Yöntem makalesi

Yüksek Verimli İskele Tabanlı Kültür Platformu Olarak SPOT'un Tekrarlanabilir Üretimi

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek verimli iskele tabanlı bir kültür platformu olan SPOT'un 96 ve 384 kuyulu formatlarda imalatını ve montajını belgelemektedir. Ayrıca, hem manuel olarak hem de piyasada bulunan bir sıvı işleyici kullanarak SPOT için tohumlama sürecini detaylandırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), tümörleri modellemek için kanser araştırmaları alanında giderek daha fazla kullanılmaktadır. İn vivo ve geleneksel in vitro modellerin faydalarını birleştirerek, hala insan hücrelerinden oluşurken doku karmaşıklığını ve heterojenliğini özetlerler. Fizyolojik olarak temsili PDO modellerinin yükselişi, organoid davranışın basit bir şekilde analiz edilmesini sağlayan cihazlara ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. Bu protokol, yüksek verimli, üç boyutlu (3D) bir organoid kültür cihazı olan Organoid Tabanlı Dokular için İskele destekli Platform'un (SPOT) nasıl monte edileceğini ve kullanılacağını açıklar. Bu platform, iki boyutlu (2D) kültürler için görüntüleme işlemine benzer şekilde doğru, hızlı görüntülemeye izin vermek için tipik olarak tohumlanmış hidrojeller tarafından oluşturulan menisküsü ortadan kaldırır. Sonuç olarak, SPOT'ta tohumlanan organoidler ve ko-kültürler, yüksek verimli mikroskopi kullanılarak kolayca görüntülenebilir. Kullanıma hazır kullanım için tasarlanan SPOT, temel doku kültürü deneyimine sahip araştırmacılar tarafından erişilebilir ve hem manuel hem de otomatik tohumlama iş akışlarıyla uyumludur. Bu protokol, montaj, tohumlama, kalite kontrol ve sorun giderme için adım adım talimatlar da dahil olmak üzere SPOT'un 96 ve 384 kuyulu formatlarda üretimini detaylandırır. İmalat, boşta kalma süresi hariç 3-4 saat gerektirirken, aynı anda birden fazla plaka üretilebilir ve bu da ölçeklenebilirliği artırır. PDO kültürünü ve analizini kolaylaştırarak SPOT, yüksek verimli ilaç taraması ve translasyonel kanser araştırmaları için sağlam bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomedikal araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, fizyolojik olarak ilgili in vitro tahlillerin geliştirilmesi hala zordur. İdeal bir tahlil, çeşitli disiplinlerdeki araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için çok çeşitli hücre tiplerini, tedavi formülasyonlarını, zaman ölçeklerini, ticari enstrümantasyonu ve analitik okumaları barındırmalıdır. Bununla birlikte, uygun araçların bulunmaması nedeniyle, araştırmacılar genellikle, özellikle kanser araştırmalarındakarmaşıklığı ve klinik alaka düzeyini özetlemekte başarısız olan, ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinin 2D tek katmanları gibi basit modellere güvenirler 1,2. Bunu ele almak için, büyük ölçekli tümör biyobankacılığı ve klinisyen işbirliği, hücre hatlarına kıyasla hastaya özgü daha fazla genetik ve terapötik profili koruyan hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar) gibi yüksek kaliteli in vitro modellerin geliştirilmesine yol açmıştır 3,4,5. Bu arada, laboratuvar otomasyonu ve ilaç keşfindeki gelişmeler, yüksek verimli iş akışlarına sorunsuz bir şekilde entegre olan platformlar gerektiriyor. Mevcut platformlar ya biyolojik doğruluğu ya da ölçeklenebilirliği ele alırken, çok azı her iki zorluğu da aynı anda çözebilmiştir 6,7,8. Temel hastalık özelliklerini kopyalayan otomatik, yüksek verimli modeller geliştirmek, biyomedikal araştırmaları ilerletmek ve çeviri uygulamaları için veri üretimini hızlandırmak için çok önemlidir.

Ortaya çıkan çok sayıda model, PDO'lar gibi yüksek verime sahip özel hücre tiplerinin kültürlenmesiyle ilgili zorlukları ele almayı amaçlamaktadır (Şekil 1). Organoidlerin 96 veya 384 oyuklu plakalarda hidrojel ile karıştırıldığı standart platformlar çeşitli sınırlamalar sunar: (i) yüksek hücre-jel hacmi tutarsız besin erişimine yol açar, (ii) kuyu menisküs eğriliği görüntüleme artefaktları ve hücresel gradyanlar oluşturur, (iii) hidrojel tohumlama, partiler ve personel arasında tekdüzelik eksikliği, (iv) otomatik üretim ve otomatik mikroskopi ile uyumsuzluk ve (v) tipik olarak yumuşak ve kırılgan risk örneği olan hücre dışı matris (ECM) kullanımı fizyolojik doku yoğunluklarında yıkım veya kasılma hücre tiplerinin dahil edilmesi 1,9. Şu anda, plaka bazlı PDO çalışmalarının çoğu, hücre jelinin plaka10,11'e manuel olarak tohumlanmasıyla veya hidrojelin daha az viskoz bir ortamla seyreltildiği ve hücrelerin uygun optik düzleme yerleştirmek için kuyu dibine santrifüjlendiği bir jel kaplama yöntemiyle yürütülmektedir12,13. Her iki yaklaşım da uzun vadeli kültür için mekanik destek sağlamada başarısız olmaktadır. Önceki gözlemlerimize (yayınlanmamış veriler) dayanarak, standart kuyu plakalarındaki hücrelerle karıştırılan ticari hidrojel, 12 gün boyunca 12 kuyudan 9'u için kuyu yüzeylerinden büzülürken, jel-kaplama yöntemi fizyolojik hücre-matris etkileşimlerinden yoksundur. Ek olarak, elde edilen kültürler, kuyu içindeki alan sınırlamaları nedeniyle uzun süreler boyunca sürdürülemez ve yüksek reaktif-hücre-ortam oranı14,15,16 gerektiren tahlillerle uyumlu değildir. Bu pratik engeller, 3B modellerin benimsenmesini engeller ve saha genelinde deneysel tekrarlanabilirliği sınırlar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Ölçeklenebilirlik ve biyolojik uygunluğa dayalı kültür modellerinin değerlendirilmesi. Çeşitli in vitro ve in vivo kültür sistemlerinin, plaka verimi ve biyolojik alaka düzeyi (x ekseni) ile tanımlanan ölçeklenebilirlik (y ekseni) boyunca göreceli olarak konumlandırılması, verim potansiyeli ile fizyolojik doğruluk arasındaki dengeleri vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu zorluklardan yola çıkarak, hem 96 hem de 384 kuyucuklu formatlarda mevcut olan Organoid Bazlı Dokular için İskele destekli Platform'u (SPOT) geliştirmek için ince bir selüloz iskelenin yüksek gözenekliliği ve mekanik takviyesinden yararlanıldı. SPOT, plaka düzenine uyan, hassas hücre-jel damlacık yerleşimini sağlayan ve hidrojel fazı için yapısal destek sağlayan, önceden geliştirilmiş bir sızma yöntemi17 kullanan bir polimer önceden desenli iskele içerir (Şekil 2A). İskeleye kılcal fitilleme, hücre-jel çözeltisini yönlendirerek mekanik olarak zorlanmış bir biyokompozit ağ oluşturur (Şekil 2B). İskelenin gözenekli yapısı nedeniyle, hücre jeli sızar ve ince bir tabaka (yaklaşık 70 μm kalınlığında) oluşturur, bu da kuyunun14 tabanını kaplamak için on kat daha az miktarda hücre jeli gerektirir. SPOT'un tohumlama pankreatik duktal adenokarsinomu (PDAC) PDO'ları ile uyumluluğu, metabolik testler ve görüntü tabanlı ölçümler kullanılarak büyümelerinin değerlendirilmesiyle de gösterilmiştir. Geliştirilmesinden bu yana SPOT, organoid kültürüyle uğraşan araştırmacılar için önemli çok yönlülük ve kullanılabilirlik göstermiştir. Ek olarak, SPOT'un tasarımı, düz, menisküs içermeyen mikrojel geometrisi sayesinde azaltılmış reaktif hacimleri ve gelişmiş görüntüleme yetenekleri ile kullanıcı dostu ölçeklenebilirliği barındırarak tek tip ışık penetrasyonu ve doğru yüksek içerikli görüntülemesağlar 14 (Şekil 2C,D). SPOT ayrıca, tümör mikroçevresini daha iyi özetlemek için fibroblastlar gibi diğer ilgili hücre tipleriyle ko-kültürü de destekler18.

