Yöntem makalesi

Manto Hücreli Lenfoma için 3D Model Olarak Hidrojel Tümör Dilimlerinin Biyobaskısı

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68417

⸱

12 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, 3D baskılı hidrojel tümör dilimlerinde manto hücreli lenfomanın üretimi, kültürü ve analizinin ayrıntılı bir tanımını sağlar.

Özet

Manto hücreli lenfoma (MCL), sıklıkla nükseden ve geleneksel kemoterapiye yalnızca sınırlı yanıt gösteren, nadir görülen, agresif bir B hücreli neoplazmdır. MCL araştırmalarındaki en büyük zorluk, hücreler 2D süspansiyon kültüründe kültürlendiğinde spontan apoptoza uğrama eğiliminde olduğundan, birincil MCL hücrelerinin ex vivo olarak kültürlenmesidir. 3D modellerin katı tümörlerin in vivo durumunu daha iyi özetlediği bilinmesine rağmen, lenfomalarda uygulamaları hala yeterince araştırılmamıştır. Lenf düğümü içindeki MCL'nin in vivo koşullarını kopyalayan 3D modeller geliştirmek, hayatta kalmalarını artırabilir, MCL-tümör mikroçevre karışmasının incelenmesini kolaylaştırabilir ve in vivo ilaç yanıtını taklit edebilir. Burada, optimize edilmiş bir kültür yöntemi ile birlikte hidrojel tümör dilimleri şeklinde 3D baskılı bir MCL modeli oluşturuldu. MCL hücre hatları veya birincil MCL hücreleri kullanılarak, hücrelerin bir jelatin destek banyosuna biyobaskı yoluyla aljinat, tip I kollajen ve bazal membran matrisi içeren bir hidrojele daldırıldığı standart bir işlem geliştirilmiştir. Elde edilen MCL hidrojel tümör dilimleri, kültür periyodu boyunca stabilitelerini korumak için bir filtre desteği üzerinde kültürlenir. Sisteme ilaç tedavileri uygulanabilir. Hidrojel tümör dilimi içindeki tek hücrelerin tepkisi, dört renkli canlı 3D floresan görüntüleme ile izlenebilir. Birincil MCL hücreleri, hidrojel tümör dilimlerinde kültürlendiğinde stabil bir canlılık gösterdi. Bu protokol, hidrojel tümör dilimlerinde MCL hücrelerinin üretimi, kültürü ve analizinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Sunulan model, tümör mikroçevresini yakından taklit ederek ve bir hava-sıvı arayüz kültürü kullanarak, geleneksel 2D kültüre kıyasla fizyolojik alaka düzeyini artırır. MCL'nin hem biyolojik hem de terapötik çalışmalarını ilerletmek için önemli bir potansiyel sunar.

Giriş

Manto hücreli lenfoma (MCL), lenf nodu1'in manto bölgesinden köken alan nadir ve agresif B hücreli non-Hodgkin lenfomadır. Manto bölgesi, B hücre folikülünün germinal merkezini çevreleyen küçük lenfositlerden oluşan bir halkadan oluşur. Tipik olarak, MCL, ilk kemoterapiden sonra sık nükslerle agresif bir klinik seyir gösterir. Hastalık oluşumunun1 daha iyi anlaşılması ve immünokemoterapi2, Bruton'un tirozin kinaz inhibitörleri3 veya antikor-ilaç konjugatları4 dahil olmak üzere yeni tedavilerin geliştirilmesi nedeniyle, MCL hastaları için tedavi seçenekleri, yanıt oranlarının artmasına ve uzun süreli progresyonsuz sağkalıma yol açmıştır. Bununla birlikte, ilaç direnci ve nüksler hastalığı hala tedavi edilemez hale getirmektedir5. Kısmen, bu heterojenliğinin ve tümör mikroçevresinin tümör gelişimi ve ilaç direnci üzerindeki etkisinin bir sonucudur6. MCL'yi incelemedeki bir zorluk, hücreler ex vivo 4,5 spontan apoptoza uğradığından, süspansiyon kültürü7'de birincil MCL hücrelerinin yetiştirilmesinin zorluğudur. Bu, klinik öncesi modellerde MCL'yi daha iyi modellemek için alternatif yaklaşımlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

İn vivo tümörler, tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri ve stromal hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenlerin yanı sıra hücre dışı matris (ECM) gibi hücresel olmayan bileşenlerden oluşan üç boyutlu (3D) yapılardır. Kollajen ve laminin gibi makromoleküllerden oluşan ECM, jel benzeribir ortam yaratan 2,8,9,10 ile oldukça hidrofilik olan elastik liflerden oluşan karmaşık bir lifli ağ oluşturur. Tümörlerin bu in vivo koşullarını ex vivo olarak daha iyi kopyalamak için çeşitli 3D modeller geliştirilmiştir. Son yıllarda, bu modeller kanser farmakolojisi ve biyolojisini incelemek için çok önemli hale geldi ve esas olarak katı tümörlere odaklandı11.

