerini başka bir 0.75 mL antibiyotik içermeyen lipofeksiyon için optimize edilmiş ortama ekleyin.
    4. RT'de 5 dakika inkübe edin.
    5. İki seyreltmeyi 15 mL'lik konik bir tüpte karıştırın ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
    6. Bu arada, HEK293T besiyerini %10 FBS ile desteklenmiş 6 mL lipofeksiyon için optimize edilmiş besiyeri ile değiştirin.
    7. DNA komplekslerini çanak yüzeyine nazikçe dağıtın ve nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde 6 saat O / N ila inkübe edin.
    8. 3. Gün: Ortamı 7 mL cDMEM ile değiştirin ve 48 saat inkübe edin.
      NOT: Bu adımdan başlayarak, kurumsal kurallara uygun olarak Biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) doku kültürü tesisinde çalışma yapılmalıdır.
    9. 5. günde, virüs içeren ortamı toplayın ve 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
    10. Aliquot ve -80 °C'de saklayın.
  2. Viral transdüksiyon
    1. 1. Gün: 6 oyuklu bir plakanın 2 oyuğunda% 60 birleşimde plaka düşük geçişli fibroblastlar.
    2. 2. Gün: Ortamı, 8 μg/mL polibren içeren önceden üretilmiş pBABE-puro-hTERT retroviral preparatından 1 mL ile değiştirin ve 12-16 saat inkübe edin.
    3. 3. Gün: Virüs içeren ortamı 2 mL cDMEM ile değiştirin.
    4. 4. Gün: 24 saat sonra, 48 saatlik iki tur puromisin seçimine (2 μg / mL) başlayın.
      NOT: Konsantrasyon, her bir antibiyotik partisi ve hücre tipi için ampirik olarak belirlenmeli ve seçimden sonraki 4 gün içinde tüm hücreleri öldürmek için en düşük konsantrasyon seçilmelidir.
    5. 8. Gün: Enfekte olmamış kontrol hücrelerinin hepsinin öldüğünü kontrol edin. Ortamı cDMEM ile değiştirin ve enfekte olmuş hücrelerin 1: 3 oranında geçmeden önce birleşene kadar büyümesine izin verin. Hücrelerin birleştiği yere ulaşmasına ve tekrar 1: 3 bölünmesine izin verin. Bu aşamada, hücreler BLS3 tesisinden çıkabilir.
      NOT: Dondurulmuş alikotları mümkün olan en kısa sürede hazırlayın. Ölümsüzleşmenin gerçekleştiğinden emin olmak için, hücreleri 5-6 kez geçirin ve geçişlerle değişmemesi gereken morfoloji ve duplikasyon oranlarını puanlayın. Aşağıda açıklanan yöntemleri kullanarak ölümsüzleştirilmiş hücreleri birincil muadilleriyle işlevsel olarak karşılaştırın.

6. Fibroblast karakterizasyonu

  1. FENOTIPIK OLARAK izole edilen hücreleri CAF / NF belirteçlerinin ekspresyonu için analiz edin ve tümör hücreleri üzerindeki potansiyel pro-onkojenik aktivitelerini işlevsel olarak karakterize edin.
    NOT: Hem RNA hem de protein seviyelerinde belirteç ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için optimize edilmiş qPCR oligonükleotidleri ve antikorları sırasıyla Tablo 2 ve Malzeme Tablosunda rapor edilmiştir. Fibroblast aktivasyon proteinine (FAP) karşı antikorların genellikle spesifik olmadığına dikkat edin. Uygun pozitif ve negatif kontrolleri eklediğinizden emin olun 31,32. Fibroblastlar ve tümör hücreleri arasındaki karışmayı değerlendirmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Burada, tümör hücrelerinin CAF'lerden veya NF'lerden türetilen şartlandırılmış ortam (CM) ile tedavi edilmesinden veya fibroblastların ve tümör hücrelerinin birlikte kültürlenmesinden oluşan iki alternatif yaklaşım tanımlanmıştır. Tümör hücrelerinin proliferasyonunu arttırmak için her iki yaklaşımın etkinliği açıklanmaktadır.

7. Şartlandırılmış ortamın hazırlanması ve konsantrasyonu

NOT: Şartlandırılmış ortam, farklı hücreler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için toplandıktan sonra konsantre edilir ve doğru şekilde dozlanır.

