Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensör Tasarım Alanının Verimli Örneklenmesi, Deney Tasarımı ve Otomasyon İş Akışı ile Etkinleştirildi

Summary

Bu protokol, otomasyon destekli genetik kütüphane oluşturma ve değerlendirme yoluyla genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin sistematik küresel optimizasyonu için bir yöntem sağlar. Bu, deneyleri kolaylaştırmak ve biyosensörleri belirli tasarım sonuçlarına göre ayarlamak için genetik bileşenlerin seçimini sağlamak için deney tasarımı metodolojileriyle birleştirilir.

Abstract

Genetik olarak kodlanmış biyosensörler, çevresel veya kimyasal girdi sinyallerinin çeşitli çıktılara iletilmesini sağlayan, yüksek verimli bilgi işleme için güçlü araçlardır. Bu, enzim optimizasyonu, suş geliştirme ve mikrobiyal süreç kontrolü de dahil olmak üzere çok çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda gen ekspresyonunun dinamik algılanmasına, doğrudan kontrolüne ve ince ayarlı düzenlenmesine olanak tanır. Bunları amaca uygun hale getirmek için, biyosensör performansı, biyosensör devre bileşenlerinin (örneğin, taşıyıcılar, giriş ve çıkış modülleri) stokiyometrisini değiştirerek ve/veya ilişkili konakçı-biyosensör moleküller arası etkileşimleri (örneğin, DNA-protein, protein-protein) ayarlayarak iyileştirilebilir. Bununla birlikte, burada, çok sayıda olası biyosensör permütasyonu, istenen fenotipik performansı sağlayan konfigürasyonları belirlemek için tarama stratejilerinin dikkatli bir şekilde optimize edilmesini gerektiren karmaşık bir kombinatoryal tasarım alanı yaratır. Bu karmaşıklık, monoklonal tarama koşulları altında efektör titrasyon analizi gerektiren ayarlanabilirlik gibi biyosensör performans özellikleriyle daha da artmaktadır. Sonuç olarak, çeşitli dizileri ve deneysel alanı keşfetme ihtiyacı, kesirli örnekleme yöntemlerini bu amaç için özellikle uygun hale getirmektedir. Bu iş akışının temelinde, bu kombinatoryal deneysel tasarım alanının verimli istatistiksel tabanlı yapılandırılmış haritalamasına ve kesirli örneklemesine izin vermek için iyi konumlandırılmış Deney Tasarımı (DoE) algoritmaları vardır.

İçinde rapor edilen, hem dijital hem de analog doz-yanıt eğrileri ile farklı konfigürasyonlar sağlamak için allosterik transkripsiyon faktörü tabanlı biyosensörlerin tasarım alanını verimli bir şekilde örneklemek için birleşik bir yüksek verimli otomasyon ve hesaplama yaklaşımıdır. Protokol, promotör ve ribozom bağlama bölgesi kitaplıklarının oluşturulması ve otomatik olarak seçilmesiyle başlar. Bu kitaplıklar ve bunlara karşılık gelen ifade verileri, yapılandırılmış boyutsuz girdilere dönüştürülerek tüm deneysel tasarım alanının hesaplamalı haritalanmasına olanak tanır. Fraksiyonel numune alma daha sonra bir DoE algoritması kullanılarak gerçekleştirilir ve yüksek verimli bir otomasyon platformu kullanılarak efektör titrasyon analizi ile birleştirilir. Bu iş akışı, gelecekteki biyosensör sistemlerinin ve genetik devrelerin geliştirilmesi ve optimizasyonu için agnostik bir çerçeve sağlayarak sentetik biyoloji topluluğu için düzenleyici bir araç seti sağlar.

Introduction

Genlerin ekspresyonunu düzenleme yeteneği, kimyasal efektörlerden biyofiziksel uyaranlara kadar hem iç hem de dış etkilere dinamik, gerçek zamanlı tepkileri kolaylaştıran, tüm yaşam formlarında temel bir işlevdir¹. Doğada bulunan sayısız transkripsiyonel düzenleyici sistem, sentetik biyolojinin mümkün kıldığı metabolik mühendislik ve biyoteknolojik araştırmaların artırılması ve hızlandırılmasında muazzam bir potansiyele sahiptir. Prokaryotlarda, hücrede meydana gelen düzenlemenin çoğu, allosterik transkripsiyon faktörlerinin (aTF'ler) bir dizi küçük moleküllü efektör² ile etkileşimleri tarafından yönlendirilen tek bileşenli düzenleyici mekanizmalar aracılığıyla kontrol edilir. Tipik olarak bir efektör bağlanma alanı (EBD) ve DNA bağlanma alanından (DBD) oluşan aTF'ler, spesifik küçük molekül efektörlerine bağlandıktan sonra moleküler anahtarlar olarak işlev görür ve genomun promotör bölgelerinde bulunan spesifik DNA operatör dizileri için DBD'lerinin afinitesini modüle ederek transkripsiyonun aktivasyonu veya baskılanması ile sonuçlanır³. Bu aldatıcı derecede basit mekanizma, baskılama/baskıdan arındırma sistemlerinden, şaşırtıcı sayıda küçük moleküllü efektörü veya çevresel uyaranı tespit edebilen ve bunlara yanıt verebilen aktivatörlere kadar bir dizi farklı düzenleme stratejisine yol açmıştır⁴. Sonuç olarak, sentetik biyoloji, çok sayıda girdi sinyalini ısmarlama çıktılara, yani floresan raportör protein üretimine ve sentetik yolların düzenlenmesine bağlayabilen genetik olarak kodlanmış biyosensörler oluşturmak için bu çeşitlilikten yararlanmıştır. Biyoteknolojik iş akışlarında uygulandığında, bu tür sistemler hücre içi metabolit konsantrasyonlarının gerçek zamanlı izlenmesini, yolların dinamik düzenlenmesini ve daha verimli yolların, suşların ve biyoproseslerin geliştirilmesine yardımcı olan kolay okumaları sağlar 5,6,7,8.

Temel olarak, biyosensörler, özgüllük, çalışma aralığı, dinamik aralık, duyarlılık ve eğim dahil olmak üzere bir dizi parametreye göre karakterize edilir ve bir biyosensörün doz yanıt eğrisi, bu parametreleri ligand konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çıkış sinyali aracılığıyla tanımlar (Şekil 1)^9,10,11,12. Hill denklemi, bir biyosensörün performans özelliklerine uyacak şekilde kullanılabilir, yukarıda açıklanan parametrelerin her biri için yarı ampirik kanıt sağlar, böylece biyosensör sistemini karakterize etmek için bir araç sağlarken aynı zamanda sistemi uygulamaya dayalı sonuçlara göre ayarlamak için gereken çabaların değerlendirilmesini sağlar. Özgüllük, bir dizi diğer potansiyel efektör moleküle kıyasla bir efektör tarafından indüklenen sinyal çıkışındaki nispi farklılıklar olarak tanımlanabilir ve tipik olarak aTF'nin EBD seviyesinde modüle edilir. Operasyonel aralık, biyosensörün algılayabildiği ligand konsantrasyonları aralığı olarak tanımlanır ve biyosensörün yanıt verebileceği konsantrasyon aralığını belirler. Dinamik aralık, aksine, ölçülebilir en yüksek aktivasyon (AÇIK) durumunun inaktive edilmiş (KAPALI) duruma oranını tanımlar ve biyosensörün arka plan oto-floresan^10'un üzerindeki efektör konsantrasyonlarını güvenilir bir şekilde raporlamasını sağlamak için önemli bir parametredir. Efektör molekül için hassasiyet, efektör^13'ün yarı maksimum konsantrasyonu (EC₅₀) ile ölçülen belirli bir çıkış sinyalini ortaya çıkarmak için gereken konsantrasyon olarak tanımlanır. Son olarak, eğrinin eğimi, promotördeki operatör bölgesi için aTF'nin işbirliği (n_H) ile gösterilir ve daha dijital veya analog bir yanıt çıkış profili ile sonuçlanır. İşbirliği, operatör bölgesi için afiniteyi güçlendiren multimerik kompleksler oluşturan liganda bağlı aTF'ler arasındaki protein-protein etkileşimlerinden kaynaklanır, bu da doygun ligand konsantrasyonları ve daha dijital bir yanıt profili¹⁴ ile devrenin yanıtında keskin artışlara neden olur.