Hematolojik kanser hücreleri hem süspansiyonda hem de lenf düğümleri, kemik iliği veya ikincil lenfoid dokular gibi stromal ortamlarda büyüme kapasitesine sahip olduğundan, bugüne kadar bu alan lenfomalarda yeterince araştırılmamıştır12. İn vivo olarak, MCL hücreleri, lenf düğümlerinin manto bölgesinden kana veya kemik iliğine yayılır, ancak esas olarak kaynaklandıkları lenf düğümleri içinde çoğalırlar13,14. Lenf düğümleri içinde, MCL hücreleri, hepsinin MCL hücrelerinin hayatta kalmasını veya ilaç yanıtını kontrol ettiği gösterilen T hücreleri, makrofajlar ve mezenkimal stromal hücreler ile çevrilidir 14,15,16,17,18. Ayrıca, MCL-tümör mikroçevre karışmasının yanı sıra gözeneklilik ve mekanik özellikler, ilaç yanıtlarını ve direnci etkileyebilecek önemli faktörlerdir 6,14. Bu nedenle, birincil MCL'yi incelemek için doğal mikro ortamı simüle eden standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir 3D MCL tümör modelleri gereklidir. Şimdiye kadar, esas olarak birincil MCL hücrelerinin sferoidleri veya organoidleri gibi hücre bazlı modeller oluşturulmuştur 6,19. Birincil MCL hücrelerinin canlılığını ve uzun vadeli kültürünü başarıyla geliştirirler. Bununla birlikte, hücre dışı matris bu modellerde yeterince temsil edilmemektedir. Bu bağlamda gelişmiş 3D biyobaskı umut verici bir yaklaşım sunuyor. Bu teknoloji, canlı hücreleri ve hidrojelleri doğrudan bir araya getirerek fizyolojik olarak ilgili hidrojel bazlı 3 boyutlu lenf nodu modellerinin oluşturulmasına olanak sağlar.

Burada, optimize edilmiş bir kültür yöntemi ile birlikte hidrojel tümör dilimleri şeklinde 3D biyobaskılı bir MCL modeli oluşturuldu. Hücreler, askıda hidrojellerin (FRESH) biyo-baskı20'nin serbest biçimli geri dönüşümlü gömülmesiyle kollajen tip I-, aljinat- ve Matrigel bazlı hidrojel dilimlerine gömülür. Hidrojel tümör dilimleri, MCL hücrelerinin lenf düğümünün in vivo koşullarını yakından özetleyen bir ortamda büyümesine izin veren bir filtre desteği üzerinde kültürlenir.

Bu protokol, hidrojel tümör dilimlerinde MCL hücrelerinin üretimi, kültürlenmesi ve analizinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Dört renkli canlı 3D floresan görüntüleme kullanılarak, hidrojel tümör dilimi içindeki tek hücrelerin canlılığı veya ilaç tepkisi izlenebilir. Primer MCL hücreleri, hidrojel tümör dilimlerinde kültürlendiğinde daha iyi sağkalım gösterdi. Bu model, MCL biyolojisini ve tedavi yanıtını incelemek için bir araç sağlayarak mikroçevresel etkileri ve MCL hasta değişkenliğini anlamanın yolunu açar.

Protokol

Primer MCL hücreleri ile yapılan çalışmanın yerel etik kurul tarafından onaylanması gerekmektedir. Bu çalışmada, Tıp Fakültesi, Eberhard-Karls-Üniversitesi ve Tuebingen Üniversite Hastanesi etik kurulu, hasta ve sağlıklı donör örneklerinin toplanmasını ve çalışmasını onayladı (proje numarası 159/2011BO2) ve hastalardan Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Burada kullanılan birincil MCL hücreleri, tüm MCL hastası lenf düğümlerinden izole edildi ve bu nedenle sadece MCL hücrelerini değil, aynı zamanda bağışıklık hücreleri ve fibroblastlar gibi diğer hücreleri de içeriyordu.

1. Destek banyosu için jelatin bulamacının hazırlanması

NOT: Jelatin bulamacı, 3D biyobaskı işlemi sırasında destek banyosu görevi görecektir. Biyomürekkebin çapraz bağlanmasını indükleyerek 3 boyutlu bir yapının oluşmasına olanak tanır. Jelatin bulamacının hazırlanması, bir hücre kültürü başlığı içinde steril koşullarda yapılmalıdır.