figure-introduction-2
Şekil 2: 96-SPOT cihazına ve görüntü analizi iş akışına genel bakış. (A) SPOT plaka imalatının şematik gösterimi: cihaz, ticari bir dipsiz kuyu plakası (üstte), PMMA desenli iskele (mavi renkle gösterilmiştir) ve polikarbonat filmin (altta) çift taraflı poliakrilik yapıştırıcı katmanları (sarı ile gösterilmiştir) kullanılarak harmanlanmasıyla monte edilir. (B) İskele kuyusuna hücre tohumlama: hücreler, polimerize olmayan bir hidrojel (pembe renkle gösterilmiştir) içinde süspanse edilir ve iskeleye sızdığı her bir oyuğa pipetlenir. Hidrojelin daha sonra iskele destekli hidrojel içindeki hücreleri kapsüllemek için jelleşmesine izin verilir. (C) Mikroskopi: Elde edilen mikrodoku, otomatik geniş alan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. (D) Görüntü tabanlı analiz: Jel içinde süspanse edilmiş floresan hücrelerin (yeşil) elde edilen görüntüleri, standart görüntü analizi boru hatları kullanılarak analiz edilebilir. Bir 96-SPOT kuyusunda GFP eksprese eden KP4 hücrelerinin temsili epifloresan mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu 500 μm'dir. Bu rakam14'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SPOT'un bir diğer avantajı, sistemin açık kaynaklı bir sıvı işleyici ile entegre edilebilmesi ve PDO kültürlerinin otomatik, tekrarlanabilir üretimini kolaylaştırmasıdır. Bu ilerleme, kullanıcı değişkenliğini azaltır ve yüksek verimli ilaç taraması ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları dahil olmak üzere karmaşık deneysel tasarımları destekler18. SPOT'un ayrıca daha önce heterojen tümör ortamlarında hücresel fenotiplerin tek hücre tabanlı çoğullanmış karakterizasyonu ve hücrelerin sindirim18 yoluyla SPOT'tan talep üzerine alınması ile uyumlu olduğu gösterilmişti. Bu özellikler, SPOT'u, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında ilaç etkinliğini ve hücresel davranışı değerlendirmek için uzunlamasına, yüksek çözünürlüklü verilerin gerekli olduğu tarama uygulamaları için çok yönlü bir araç olarak konumlandırmaktadır14,18. Bu teknik yenilikleri bir araya getiren SPOT, geleneksel 3D kültür sistemlerindeki kritik sınırlamaları ele alıyor.

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir 3D organoid kültürler için SPOT bileşenlerinin üretimi, plakaların birleştirilmesi ve tohumlama yöntemleri için kapsamlı bir kılavuz sağlar. Mikropipet kullanarak manuel plaka tohumlama ve hem 96 hem de 384 kuyucuklu formatları destekleyen sıvı işleyicili otomatik tohumlama iş akışları için ayrıntılı talimatlar içerir. Ek olarak, bu protokol, yüksek deneysel standartları korumak için tek tip jel dağılımının ve iskele bütünlüğünün doğrulanması gibi temel kalite kontrol önlemlerini ana hatlarıyla belirtir. Eksik jel sızması, tohumlama sırasında buharlaşma ve iskele ayrılması gibi yaygın sorunları ele almak için sorun giderme stratejileri de sağlanarak araştırmacıları iş akışlarını optimize etmek ve güvenilir sonuçlar elde etmek için pratik çözümlerle donatmaktadır.

SPOT, jel bütünlüğünü korurken tahlillerin gerçekleştirilmesi ve ortam değişikliği ile ilgili zorluklar da dahil olmak üzere geleneksel organoid tahlillerin karşılaştığı boşlukları doldurmak için tasarlanmıştır 10,11,12,13. Bu yöntemin genel amacı, 12 günlük bir süre boyunca organoid kültürü destekleyen iskele destekli bir platform üretmektir. Ek olarak, bu yöntem ayrıca, kullanıcıların ilaç IC50 tahlilleri ve küçük molekül taraması dahil olmak üzere herhangi bir aşağı akış pertürbasyonu gerçekleştirmesine izin vermek için manuel veya sıvı işleyici destekli tohumlama yoluyla SPOT'ta doku dizileri oluşturmayı da kapsar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) organoidleri örnek olarak kullanılmıştır. Bu organoidler, Toronto Üniversitesi Araştırma Etik Kurulu yönergelerine (protokol #36107) uygun bir protokol kapsamında Princess Margaret Kanser Merkezi'ndeki UHN Biobank'tan (Kanada Üniversitesi Sağlık Ağı'ndan PMLB tanımlayıcısı PPTO.46) satın alınan PDAC hastalarından oluşturulmuştur. Lütfen Malzeme Tablosundaki tüm gerekli malzemelere, reaktiflere ve ekipmanlara bakın.