Bir biyosensörün doz yanıt özellikleri, uygulamalarının uygunluğunu önemli ölçüde etkileyebilir ve genellikle herhangi bir kavramsal uygulama için bir 'yap ya da boz' noktasıdır. Biyosensör performansı, sistemden sisteme büyük ölçüde değişebilir, çalışma aralığı tipik olarak 0.1nM-10mM¹³ arasında değişirken, dinamik aralıklar 1.4-2000 kat¹⁵ arasında olabilir. Ayrıca, aTF'ler için bildirilen efektör bileşiklerin sayısı geniş olsa da (metabolik ürünler, amino asitler, metaller, antibiyotikler, çekirdek algılama, vb.)¹¹, her şeyi kapsamamaktadır ve efektörleri için uygun bir biyosensör literatürde mevcut olmadığında araştırmacılara zorluklar sunmaktadır. Sentetik biyoloji, bu tür zorlukları ele alan, efektör kapsamının ve doz-yanıt özelliklerinin uygulamanın araştırma sonuçlarıyla daha yakından uyumlu olacak şekilde ayarlanmasına izin veren biyosensörlerin mühendisliğini mümkün kıldı ve sırasıyla yukarıda belirtilen her iki sorunu da ele almak için kullanıldı ^16,17. Mühendislik için iki kilit alan, sentetik biyoloji, biyosensörün promotör bölgesi ve aTF'nin kendisi aracılığıyla hedeflenebilir ve bunların transkripsiyonel ve protein düzeyindeki etkilerine aracılık eder. Promotör düzeyinde performansı modüle etmek için biyosensörün genetik elemanlarına odaklanan yaklaşımlar, hassasiyeti, operasyonel ve dinamik aralıkları ayarlamak için RBS, operatör siteleri ve -35, -10 (altıgen kutular) mühendisliğini içerir ve bu makalede özetlenen metodolojinin odak noktasıdır (Şekil 1). Alternatif olarak, efektör bağlanma alanının analizi ve efektör koordinasyonunda yer alan kalıntıların mutasyonu (dizi homolojisi ve/veya yapısal biyoloji kullanılarak) yoluyla biyosensörün seçiciliğini ve duyarlılığını değiştirmek, aynı kökenli bir efektöre 18,19,20 tepkisini modüle edebilir veya tamamen aynı kökenli olmayan bir efektöre doğru değiştirebilir 16,17,21. Bu tür ayarlama çabaları daha sonra biyosensörleri, bunlar genellikle metabolik kontrolörler (geri besleme döngüleri, kontrol devreleri), birincil tarama araçları (Enzim veya suş keşfi), ikincil tarama araçları (enzim varyant taraması, metabolik mühendislik) ve taşıyıcı biyolojik araştırma 22,23,24 olmak üzere belirli uygulamalara yönlendirebilir. Böyle bir örnek, dinamik ve operasyonel aralığı iyileştirmek için tasarlanmış bir promotör dizisi ile birlikte mukonik aside duyarlı bir aTF olan CatM'nin kullanımını içerir. Bu sistem, adaptif laboratuvar evrimini^{takiben GFP} floresansına dayalı en etkili mukonik asit üretim suşlarını izole etmek için floresanla aktive olan hücre sınıflandırması ile entegre edildi 25.

Yukarıda özetlenen mühendislik stratejilerinin başarısı apaçık olsa da, sentetik bir biyoloğun biyosensörleri ayarlamak için kullanabileceği kaldıraçların karşılıklı bağımlılıkları, tasarım sürecini karmaşıklaştırabilir ve biyosensör geliştirmede harcanan süreyi uzatabilir, bu da bazı araştırmacıları biyosensörleri kendi iş akışlarına uygulamaktan caydırabilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, altıgen kutuları değiştirerek bir biyosensörü belirli bir sonuca göre ayarlama girişimleri, istemeden diğer parametreleri zayıflatabilir, bu karşılıklı bağımlılık, biyosensör mühendisliğinde¹² bilinen bir zorluktur. Biyosensör ayarlamanın yaygın yaklaşımları, rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş evrim mühendisliğinden oluşur ve ilki, deneyleri yüksek başarı olasılığı olan bileşenlere odaklamak için sistemin yapısal ve mekanik özelliklerinin önsel olarak anlaşılmasına dayanır; ikincisi ise optimize edilmiş özellikler sergileyen varyantları seçmek için yüksek verimli bir ekrana birleştirilmiş randomize mutajenez ve doğal evrime dayanır 26,27,28,29,30. Etkili olmakla birlikte, her iki teknik de bazı dezavantajlardan muzdariptir: örneğin, belirli yapısal veya işlevsel unsurlara odaklanması yoluyla, hedeflenen mühendislik, tüm deneysel alanın sınırlı keşfine eğilimlidir ve allosterik veya ikincil etkileri göz ardı edebilir³⁰. Hedeflenmemiş kitaplık oluşturma ve tarama, tasarımları kılavuzsuz bir şekilde optimize etmek için ideal olsa da, ön tasarım çalışması (yani, kitaplık tasarımı ve oluşturma) açısından çok az şey gerektirir, yararlı mutasyona yönelik bir önyargı gerektirir. Böyle bir önyargı olmadan, mutasyonların çok daha büyük bir yüzdesinin zararlı olabileceği ve daha fazla tarama gerektirebileceği beklenir³¹. Bu nedenle, yalnızca biyosensörü oluşturan parçaların (aTF, RBS, operatör bölgeleri ve altıgen kutular) birincil etkisini değil, aynı zamanda bu bileşenlerin biyosensör parametrelerini etkilemek için birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini de dikkate alan bütünsel yaklaşımlar oldukça çekicidir.

Yapılandırılmış çok değişkenli deney ve istatistiksel modelleme metodolojileri, mümkün olan en az sayıda deney kullanarak çok boyutlu deney alanını sorgulamak için proses mühendisliği iş akışlarında yaygın olarak benimsenmiştir. Deney tasarımı (DoE) olarak adlandırılan deney ve modellemeyi birleştiren bu yaklaşım, araştırmacıların kapsamlı a priori bilgi gerektirmeden karmaşık çok değişkenli süreçleri tanımlanmış sonuçlara göre optimize etmelerine önemli ölçüde olanak tanır^23,30. Tipik olarak, yapılandırılmış deneysel araştırmanın daha kolay olduğu sürekli değişkenlerin optimizasyonuna uygulanırken, DoE, genetik düzeyde metabolik yolların optimizasyonunda da kullanılmıştır 31,32,33. Bu, istenen sonuç için en önemli olduğu düşünülen faktörlerin seçildiği bir ilk tarama adımını, ardından seçilen faktörlerin istenen çıktıyı elde etmek için ayarlandığı bir optimizasyon adımını içerir, bu durumda uygulama kapsamlarını artırmak için belirli biyosensör parametrelerini optimize etmek için. Kritik olarak, bu teknik, biyosensör performansını veriye dayalı bir temelde küresel olarak optimize etmek için 10³ - 10^4'lük orta ölçekli kitaplıklara kadar tarama verimini artırmak için otomatik sıvı işleme platformlarıyla birleştirilebilir²³. Aşağıda, biyosensör duyarlılığının küresel optimizasyonu için kütüphane oluşturmayı, taramayı ve veri toplamayı kolaylaştırmak için sıvı işleme robotları ile desteklenen, biyosensör optimizasyonuna yönelik DoE odaklı bir yaklaşımın uygulanmasına yönelik bir protokolü açıklıyoruz.

Protocol

1. RBS/promotör parça tasarımı

1. DoE sürecinde sürekli değişkenler olarak sistematik olarak ayarlanabilen biyosensöre özgü düzenleyici unsurları tanımlayın. Bu düzenleyici öğeleri farklı modüller halinde gruplandırın. Bu, efektör taşınmasını, transkripsiyon faktörü ekspresyonunu ve/veya çıktı gen ekspresyonunu düzenleyen modülleri içerebilir. Her modülün bir promotör veya RBS (örneğin, sırasıyla RBS_trans, P_reg, RBS_out ve P_out) tarafından transkripsiyonel ve/veya translasyonel düzeyde ayarlanabildiğinden emin olun.
2. Onaltılık kutular, operatör siteleri ve RBS dizileri gibi seçilen promotör ve RBS bölgelerindeki önemli işlevsel siteleri belirleyin.
   NOT:^Literatürde 34,35,36'dan kütüphaneler oluşturmak için birçok karakterize edici destekleyici ve RBS mevcuttur. Bununla birlikte, karakterize edilmemiş promotör dizileri için (tipik olarak P_reg promotörü), literatürde mevcut değilse, ayarlanabilir genetik dizi elemanlarını bulmak için daha fazla adım için aşağıya bakın.
   1. İstenen algılama girdisi ile aTF'nin BlastP aramaları yoluyla ilgilenilen biyosensör dizilerini içeren diğer operonları bulun. Promotör dizileri elde etmek için aTF'nin intergenik bölgesini ve düzenlenmiş genlerini çıkarın.
      NOT: Promotör dizilerinin yeri ve sayısı, kullanılan aTF sınıfına bağlı olarak değişecektir.
3. Altıgen kutular ve operatör siteleri gibi korunmuş motifler için varsayılan promotörleri aramak için çoklu dizi hizalama araçlarını ve diğer motif yazılımlarını kullanın. Promotör dizi analizine dayanarak, dejenere bazlarla randomizasyon için nükleotid dizilerini seçin, örneğin, N = herhangi bir şey, R = herhangi bir pürin, Y = herhangi bir pirimidin, vb.
   NOT: Okuyucular, promotör analizi ve temel randomizasyon²³ hakkında daha fazla ayrıntı için kaynak yayına yönlendirilir.