  1. 6.75 g jelatin tozunu 1.5 mL 1 M HEPES, 15 mL 110 mM CaCl2 ve 133.5 mL steril H2O içinde kapaklı steril bir Mason kavanozda çözerek 10 mM HEPES ve 11 mM CaCl2 içinde% 4.5 (a/h) jelatin çözeltisi hazırlayın. Mason kavanozun yüksek performanslı bir karıştırıcıda karıştırmaya uygun olduğundan emin olun.
  2. Çözeltiyi 37°C'de 4 saat boyunca veya çözelti karıştırıldıktan sonra jelatinin tamamen çözüldüğünü gösteren hiçbir leke görülmeyene kadar inkübe edin. Jelatini gece boyunca veya en az 12 saat boyunca 4°C'de soğutun.
  3. 10 mM HEPES ve 14.4 mM CaCl2'den oluşan steril bir yıkama tamponu hazırlayın. Yıkama tamponunu 4°C'ye önceden soğutun.
  4. Katılaşmış %4,5 jelatini steril bir kaşık kullanarak birkaç parçaya bölün.
  5. %4,5 jelatin içeren Mason kavanozunu önceden soğutulmuş yıkama tamponuyla tamamen doldurun ve jelatin bulamacının hazırlanması işlemi boyunca tamponun soğuk kalmasını sağlayın.
  6. Jelatin içeren Mason kavanozunu, jelatin süspansiyonu 0°C'ye ulaşana kadar -20°C'de 45-60 dakika dondurun, ancak henüz buz kristalleri oluşturmaya başlamamıştır. Sıcaklığı izlemek için bir termometre kullanın.
  7. Mikser kapağını ve bıçağını Mason kavanoza takın, ardından Mason kavanozu miksere monte edin. Jelatin süspansiyonunu darbe ayarını kullanarak 120 saniye karıştırın.
    NOT: Farklı tipte bir blender kullanıldığında blender ayarlarının yapılması gerekebilir.
  8. Harmanlanmış süspansiyonu önceden soğutulmuş 50 mL'lik tüplere aktarın. 4°C'de 2 dakika boyunca 3.800 x g'da santrifüjleyin. Süspansiyonun altta katı jelatin bulamacına ve üstte sıvı yıkama tamponuna ayrıldığından emin olun.
  9. Buz üzerinde aşağıdaki adımı gerçekleştirin: Jelatin bulamacını yıkayın. Yıkama tamponunun üstünde görünen kabarcıkları gidermeye çalışarak üst sıvı tabakasını aspire edin. Tüpe 20 mL taze, 4°C yıkama tamponu ekleyin. Jelatin bulamacını yıkama tamponu ile karıştırmak için tüpü vorteksleyin.
  10. Santrifüjleme ve yıkama işlemini en az 3 kez veya yıkama tamponunun üst kısmında kabarcık görünmeyene kadar tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kalan yıkama tamponunu aspirasyon yoluyla çıkarın. Jelatin bulamacı 4°C'de birkaç hafta saklanabilir.

2. Hücre yüklü biyomürekkebin hazırlanması

  1. Baskıdan 1-2 gün önce steril bir %5 aljinat solüsyonu hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpte 20 mL steril PBS'ye 1 g Aljinat ekleyin. Kuru aljinat tozu kalıntılarını önlemek için, PBS'yi küçük artışlarla ekleyin, eklemeler arasında girdap oluşturun. Çözeltiyi 37 °C'lik bir su banyosunda birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında bir tüp silindiri üzerinde inkübe edin. Aljinat tamamen çözüldükten sonra, çözeltiyi ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Bir MCL hücre dizisi ile çalışıyorsanız, hücreleri bir T75 şişesinde süspansiyon halinde kültürleyin. Baskı gününde, 9-10 hidrojel tümör dilimi verecek 1 mL biyomürekkebin hazırlanması için 1.4 x 107 hücrenin mevcut olduğundan emin olun.
  3. Birincil MCL hücreleri ile çalışılıyorsa, hücrelerin biyobaskıdan önce süspansiyon kültüründe kültürlenmesine gerek yoktur. Dondurularak saklanan birincil MCL hücrelerini biyobaskıdan hemen önce çözün. Birincil MCL hücrelerini kültür ortamı ile 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan dondurucu ortamı çıkarmak için, tüpü hemen 340 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın. Hücre sayımı için hücre peletini 20 mL taze ortamda yeniden süspanse edin.
  4. Baskı gününde, ilgilenilen hücreler için uyarlanmış biyomürekkebi hazırlayın. Jeko-1 hücreleri için %0,5 (a/h) aljinat, %20 (h/h) tip-I kollajen, 1x RPMI ve 2 mM HEPES'ten oluşan bir biyomürekkep hazırlayın. 1 mL biyomürekkep için 100 μL %5 aljinat, 200 μL tip-I kollajen, 100 μL 10x RPMI, 200 μL 10 mM HEPES ve 350 μL PBS'yi karıştırın. Hücreler adım 2.6'da eklenecektir.
  5. Birincil MCL hücreleri için %0,5 (a/h) aljinat, %20 (h/h) tip-I kollajen, 1x RPMI ve 0,5 mM HEPES'ten oluşan bir biyomürekkep hazırlayın. 1 mL biyomürekkep için 100 μL %5 aljinat, 200 μL tip-I kollajen, 100 μL 10x RPM, 50 μL 10 mM HEPES ve 500 μL bazal membran matrisini karıştırın. Hücreler adım 2.6'da eklenecektir. Bir MCL hücre hattı ile çalışıyorsanız, hücre süspansiyonunu kültür şişesinden 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. Hücreleri %0.4 tripan mavisi ile 1:1 oranında karıştırın. Bir hücre sayacı veya bir Neubauer odası kullanarak canlı hücreleri (boyanmamış) sayın. 1.4x107 hücreye eşit olan 1 mL biyomürekkep için hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Hesaplanan hacmi yeni bir 50 mL tüpe aktarın. 340 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın. Nihai hücre yüklü biyomürekkebi oluşturmak için hücre peletini hazırlanan biyomürekkepte yeniden süspanse edin.
    NOT: Hücre peletinin 50 μL ortam hacmine sahip olduğu tahmin edilmiştir. Adım 2.4'te hazırlanan biyomürekkep ile birlikte bu, 1 mL biyomürekkep verecektir.