  1. Hücreleri cDMEM'de 15 cm'lik bir tabakta% 70 birleşim noktasında plakalayın.
  2. Ertesi gün, 15 mL açlık ortamına (FBS'siz DMEM) geçin ve CM'yi üretmek için 48 saat inkübe edin.
  3. CM'yi toplayın, RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak ve sterilize etmek için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
  4. Konsantre tüplere (MWCO 10.000 Da) aktarın ve yaklaşık 1 mL konsantre CM (conCM), yani 15 x konsantrasyon elde etmek için 2000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika veya üreticinin talimatlarına göre santrifüjleyin.
  5. ConCM'yi ayırın ve -80 °C'de saklayın.
  6. Kolorimetrik bir protein tahlili kullanarak toplanan conCM'nin protein içeriğini ölçün.
    NOT: Elde edilen ortalama konsantrasyon 0,5 ve 2 μg/μL'dir. Daha düşük konsantrasyonlar hala kullanılabilir.

8. Proliferasyon testi

NOT: Hücre proliferasyonu (DU145 veya LNCaP insan PCa hücre hatları kullanılarak), tümör hücrelerinin conCM ile tedavi edilmesi veya CAF'lar veya NF'lerle birlikte yetiştirilmesi olmak üzere iki farklı ayar altında bir canlı hücre analiz cihazı kullanılarak değerlendirildi. Bu durumda, floresan tümör hücreleri kullanılmalıdır. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir.

  1. ConCM ile tedavi üzerine proliferasyon testi
    NOT: Bu protokol DU145 hücreleri için optimize edilmiştir; Farklı hücrelerin ayarlanması gerekebilir.
    1. 96 oyuklu bir plakada (750 hücre / kuyucuk) cDMEM'deki plaka tümör hücreleri, koşul başına en az 3 kopya göz önünde bulundurularak ve O / N'yi inkübe edin.
    2. cDMEM'i 50 μg / mL conCM ile takviye edilmiş veya edilmemiş açlık ortamı ile değiştirin.
    3. Plakayı inkübatör içindeki canlı hücre analiz cihaz odasına aktarın.
    4. 37 °C'de 30 dakika ısınmaya bırakın, ardından ilk taramaya başlayın.
    5. Faz kontrast kanalını kullanın, uygun bir hedef ve istenen alan/kuyu sayısını (10x objektif ve 5 alan/kuyu önerilir) ve standart tarama türünü seçin. 4-5 gün boyunca her 6 saatte bir tarayın (süre, koşullar ve hücre tipleri için ampirik olarak belirlenmelidir).
    6. Analizi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
    7. Her kuyucuk için (her koşul için teknik kopyalar) sıfır zamanındaki değerine göre kat değişimini hesaplayın. İlgili grafikleri oluşturun ve uygun yazılımı kullanarak istatistiksel anlamlılığı değerlendirin.
  2. Birlikte kültürleme üzerine proliferasyon testi
    1. 96 oyuklu bir plakada cDMEM'de 1: 3 oranında 750 RFP eksprese eden DU96 hücreleri ve CAF'ler veya NF'ler ortak plaka.
    2. Ertesi gün, %2 FBS DMEM'e geçin. Plakayı inkübatördeki canlı hücre analizi cihaz odasına aktarın ve hem faz kontrastını hem de turuncu kanalı kullanarak 4 gün boyunca her 6 saatte bir standart taramaya başlayın.
    3. Üreticinin talimatlarına göre proliferasyon analizi yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Her kuyucuk için (her koşul için teknik kopyalar) sıfır zamanındaki değerine göre kat değişimini hesaplayın. İlgili grafikleri oluşturun ve uygun yazılımı kullanarak istatistiksel anlamlılığı değerlendirin.

9. Yara iyileşmesi migrasyon testi

NOT: Burada, canlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak hücre göçünü ölçmek için klasik çizik testi33'ün otomatik bir versiyonu sunulmaktadır.

  1. Birleştirilmiş bir tek tabaka elde etmek için canlı hücre analiz cihazına uygun 96 oyuklu bir plakadaki plaka tümör hücreleri.
  2. Ertesi gün, hücreleri 2 saat boyunca 10 ug / mL mitomisin C ile tedavi edin.
    NOT: Bu adım, tahlil sırasında hücre proliferasyonunu önlemek için gereklidir, bu da sonuçları karıştırır.
  3. Üreticinin talimatlarına göre çiziği kuyucuklara uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  4. Ayrılmış hücreleri çıkarmak için 100 μL PBS ile yıkayın.
  5. 50 mg / mL veya (kontrol) olmadan açlık ortamı ekleyin.
  6. Plakayı inkübatördeki canlı hücre analiz odasına yerleştirin.
  7. 30 dakika sonra, hücrelere ve koşullara bağlı olarak her 4 saatte bir 1 gün veya daha uzun süre önerilen yara iyileşmesi tarama protokolünü programlayın.
  8. Sonuçları üreticinin talimatlarına göre analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).