2. Parça kitaplığı montajı ve doğrulaması

1. Bir floresan işaretleyicinin (örneğin, GFP) yukarı akışında promotör/RBS dizi varyantlarının eklenmesine izin vermek için istenen ekspresyon vektörünü spesifik olarak yükseltecek primerleri tasarlayın ve sipariş edin. Liyofilize primerleri varışta steril deiyonize H₂O içinde 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   1. PCR reaksiyon karışımını, spesifik polimerazın parametrelerine göre PCR tüplerinde buz üzerinde birleştirin. Mutasyonların ekspresyon vektörünün omurgasına taşınmasını önlemek için yüksek kaliteli bir polimeraz kullanıldığından emin olun. Tavlama sıcaklığını ve uzatma süresini primerlerin ihtiyaçlarına ve istenen PCR ürününün uzunluğuna göre ayarlayın.
   2. PCR ürününü jel elektroforezi yoluyla analiz edin ve PCR saflaştırması veya bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak doğrusallaştırılmış vektörü saflaştırın. Doğrusallaştırılmış vektör DNA'sının konsantrasyonunu ölçün ve -20 °C'de saklayın.
2. Ekspresyon vektörüne hedeflenen homolog rekombinasyon için hem 5' hem de 3' uçlarında 30 bp plazmit homoloji kolları ile tek sarmallı dejenere oligonükleotitler olarak doğrusallaştırılmış vektöre eklemek için tasarlanmış varyant kitaplıklarını (RBS veya promotörler) sipariş edin.
   1. Varışta, liyofilize oligonükleotitleri steril deiyonize H₂O içinde 100 ng / μl'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin.
3. Çevrimiçi hesap makinelerini kullanarak doğrusallaştırılmış vektör ve varyant kitaplığının eşmolar miktarları için hacimleri belirleyin. Reaksiyonun son hacminin 20 μL olacağından ve 2:1 molar ek/vektör oranının kullanıldığından emin olun.
   1. Ticari Gibson montaj ana karışımının (X2) bir kısmını buz üzerinde çözün ve reaksiyonu seçilen hesap makinesi tarafından sağlanan hacimlere göre bir PCR tüpünde birleştirin.
      NOT: Gibson ana karışımı laboratuvarda^{da yapılabilir 37,38}.
   2. DNA fragmanlarına 10 μL 2x Gibson ana karışımı ekleyin ve bir termocycler veya benzeri bir yerde 50 °C'de 1 saat inkübe edin.
   3. 20 μL'lik ligasyon ürününün tamamını bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL yetkin E. coli'ye uygulayın. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ardından 42 °C'de 45 saniye ısı şoku uygulayın.
   4. Hücreleri 2 dakika buza geri koyun, tüpe katabolit bastırma (SOC) ortamı içeren 800 μL süper optimal et suyu ekleyin ve hücrelerin çalkalanan bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat iyileşmesine izin verin.
   5. 50 μL dönüştürülmüş hücreyi, ilgili antibiyotik seçimi ile birden fazla 60 mm Luria-Bertani (LB) agar petri plakasına yayın. Plakaları 37 °C'de 18 saat inkübe edin.
4. Dönüştürücüler için plakaları kontrol edin, her bir varyantın yeterli temsilini yakalamak için teorik kitaplık çeşitliliğinin 3 katını temsil eden koloni sayısını hesaplayın. Koloni sayısı düşük/sıfır ise izotermal düzeneği optimize edin.
   NOT: Yüksek kaliteli reaktiflerden veya sentezden oluşturulan ideal bir kitaplık düşünüldüğünde aşırı örnekleme gereklidir. Bu genellikle kitaplığın toplam boyutundan 3 kat daha büyüktür. Örneğin, 4 dejenerasyon pozisyonu (NNNN) = 4⁴ = 256 benzersiz dizi. Bu nedenle, ~768 koloniyi kazıyın.
   1. Gerekli sayıda koloniyi, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 25 mL LB ortamı içeren tek bir steril 125 mL'lik şişeye kazıyın. Şişeyi 37 °C'de 18 saat boyunca çalkalayan bir inkübatörde (180 rpm) inkübe edin ve bu süre geçtikten sonra kültürün gözle görülür şekilde yoğun olmasını sağlayın.
   2. Varyant kitaplığını hazırlanan transformant kültürden saflaştırmak için bir plazmit midi-prep saflaştırma kiti kullanın. Plazmit kütüphanesi DNA'sının konsantrasyonunu belirleyin; Aşağı akış adımları için 1-10 μg gereklidir. Kütüphane DNA'sının steril deiyonize H₂O kullanılarak ayrıştırıldığından emin olun.
      NOT: Bu noktanın ötesindeki adımlar, Pseudomonas putida (P. putida) ifade konağındaki varyant kitaplıklarının klonlanmasına ve doğrulanmasına odaklanacaktır; Protokolün diğer konakçılara uyarlanması, inkübasyon sürelerinin, inkübasyon sıcaklıklarının ve dönüşüm yöntemlerinin değiştirilmesini gerektirebilir.
5. Bir gliserol stoğundan çizerek ve plakayı 30 °C'de 18 saat inkübe ederek istenen ekspresyon konakçısı P. putida'nın bir LB agar plakasını hazırlayın.
   1. LB agar plakasından tek bir P. putida kolonisi seçin, 10 mL LB ortamını aşılayın ve 180 rpm çalkalamada 18 saat boyunca 30 °C'de büyütün.
   2. Yetiştirilen kültürü 4000 x g'da 18 °C'de 2 dakika santrifüjleyerek hücreleri elektro-yeterlilik için hazırlayın. Süpernatanı dökün, 1 mL steril deiyonize H₂O içinde yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: P. putida hücreleri peletlendiğinde pembemsi görünmelidir.
   3. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 4 x g'da 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dökün ve 1 mL steril deiyonize H₂O içinde yeniden süspanse edin. Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımlarını 4 kez daha tekrarlayın.
      NOT: Yıkama sırasında süpernatan dökülürken hücre kaybı meydana gelebilir; Bu normaldir ve verimi etkilememelidir.
   4. 100 μL yıkanmış hücreyi 0,2 cm'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın, küvete 1-10 μg plazmit kütüphanesi DNA'sı ekleyin ve karıştırın.
   5. Elektroporatörü açın, voltajın 2.5 cm küvet için 0.2 kV'a ayarlandığından emin olun, küveti elektroporasyon odasına yerleştirin ve nabız atın.
   6. Küvete 900 μL SOC ortamı ekleyin, karıştırın ve hücreleri steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücrelerin çalkalanan bir inkübatörde 30 °C'de 2 saat iyileşmesine izin verin.
6. 50 μL dönüştürülmüş hücreyi, ilgili antibiyotikle desteklenmiş büyük kare petri plakalarına (230 mm) LB agar yayın ve 30 °C'de 18 saat inkübe edin.
   NOT: Kütüphane plakalarında orta derecede koloni yoğunluğu sağlayın (2-3 CFU/^cm2). Bu, bakteri yeterliliğine ve kaplama hacmine bağlı olacaktır. Çok düşükse, koloni sayılarını artırmak için dönüşümün optimizasyonu veya ardışık dönüşüm turları kullanılabilir.
7. Dizi doğrulaması için tüm transformant plakalardan 25-50 koloni arasından seçim yapın. Dejenere dizi boyunca amplifiye eden primerler kullanın, bölgeyi PCR ile amplifiye edin ve dizi çeşitliliğini ve poliklonaliteyi değerlendirmek için Sanger dizilimine gönderin.
   NOT: Poliklonalite sorunlu hale gelirse, dönüşümleri 1 μg DNA ile birden fazla küvet grubuna yaymak bu etkiyi azaltmaya yardımcı olabilir.