3. Banyo içi biyobaskı

NOT: Mümkünse, 3D baskı işlemini hücre kültürü başlığı altı gibi steril bir ortamda gerçekleştirin. Kullanılan 3D yazıcı, Hinton ve ark.20'de açıklandığı gibi bir şırınga pompası genişletici eklenerek FRESH baskı için modifiye edilmiştir.

  1. Biyoyazıcıyı açın ve 3D yazıcı yazılımına bağlayın. Hidrojel tümör dilimlerinin planını içeren .stl dosyasını açın. Aynı anda en fazla 5 dilim yazdırılabilir. Her hidrojel tümör diliminin 8 mm çapında ve 1,5 mm yüksekliğinde olduğundan emin olun. Doldurma yoğunluğunu %85 olarak ayarlayın. Yazıcı kafasını yerleştirin.
    NOT: STL dosyası Fusion 360 ile tasarlanmıştır ve Ek Kodlama Dosyası 1'de bulunabilir. 3D baskı için Cura Sürüm 15.04.5 yazılımı kullanıldı.
  2. Önceden hazırlanmış jelatin bulamacını, yarısı dolana kadar 35 mm çapında bir Petri kabına aktarın. Jelatin bulamacında hava boşluğu kalmadığından emin olun. Macun kıvamında olan ve yeterli kuvvet uygulanana kadar şeklini koruyan bir jelatin destek banyosu oluşturmak için tek kullanımlık hassas mendiller kullanarak bulamaçtaki fazla suyu çekin.
  3. Hücre yüklü biyomürekkebi 2,5 mL'lik bir cam şırıngaya aktarın ve 0,8 mm'lik kör bir nozüle bağlayın. Şırıngayı ters çevirin ve fazla havayı ve hava kabarcıklarını dikkatlice boşaltın. Şırınga hazırlandıktan sonra biyoyazıcıya yerleştirin. 3D yazıcı yazılımını kullanarak, biyomürekkebi nozülden çıkmaya başlayana kadar sıkın. Püskürtme ucunun tıkanmasını önlemek için püskürtülen biyomürekkep damlasını tek kullanımlık bir bilimsel hassas mendil kullanarak silin.
  4. Jelatin destek banyosunu şırınga ağzının hemen altına yerleştirin. Püskürtme ucu, destek banyosunun tabanının 2 mm yukarısında, jelatin bulamacının içine yerleştirilene kadar yazıcı kafasını indirin.
  5. 3D yazıcı yazılımı aracılığıyla yazdırma işlemini başlatın.
  6. Yazdırma işlemi tamamlandıktan sonra, tıkanmayı önlemek için nozüldeki fazla jelatin bulamacını çıkarın. Hidrojel tümör dilimlerini içeren destek banyosunu çıkarın ve steriliteyi korumak için bir kapakla kapatın.
  7. Jelatinin erimesini sağlamak için basılı hidrojel tümör dilimlerini içeren destek banyosunu 37 °C'de inkübe edin. Bu adım, basılı hidrojel tümör dilimlerini destek banyosundan serbest bırakacaktır.
  8. Yıkama tamponunu ve hücre kültürü ortamını 37 °C'ye ısıtın. Jelatin erirken, hidrojel tümör dilimlerini yıkamak için 6 oyuklu bir plaka hazırlayın. İki kuyucuğu 10 mM HEPES, 14.4 mM CaCl2 yıkama tamponu (jelatin bulamacının yıkanması için kullanılan aynı tampon) ve iki kuyucuğu hücre kültürü ortamı ile doldurun.
  9. Jelatin eridikten sonra, hidrojel tümör dilimlerini yıkama tamponuna aktarmak için steril bir spatula kullanın. Dilimleri önce iki yıkama tamponu içeren kuyucukta, ardından iki orta içeren kuyucukta 1'er dakika yıkayın. Hücre yüklü hidrojel tümör dilimleri artık kültüre hazırdır.
  10. Yazdırma işlemini tekrarlamak için kalan biyomürekkebi saklayın.