1. PMMA-aseton çözeltisinin yapılması (Zamanlama: 20 dk + ~ 8-16 saat boşta)

NOT: Polimetil metakrilat (PMMA)-aseton çözeltisi, SPOT'ta kuyuları tanımlamak ve kuyular arası sızıntıyı önlemek için kullanılır. Genel prosedür, katı PMMA'yı aseton içinde çözmektir. Daha önce, PMMA-aseton çözeltisi, farklı bir 3D kültür modelinde17 hipoksi elde etmek için ortam ve gaz değişimini bloke etmek için benzer bir kağıt iskeleyi modellemek için kullanılıyordu. Burada, PMMA-aseton formülü, SPOT üretimi için PMMA ile sızmış iskeleler oluşturmak üzere uyarlanmıştır.

  1. Etiketli 50 mL konik santrifüj tüpüne 1.75 g PMMA tozu ekleyin. Ardından, bir çeker ocakta 7.84 mL aseton ekleyin ve çözücünün buharlaşmasını önlemek için tüpü sıkıca kapatın.
  2. Polimer deseninin görselleştirilmesi gerekiyorsa, çözeltiye 5-10 damla oje ekleyin. Santrifüj tüpünü sıkıca kapatın. Cilayı PMMA-aseton çözeltisi ile karıştırmaya başlamak için tüpü manuel olarak sallayın.
    NOT: Birden fazla çizim partisinde tutarlı olmak için, bilinen miktarda ojeyi asetonla seyreltin, ardından bu çözeltiyi 7.84 mL aseton olarak pipetleyin.
  3. Çözeltinin çözünmesini sağlamak için PMMA-aseton çözeltisini gece boyunca girdap karıştırıcıya yerleştirin. PMMA-aseton çözeltisini açılmamışsa en fazla 2 hafta boyunca 4 °C'de saklayın.

2. PMMA ile sızmış iskeleler yapmak

(Zamanlama: 96 SPOT modelleme için: 15 dakika kurulum + iskele başına 6 dakika; 384 SPOT modelleme için: 15 dakika kurulum + iskele başına 10 dakika)

NOT: 96-/384-SPOT için PMMA sızmış iskelelerin imalatı, yalnızca bir tezgahta (steril olmayan ortam) gerçekleştirilir. 96/384-SPOT iskeleleri yapmak için lütfen ilgili grafik düzenleme çizici yazılımının veya vektör çizici kontrol kitaplığının kurulu olduğundan emin olun . Prosedürün bazı alt bölümlerinin hem 96-SPOT hem de 384-SPOT için geçerli olduğunu, diğerlerinin ise tek bir plaka boyutuna özgü olduğunu lütfen unutmayın. İkinci durumda, A (96-SPOT için) ve B (384-SPOT için) seçenekleri sunulacaktır. (A) 96-SPOT modeli için üç katman vardır; ilk olarak, hazırlama hatları PMMA-aseton çözeltisinin tutarlı bir akışını oluşturur; ikincisi, 96 daireden oluşan dizi; son olarak, bir seyahat eden satış elemanı (TSP) modeli, kuyular arası boşlukları çizer. (B) 384-SPOT modeli için, ilk modül astar çizgileri içerir; ikincisi, kuyu plakasını çevreleyen sınır; Son olarak, 384 bölge kalacak şekilde bir ızgara çizilir. Her iki model için de, kuyuların boyutları, Li ve ark.14 tarafından gösterildiği gibi, kaynak kodu değiştirilerek kontrol edilebilir.