3. Parça kitaplığı klonal tarama - otomasyon

1. Sıvı işleyici kurulumu
   1. Pipetleme açısından yoğun adımların önemsizleştirilmesini sağlamak için bir sıvı işleyici platformunda 7 program oluşturun.
   2. Bir "MTP Sıvı Transferi" programı oluşturun, sıvı işleyicinin hazırlanmış bir rezervuardan düzenindeki boş mikrotitre plakalarına (MTP) ayarlanabilir bir hacmi pipetleyecek şekilde ayarlandığından emin olun.
   3. Bir "MTP'ye gliserol ekle" programı oluşturun, sıvı işleyicinin 100 μL hacimde P gliserolü plakalara pipetleyecek şekilde programlandığından emin olun, dağıtım ve aspirasyon hızının 5-20 μL/s olduğundan emin olun.
      NOT: Kontrol edilmezse kabarcık oluşumuna, eksik aspirasyona veya sıçrama nedeniyle komşu kuyuların çapraz kontaminasyonuna yol açabilecek P gliserolün daha yüksek viskozitesini hesaba katmak için ayrı bir program oluşturulmuştur.
   4. Bir "DWB Sıvı Transferi" programı oluşturun, sıvı işleyiciyi ayarlanabilir hacim ayarıyla derin kuyulu bloklara (DWB) pipetleyecek şekilde ayarlayın ve sıvı işleyici pipetlerinin önceden doldurulmuş bir rezervuardan geldiğinden emin olun.
   5. Bir "Çözülmüş MTP'den Aşılama" programı oluşturun, sıvı işleyicinin seçilen kolonileri içeren çözülmüş MTP'den 5 μL aspire edecek şekilde programlandığından emin olun ve bunu düzendeki ilgili DWB plakalarına aktarın.
      NOT: Yanlışlıkla çift aşılamayı veya plakaların kaçırılmasını önlemek için olayların mantıksal bir sırasını sağlayarak düzendeki MTP ve DWB düzenlemesine çok dikkat edin.
   6. Bir "Test DWB'ye Transfer" programı oluşturun, sıvı işleyicinin 5 μL hücreyi bir DWB plaka konumundan başka bir DWB plaka konumuna aktaracak şekilde ayarlandığından emin olun. Program daha sonra bu eylemi, her transfer farklı bir plaka pozisyonunu, yani P1 -> P2, P1 -> P3, vb. aşılayarak 4 kez tekrarlamalıdır.
      NOT: Bu program, 96 varyantın farklı tahlil konsantrasyonlarına sorunsuz bir şekilde alt kültürlenmesini sağlar.
   7. Bir "Test Kurulumu - PBS Yeniden Süspansiyon (DWB)" programı oluşturun, sıvı işleyicinin düzendeki her DWB'yi 500 μL PBS ile pipetlediğinden emin olun, program ayrıca hücre peletlerinin uygun şekilde yeniden süspanse edilmesini sağlamak için bir karıştırma adımı içermelidir.
   8. Bir "Test Kurulumu - Hücreler ve PBS Ekleme (MTP)" programı oluşturun, bu programın 200 μL'lik yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir DWB plaka konumundan boş bir MTP konumuna aktarmak için bir adım içerdiğinden emin olun.
      NOT: 3.1'in tüm adımları için programlama ve sıvı işleyici düzenleri farklılık gösterecektir; Araştırmacılar, yukarıdaki programları deneyin kapasitesine ve ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirmek için belirli ticari sıvı işleyicilerin kılavuzlarına başvurmalıdır.
2. Varyant kitaplığı kültürü ve barkodlama
   3. 
      
   5. 
      
   6. 
      
   9. 
      
3. 4. 
      
   7. 
      
   8. 
      
   13. 
       
   16. 
       
   18. 
       
   21. 
       

1. 
   
2. 
   
3. 
   
5. 
   
   
   
   
   
   

4. 
   
5. 
   

Results

Başlangıçta, biyosensör işlevini etkilediği düşünülen modüller varyasyon için seçilmelidir; bu, ligandların hücre içi konsantrasyonunu ve dolayısıyla biyosensör çıktısını etkileyebilen taşıma proteinlerinin düzenlenmesini içerebilir, ancak aynı zamanda aTF'nin kendisinin nispi transkripsiyon ve translasyon seviyelerinin yanı sıra floresan raportör veya çıkış genini de içerir (Şekil 1). Şekil 2 , biyosensör optimizasyonu için DoE tabanlı bir deneyin geliştirilmesinde kullanılan tipik bir iş akışını göstermektedir; düzenleyici elemanların, özellikle operatör sitelerinde, altıgen kutularda veya RBS'de dizi düzeyindeki değişiklikler yoluyla sentetik biyoloji yoluyla manipülasyona uygun farklı modüller halinde düzenlenmesinden başlayarak (Şekil 2A). Bu nedenle, DoE iş akışındaki bir sonraki adım, varyant kitaplıkları oluşturmak için dizi sitelerinin rastgele hale getirilmesidir (Şekil 2B). Taranan kolonilerin sayısı, N'nin rastgele temel konumların sayısına eşit olduğu 4^N rastgeleleştirme derecesi ile ölçeklendirilmesi gerektiğinden, rastgeleleştirme derecesi dikkatlice düşünülmelidir. Her bir benzersiz promotörü veya RBS dizisini DoE'de benzersiz bir kategorik değişken olarak ele almak, gerekli yapıların sayısını deneysel olarak mümkün olmayan seviyelere çıkaracaktır, çünkü kitaplıkların karakterizasyonu yoluyla sürekli değişkenlere bu tür bir dönüşüm, rastgeleleştirme yoluyla elde edilen fonksiyon aralığını ölçmek ve üst, orta, ve işlevselliğin alt sınırları. Bu, ilk olarak, bir raportör gen aracılığıyla RBS veya promotör varyantının gücünün bir ölçüsü olarak kütüphanelerin çıktısının analizi yoluyla elde edilir (Şekil 2C). Sürekli değişkenleri, farklı kombinasyonları keşfetmek ve bu değişkenlerin etkilerini açıklayan bir model geliştirmek için DoE tarafından kullanılabilecek seviyelere ayrıklaştırmak için gösterildiği gibi bir lin-log dönüşümü gerçekleştirilir. Daha sonra, her bir faktör için aktivite aralığını kombinatoryal bir şekilde tanımlayan 3 seviye kullanılarak bir tarama tasarımı uygulanır (Şekil 2D). Önerilen tasarımların montajı ve test edilmesi yoluyla deneysel alan verimli bir şekilde araştırılır ve faktörler arasındaki etkileşimler ortaya çıkarılır. Elde edilen verilerin istatistiksel analizi, hangi faktör kombinasyonunun biyosensör çıktısı üzerinde en önemli etkiye sahip olduğunu belirlemek için kullanılır ve SLSR, sistemin davranışını farklı kriterler altında tahmin etmek için kullanılır ve biyosensörün artan dinamik aralık veya hassasiyet gibi belirli sonuçlara göre optimizasyonunu kolaylaştırır (Şekil 2D).