4. Hidrojel tümör dilim kültürü ve tedavisi

  1. Hidrojel dilimlerini kültürlemek için, bunları 6 oyuklu bir plaka içine yerleştirilmiş bir filtre desteğine (0,4 μm gözenek boyutu) aktarın. Tek bir filtre desteği üzerinde 5 adede kadar hidrojel dilimi kültürleyin. Filtre desteğinin altına 1,5 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Kurumasını önlemek için hidrojel tümör dilimlerinin üzerine bir damla ortam ekleyin.
  2. Hidrojel tümör dilimlerinin ilaç tedavisi için, hücre kültürü ortamına istenen miktarda ilaç ekleyin. Burada hidrojel tümör dilimleri 0.33 μM-27 μM Doksorubisin ile 48 saat veya 72 saat süreyle tedavi edildi. Her zaman kontrol olarak işlem görmeden bir dizi dilimi kültürleyin.
  3. Hidrojel tümör dilimleri ile 6 oyuklu plakayı 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve% 5CO2 istenen yetiştirme periyodu için.

5. Tripan mavisi dışlama testi ile hücrelerin canlılık analizi

  1. Kültür veya tedaviden sonra hücre canlılığını değerlendirmek için hidrojel tümör dilimlerini çözün. Bir hidrojel tümör dilimini 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. 30 mM EDTA, 55 mM sodyum sitrat ve 150 mM sodyum klorür (pH 6.8) içeren bir çözünen tamponun dilimi başına 500 μL ekleyin. Hidrojel tamamen eriyene kadar yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. Çözeltiyi 340 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Hücreleri, çözünmüş hidrojel dilimi başına 500 μL ortamda yeniden süspanse edin.
  3. Hücre süspansiyonunu 1:1 oranında %0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Canlı (boyanmamış) ve ölü hücreleri (lekeli) bir hücre sayacı veya bir Neubauer odası ile sayın. Daha fazla analiz için canlı ve ölü hücrelerin sayısını kaydedin.

6. Dört renkli canlı 3D floresan görüntüleme

NOT: Burada kullanılan dört renkli boyama, canlı hücreler (TMRM-pozitif), apoptotik hücreler (Florojenik Kaspaz-3 substrat-pozitif) ve ölü hücreler (PicoGreen-pozitif) 21,22,23 arasında ayrım yapılmasına izin verir. Çekirdekler DRAQ5 ile tespit edilir. Bununla birlikte, bu protokol, biyobelirteçleri, hücresel yapıları veya tercih edilen hücre tiplerini tespit etmek için başka herhangi bir fotostabil, spesifik floresan boyaya ayarlanabilir. Boyamadan önce, mikroskobun boyama için kullanılan floroforların dalga boylarını algılayabildiğinden emin olun.

  1. Bir hidrojel tümör diliminin dört renkli boyanması için, sırasıyla 0.5 μM, 5 μM ve 2 μM'lik bir nihai konsantrasyonda 1 mL hücre kültürü ortamına TMRM, DRAQ5 ve florojenik Kaspaz-3 substratı ekleyerek bir boyama çözeltisi hazırlayın.
  2. Steril bir spatula kullanarak, bir hidrojel tümör dilimini odacıklı bir cam lamel üzerine aktarın. Hazırlanan boyama solüsyonunu tamamen kaplanana kadar hidrojel diliminin üzerine ekleyin. Numuneyi karanlıkta 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  3. İlk inkübasyondan sonra, hidrojel tümör dilimini kaplayan boyama solüsyonunu toplayın ve 0.7 μL/mL PicoGreen ekleyin. Boyama solüsyonunu hidrojel dilimine geri pipetleyin ve karanlıkta 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, hidrojel dilimini nemli tutmak için yeterli boyama solüsyonu bırakırken fazla ortamı dikkatlice çıkarın.
  5. Konfokal mikroskop kullanarak dilimi hemen analiz edin. Fototoksisiteyi ve fotoağartmayı önlemek için, lazer yoğunluğunu ve uyarma süresini azaltarak uygulanan foton dozunu en aza indirin. Yukarıda açıklanan lekelerin uyarma/emisyon spektrumları Tablo 1'de bulunabilir.
  6. Hidrojeldeki hücrenin hücresel dağılımına genel bir bakış elde etmek için z-kesitlerini yakalayın. Görüntüleme sırasında z kesitleri alınmışsa, uygun yazılımı kullanarak hidrojel tümör dilimlerinin 3D rekonstrüksiyonlarını oluşturun. Bu rekonstrüksiyonlar, hidrojel tümör dilimlerindeki hücrelerin uzamsal dağılımının ve hücresel durumunun kapsamlı bir analizine izin verecektir.
  7. Hücre segmentasyonu ve yeniden yapılandırmasını gerçekleştirmek için Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'de sağlanan talimatları ve komut dosyasını izleyin.