  1. İskele sızma işlemi için kurulum
    1. PMMA-aseton çözeltisinin (4 ° C'de saklanır) oda sıcaklığında 10 dakika çalkalanmasına izin verin. Çizim başlayana kadar tüp tutucuyu bırakın.
    2. Güç kablosunu kullanarak çiziciyi güce bağlayın. Yanıp sönen yeşil ışık, cihazın açık olduğunu gösterir. Çizicinin USB kablosunu çizim için belirlenen bilgisayara takın.
    3. Klips şövalesini bir parça parşömen kağıdı ile örtün. Şövale yüzeyinin tamamının kaplandığından emin olun.
      1. 96/384-SPOT desenlerinin çizimine rehberlik etmek için, bir yaprak yazıcı kağıdına 96-/384-SPOT şablonu hazırlayın. Şırınga yerine kalem ve parşömen kağıdı ve çay filtresi yerine yazıcı kağıdı kullanarak 2.2-2.3 adımlarını gerçekleştirin. Şablon hazır olduğunda, Klipsli Şövale üzerine yerleştirin ve parşömen kağıdı ile kaplayın. Adım 2.2'ye geçin ve 96-/384-SPOT iskeleleri yapmak için protokolü izleyin.
    4. Parşömen kağıdını bağlayıcı klipsler kullanarak şövale üzerine sıkıştırın (Şekil 3A). Bir iskele tabakası (yani çay filtre kağıdı) alın ve iki katmanın birbirine kaynaştığı kenarlar boyunca kesin (Şekil 3B).
    5. Bundan sonra kağıt iskele olarak adlandırılan kesilmiş çay filtresini, düz tarafı (çay filtresinin dış tarafı) yukarı bakacak şekilde klipsli şövale üzerine yerleştirin. Üç taraftan sıkıştırın. Kağıt iskelenin klipsli şövale üzerinde tamamen düzleştiğinden emin olun; Çizim alanında kırışıklık olmamalıdır.
  2. 96/384-SPOT modelini çizme
    1. Plotter yazılımını ve dosyasını 96-SPOT için ayarlamak için 2.2.2 seçeneğini izleyin; Yazılımı ve dosyayı 384-SPOT için ayarlamak için 2.2.3 seçeneğini izleyin.
    2. Plotter yazılımının ve 96-SPOT çizim dosyasının kurulması
      1. Yazılım uygulamasında, 96-SPOT için SVG dosyasını açın (Ek Dosya 1; Şekil 4A). Menü çubuğunda, Uzantılar > Plotter Kontrolü'ne gidin (Şekil 4B).
      2. Yeni pencere göründüğünde, ayarları Ek Şekil 1 ile eşleşecek şekilde ayarlayın. Plotter Control Extension (Çizici Kontrol Uzantısı) penceresinin Plot (Çizim) sekmesine geri dönün. Bunu daha sonrası için açık bırakın.
    3. Vektör çizici kontrol kitaplığı API'sini ve 384-SPOT çizim dosyasını ayarlama
      1. Komut İstemi penceresini (Windows) veya Terminal'i (Mac) açın. Belirlenen etkileşimli bilgi işlem not defterini başlatmak için komutu girin. Not defterinin bir tarayıcıda açıldığından emin olun.
      2. Açmak için 384-SPOT kod dosyasını (Ek Dosya 2) seçin. 20G'lik bir uç (veya 384-SPOT modeli için 16G'lik uç) kullanarak, 3 mL'lik çizim şırıngası ile 1 mL PMMA-aseton solüsyonunu aspire edin (Şekil 3C).
        NOT: 10 mL yükleme şırıngası ile EVA borusu arasındaki akış kontrol vanası açık olmalıdır (namluya paralel). Sızma işlemi yerçekimi ile yönlendirildiğinden, çizim sırasında tutarlı dağıtım hacmini korumak için 3 mL'lik çizim şırıngasının her zaman 0.5-1.5 mL işareti arasında doldurulduğundan emin olun.
    4. 3 mL'lik çizim şırıngasının ucu hala PMMA-aseton çözeltisinin içindeyken, 10 mL yükleme şırıngası ile EVA borusu arasındaki akış kontrol valfini kapatın (namluya dik olarak getirin).
    5. PMMA-aseton çözeltisi tüpünü hızla kapatın. 3 mL'lik şırıngayı kalem tutucuya yerleştirin. Aşağıdaki hizalamayı elde etmek için şırınganın yüksekliğini tutucuya göre ayarlayın (Şekil 3D).
    6. Klipsli Şövalenin konumunu, 3 mL şırınganın ucu çizilen desenin başlangıç noktasına (yani şablon deseninin sol üst köşesindeki koyu noktaya) dayanacak şekilde ayarlayın. Klipsli Şövaleyi altına kaydırmak için şırınga takılıyken çizici kalem tutucusunu kaldırın.
    7. Atmosferik basıncın 3 mL çizim şırıngasında depolanan PMMA-aseton çözeltisine basınç uygulanmasına izin vermek için 10 mL'lik şırıngayı borudan hızla ayırın. Akış kontrol vanasını açın.
    8. 96 NOKTA modelini çizmeye başlamak için 2.2.9 adımlarını izleyin; 384-SPOT'u çizmeye başlamak için 2.2.10 adımını izleyin.
    9. Aşağıda açıklandığı gibi belirlenen çizicide 96-SPOT'un çizimini başlatın.
      1. Yazılımda, çizici Kontrol Uzantıları'nda Uygula'ya tıklayın. Çizici şimdi PMMA modelini çizerek çalışmaya başlayacaktır. Çizim tamamlanana ve çizici kalem tutucu ana konumuna geri dönene kadar başka bir işlem yapılmasına gerek yoktur.
      2. Çizim sırasında çiziciyi duraklatmak için, çizicinin sol tarafındaki küçük gümüş düğmeye basın. Ardından, grafik yazılımındaki çizici Kontrol Uzantıları > Devam Et sekmesi aracılığıyla, çizime kaldığı yerden devam etmeyi veya kalem tutucuyu başlangıç konumuna geri döndürmeyi seçin (Ek Şekil 1C(iii)).
    10. Aşağıda açıklandığı gibi belirlenen bilgi işlem arayüzünde 384-SPOT'un çizimini başlatın.
      1. Arayüzde, Çekirdeği yeniden başlat'a tıklayın ve yeniden çalıştırın (araç çubuğundaki çift ok). Kod şimdi PMMA modelini çizerek çalışmaya başlayacaktır. Desenin çizimi tamamlanana ve kalem tutucu başlangıç konumuna dönene kadar başka bir işlem yapılmasına gerek yoktur.
      2. Çizim sırasında çiziciyi duraklatmak için, çizicinin sol tarafındaki Küçük Gümüş düğmesine basın. Yazıcı kafasını başlangıç konumuna ulaşması için manuel olarak tamamen geriye ve sola hareket ettirin. Çiziciyi güce yeniden bağlayın. 96-SPOT çiziminden farklı olarak, 384-SPOT için çizime duraklatıldığı yerden devam etmenin bir yolu yoktur; Kağıt iskeleyi değiştirin ve kodu baştan başlatın.
  3. Şırınganın boşaltılması ve temizlenmesi
    1. Çizim tamamlandıktan sonra, 10 mL'lik şırıngayı boruya tekrar takın. 3 mL'lik şırıngayı çizici kalem tutucusundan çıkarın ve kalan PMMA-aseton çözeltisini stok şişesine geri aktarın veya önceki adımlar sırasında önemli bir buharlaşma meydana geldiyse atın.
    2. 3 mL şırınganın namlusunu asetonda pipetleyerek yıkayın. Şırınga boru sistemini saklama yerine geri koymadan önce havayla kurumaya bırakın.
    3. SPOT iskelesini Klipsli Şövale'den dikkatlice çıkarın.
    4. Deneyler için kullanılabileceklerinden emin olmak için çizilen SPOT iskelelerini inceleyin (Şekil 3E,F). Rehberlik için sorun giderme Tablo 1'e ve kalite güvencesi ve kontrol Tablo 2 ve Tablo 3'e bakın.
    5. Tüm PMMA desenli iskeleleri serin ve kuru bir yerde kilitli bir torbada saklayın.

3. 96/384 kuyulu bant kesme

(Zamanlama: 96 SPOT desenleme için: 5 parça bant için 15 dakika; 384 SPOT desenleme için: 5 parça bant için 30 dk)

NOT: Bu, özellikle 384 kuyulu bant desenleri için bantları hassas ve verimli bir şekilde kesmenin en etkili yollarından biridir. Bu yöntem aynı zamanda, montaj işlemi sırasında kullanılabilirliği artırmak için bandın bir katmanını (üst kapak plastiği) lazerle kazıma imkanı da sunar. Alternatif olarak, bantlar, kazıma işlemi olmadan daha yavaş bir hızda kağıt kesiciler kullanılarak da kesilebilir.