Şekil 3 aTF tarafından düzenlenen bir promotör kitaplığının montajını ve taranmasını gösterir. Dejenere bir oligonükleotit kullanılarak izotermal montaj, plazmit kodlu bir kitaplık oluşturmak için gerçekleştirildi, bu sayede her plazmit belirli pozisyonlarda benzersiz bir şekilde randomize edildi. Kütüphane çeşitliliğinin derecesi, nihayetinde taranacak koloni sayısını belirleyecek ve daha büyük teorik kütüphane boyutları otomasyondan büyük ölçüde yararlanacaktır. Homolog operonların TphR'ye promotör dizi analizi, rastgeleleştirme konumlarını, özellikle bir dereceye kadar varyasyon gösteren ve bu nedenle kesinlikle gerekli olmadan aktiviteyi modüle edebilen bazları bilgilendirmek için kullanılan bir baz koruma haritası sağladı²³. -35 ve -10 altıgen kutuların her birindeki üç baz, operatör sahasındaki altı baza ek olarak tam rastgeleleştirme için hedeflendi (Şekil 3A), ~500.000'lik teorik bir promotör kitaplığı ile sonuçlanır. Plazmit kütüphanesi daha sonra konakçı suşu dönüştürmek için kullanıldı. Bu aşamada, aşağıda gösterilen yaygın sorun giderme yaklaşımlarıyla yeterli kitaplık kapsamı elde etmek için iyi bir dönüşüm verimliliği çok önemlidir. Şekil 3B. DNA konsantrasyonlarının, dönüşüm yönteminin ve klonlama tasarımının optimizasyonu, dönüştürücü verimlerini önemli ölçüde artırabilir. Şekil 3C Tipik bir iş akışı gösterir Transformantlar elde edildikten sonra, herhangi bir karakterizasyon çalışması başlamadan önce benzersiz varyantlara karşılık gelen bireysel kolonilerin ilk olarak ortamda büyütülmesi gerekir. Teorik kütüphane boyutunu kapsamak için, çok sayıda varyantın seçilmesi ve plakalara dizilmesi gerekecektir. Sıvı işleyiciler ve koloni toplayıcılar gibi otomatik sistemlerden yararlanmak, bu emek yoğun adımı önemsizleştirebilir. 1. adım Şekil 3C büyüme ortamının, sıvı işleme yuvasına manuel olarak yüklenen MTP'lere aktarılmasını ve ardından bir koloni toplayıcı tarafından otomatik aşılamayı gösterir. Plakaların kapatılması ve çevrimdışı inkübatörlere aktarılması gibi bazı aşamalar manueldir ancak istenirse otomatikleştirilebilir. Kültürlerin büyümesini takiben, sıvı işleyiciler, gösterildiği gibi, gliserol ilavesi yoluyla kriyo-stoklar oluşturmak için de kullanılabilir. Şekil 3C. Bu aşamada, plakaların barkodlanması, seçilen her varyantın belirli bir plakaya ve kuyu konumuna bağlanmasını sağlayacak ve daha sonraki aşağı akış karakterizasyonu için kolay referanslama sağlayacaktır. Otomatik yaklaşımların en büyük avantajlarından biri, emeğin azaltılmasının yanı sıra, kütüphane hazırlama aşamasındaki hataların ileriye taşınma olasılığının daha düşük olması nedeniyle insan hatasının azalmasıdır. 2. adım Şekil 3C kütüphane hazırlığının otomatik karakterizasyon aşamasını gösterir. Bu başlar via DWB'lerin sıvı işleme platformu kullanılarak ortamla doldurulması ve ardından barkodlu kriyo stokları kullanılarak aşılama. Bu aşamadaki otomasyon yine pipetleme hatalarının ve işçiliğin en aza indirilmesini sağlar. Plakalar daha sonra kapatılır ve büyüme için manuel olarak çevrimdışı inkübatörlere aktarılır, bu noktada efektör bileşiklerin taze derin kuyulu plakalara dizilenmesi başlatılabilir. Parça kitaplıklarının ilk ekranının amaçları doğrultusunda, basit bir AÇIK/KAPALI ekranı arzu edilebilir, çünkü bu, temel yapıya eşit veya daha kötü aktivite sergileyen işlevsel olmayan varyantları önceden taramak ve gelişmiş aktivite sergileyenler için varyant havuzunu zenginleştirmek için kullanılabilir. Bunun, büyük kütüphane tarama protokollerinde engelleyici hale gelebilecek uçların ve plakaların malzeme maliyetlerini azaltma gibi ek bir faydası vardır. Bununla birlikte, daha karmaşık biyosensör performans ölçümlerinin optimizasyonunun gerekli olduğu durumlarda (örneğin, EC₅₀), ek efektör konsantrasyonları gerekli olacaktır. Kültürlerin büyümesinin ardından, plakalar, test süresince bir kez daha inkübatöre manuel olarak geri gönderilmeden önce efektör bileşikler içeren plakaları aşılamaya başlayan sıvı işleme platformuna geri döndürülür. Şekil 3D veri toplamadan önceki son otomasyon adımını gösterir. Büyüme ve biyosensör aktivasyonu için geçen sürenin ardından, plakalar çevrimdışı inkübatörden çıkarılır ve sıvı işleme platformuna geri döndürülür. Floresan verilerinin toplanmasına müdahale edebilecek artık büyüme ortamını çıkarmak için santrifüjleme, süpernatantın uzaklaştırılması ve hücrelerin 1x PBS ile yıkanması gerekir. Sıvı işleyicilerin kullanımı, yıkanmış hücrelerin tarama için 96 oyuklu formatlı MTP'lere aktarılması da dahil olmak üzere, plakaların hızlı bir şekilde işlenmesini sağlayan kültürlerin otomatik olarak yeniden süspansiyonu ile bu süreci bir kez daha önemsizleştirebilir. Veri toplama, manuel veya otomatik bir şekilde gerçekleştirilebilir, bazı okuyucular, veri toplama sürecini daha da otomatikleştirmek için sıvı işleyicilerle arayüz oluşturabilen plaka yığınlarına sahiptir. Efektör varlığında biyosensör aktivasyonunun oranı (AÇIK) ile yokluğunda (KAPALI) karşılaştırılarak, biyosensör fonksiyonunu belirlemek için biyosensör aktivasyon derecesi (kat değişimi) kullanılarak 5.000 varyant değerlendirildi; Dağılım grafiğinin kırmızı-pembe gölgeli bölgesi (Şekil 3D). Zenginleştirilmiş varyant havuzunun plaka ve kuyu konumlarına bağlı olarak, biyolojik kopyalar veya farklı efektör konsantrasyonları kullanılarak sağlam karakterizasyon, iş akışının Adım 1'inde oluşturulan orijinal barkodlu kriyo-stok plakalarına geri dönülerek gerçekleştirilebilir.

Şekil 4, duyarlılığı optimize etmek için bir promotör kitaplığı geliştirmeyi amaçlayan ilk kitaplık taramasından önceliklendirilmiş varyantların taranmasını göstermektedir. Önceki iş akışında taranan 5.000 varyanttan elde edilen veriler kullanılarak, ilk AÇIK/KAPALI ekranından ebeveyn dizisinden daha aktif olduğu belirlenen 226 varyanttan oluşan önceliklendirilmiş bir havuz, daha sonra bir DSD'nin tasarlanabileceği seviyeler olarak hareket etmek için duyarlılıklarına göre daha fazla karakterize edildi ve sıralandı. İlk adım olarak kategorik değişkenler, bu durumda P_çıkış üst değişkenleri, geniş bir duyarlılık aralığını kapsayan sürekli değişkenlere dönüştürülmelidir. Hassasiyeti taramak için, çizilen bir Hill fonksiyonundan EC₅₀ verilerini elde etmek için doz yanıt eğrileri gereklidir; bu, kaplama işini önemli ölçüde artırır ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi tahlil kurulumu ve tarama sürecini basitleştirmek için sıvı işleyiciler kullanan otomasyona çok uygundur. Şekil 3C'nin Adım 2'sinde oluşturulan iş akışını takiben, büyüme ortamı ve antibiyotiklerle dolu DWB'leri aşılamak için zenginleştirilmiş varyant havuzuna karşılık gelen plaka barkodları ve kuyu konumları kullanıldı. Deneysel sağlamlığı arttırmak için varyantlar biyolojik üçlü olarak tarandı. Plakaların büyümek için çevrimdışı inkübatöre aktarılmasının ardından, taze DWB'ler, emeği azaltmak için sıvı işleyiciler kullanılarak 0, 1, 25 ve 1000 μM efektör takviyeli büyüme ortamı ile dolduruldu. Test için gereken plaka sayısını azaltmak için, eğrinin alt, orta ve üstünü kapsayan bir konsantrasyon aralığı seçildi ve orta nokta konsantrasyonları, Şekil 4A'da gösterildiği gibi her bir varyantın nispi hassasiyetlerini ortaya çıkardı. Her efektör konsantrasyonunda varyant havuzlarının aşılanmasından ve floresan ve OD₆₀₀ analizinden sonra, EC_50'yi belirlemek için kullanılan doğrusal olmayan regresyon analizi ile doz yanıt eğrileri çizildi. Bu aşamada, kitaplık boyutunu daha da azaltmak için Şekil 4B'de gösterildiği gibi en sağlam 100 varyant öne alınarak, benzersiz bir EC₅₀ değerine sahip her varyantın ham bir kitaplığı oluşturuldu. Bununla birlikte, bu kitaplığın DoE'de kullanılabilmesi için, benzersiz değişkenlerin, içinde yer alan duyarlılık aralığını temsil eden sıralanmış bir kitaplığa dönüştürülmesi gerekir. Bu, her bir varyantın en hassas (-1) ile en az hassas (+1) arasında sıralanması için verileri sıralayan ve yeniden ölçeklendiren verilerin lin-log dönüşümü gerçekleştirilerek ve ayrıca veri kümesinin geometrik ortalamasını temsil eden bir orta nokta değeri (0) tanımlanarak elde edildi Şekil 4C. Ham verilerin dönüşümü, Şekil 4D'de gösterilen mavi grafiği üretti, buradan +1, 0 ve -1'e karşılık gelen ayrık P_çıkış dizileri, P_çıkış faktörü seviyeleri olarak kesin tarama tasarımına alındı.