Sonuçlar

MCL hücrelerini içeren hidrojel tümör dilimleri, yukarıda açıklanan protokol ile oluşturuldu. Hidrojel tümör dilimlerinin 3D baskısı ve kültürlenmesi için iş akışının adımları Şekil 1A'da gösterilmektedir. Kullanılan 3D yazıcı, Hinton ve ark.20'de (Şekil 1B) tarif edildiği gibi bir şırınga pompası genişleticisinin eklenmesiyle FRESH baskı için modifiye edilmiştir. Aynı anda beş dilime kadar basıldı (Şekil 1C) ve bir filtre desteği üzerinde kültürlendi (Şekil 1D). Hidrojel tümör dilimlerine besin kaynağı sağlamak için filtre desteğinin altına ortam eklendi. Kurumasını önlemek için her hidrojel tümör diliminin üzerine bir damla ortam eklendi. Bir filtre desteği üzerinde kültürlenen beş hidrojel tümör dilimine genel bir bakış, bir hidrojel diliminin yakın çekim görüntüleri ile birlikte Şekil 1E'de gösterilmektedir. 3 günlük bir kültür periyodu boyunca hidrojel tümör dilimleri stabildi ve yapılarını korudu (Şekil 2A). Baskıdan hemen sonra, hidrojel tümör dilimlerinde hava kabarcıkları mevcuttu, ancak bunlar yetiştirme sırasında kayboldu (Şekil 2A).

Hidrojel tümör dilimlerinde (3D) kültürlenen MCL hücre hattı Jeko-1'in canlılığı, süspansiyon kültüründe (2D) kültürlenen Jeko-1 hücrelerine kıyasla tripan mavisi dışlama testi ile değerlendirildi (Şekil 2B

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

Bu protokolde açıklanan hidrojel tümör dilimleri, lenf nodu yapısını taklit eden bir MCL modeli sunarak, biyobaskı ile oluşturulan bir 3D tümör mikro ortamında MCL hücresi sağkalımı ve ilaç yanıtının incelenmesine izin verir.

En yaygın kullanılan biyobaskı yöntemleri, biyomürekkebin bir dağıtım sistemi aracılığıyla püskürtüldüğü ekstrüzyona dayanır. Örneğin mürekkep püskürtmeli baskıda, biyomürekkepler biriktirmeden sonra 3 boyutlu yapılar oluşturmak üzere hızla çapraz bağlanır25. Ancak bu yaklaşım, özellikle kullanılan malzemelerin viskozitesi ve katmanları istifleme yeteneği açısından sınırlamalarla birlikte gelir. Buna karşılık, bu protokolde kullanılan FRESH biyobaskı gibi gömülü şırınga bazlı ekstrüzyon 3D biyobaskı, jel içinde jel yaklaşımı uygular. Bu, kollajen gibi düşük viskoziteli biyomürekkeplerin kararlı yapılara basılmasına izin vererek, karmaşık tümör mikro ortamını20,26 taklit etmeyi mümkün kılar. Biyobaskı için özel olarak geliştirilen 3D yazıcılar pahalı olabilse de burada sunulan yöntem daha erişilebilir bir giriş noktası sunuyor. Nispeten basit modifikasyonlarla standart ekstrüzyon yazıcılara uyarlanabilir. Bu modifikasyonlar, uygun fiyatlı filamentlerle 3D olarak basılabilir ve tasarımlar, örneğin Hinton ve ark.20 tarafından açık kaynaklı kaynaklar olarak mevcuttur. Bununla birlikte, FRESH biyobaskı için hidrojel destek banyosunun hazırlanmasının sıcaklığa oldukça duyarlı olduğunu ve bulamaç hazırlama sırasında dikkatli dikkat gerektirdiğini unutmamak önemlidir.

Sıklıkla, 3D baskılı tümör modelleri, in vivo oksijen gradyanı25'ten yoksun yüzen sistemlerde veya yüksek derecede karmaşıklık yakalayan ancak düşük verime sahip olan ve yüksek bakım gerektiren mikroakışkan çip kültürlerinde27 kültürlenir. Bu engeller, burada açıklanan hidrojel tümör dilimleri ile aşılabilir. Bir hava-sıvı arayüzü üzerinde beş adede kadar hidrojel tümör diliminin kültürlenmesi düzeneği, katı tümörlerin hassas kesilmiş tümör dilimlerinin kültüründentüretilir 28. Bu protokolde kullanılan filtre desteğinin membranı, besin alışverişine izin veren ancak hücresel bağlanmayı veya hücre göçünü önleyen 0.4 μm gözenek boyutuna sahip bir politetrafloroetilen (PFTE) membranından oluşur29. PTFE membran üzerindeki kültür, dilimlerin stabilitelerini korumaları ve yırtılmalarını veya parçalanmalarını önlemeleri için fiziksel destek sağlar. Ek olarak, esas olarak yukarıdaki havadan oksijen ve filtrenin30 altındaki ortamdan besin sağlayan bir hava-sıvı arayüzü sağlarlar. Bu nedenle sistem, in vivo25'te meydana gelebilecekleri için besin kaynağı, hücre proliferasyonu ve oksijenasyondaki uzay-zamansal varyasyonları içerir. Bir filtre desteği üzerindeki hidrojel tümör dilimlerinde kültürlenen primer MCL hücreleri, 4 gün boyunca %40'ın üzerinde bir canlılığı korudu, bu da 2D süspansiyon kültüründe gözlenen canlılıktan daha üstündü (Şekil 3A, Ek Şekil 2). Daha ileri araştırmalar, primer B hücreli lenfoma tümörü 6,19,30'un sferoidlerinde ve organoidlerinde veya CD40L eksprese eden fibroblast L hücreleri ile primer MCL hücrelerinin ko-kültürlerinde tarif edildiği gibi, sitokinlerin eklenmesi veya CD40L eksprese eden fibroblastlarla birlikte yetiştirilmesi yoluyla uzun süreli bir canlılığın elde edilip edilemeyeceğini ele almalıdır14. Bu tür yaklaşımların hidrojel tümör dilimlerine dahil edilmesinin, birincil MCL hücrelerinin kültürünü ve ayrıca doğal mikro çevreye benzerliği arttırdığı düşünülmelidir.