  1. 96-/384 kuyulu bant deseni lazer kesim dosyasını açın (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4) ve Ek Şekil 2A'da aşağıdaki ayarlarla Çizim'e tıklayarak üç farklı renkle kodlanmış baskı desenini lazer kesim yazılımına yükleyin.
  2. Lazer kesici yüzeyine bir parça bant yerleştirin ve bandın yüzeyde düzgün bir şekilde düzleştiğinden emin olun. Kesim sırasında bantları tutmak için kağıt bantlar veya ağır ağırlıklar kullanın.
    NOT: Bandın lazer kesici yüzeyinde düz olduğundan emin olun. Herhangi bir çarpma, kesilmiş bantların, özellikle de 384 oyuklu bantların kalitesini etkileyebilir.
  3. Yazdırma deseninin konumunu, lazer kesici kılavuzuna göre bant konumuyla hizalanacak şekilde ayarlayın.
  4. Ek Şekil 96B'de gösterildiği gibi aynı lazer kesici ayarını kullanarak her iki 384-/2 kuyulu bandı kesin. Belirli renklere sahip çizgilerin sırası önemlidir. Yeşil çizgiden önce kırmızı çizgiyi kesin. Sonunda maviyi kesin.
    Kırmızı çizgi: %45 lazer gücü, %80 hız, 1000 PPI ve 0,50 mm Z ekseni ile Rast/Yelek modu.
    Yeşil çizgi: %7 lazer gücü, %100 hız, 1000 PPI ve 0,50 mm Z ekseni ile Rast/Yelek modu.
    Mavi çizgi: %50 lazer gücü, %80 hız, 1000 PPI ve 0,50 mm Z ekseni ile Rast/Yelek modu.
  5. Desenli bantları SPOT montajına kadar uygun şekilde saklayın.

4. 96/384-SPOT Montajı (Zamanlama: 1 saat)

NOT: Bu bölüm, 96-/384-SPOT cihazlarının biyogüvenlik kabini (BSC) gibi steril bir ortamda monte edilmesine ilişkin prosedürü detaylandırır. Alternatif olarak, 96-/384-SPOT cihazları steril olmayan bir ortamda önceden monte edilebilir ve daha sonra etilen gazı sterilizasyon işlemi ile sterilize edilebilir.

  1. Montaj için SPOT iskele hazırlanması
    1. 96 veya 384 SPOT için PMMA desenli bir iskele alın. İskelenin mavi bölgesinin etrafındaki fazla kağıdı kesin. Mavi bölgenin çevresinde 5 mm beyaz boşluk bırakın. Ortaya çıkan tabaka yaklaşık 760 mm x 1300 mm olacaktır.
      NOT: Astar hattını kesmeyin. İskelenin hangi tarafının pürüzlü/pürüzsüz olduğunu belirlemede faydalıdır (Şekil 3E,F).
    2. 96 SPOT'lu bir iskeleyi montaja hazırlamak için adım 4.1.3'ü izleyin. 384-SPOT iskele hazırlamak için adım 4.1.4'ü izleyin.
    3. 96-SPOT iskele üzerinde kuyular arası boşlukların delinmesini gerçekleştirin.
      1. Sert bir akrilik desteğin (2700 mm x 2700 mm) üzerine bir parça polietilen film (1000 mm x 1500 mm) yerleştirin. Polietilen film kaplı desteği çalışma yüzeyine yerleştirin ve iskeleyi polietilen filmin üzerine yerleştirin (Şekil 5A).
      2. Cetvelin bir kenarını ilk iki sıra arasında, bu kenarın yanında izleme yapıldığında bir kuyuya girmeyecek şekilde hizalayın.
      3. İzleme tekerleğini iskelenin altındaki cetvele yerleştirin. Bıçağın yolunu yönlendirmek için cetveli kullanarak izleme tekerleğini iskelenin tepesine doğru yukarı doğru döndürün. Bunu, iskele üzerindeki tüm sıralar arası boşluklar için tekrarlayın (yani, 7x).
      4. 4.1.3.2 ve 4.1.3.3 adımlarını, ilk iki sütun arasındaki boşluktan başlayarak diğer tüm sütunlar arası boşluklar için yineleyin.
    4. Aşağıdaki adımları izleyerek 384-SPOT iskelesinde kuyular arası boşluklara delik açmayın.
      1. 384-SPOT iskelenin kuyu arası boşluklarını delmeyin. Doğrudan adım 4.2'ye ilerleyin.
  2. SPOT malzemelerinin ve montaj ekipmanlarının sterilize edilmesi
    1. Baskılı iskeleyi, iki adet 96 oyuklu bandı (veya 384 oyuklu bantları), 96 oyuklu dipsiz plakayı (veya 384 oyuklu dipsiz plakayı), 96 oyuklu plaka kapağını (veya 384 oyuklu plaka kapağını), polikarbonat filmi, polidimetilsiloksan (PDMS) levhası, yeniden kapatılabilir plastik torbayı, cımbızı ve hassas bıçağı bir tarafta 20 dakika boyunca BSC, UV'ye yerleştirin (Şekil 5B).
    2. Tüm malzemeleri ve montaj ekipmanını diğer tarafa ve UV'ye 20 dakika daha çevirin.
  3. İskelenin ilk 96/384 kuyulu banda takılması
    1. İskeleyi pürüzlü tarafı yukarı bakacak şekilde (Şekil 3F), sıralar yatay olarak uzanacak şekilde PDMS levhasının üzerine yerleştirin. Hangi tarafın pürüzlü olduğunu belirlemek için astarlama çizgisini kullanın (Sağa hizalanmış astar çizgisi, pürüzlü tarafın yukarı baktığını gösterir).
    2. İskeleyi, iskele üzerinde (veya altında) kırışıklık veya kabarcık olmayacak şekilde PDMS levhası üzerine düzleştirin. Çift taraflı bandın kazınmamış tarafındaki koruyucu tabakayı çıkarın. Bandın ortasını hafifçe tokalayın ve bandın ortadaki iki sütununu iskele ile hizalayın.
    3. Hizalandıktan sonra bandın ortasını aşağı doğru bastırın. Bandı ortadan başlayıp dışa doğru hareket ettirerek iskele üzerine sabitleyin.
      NOT: Yanlış hizalanmış bir iskele, iyi tohumlama bölgesiyle örtüşen belirgin bir PMMA modeline sahip olacaktır.
    4. İskeleyi PDMS levhasından dikkatlice çıkarmak için cımbızı kullanın ve levhayı gelecekteki imalatlar için saklayın.
  4. İskelenin ikinci 96/384 kuyulu banda takılması
    1. İskeleyi tezgahın üzerine yerleştirin. İskeleyi, düz tarafı (bantlanmamış taraf) yukarı bakacak şekilde çevirin.
    2. İkinci bandın oyulmuş tarafından orta koruyucu tabakayı çıkarın. Bandın ortadaki iki sütununun açıkta olduğundan emin olun. Kazınmamış bant tasarımı kullanılıyorsa, koruyucu tabakayı bir taraftan tamamen çıkarın.
    3. Bandın ortasını hafifçe tokalayın ve bandın ortadaki iki sütununu iskele ile hizalayın.
    4. Bant iskeleye hizalandıktan sonra, bandın ortasını aşağı doğru bastırın. Oyulmuş bant tasarımı kullanılıyorsa, bandın açıkta kalan orta kısmına bitişik diğer iki koruyucu katmanı çıkarın. Bandı ortadan başlayıp dışa doğru hareket ettirerek iskele üzerine düzeltin.
  5. İskelenin dipsiz plakaya tutturulması
    1. Bandın koruyucu tabakasını iskelenin pürüzlü tarafından çıkarın. Oyulmuş bant tasarımını kullanıyorsanız, yalnızca ortadaki koruyucu tabakayı çıkarın.
    2. İskeleyi dipsiz plakanın (kapaklı) alt tarafına hizalayın. Hizalandıktan sonra, iskelenin ortasını plakanın alt tarafına bastırın. Oyulmuş tasarımı kullanıyorsanız, açıkta kalan ortaya bitişik koruyucu katmanları çıkarın. İskeleyi plakanın üzerine ortadan dışa doğru düzleştirin.
  6. İskelenin polikarbonat filme tutturulması
    1. Cımbız kullanarak, polikarbonat filmin koruyucu tabakasını dikkatlice gevşetin. Gevşedikten sonra, koruyucu tabakayı filmden yavaşça soyun. Mikroskopi görüntüleme için optik özelliklerini etkileyeceği için filmde girintiler oluşturmayın.
    2. Polikarbonat filmin diğer tarafı ile adım 4.6.1'i tekrarlayın. Her iki koruyucu tabaka da çıkarıldıktan sonra, filmi tezgahın üzerinde bir kenara koyun.
    3. Koruyucu tabakayı plakanın altına takılan banttan çıkarın. Polikarbonat filmi ortadan başlayarak iskele üzerine bastırın.
    4. Polikarbonat filmi, tüm kuyucuklar iyi belirgin bir sınır elde edecek şekilde plaka tabanına sıkıca bastırın.
    5. Hassas bir bıçak kullanarak, fazla malzemeyi plakanın altından dikkatlice kesin.
      NOT: Plakayı veya herhangi bir kuyuyu kesmemeye özellikle dikkat edin. Bıçak kolayca kesmiyorsa, plakayı kesip kesmediğini kontrol edin.
  7. Montajdan sonra 96/384-SPOT'un depolanması
    1. 96-SPOT'u tamamen monte ettikten sonra, şeffaf, yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun. Çantayı BSC'nin dışına getirin.
    2. Plakanın alt tarafına sert bir akrilik destek yerleştirin. Akrilik desteği zıt köşelerdeki plakaya sıkıştırın (Şekil 5C). Kullanmadan önce her köşede en az 30 dakika kelepçeli tutun.
    3. Plakayı kullanana kadar temiz ve kuru bir yerde saklayın.

