Method Article

Yüksek Verimli İskele Tabanlı Kültür Platformu Olarak SPOT'un Tekrarlanabilir Üretimi

DOI:

10.3791/68405

⸱

July 29th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek verimli iskele tabanlı bir kültür platformu olan SPOT'un 96 ve 384 kuyulu formatlarda imalatını ve montajını belgelemektedir. Ayrıca, hem manuel olarak hem de piyasada bulunan bir sıvı işleyici kullanarak SPOT için tohumlama sürecini detaylandırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), tümörleri modellemek için kanser araştırmaları alanında giderek daha fazla kullanılmaktadır. İn vivo ve geleneksel in vitro modellerin faydalarını birleştirerek, hala insan hücrelerinden oluşurken doku karmaşıklığını ve heterojenliğini özetlerler. Fizyolojik olarak temsili PDO modellerinin yükselişi, organoid davranışın basit bir şekilde analiz edilmesini sağlayan cihazlara ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. Bu protokol, yüksek verimli, üç boyutlu (3D) bir organoid kültür cihazı olan Organoid Tabanlı Dokular için İskele destekli Platform'un (SPOT) nasıl monte edileceğini ve kullanılacağını açıklar. Bu platform, iki boyutlu (2D) kültürler için görüntüleme işlemine benzer şekilde doğru, hızlı görüntülemeye izin vermek için tipik olarak tohumlanmış hidrojeller tarafından oluşturulan menisküsü ortadan kaldırır. Sonuç olarak, SPOT'ta tohumlanan organoidler ve ko-kültürler, yüksek verimli mikroskopi kullanılarak kolayca görüntülenebilir. Kullanıma hazır kullanım için tasarlanan SPOT, temel doku kültürü deneyimine sahip araştırmacılar tarafından erişilebilir ve hem manuel hem de otomatik tohumlama iş akışlarıyla uyumludur. Bu protokol, montaj, tohumlama, kalite kontrol ve sorun giderme için adım adım talimatlar da dahil olmak üzere SPOT'un 96 ve 384 kuyulu formatlarda üretimini detaylandırır. İmalat, boşta kalma süresi hariç 3-4 saat gerektirirken, aynı anda birden fazla plaka üretilebilir ve bu da ölçeklenebilirliği artırır. PDO kültürünü ve analizini kolaylaştırarak SPOT, yüksek verimli ilaç taraması ve translasyonel kanser araştırmaları için sağlam bir araç sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomedikal araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, fizyolojik olarak ilgili in vitro tahlillerin geliştirilmesi hala zordur. İdeal bir tahlil, çeşitli disiplinlerdeki araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için çok çeşitli hücre tiplerini, tedavi formülasyonlarını, zaman ölçeklerini, ticari enstrümantasyonu ve analitik okumaları barındırmalıdır. Bununla birlikte, uygun araçların bulunmaması nedeniyle, araştırmacılar genellikle, özellikle kanser araştırmalarındakarmaşıklığı ve klinik alaka düzeyini özetlemekte başarısız olan, ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinin 2D tek katmanları gibi basit modellere güvenirler 1,2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) organoidleri örnek olarak kullanılmıştır. Bu organoidler, Toronto Üniversitesi Araştırma Etik Kurulu yönergelerine (protokol #36107) uygun bir protokol kapsamında Princess Margaret Kanser Merkezi'ndeki UHN Biobank'tan (Kanada Üniversitesi Sağlık Ağı'ndan PMLB tanımlayıcısı PPTO.46) satın alınan PDAC hastalarından oluşturulmuştur. Lütfen Malzeme Tablosundaki tüm gerekli malzemelere, reaktiflere ve ekipmanlara bakın.