Şekil 5 DSD üretiminden DoE destekli öğrenmelere dayalı olarak bir biyosensörün modellenmesine ve küresel optimizasyonuna kadar kütüphane oluşturulduktan sonraki tüm iş akışını gösterir. Şekil 5A tipik bir biyosensörün 1 (Taşıma ve Regülatör modülleri) veya 2 (Çıkış modülü) düzenleme düğümü ile 3 modüle bölünmesini içerir. Örneğini takip ederek Şekil 4, RBS veya destekleyici kitaplıkları geliştirilmiş ve her faktörün en büyük varyasyonunu kapsayacak şekilde +1, 0 ve -1 arasında değişen seviyeler seçilecektir. Taranan kitaplıkların boyutu tipik olarak tasarım alanını tam olarak keşfetmek için gereken deney sayısını belirleyecektir, örneğin, her kitaplık 22 boyutunda olsaydı, bu 22'ye eşit olurdu⁴ (234.256) kombinasyon. DoE, yapılandırılmış tarama tasarımları aracılığıyla kombinasyon sayısını azaltarak deneysel iş yükünü basitleştirmeyi amaçlamaktadır. Birçok metodoloji mümkün olsa da, DSD, kafa karıştırıcı ikinci dereceden etkilerden kaçınırken ana faktörlerin ve iki faktörlü etkileşimlerin tanımlanmasına izin verdiği için biyosensör geliştirme için idealdir. Ek olarak, DSD tasarımları 3 seviye kullandığından, eğriliği (doğrusal olmama) tahmin etmek mümkündür. Şekil 5A 4 modülün her birinin farklı seviyelere ayarlandığı tipik bir DSD çıkışını gösterir; her seviye belirli bir promotöre veya RBS varyantına karşılık geldiğinden, DSD'nin önerilen tasarımlarına karşılık gelen genetik yapıları oluşturmak için izotermal düzenek kullanılır. Konakçı suşunu önerilen yapılarla birleştirdikten ve dönüştürdükten sonra, her bir yapının performansına daha fazla güven sağlamak için çok çeşitli efektör konsantrasyonları kullanılarak doz yanıt eğrileri elde edilir Şekil 5B. DSD, yapı sayısını önemli ölçüde azalttığından, bu adım genellikle elle veya tercih edilirse otomatik sıvı işleyiciler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Şekil 5C DSD ekranından önerilen kombinasyonların oluşturulması ve test edilmesinden ve Hill katsayısına dayalı tahmin modellerinin oluşturulmasından sonra elde edilen tahmin profilinin çıktısını sunar (n_H) ve EC₅₀ test edilen her kombinasyonun çıktısı. Deneyin amacı, her iki n_H ve EC₅₀ her iki parametreyi de en üst düzeye çıkarmak için 4 düzenleyici düğümün ifadesinin modülasyonu yoluyla. Her düzenleyici faktör, lin-log dönüştürülmüş promotör ve RBS parça kitaplıklarına (-1 ila +1) karşılık gelen x ekseni boyunca belirtilen ifade derecesi ile kendi sütununda gösterilir. Düğümlerin ifadesini değiştirmenin her iki EC üzerindeki etkisi₅₀ ve n_H alt grafiklerdeki eğrilerle gösterilir. Profil grafikleri, biyosensör optimizasyonunun genellikle sezgisel olmayan doğasını vurgular, bu sayede bir düzenleyici düğümün ayarlanması çıktı parametreleri üzerinde zıt etkilere sahip olabilir. Örneğin, RBS_Trans n ile güçlü bir korelasyonu olmadığı gösterilmiştir._H,_{ancak, EC ile pozitif korelasyon gösterir50} doğrusal olmayan bir şekilde. RBS durumunda daha yüksek dereceli (doğrusal olmayan) etkileşimler de ima edilir_dışarıya Mukavemetteki bir artış, eğimi artıracaktır (daha yüksek N_H) duyarlılıkta eşzamanlı bir artışla (düşük EC₅₀), daha dijital bir eğime ve artan efektör konsantrasyonuna daha keskin tepkiye sahip bir eğri ile sonuçlanır. Bu modellerden, biyosensör ayarının sezgisel olmayan yönleri daha net bir şekilde oluşturulabilir ve bu da düzenleme düğümlerinin küresel bir optimuma doğru optimizasyonunu sağlar. Modeller, her iki EC için de küresel optimumu tahmin etmek için kullanıldı.₅₀ ve n_H , grafikteki kırmızı çizgiler her bir düzenleyici düğümün (Şekil 5C). Şekil 5D ilk ebeveyn biyosensör yapısının (Mavi) doz-yanıt profilini, en iyi performans gösteren DSD tasarımı (Yeşil) ve küresel olarak optimize edilmiş yapı (Leylak) ile karşılaştırır. EC'yi en üst düzeye çıkarmak için ideal modül güçlerini tahmin etmek için modeli kullanma₅₀ ve n_H, RBS'ye karşılık gelen bir değişken_Trans (-1), P_Reg (-0.7), P_dışarıya (-0.3) ve RBS_dışarıya (+1) güçlü yönler bir araya getirildi ve EC'deki iyileştirmeleri gösteren optimize edilmiş yapı ile karakterize edildi₅₀ ve n_H (Şekil 5D). Hem DSD hem de küresel olarak optimize edilmiş biyosensörler benzer EC₅₀ (0,8'e karşı 0,7 μM), n_H AK'den ödün vermeden önemli ölçüde iyileştirildi₅₀ zaten elde edilmiş kazanımlar. Sonuçlar, veriye dayalı tasarımın sezgiye dayalı yaklaşımlara göre avantajlarını açıkça göstermektedir ve biyosensör ayarlama sürecini kolaylaştırma ve basitleştirme aracı olarak DoE'yi doğrulamaya hizmet etmektedir.