5. 96/384-SPOT tohumlama (Zamanlama: 2 saat 45 dk)

NOT: Bu bölüm, tek tip 3D mikro dokular oluşturmak için 96-/384-SPOT cihazlarının tohumlanması prosedürünü detaylandırır. Tohumlama işlemi, tanımlanmış bir hücre-jel hacminin (örneğin, 96-SPOT için 5 μL veya 384-SPOT için 2 μL) önceden monte edilmiş SPOT iskelesine dikkatli bir şekilde dağıtılmasını içerir. Düzgün infiltrasyon ve jel dağılımı sağlamak için, hücre-jel damlacığı, kılcal fitilleme yoluyla iskelenin gözenekli yapısı boyunca yönlendirilir. Bu adım, bir mikropipet kullanılarak manuel olarak veya sıvı işleme ile otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Tohumlamadan sonra, jel polimerizasyonu ve hücre kapsüllemesini sağlamak için plakalar 37 °C'de inkübe edilir.

  1. 96/384-SPOT plakanın hazırlanması
    1. 96-/384-SPOT'un kelepçesini açın ve akrilik desteği alttan çıkarın.
    2. Bir BSC'de, SPOT'u plastik torbadan çıkarın. Plakanın içini sterilize etmek için UV'yi açın ve kapağı kapatmadan ve 20 dakikalık bir UV işlemi için plakanın dibine çevirmeden önce 20 dakika boyunca örtün.
    3. 96-SPOT plakasının her bir kuyu arası boşluğuna 70 μL PBS pipetleyin. PBS'yi 384-SPOT plakasına pipetlemeyin. Tohumlamadan önce plakayı en az 30 dakika 4 °C'de soğutun.
  2. Hücrelerin hazırlanması
    1. Önerilen kullanıma göre hücreleri kültür şişelerinden veya organoidleri jel kubbelerinden ayırın ve üreticinin talimatlarına göre hemositometreyi kullanarak hücre miktarını sayın. İstenen tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak 5.4.1-5.4.2 adımları için gereken hücre süspansiyon hacmini hesaplamak için hücre süspansiyonunun hücre yoğunluğuna (yani mL başına hücre sayısı) dikkat edin.
  3. Jelin hazırlanması
    1. Daha önceoptimize edilmiş hidrojel hazırlama talimatlarını takiben 17,19,20,21, 1 mL 3 mg / mL Tip 1 sığır kollajenini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtarak hidrojeli oluşturun.
      NOT: Bileşenler ve elde edilen karışım, hazırlama süresi boyunca buz üzerinde tutulmalıdır.
    2. Sığır kollajenine 125 μL 10x konsantre minimum esansiyel ortam (MEM) dağıtın. Karışım pembeden sarıya dönene kadar karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
    3. Sığır kollajen karışımına 8 μL 0.8 M sodyum bikarbonat dağıtın. Karışım soluk pembe olana kadar karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Birden fazla deneyde tutarlı jelleşme sağlamak için karışık çözeltiyi hazırlandıktan sonraki 30 dakika içinde kullanın.
      NOT: Karışım sarı kalırsa, soluk pembe bir renk elde edilene kadar 0,5 μL'lik alikotlarda 0,8 M ekleyerek çözeltiyi pH 7'ye titre edin. İSTEĞE BAĞLI: Aynı prosedürü takiben, daha yüksek kollajen konsantrasyonu gerektiren kültürler için jel hazırlanabilir. Organoidleri kültürlemek için, Landon-Brace ve ark.17 ile karakterize edilen hidrojel karışımını kullanın.
  4. Jel içinde hücrelerin süspansiyonu
    1. Hedef hücre-jel yoğunluğu için gerekli hücre süspansiyonu hacmini bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    2. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini jel içinde yeniden süspanse edin (hacim hedef konsantrasyona göre değişir)
  5. 96-/384-SPOT plakasını manuel olarak tohumlama
    1. 96-/384-SPOT plakasını donmuş bir buz torbasının üzerine yerleştirin. 96-SPOT'u tohumlamak için 5.5.2 adımlarını izleyin. 384-SPOT'u tohumlamak için 5.5.3 adımlarını izleyin.
    2. 96-SPOT'u manuel olarak tohumlama
      1. 10 μL'lik bir pipet ucunu hücre-jel karışımıyla önceden kaplayın. 20 μL'lik bir pipet kullanarak 5 μL jeli aspire edin ve uçta bir damlacık oluşana kadar ilk durağa kadar çıkarın. Damlacığı bir kuyunun ortasına dokundurun.
        NOT: Pipeti ikinci durdurucuya bastırarak jeli çıkarmak hava kabarcıklarına neden olabilir. Kuyular arasında tutarlı jelleşme için tüm kuyucuklar 5 dakika içinde tohumlanmalıdır.
      2. İstenilen tüm kuyucukları tohumladıktan sonra, plakayı örtün ve jeli polimerize etmek için üreticinin talimatlarına göre 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin. Her tohumlanmış kuyucuğa 200 μL ortam dağıtın ve gerekli herhangi bir görüntüleme veya pertürbasyondan önce en az 1 saat kesintisiz inkübe edin.
    3. 384-SPOT'u manuel olarak tohumlama
      1. 10 μL'lik bir pipet ucunu hücre-jel karışımıyla önceden kaplayın. 10 μL'lik bir pipet kullanarak 2 μL jeli aspire edin ve uçta bir damlacık oluşana kadar ilk durağa kadar çıkarın.
        NOT: Çok kanallı 10 μL'lik bir pipet şiddetle tavsiye edilir.
      2. Damlacığı bir kuyunun ortasına dokundurun. İstenilen tüm kuyucukları tohumladıktan sonra, plakayı örtün ve jeli polimerize etmek için üreticinin talimatlarına göre 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