10. Yumuşak agar testi ile ankrajdan bağımsız büyüme

  1. 12 oyuklu plakalarda% 70 birleşimde plaka CAF'leri veya NF'ler, kontrol olarak üç boş kuyu bırakır.
  2. Ertesi gün, steril koşullar altında 50 mL'lik konik bir tüpte 12,5 mL PBS'ye 0,45 g düşük erime noktalı agar ekleyerek 4x yumuşak agar stok çözeltisi (%3,6) hazırlayın.
  3. Mikrodalga fırında eritin. Çözeltinin konsantre olmasına neden olacak aşırı kaynamaya dikkat edin.
  4. 37 °C'de soğutun, ardından önceden ısıtılmış cDMEM ile 1:4 oranında seyrelterek 1x çalışma solüsyonu hazırlayın.
  5. Ortamı 12 oyuklu plakadan aspire edin ve her oyuğa 500 μL 1x agar çözeltisi ekleyin.
  6. Agar solüsyonunun geri kalanını 37 °C'de saklarken 4 °C'de 20 dakika katılaşmasına izin verin.
  7. Bu arada, tümör hücrelerini tripsinize edin ve 2 x 104 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
  8. Eşit hacimlerde hücre süspansiyonu ve agar 1x solüsyonunu birden çok kez pipetleyerek karıştırın ve her bir oyuktaki ilk agar tabakasının üzerine 500 μL (yani 5000 hücre) dağıtın. En az %10 fazla hücre süspansiyonu hazırladığınızdan emin olun.
  9. Agarın 4 °C'de 20 dakika inkübe ederek katılaşmasına izin verin.
  10. Her bir oyuğa 1 mL cDMEM ekleyin ve yumuşak agar tabakasının yer değiştirmesini önlemek için ortamı kuyu kenarından nazikçe aspire ederek ve taze besiyerini merkeze neredeyse damla damla ekleyerek her gün yenileyin.
  11. Kolayca görülebilen koloniler görünene kadar kuluçkaya yatırın. DU145 hücreleri genellikle hafif değişikliklerle yaklaşık 12 gün sürer.
  12. 200 μL nitroblue tetrazolium klorür çözeltisi (PBS'de 1 mg / mL) ekleyerek ortam ve leke kolonilerini atın. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  13. Koloniler boyandıktan sonra, boya çözeltisini atın ve bir stereomikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Plakayı mikroskop tablasına yerleştirin ve tüm kuyucuğun görünür olduğundan emin olmak için büyütmeyi en düşük değerine (0.8x) ayarlayın. Kolonileri keskin netleme haline getirmek için kaba netleme düğmesini kullanın, ardından görüntüleri çekmeden önce aydınlatma ve mod ayarlarını yapın.
  14. Ek Dosya 34'de verilen adımları izleyerek koloni sayısını ve işgal edilen alanı ölçmek için uygun yazılımı 1 kullanın.
  15. Kolonilerin sayısını ve boyut dağılımını puanlayın (bkz. Şekil 4).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol ile 7 yüksek dereceli PCa hastasından alınan CAF ve NF çiftleri başarılı bir şekilde izole edildi. Hastaların ameliyat yaşı ve Gleason skorları Tablo 3'te özetlenmiştir. Türetilmiş fibroblast popülasyonlarının saflığını değerlendirmek için, pasaj iki birincil CAF ve NF ayrıldı ve apoptozu değerlendirmek için belirtilen floresan antikorlarla veya propidyum iyodür ile boyandı. Müteakip FACS analizinden elde edilen temsili sonuçlar, geçit stratejisini ve her bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PCa dokusundan hücrelerin türetilmesi ve analizi, özellikle mevcut hayvan modellerinin insan prostat anatomisini ve hastalığın ilerlemesini tam olarak kopyalamadığı göz önüne alındığında, ilgili bir deneysel model sağlar37. Şempanzelerin prostat bezleri anatomik olarak insanlara benzer, ancak etik sınırlamaları ima etmenin yanı sıra yavaş, stokastik bir hastalık ilerlemesi gösterir. Köpekler prostat yapısı ve patobiyolojisi açısından önemli ölçüde farklılık göster...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, İtalyan Kanser Araştırma Derneği (AIRC), IG16930 ve VP'ye IG24851 tarafından desteklenmiştir; İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (MIUR PRIN 2017 ve 2022'den VP'ye); Truus ve Gerrit van Riemsdijk Vakfı, Lihtenştayn, V.P.'ye bağış; Piedmont Bölgesi (saptırma). A.S., İtalyan Kanser Araştırma Vakfı (FIRC) doktora sonrası bursu tarafından desteklendi ve LA, Fondazione Umberto Veronesi tarafından desteklendi. Şekil 2 ile oluşturuldu BioRender.com.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 kuyucuklu plakaSarstedt833921
24 kuyucuklu plakaSarstedt833922
6 kuyucuklu plakaSarstedt833920
96 kuyucuklu plakaSarstedt833924