Şekil 1: Genetik olarak kodlanmış biyosensör parametrelerinin ayarlanması. aTF, operatör siteleri (OS), altıgen kutular (-35, -10) ve RBS bileşenleri dahil olmak üzere genetik olarak kodlanmış bir biyosensörün genetik modüllerinin düzeni. Renkli kutular, tipik olarak biyosensör parametrelerini etkileyen etkileşimlere karşılık gelir, örneğin: Ligand-aTF afinitesi (Gri), aTF-operatörü (Pembe), RNAP-Hexbox (Yeşil) ve RBS (Turuncu). Her parametrenin doz-yanıt özellikleri üzerindeki etkileri temsili grafiklerde belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tipik bir DoE biyosensör optimizasyon iş akışına genel bakış. (A) Hedef efektörü içe aktarmak için bir taşıma proteinini kodlayan bir taşıma modülünü, aTF ile ilgili bir regülatör modülünü ve sfGFP gibi bir raportör proteini kodlayan bir çıkış modülünü gösteren biyosensör bileşenlerinin modülerleştirilmesine genel bakış. Ayrıca, biyosensör parametrelerini keşfetmek için randomizasyona tabi tutulacak genetik düğümlere karşılık gelen RBS_trans, P_reg, P_out ve RBS_out gibi düzenleme düğümleri de gösterilmektedir. (B) Promotörler ve RBS'ler dahil olmak üzere temel randomizasyona uygun bir dizi elemanı seçimi. Promotörün ebeveyn dizisi en üst satırda gösterilir, nihai mutant dizisi aşağıda gösterilmiştir, yıldızlar değişmemiş bazları gösterirken, K, M ve N sırasıyla Guanin/Timin, Adenin/Sitozin veya herhangi bir nükleotidi ifade eder. Destekleyiciler, altıgen kutuları veya operatör sitelerini hedefleyerek daha fazla rastgeleleştirme potansiyeli sunar ve ayrıca dizilerin aralıklarının çoğaltılmasını veya değiştirilmesini de içerebilir. RBS kitaplıkları daha sınırlı rastgeleleştirme seçenekleri sunar, ancak daha küçük maksimum çeşitlilikleri nedeniyle taranmaları önemli ölçüde daha kolaydır. (C) Varyantların ekspresyon seviyeleri karakterize edilir ve daha sonra kategorik varyant faktörlerini DoE yoluyla analize daha uygun olan 3 ayrı seviyeye dönüştürmek için sıralanmış bir lin-log kitaplığına dönüştürülür. (D) Deney alanının haritalanması, biyosensör performansını istenen sonuçlara göre ayarlamak için tasarım seçimlerini bilgilendirmek için kullanılabilecek bir model oluşturmak için her modülün üç seviyesinin çoğullanmış kombinasyonları kullanılarak gerçekleştirilir, bu dinamik aralığa veya duyarlılığa doğru olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Biyosensör modülerleştirmesi, promotör kitaplığı oluşturma ve otomatik iş akışı. (A) aTF promotöründeki spesifik dizilerin randomizasyonu ve izotermal montaj yoluyla biyosensör yapısına yerleştirilmesi örneği. Kalın harfler, dejenere oligonükleotit sentezi sırasında sağlanan anahtara göre operatör bölgesinde veya altıgen kutularda rastgele seçilen konumları gösterir. (B) Ortaya çıkan biyosensör varyant kitaplığının E. coli gibi bir klonlama konağına dönüşümünü ve dönüştürücü verimine bağlı olarak sonraki adımları açıklayan panel. Düşük dönüşüm verimliliği, teorik kütüphane kapsamının zayıf olmasına ve tasarım alanının yetersiz araştırılmasına neden olabilir. Bu aşamada sorun giderme, varyantların önemli bir kısmının karakterizasyon için mevcut olmasını sağlamak ve ortak sorun giderme önlemlerinin ana hatlarıyla belirtilmesini sağlamak için zorunludur. (C) Protokolde belirtildiği gibi 1. ve 2. adımların iş akışı, kırmızı el sembolü manuel adımları ve dişli çark otomatik adımları gösterir. 1. adım iş akışı, koloni seçiminden kriyo-stok üretimine kadar protokoldeki önemli adımları vurgular. Adım 2 iş akışı, doz yanıt eğrisi ile tahlil için kriyo stoklarının canlandırılmasını ve yeniden düzenlenmesini gösterir. (D) Floresan ve OD ölçümünden önce hücrelerin yıkanması ve tahlil plakalarına aktarılması da dahil olmak üzere, taramadan önceki son prosedürü gösteren panel. Panelde 5000'lik taranmış bir varyant havuzu gösterilir ve varyantlar turuncu kutuda vurgulanan ebeveyn promotör dizisini (3,6 kat) aşan AÇIK/KAPALI gösterir. Varyantların birçoğunun 1 civarında kümelendiği görülebilir, bu da muhtemelen işlev kaybına neden olan dizi seviyesindeki rastgeleleştirme nedeniyle düşük performans ve düşük değişkenliği gösterir. Grafikte kutulu olarak gösterilen 226 varyant, sağlam karakterizasyon için ileriye götürüldü. Veriler, Alvarez Gonzalez ve ark.²³ tarafından yapılan orijinal yayından uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Promotör kitaplığı üst varyant taraması ve lin-log dönüşümü yoluyla ayrıklaştırma. (A) Bir RBS veya promotör kitaplığı için ifade verileri oluşturmaya yönelik standart prosedürün ana hatları. İyi bir ekspresyon seviyesi aralığını temsil eden triyaj varyantlarını kullanarak, sıvı işleyiciler, triyaj 226 varyantının doz yanıt eğrilerini türetmek için önceden belirlenmiş efektör konsantrasyonu ile önceden doldurulmuş tahlil plakaları oluşturmak için kullanılır. (B) EC₅₀ tayini ve karakterize edilen kitaplığın 100 varyanta daha da düşürülmesinden sonra, veriler, promotör randomizasyonundan üretilen farklı hassasiyetlerin karışımını gösteren bir çubuk grafik olarak çizilir. (C)EC₅₀ verileri, sürekli veri setini bir DSD'de çarpanlara ayırmaya daha uygun kategorik bir veri setine dönüştürmek için lin-log oran denklemi kullanılarak dönüştürülür. (D) Dönüştürülmüş EC₅₀ varyant verileri şimdi basitleştirilmiş bir ölçeğe indirgenmiş ve yüksekten düşük EC₅₀ aktivitesine doğru sıralanmış olarak gösterilmektedir. Bundan, üst (+1) geometrik ortalama (0) ve alt (-1) varyantlarına karşılık gelen 3 seviye seçilir ve deney alanını keşfetmek için DSD'ye taşınacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: DSD deneysel tasarımı, testi ve model tabanlı öğrenme çıktıları. (A) RBS_trans, P_reg, P_{out ve RBSout} modüllerinin lin-log dönüştürülmüş sıralanmış kitaplıklarına dayalı bir DSD tasarım tablosunun oluşturulmasını gösteren şematik iş akışı. DSD tasarım tablosu, deney alanını verimli bir şekilde haritalamak için en az sayıda kombinasyonu önerir. +1, 0 ve -1'in, lin-log dönüşümleri tarafından açıklandığı gibi her düzenleyici düğüm için üst, orta ve alt performans gösteren varyantları ifade ettiği örnek bir çıktı verilmiştir. Bunlar, izotermal montaj yoluyla oluşturulur ve karakterizasyon için ekspresyon konağına dönüştürülmeden önce dizileme ile doğrulanır. (B) Dönüşümün ardından, hücreler büyütülür ve çok çeşitli efektör konsantrasyonlarına karşı test edilir ve doz-yanıt eğrileri oluşturmak için floresan çıkışı ölçülür. nH ve EC50 gibi çeşitli parametreler, doz-yanıt eğrilerinden çıkarılır ve her faktör için öngörücü modeller oluşturmak üzere DSD'ye beslenir. (C) Modeller kullanılarak, herhangi bir düzenleyici modülün ekspresyon seviyesini değiştirerek bir biyosensör parametresini modüle etmenin etkisine ilişkin tahminler yapılabilir. Daha da önemlisi, düzenleyici düğümlerin küresel olarak ayarlanması mümkün hale gelir ve her bir alt grafikte kesikli kırmızı çizgilerle gösterilen bir veya daha fazla biyosensör parametresinin aynı anda maksimize edilmesini sağlar. (D) Modelin maksimum duyarlılığa göre optimize edilmesi, doz yanıt eğrisi en iyi performans gösteren DSD yapısına (yeşil) ve ebeveyn biyosensör yapısına (mavi) karşı çizilen küresel olarak optimize edilmiş yapı (leylak) ile sonuçlanır. Çıkarılan n_H ve EC₅₀ parametreleri, grafiğin altında gösterilmiş olup, her iki parametrenin de en iyi performans gösteren DSD yapısının üzerindeki gelişimini göstermekte ve DSD'den oluşturulan tahmine dayalı modellerin etkinliğini doğrulamaktadır. Veriler, Alvarez Gonzalez ve ark.²³ tarafından yapılan orijinal yayından uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Biyosensör kitaplığı hazırlama ve tahlil kurulumu için kullanılan otomatik sıvı işleme protokolü adımları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2'den Ek Şekil 6'ya: Kesin Tarama Tasarımının (DSD) adım adım oluşturulması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Geniş genetik değişkenliği kapsayan genetik element kütüphaneleri, DoE tabanlı bir metodolojinin başarısı için çok önemlidir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, teorik varyantların sayısı, mutajenez için hedeflenecek pozisyonların sayısı ve randomizasyon derecesi ile artar ve bu sürekli artan kütüphane boyutu önemli tarama darboğazları yaratır. Hedeflenen konumların sayısını veya rastgeleleştirme derecesini azaltmak, taranması gereken varyantların sayısını azaltabilir ve ayarlama için daha hedefli bir yaklaşım gerekiyorsa veya bir kılavuz olarak sistem hakkında önemli a priori bilgi mevcutsa çekici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, birçok örtüşen özelliğe sahip olan veya iyi karakterize edilmiş genetik öğelere sahip olmayan biyosensörler gibi sistemler söz konusu olduğunda, kitaplık boyutu gereksinimini aşmak zordur. Otomatik sıvı işleyicilerin kullanımı, özellikle doz yanıt eğrileri ile AÇIK/KAPALI gibi iki veri noktası karşılaştırıcısı gibi daha gelişmiş işlevlerin çizilmesi için artan veri noktası toplama gerektiğinde, koloni toplama ve varyantları kültürleme emeğini önemsizleştirebilir. Otomatik iş akışlarının dahil edilmesinden kazanılan zamanı spesifik olarak ölçmek zor olsa da, Uygulanmasının en büyük yararı, diğer paralel deneylere ayrılabilecek zamandır³⁸.

Buna rağmen, kitaplık boyutlarının 10^4'ü aştığı birçok durumda, sıvı işleyici destekli metodolojiler bile pratik olmaz hale gelir³⁹. Bu gibi durumlarda, akış sitometreleri kullanılarak varyantların ön taraması, saat⁴⁰ başına 10⁷ hücreye kadar çok daha büyük bir sıralama kapasitesi ile oldukça çekici bir yaklaşımdır. İki tur pozitif seçim ve en az bir tur negatif seçim ile floresanla aktive olan hücre sıralamasının (FACS) kullanılması, daha kapsamlı karakterizasyon ^16,26,42'den önce biyosensörlerin en iyi performans gösteren varyantlarının önceliklendirilmesinde rutin olarak kullanılmıştır. FACS kullanan bu tür protokollerin geliştirilmesi ve yürütülmesi başka bir yerde ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir³¹. İlk triyaj taramaları, yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi, plaka bazlı sıvı işleyici tahlilleri kullanılarak mümkündür; Şekil 3D'de gösterildiği gibi tek bir efektör konsantrasyonu kullanarak AÇIK/KAPALI verilerini karşılaştırarak, daha ayrıntılı karakterizasyon, kitaplık geliştirmeyi ve deneysel çalışma süresini kolaylaştırmak için yalnızca kayda değer bir fonksiyon kazancına (yöntemlerde sağlandığı gibi 3,6 kat) sahip varyant biyosensörler seçilebilir. Bununla birlikte, hem FACS hem de sıvı işleyici platformları, laboratuvar için önemli miktarda sermaye yatırımı ile birlikte gelir ve genellikle işletmek ve sürdürmek için bir düzeyde teknik uzmanlık gerektirir. Agar plakası bazlı ekranlar, giriş için daha düşük bir teknik ve finansal engel sağlar ve floresan^43,44 yoğunluğuna dayalı olarak RBS kütüphane varyantlarının yanı sıra enzim mutantlarını seçmek için gfp veya mavi-beyaz koloni taraması ile birlikte kullanılmıştır. Bununla birlikte, bunlar da etkili bir şekilde taranabilen varyantların sayısında sınırlıdır, ancak aynı zamanda tespit edilebilmesi için floresanda önemli bir fark gerektirir⁴⁴. Aynı anda birden fazla öğenin tamamen kombinatoryal eşzamanlı mutasyonu arasında bir uzlaşma olarak, bir "böl ve yönet" metodolojisi bunun yerine büyük değişken kitaplıkları daha yönetilebilir tarama bloklarına⁴¹ bölmeyi amaçlar. Modülerleştirilmiş bir yaklaşım pragmatik olsa da, biyolojik bileşenlerin performansının, özellikle transkripsiyonel ve translasyonel eşleşmenin yaygın olduğu bakterilerde, büyük ölçüde bağlama bağlı olduğu bilindiğinden, kombinatoryal tasarım alanını etkili bir şekilde keşfetmez. Bu, küresel optimum yerine yerel maksimumları hedefleyen tasarım seçimleriyle sonuçlanma potansiyeline sahiptir.