      3. Her tohumlanmış kuyucuğa 60 μL ortam dağıtın ve gerekli herhangi bir görüntüleme veya pertürbasyondan önce kesintisiz olarak en az 1 saat inkübe edin.
    4. Sıvı işleyici kullanarak 96/384-SPOT tohumlama
      1. Hücre-jel karışımının hazırlanması sırasında, sıvı işleyiciyi ve HEPA filtre modülünü yükseğe getirin. Sıvı işleyicinin içine dikkatlice %70 etanol püskürtün ve etanole batırılmış kağıt havluyla silin.
      2. Pipet kafası kalibrasyonunu gerçekleştirmeden önce 96-SPOT veya 384-SPOT tohumlama protokolünü (Ek Dosya 5 veya Ek Dosya 6) yükleyin. Sıcaklık modüllerini yuva 1 ve 4'e takın (Şekil 6A).
      3. Kalibrasyon amacıyla, belirtilen P20 ve P200 filtre ucu kutularını kullanın. Bunları sırasıyla 5 ve 6 numaralı yuvalara yerleştirin (Şekil 6B). Pipet kafasını yazılımda görüntülenen istemlere göre kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, yuva 5 ve 6'ya tohumlama için steril P20 ve P200 filtre uçları kutusuna geçin. Yüzeye% 70 etanol püskürtün ve tohumlanana kadar kapıyı kapatın.
        NOT: 96-/384-SPOT plakasının üst kısmına kadar olan uçları doğru bir şekilde kalibre etmek önemlidir. Plakanın üst kısmına göre z ekseni uçlarını görselleştirmeye yardımcı olmak için plaka sızdırmazlık bandı kullanılması önerilir. İdeal konum, çok kanallı başlıktaki uçların tümünün plaka sızdırmazlık bandına temas ettiği ve küçük bir çukur oluşturduğu zamandır.
    5. Her iki sıcaklık modülünü de açın ve hücre-jel karışımı hazırlama sırasında hücreler son eğirme adımındayken bunları 4 °C'ye ayarlayın. Adım 5.4'ün tamamlanmasından sonra, BSC içindeki 8 şeritli 0.2 mL PCR tüplerinin her bir tüpüne istenen miktarda hücre-jel karışımı yükleyin.
      NOT: Her bir tüpe yüklenecek minimum hücre-jel karışımı hacmi: 96-SPOT: 5 μL, ekilmesi gereken sütun sayısı artı ölü hacim ile çarpılır; 384-SPOT: 2 çarpı 2 μL, tohumlanması gereken sütun sayısı ile çarpılır ve ardından ölü hacim eklenir. Sonlara doğru kabarcıkları ve eksik sütunları önlemek için ölü hacmin tüp başına yaklaşık 10 - 20 μL olması önerilir.
    6. Hücre-jel karışımını BSC'den buz üzerinde aktarmadan önce 8 şeritli düz kapakları kullanarak 8 şeritli 0.2 mL PCR tüplerini kapatın.
    7. Önceden soğutulmuş SPOT plakasını, düz tabanlı plaka format bloğu ile yuva 4'teki sıcaklık modülüne yükleyin (Şekil 6B).
    8. Hücre-jel karışımı içeren 8 şeritli 0.2 mL PCR tüplerini 3 oyuklu format bloğu ile 96. yuvadaki sıcaklık modülüne yükleyin.
    9. Düz kapakları ve SPOT plaka kapağını açın ve bunları sıvı tutucunun içinde, ancak kullanılmış yuvalardan uzakta saklayın. P20 ve P200 filtre ucu kutusunun kapağını açın.
    10. Protokolü çalıştırın. İstenilen tüm kuyucukları tohumladıktan sonra, plakayı örtün ve jeli polimerize etmek için üreticinin talimatlarına göre 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
    11. Her tohumlanmış kuyucuğa 200 μL veya 60 μL (96-/384-SPOT) ortam dağıtın ve gerekli herhangi bir görüntüleme veya pertürbasyondan önce kesintisiz olarak en az 1 saat inkübe edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kağıt iskelenin PMMA deseni, kuyular arasında içerik alışverişini önlemek için fiziksel bir bariyer görevi görür. Bu tasarım, bitişik kuyucukların kimyasal ve biyolojik olarak izole kalmasını sağlamak, ortamın, ilaçların, salgılanan faktörlerin ve hatta hücrelerin istenmeyen difüzyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir14. PMMA'nın dahil edilmesi, hassas bölümlere ayırmaya izin vererek, SPOT'u çapraz kontaminasyonun en aza indirilmesi gereken yüksek verimli tarama ve ko-kültür çalışmaları için gü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, 96 ve 384 kuyulu SPOT'un üretimi ve kullanımı için montaj, manuel ve sıvı işleyici destekli hücre-jel tohumlamasını kapsayan ayrıntılı bir kılavuz sağlanmıştır. Geleneksel hidrojel tıkaç sistemlerinden farklı olarak SPOT, menisküsle ilgili artefaktları ortadan kaldırarak daha önce tarif edildiği gibi organoidlerin tahribatsız, yerinde görüntülenmesini kolaylaştırır 14,16,22.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, görüntü elde etmede Jennifer Lam'in yardımını kabul ediyorlar. Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 7A, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif hibesi (hibe #RGPIN-2021-03488) tarafından APM'ye desteklenmiştir; A.P.M.'ye Kanada İlk Araştırma Mükemmelliği (CFREF) Tasarım Büyük Sorular programı ile Tıp; NSERC Kanada Yüksek Lisans Bursları - R.C.'ye Doktora programı; R.C.'ye Peterborough K.M. Hunter Hayırsever Vakfı Ödülü; NTL'ye verilen Ulusal Araştırma Konseyi (NRC) CRAFT Bursu; NSERC CREATE TOeP'den N.T.L.'YE; NSERC Lisans Öğrencisi Araştırma Ödülü Z. K.'ye; ve C.M.T.'ye Toronto Üniversitesi Mükemmellik Ödülü