Anti-GAPDH Fare mAb'si (6C5)Sigma AldrichCB1001 SerisiKaynak: Fare; WB için seyreltme: 1:1000
aSMASigma AldrichA5228 Kaynak: Fare; Dünya Bankası için seyreltme: 1:3000
CaveolinHücre Sinyalizasyon TeknolojisiCST3267Kaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Akış Sitometrisi Ab, Endotel hücre belirteci
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Akış Sitometrisi Ab, Epitel hücre belirteci
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Akış Sitometrisi Ab, Pan lökosit belirteci
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Akış Sitometrisi Ab, Fibroblast belirteci
Kolajen VI (COL6A1)Abcamab182744Kaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
Konik tüp 15 mLSarstedt62554502
Konik tüp 50 mLSarstedt62547254
Cryopure 2 mL mikrotüplerSarstedt72380992
Kültür tabağı 100 mm çapında Corning353003
Kültür tabağı 100 mm çapında Corning353025
Kültür tabağı 60 mm çapında Corning353002
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma AldirchD8418 SerisiBiyolojik başlıkta kullanım
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)Gibco119650924 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
FAPAbcamAB53066Kaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:500
FcR Engelleme Reaktifi, insanMilteny Biotec130-059-901FC Engelleyici
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco160000444 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Filtrelenmiş uçlar 10 µ LSarstedt703010255
Filtrelenmiş uçlar 100 &mikro; LSarstedt703030255
Filtrelenmiş uçlar 1000 µ LSarstedt703060255
Filtrelenmiş uçlar 20 µ LSarstedt703030265
Filtrelenmiş uçlar 200 &mikro; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Forceps2Biol1102412
FSP1/S100A4Hücre Sinyalizasyon TeknolojisiD9F9D (13018)Kaynak: Tavşan; Dünya Bankası için seyreltme: 1:2000
IL6Abklonal teknolojiA0286 SerisiKaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
ResimJUlusal Sağlık EnstitüsüSürüm 1.53CGörüntü analizi için yazılım
incucyte imagelock 96 oyuklu plakaSartorikBA-04857
Incucyte® SX5 SerisiSartorikSX5 SerisiCanlı hücre analiz cihazı 
Lipofectamine 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher Bilimsel11668019katyon lipid aracılı transfeksiyon reaktifi
MACS® Doku Depolama ÇözümüMilteny Biotec130-100-008
Mikroplaka okuyucu (600 nm absorbans)PromegaGM3500 Serisi
Mikrotüpler 1.5 mL Sarstedt7269001
NCADAbcamAB18203Kaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
Nitro Mavi Tetrazolium Sigma AldirchN5514
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
pCL-AmphoNovus Biyolojik NBP2-29541 Serisi-20 °'de saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
PDGFRB HakkındaSanta CruzSC-432 SerisiKaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
Penisilin-Streptomisin (PS, 10,000 μ g/mL) Gibco151401224 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Faz kontrast mikroskobu Olympus BX42 Serisi
Fosfat Tamponlu Salin  (PBS)Ev yapımıNaCl, 137 mM; KCl, 2.7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1.8 mM. RT'de Otoklav ve Mağaza
Poli-L-lizin çözeltisiSigma AldirchP89204 ° C, Biyolojik başlıkta kullanın
Puromisin dihidroklorürSigma AldirchP8833
Secura Yarı Mikro TeraziSartoriusSECURA125-1S
Serolojik pipet 10 mL Sarstedt861254001
Serolojik pipet 2 mL Sarstedt861252001
Serolojik pipet 25 mL Sarstedt861256001
Serolojik pipet 5 mL Sarstedt861253001
İSTAT3CST9139Kaynak: Fare; WB için seyreltme: 1:1000
STAT3 Y705CST9131Kaynak: Tavşan; WB için seyreltme: 1:1000
stereomikroskopLeicaMZ125 Serisi
Şırınga 10 mLPentafert00202260D12
TermoMikserEppendorph22331
Tripsin-EDTA (%0,5), fenol kırmızısı içermezGibco15400054
VimSanta CruzSC-6260 SerisiKaynak: Fare; Dünya Bankası için seyreltme: 1:2000
Vivaspin 20 santrifüj konsantratör Sigma AldirchZ614602MWCO 10,000 Da 
Wagner makası2Biol14070-12

Kaynaklar

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Prostat Kanseri FibroblastlarFibroblast zolasyonuT m r Mikro evresiKondisyonlu MedyumAnkrajdan Ba ms z B y meYumu ak Agar DeneyiFibroblast Ko K lt rT m r StromasFibroblast Karakterizasyonu

İlgili makaleler