Lenf düğümleri, iyi gelişmiş bir hücre dışı matris lifleri ağı içerir. Desenleri nedeniyle retiküler lifler olarak bilinirler. Esas olarak, bu lifler kollajen ve bazal membrana özgü bileşenlerdenoluşur 31,32,33. Lenf düğümlerinde in vivo duruma benzeyen bir matris oluşturmak için, hidrojel tümör dilimlerini oluşturmak için kullanılan biyomürekkep, kolajen tip I ve dört ana bazal membran ECM proteini laminin, kolajen IV, entaktin ve perlecan34'ten oluşan Matrigel'den oluşur. Ayrıca, hidrojel tümör dilimlerini stabilize etmek için biyomürekkebe aljinat eklenir, bu da uzun süreli bir kültüre ve bir spatula kullanılarak bir kaptan diğerine taşınmasına izin verir. Kollajen ve aljinat içeren farklı hidrojellerin test edilmesi, %0.5 aljinat ve %20 kollajen içeren bir biyomürekkep kullanıldığında stabil ve dayanıklı bir hidrojel dilimi ile kombinasyon halinde en yüksek hücresel canlılığı gösterdi (veriler gösterilmemiştir). Bileşenlerin yanı sıra, 0,8 cm'lik hidrojel tümör dilim çapı, 1cm35'lik ortalama lenf nodu çapına da benzemektedir. Hidrojel tümör dilimlerinin canlı 3D görüntülemesi ayrıca hücrelerin eşit dağılımını gösterdi (Şekil 2C).

Burada, hidrojel dilimlerini ilaçlarla tedavi etme yeteneği, yaşlı MCL hasta alt grupları için standart bir bakım tedavisi olan R-CHOP tedavisinin bir parçası olan doksorubisin (rituksimab, siklofosfamid, doksorubisin, vinkristin, prednizon) ile tedavi ile gösterilmiştir24. 2D kültürlerle karşılaştırıldığında, tümör mikroçevresinin tedavi etkileri üzerindeki etkileri hidrojel tümör dilimlerinde incelenebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, hidrojel dilimlerinde kültürlenen Jeko-1 hücreleri, Doksorubisin tedavisine 2D kültürlenmiş hücrelere göre daha dirençliydi. Bu, hücre dışı matrisin ilaç yanıtlarını etkileyebileceği ve tümör sertliğini36, hücre-hücre iletişimini37 ve ilaç dağıtımını38 modüle ederek sıklıkla ilaç direncini artırabileceği gözlemleriyle uyumludur. Ek olarak, akış sitometrik analizinin yanı sıra immünohistokimyasal veya multipleks immünofloresan boyama, hidrojel tümör dilimlerindeki tek hücrelerin tedavi yanıtı hakkında daha derin bilgiler verebilir.

Sonuç olarak, bu protokol, doğal üç boyutlu lenf nodu yapısını taklit eden bir 3D lenf nodu modelini temsil eden hidrojel tümör dilimlerinin oluşumunu ve kültürünü açıklamaktadır. Uygulamayı MCL hücrelerinden diğer primer lenfoma endikasyonlarına genişletme potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

Bu çalışma Robert-Bosch Stiftung ve Baden-Württemberg Bilim, Araştırma ve Sanat Bakanlığı (3R-Network BW) tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler

Mükemmel teknik yardımı için Kerstin Willecke'ye ve 3D görüntü analizi konusundaki değerli yardımı için Yang Zhang'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
µ-slide 8 Kuyucuklu Cam Altibidi GmbH80827Hidrojel dilimlerinin canlı görüntülenmesi için kullanılan cam tabanlı slaytlar
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Biyomürekkep bileşeni
10X RPMI-1640 OrtaSigma-AldrichR1145 SerisiBiyomürekkep bileşeni
2,5 ml Gaz Geçirmez Şırınga Model 1002 TLLHamilton81420Biyobaskı için şırınga
3D Ekstrüzyon yazıcı, PrintrBot SimpleYazıcı robotuBiyomürekkeplerin basılmasına izin vermek için kendi kendini değiştirdi
6 oyuklu plakaTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Hidrojel dilimlerinin kültürü
Şişe üstü vakum filtrasyon sistemleri, PES membran, 500 ml, 0.22 µ m gözenek boyutu, 70  mm çaplı membranCorning A.Ş.513-3355Tamponların steril filtrasyonu
Kalsiyum klorür dehidratCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2Yıkama tamponu ve jelatin bulamacının bileşeni
Sıçandan kolajen ICorning A.Ş.CLS354249Biyomürekkep bileşeni
3D baskı için Cura Sürüm 15.04.5 yazılımıUltimaker3D baskı için kullanılan yazılımlar
DRAQ5Biyodurum Ltd.DR50050Hidrojel dilimlerinin canlı görüntülenmesi için leke
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) disodyum tuzu dihidratSigma-AldrichE5134 (İngilizce)Aljinat çözme tamponunun bileşeni
EVE Otomatik Hücre SayacıNano EnTek A.Ş.10027-452Hücre Sayacı
Falcon Kapaklı Bakteriyolojik Petri Kapları, 35 mm çapDoğan351008Biyobaskı için destek banyosunu oluşturmak üzere jelatin bulamacı ile doldurulur
Falcon Tüpleri, 50 mLSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Fetal buzağı serumuSigma-AldrichS0615Hücre kültürü ortamı takviyesi
Domuz derisinden jelatinSigma-AldrichG1890 SerisiJelatin bulamacının ana bileşeni
HEPES, Serbest Asit, Moleküler Biyoloji SınıfıMerck KGaACAS 7365-45-9 (İngilizce)Yıkama tamponu ve jelatin bulamacının bileşeni
Jeko-1 MCL hücre hattıATCCCRL-3006MCL hücre hattı
KIMTECH Science Hassas mendillerKimberly Clark Şirketi7551Jelatin bulamacından fazla suyu çekmek ve 3D yazıcı nozulundan damlacıkları çıkarmak için kullanılır
LAS X yazılımı Sürüm 3.5.7.23225Leica3D rekonstrüksiyonlar için kullanılan yazılımlar
Leica TCS SP8 Konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaTCS SP8Canlı görüntüleme için konfokal mikroskop
Mason Jar Regular Pint 16 ozTop ŞirketiG001 SerisiJelatin bulamacının hazırlandığı kavanoz
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran MatrisiCorning A.Ş.356231Biyomürekkep bileşeni
Millicell hücre kültürü ekleme, 0.4 µ m gözenek boyutuMerck KGaAPICMORG 50Hidrojel dilimleri için filtre desteği
NucView 405 Kaspaz-3 Substrat, 1x PBS'de 1 mMBiyotyum10405Hidrojel dilimlerinin canlı görüntülenmesi için leke
Oster Profesyonel Serisi BlenderOsterBPST02-B00Jelatin bulamacı oluşturmak için blender
Penisilin/StreptamisinGibco15140163MCL hücre kültürü ortamı için ek
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienDavetliP7589 (İngilizce)Hidrojel dilimlerinin canlı görüntülenmesi için leke
Rotina 35 RHettich24573Hücrelerin santrifüjlenmesi
ROTINA 38/38R santrifüjHettichZ720109Jelatin bulamacının santrifüjlenmesi
RPMI-1640+GlutaMAXGibco61870036MCL hücreleri için kültür ortamının temeli
Sodyum aljinatFMC İşbirliğiGQ9109901Biyomürekkep bileşeni
Sodyum klorürMerck KGaA1.06404Aljinat çözme tamponunun bileşeni
Sodyum sitratCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Aljinat çözme tamponunun bileşeni
Sterican künt uygulama kanülleri 21G 0.8x22 mmB. Braun91801093D baskı için nozul
Tetrametilrodamin-metilester-perklorat (TMRM)Sigma-AldrichT5428 SerisiHidrojel dilimlerinin canlı görüntülenmesi için leke
Tripan mavisi, %0,4Sigma-AldrichT8154 SerisiCanlılık analizi için leke
Su geçirmez termometreVWR620-2099Jelatin bulamacının sıcaklığını izlemek için termometre

Kaynaklar

  1. Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
  2. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  3. Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
  4. Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
  5. Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
  6. Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
  7. Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  11. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  12. Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
  13. Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
  14. Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
  15. Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
  16. Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
  17. Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
  18. Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
  19. Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
  22. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
  23. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
  24. Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
  25. Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
  26. Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
  27. Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
  28. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
  29. Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
  30. Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
  31. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
  32. Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
  33. German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
  34. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  35. Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
  36. Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  37. Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
  38. Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Biyobas mT m r Mikro evresiPrimer MCL H creleriKollajen Biyo m rekkepJelatin Destek Banyosula Yan t AnaliziCanl Floresan G r nt lemeHava S v Aray z K lt r
Manto Hücreli Lenfoma için 3D Model Olarak Hidrojel Tümör Dilimlerinin Biyobaskısı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.