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2mL PCR tüpleri (8'li şeritler) Sarstedt72.985.002
1.5 mL santrifüj tüpüKurbağa BiyoLMCT1.7B
1000-μ L pipet uçlarıTutulma4-1019-260-000
10 mL serolojik pipetlerKurbağa Biyo394010
10 mL şırıngaBD, Kanada302995
10x Minimum temel ortam (MEM 10x)Gibco11430030
150 mm çanakCorning430599
Luer kilit bağlantılı 16 gauge dağıtım uçlarıMcMaster-Carr, Illinois, ABD6699A2
20&mikro; L filtre uçları raflarıOpentron'lar999-00099
200&mikro; L filtre uçları raflarıOpentron'lar999-00081
200-μ L pipet uçlarıTutulma4-1030-260-000
Luer lock bağlantılı 20 gauge dağıtım uçlarıMcMaster-Carr, Illinois, ABD6699A4
384 oyuklu dipsiz kuyu plakası (siyah)Greiner82051-544
3-mL şırınga BD, Kanada309657
50 mL polipropilen konik santrifüj tüpüVWRCA21008-940
50 mL polipropilen konik santrifüj tüpüVWRCA21008-940
96 oyuklu dipsiz kuyucuk plakası (siyah)Greiner82050-714
AsetonFisher BilimselA18-1 Fırlatma Uçağı
Analitik teraziYOKYOK
Inkscape için AxiDraw uzantısı (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)YOKYOK
AxiDraw Python API'si (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) YOKYOK
AxiDraw V3 Yüksek Performanslı Kişisel Yazma ve Çizim MakinesiKötü Çılgın Bilim Adamları, ABDYOK
Sığır kolajeni (PureCol 3 mg/ml)Gelişmiş BioMatrix5005
Tercih edilen hücre hattıYOKYOK
Klipsli Şövale (AxiDraw V3 paketine dahildir)Kötü Çılgın Bilim Adamları, ABDYOK
Tercih edilen kültür ortamıYOKYOK
Kir Tutucu Koruma Bandı3 milyon6851 PN36851
Çift taraflı poliakrilik yapışkan bant (800 mm x 1200 mm)Yapıştırıcı Araştırmaları, ARcare90106 Not
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco12483-020
Finum çay filtreleri XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Almanya420.69.00
0,2 mL PCR tüpleri için düz kapaklar (8'li şeritler)Sarstedt65.989.002
Ağır hizmet tipi plastik yaylı kelepçelerKRİTER1024-554
HEPA modülü – 110-130V 60Hz modeliOpentron'lar999-00109
Buz torbası (dondurulmuş, 1400 mm x 1800 mm)YOKYOK
Inkscape yazılımıYOKYOK
Lazer kesiciÜniversal Lazer SistemiVLS3.75 Serisi
0,07 inç dış çaplı minyatür etil vinil asetat (EVA) boruMcMaster-Carr, Illinois, ABD1883T3
Çok Kanallı elektronik pipet P20 (Gen2)Opentron'lar999-00005
Çok Kanallı elektronik pipet P300 (Gen2)Opentron'lar999-00006
OjeSally HansenSBS-006861PMMA mürekkebinin pigmentasyonu için isteğe bağlı
Opentron'lar OT-2Opentron'lar999-00111
P1000 pipetGilson'ınFA10006M
P200 8 kanallı pipetGilson'ınF144072
P200 pipetGilson'ınFA10005M
Kağıt havlularYOKYOK
ParafilmBemis Şirketi A.Ş.52859-079
Pergament kağıdı   YOKYOK
Pastör pipetleriVWR14672-380
Penisilin-streptomisin (P/S)Sigma-AldrichP4333
Poli(metil metakrilat) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Polikarbonat film (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr'ın fotoğrafı.85585K102 Serisi
Polidimetilsiloksan monomer ve çapraz bağlayıcı (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Ellsworth Yapıştırıcılar4019862
Hassas bıçakYOKYOK
Sert akrilik destek (kuyu plakasının altına takılan boyut)McMaster-Carr'ın fotoğrafı.8560K239 Serisi
Sert karton destekYOKYOK
CetvelYOKYOK
Makas YOKYOK
Sodyum bikarbonat (damıtılmış suda 0,8M)Sigma-AldrichS6014 Serisi
Alüminyum bloklu sıcaklık güvertesi (Gen2)Opentron'lar999-00097
İzleme tekerleği HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
Şeffaf bant YOKYOK
Tripan mavisiGibco15250-061
TripsinGibco25200-056
CımbızYOKYOK
Vortex karıştırıcı YOKYOK

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hasta Kaynakl OrganoidlerOrganoid K lt r PlatformuY ksek Kapasiteli TaramaHidrojel PlatformuOtomatik S v Aktar mDoku M hendisli iKanser Hastal ModellemeOrganoid G r nt leme3B H cre K lt r

İlgili makaleler