1. PMMA-aseton çözeltisinin yapılması (Zamanlama: 20 dk + ~ 8-16 saat boşta)

NOT: ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kağıt iskelenin PMMA deseni, kuyular arasında içerik alışverişini önlemek için fiziksel bir bariyer görevi görür. Bu tasarım, bitişik kuyucukların kimyasal ve biyolojik olarak izole kalmasını sağlamak, ortamın, ilaçların, salgılanan faktörlerin ve hatta hücrelerin istenmeyen difüzyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir14. PMMA'nın dahil edilmesi, hassas bölümlere ayırmaya izin vererek, SPOT'u çapraz kontaminasyonun en aza indirilmesi gereken yüksek verimli tarama ve ko-kültür çalışmaları için gü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, 96 ve 384 kuyulu SPOT'un üretimi ve kullanımı için montaj, manuel ve sıvı işleyici destekli hücre-jel tohumlamasını kapsayan ayrıntılı bir kılavuz sağlanmıştır. Geleneksel hidrojel tıkaç sistemlerinden farklı olarak SPOT, menisküsle ilgili artefaktları ortadan kaldırarak daha önce tarif edildiği gibi organoidlerin tahribatsız, yerinde görüntülenmesini kolaylaştırır 14,16,22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, görüntü elde etmede Jennifer Lam'in yardımını kabul ediyorlar. Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 7A, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif hibesi (hibe #RGPIN-2021-03488) tarafından APM'ye desteklenmiştir; A.P.M.'ye Kanada İlk Araştırma Mükemmelliği (CFREF) Tasarım Büyük Sorular programı ile Tıp; NSERC Kanada Yüksek Lisans Bursları - R.C.'ye Doktora programı; R.C.'ye Peterborough K.M. Hunter Hayırsever Vakfı Ödülü; NTL'ye verilen Ulusal Araştırma Konseyi (NRC) CRAFT Bursu; NSERC CREATE TOeP'den N.T.L.'YE; NSERC Lisans Öğrencisi Araştırma Ödülü Z. K.'ye; ve....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2mL PCR tüpleri (8'li şeritler) Sarstedt72.985.002
1.5 mL santrifüj tüpüKurbağa BiyoLMCT1.7B
1000-μ L pipet uçlarıTutulma4-1019-260-000
10 mL serolojik pipetlerKurbağa Biyo394010
10 mL şırıngaBD, Kanada302995
10x Minimum temel ortam (MEM 10x)Gibco11430030
150 mm çanakCorning430599
Luer kilit bağlantılı 16 gauge dağıtım uçlarıMcMaster-Carr, Illinois, ABD6699A2
20&mikro; L filtre uçları raflarıOpentron'lar999-00099
200&mikro; L filtre uçları raflarıOpentron'lar999-00081
200-μ L pipet uçlarıTutulma4-1030-260-000
Luer lock bağlantılı 20 gauge dağıtım uçlarıMcMaster-Carr, Illinois, ABD6699A4
384 oyuklu dipsiz kuyu plakası (siyah)Greiner82051-544
3-mL şırınga BD, Kanada309657
50 mL polipropilen konik santrifüj tüpüVWRCA21008-940
50 mL polipropilen konik santrifüj tüpüVWRCA21008-940
96 oyuklu dipsiz kuyucuk plakası (siyah)Greiner82050-714
AsetonFisher BilimselA18-1 Fırlatma Uçağı
Analitik teraziYOKYOK
Inkscape için AxiDraw uzantısı (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)YOKYOK
AxiDraw Python API'si (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) YOKYOK
AxiDraw V3 Yüksek Performanslı Kişisel Yazma ve Çizim MakinesiKötü Çılgın Bilim Adamları, ABDYOK
Sığır kolajeni (PureCol 3 mg/ml)Gelişmiş BioMatrix5005
Tercih edilen hücre hattıYOKYOK
Klipsli Şövale (AxiDraw V3 paketine dahildir)Kötü Çılgın Bilim Adamları, ABDYOK
Tercih edilen kültür ortamıYOKYOK
Kir Tutucu Koruma Bandı3 milyon6851 PN36851
Çift taraflı poliakrilik yapışkan bant (800 mm x 1200 mm)Yapıştırıcı Araştırmaları, ARcare90106 Not
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco12483-020
Finum çay filtreleri XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Almanya420.69.00
0,2 mL PCR tüpleri için düz kapaklar (8'li şeritler)Sarstedt65.989.002
Ağır hizmet tipi plastik yaylı kelepçelerKRİTER1024-554
HEPA modülü – 110-130V 60Hz modeliOpentron'lar999-00109
Buz torbası (dondurulmuş, 1400 mm x 1800 mm)YOKYOK
Inkscape yazılımıYOKYOK
Lazer kesiciÜniversal Lazer SistemiVLS3.75 Serisi
0,07 inç dış çaplı minyatür etil vinil asetat (EVA) boruMcMaster-Carr, Illinois, ABD1883T3
Çok Kanallı elektronik pipet P20 (Gen2)Opentron'lar999-00005
Çok Kanallı elektronik pipet P300 (Gen2)Opentron'lar999-00006
OjeSally HansenSBS-006861PMMA mürekkebinin pigmentasyonu için isteğe bağlı
Opentron'lar OT-2Opentron'lar999-00111
P1000 pipetGilson'ınFA10006M
P200 8 kanallı pipetGilson'ınF144072
P200 pipetGilson'ınFA10005M
Kağıt havlularYOKYOK
ParafilmBemis Şirketi A.Ş.52859-079
Pergament kağıdı   YOKYOK
Pastör pipetleriVWR14672-380
Penisilin-streptomisin (P/S)Sigma-AldrichP4333
Poli(metil metakrilat) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Polikarbonat film (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr'ın fotoğrafı.85585K102 Serisi
Polidimetilsiloksan monomer ve çapraz bağlayıcı (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Ellsworth Yapıştırıcılar4019862
Hassas bıçakYOKYOK
Sert akrilik destek (kuyu plakasının altına takılan boyut)McMaster-Carr'ın fotoğrafı.8560K239 Serisi
Sert karton destekYOKYOK
CetvelYOKYOK
Makas YOKYOK
Sodyum bikarbonat (damıtılmış suda 0,8M)Sigma-AldrichS6014 Serisi
Alüminyum bloklu sıcaklık güvertesi (Gen2)Opentron'lar999-00097
İzleme tekerleği HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
Şeffaf bant YOKYOK
Tripan mavisiGibco15250-061
TripsinGibco25200-056
CımbızYOKYOK
Vortex karıştırıcı YOKYOK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Patient Derived OrganoidsOrganoid Culture PlatformScaffold Based CultureHigh Throughput ScreeningHydrogel PlatformAutomated Liquid HandlingTissue EngineeringCancer Disease ModelingOrganoid Imaging3D Cell Culture

Related Articles