Spesifik indükleyicilerin taşınması ve tanınması, ana hatlarıyla belirtilen protokolün ana odağı olmamasına rağmen, biyosensör gelişiminin bahsetmeyi hak eden bir başka önemli özelliğini temsil eder. Hedef molekül için uygun bir aTF'nin bulunmaması araştırmacılar için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Hedef efektörün yapısal bir analoğunu bağlayan mevcut bir aTF'nin rasyonel seçimi, aTF'nin özgüllüğünü istenen efektöre¹⁷ ayarlamak için kodon rastgeleleştirmesinin uygulanacağı ideal bir şablon sağlayabilir. Hedef dizinin çözülmüş yapılara veya Alphafold tahminlerine hizalanması, protokol^17'ye uyarlanabilen, yarı rasyonel randomizasyon ve sıralamaya tabi tutulan şüpheli amino asit kalıntıları ile efektör bağlanma bölgelerinin tanımlanmasını sağlayabilir. Benzer şekilde, efektörlerin ithalatından/ihracatından sorumlu taşıyıcıların seçimi ve modülasyonu, biyosensör doz-yanıt özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilir. Taşıyıcı gen ekspresyonunun, biyosensör yanıtının¹⁷ sağlamlığını artırarak, birden fazla FACS turu boyunca ekspresyonunu stabilize etmek için kullanılan bir MucK taşıyıcısının ekspresyonunu kontrol eden çeşitlendirilmiş bir P_tac promotörleri ve RBS kütüphanesi ile biyosensör yanıtında önemli bir oyuncu olduğu bulunmuştur. Benzer şekilde, farklı taşıyıcı proteinlerin kendilerinin taranması, PCA'ya duyarlı bir biyosensör kullanılarak varsayılan bir PcaK taşıyıcı setinin taranmasıyla, 3,5-hidroksillenmiş substratları benzersiz bir şekilde alabilen iki taşıyıcının tanımlanmasına yol açarak, bu sistem²⁴ tarafından saptanabilen bileşikler setini genişleterek, biyosensörlerin özgüllüğünü modüle edebilir.

Otomatik platformlar, DoE ilkelerini derin öğrenme modelleriyle birleştirirken karakterizasyon ve keşif için daha da güçlü araçlar haline gelebilir^46,47. İlk olarak yüksek verimli bir platforma sahip bir biyosensörün tasarım alanını keşfettikten sonra, karakterize edilmemiş dizilerin işlevini iyi bir doğrulukla tahmin etmek için makine öğrenimi algoritmalarından yararlanılmıştır ⁴⁷. Bu protokolde özetlenen yöntemler, çapraz RBS dizi tahmini^48'e dayalı olarak geliştirilen modellere benzer şekilde, promotör tasarımı için yeni dil öğrenme modellerinin test edilmesinde kolayca uygulanabilir. Ayrıca, bu tür modellerin entegrasyonu, işlevsel olmayan promotör tasarımlarında yer alan dizi fonksiyonu verilerinden yararlanabilir ve bir bütün olarak biyosensörün daha geniş işlevselliği hakkında kritik bilgiler sağlayabilir. Yani, bu, DoE iş akışının çok önemli bir sınırlamasını, örneğin işlevsel olmayan bir promotörün yanlış pozitiflerinin, sahte transkripsiyon veya DoE verilerine tanımlanması ve kontrol edilmesi zor olan bir gürültü unsuru eklenmesi gibi fenomenlerle birlikte ölçülen sıfır çıktısına eşit olmaması gibi önemli bir sınırlamayı ele alma potansiyeline sahip olacaktır. En önemlisi, toplam deneysel tasarım alanını kapsamak için, oluşturulan herhangi bir kütüphane geniş bir faaliyet yelpazesi sergilemelidir, çünkü yetersiz bir faaliyet aralığı çarpık tasarım çıktılarına neden olacak ve veri kümesinden³⁰ oluşturulan herhangi bir istatistiksel modelde güvenilmezlik yaratacaktır. Düşük kitaplık değişkenliği bir sorun haline gelirse, diğer dizi öğelerini keşfetmek veya rastgeleleştirme derecesini artırmak uygulanabilir ve uygun bir değişken havuzu elde edilene kadar kitaplıklar arasındaki varyasyon karşılaştırılabilir.

DoE sürecinin önemli bir yönü, CSD'den elde edilen ve daha sonra istatistiksel analize dahil edilecek olan birincil ve ikincil etkilerin doğru tahmin edilmesini ve seçilmesini içerir. Modellemeye dayalı bir yaklaşım olan DoE, yinelemeli mühendislik çabalarını tasarım alanının⁴⁹ optimal olmayan bölümlerine yönlendirerek optimizasyon sürecini hızla karmaşıklaştırabilen aşırı uyum ve önyargıya oldukça yatkındır. Bu nedenle, herhangi bir tasarımın hem tasarım aşamasında hem de verilerin analizi aşamasında bu tür etkilerden sağlam bir şekilde yalıtılmasını sağlamak çok önemlidir. İlk tarama tasarımı aşamasında, tüm faktörlerin geometrik ortalamaya (yani 0,0,0,0) ayarlandığı ortalanmış çalışmalar, doğrusal olmayan etkileşimleri daha iyi hesaba katarak model yanlılığını azaltmaya yardımcı olabilirken, önemli deneysel yük (1-3 ek çalışma)⁴⁹. Ek olarak, rastgele tasarımların dahil edilmesi, deneysel tasarıma dahil edilmeyen ancak yine de ölçülen yanıt değişkenlerini etkileyebilecek yabancı değişkenlerin hesaba katılmasına yardımcı olabilir. Biyolojik bağlamda rastgeleleştirme, plaka konumu veya partiden partiye değişim gibi uzay-zamansal etkiler gibi sorunları ele alarak bu tür etkilerin veri yorumlamasını önemli ölçüde etkilemesini önler. Bu erken aşamada bu tür ayrıntılara dikkat edilmesi, modellerin sağlamlığını artırabilir ve daha güvenilir sonuçlara yol açabilir. DSD tarafından önerilen deneyleri gerçekleştirdikten sonra, çıktı parametreleri üzerinde önemli bir etkisi olan faktörleri aydınlatmak için verilerin istatistiksel analizi gereklidir. Yarı normal grafikler, hiçbir önemi olmayan etkilerin tipik olarak düz bir çizgi boyunca düşmesiyle, etki büyüklüklerinin sezgisel bir görsel temsilini sunarken, önemli bir etkiye sahip etkiler bu çizgiden saparak biyosensör optimizasyonunda en önemli faktörlerin basit bir şekilde seçilmesini sağlar. Bunu akılda tutarak, modelin aşırı uyma riskini azaltmak için tüm modellemelerde olduğu gibi efekt seçimine muhafazakar bir yaklaşım benimsenmelidir.

Biyosensörleri ve diğer genetik devreleri hızlı bir şekilde tasarlama ve optimize etme yeteneği, suş ve enzim geliştirme gibi biyoteknoloji alanındaki araştırmaların yanı sıra gerçek zamanlı teşhisteki araştırmaların hızını büyük ölçüde artıracaktır. Bu alanda DoE tabanlı tarama metodolojilerinin ortaya çıkması özellikle umut vericidir, mümkün olan maksimum tasarım alanını keşfederken zamanın ve kaynakların verimli kullanımını kolaylaştırır ve metabolik yollar ve biyosensörler için genetik devrelerin optimizasyonunda büyük etki için zaten kullanılmıştır 31,33,34,51. DoE, özellikle birçok birinci, ikinci ve hatta üçüncü dereceden etkileşimin iş başında olduğu çok faktörlü optimizasyon problemleri için çok uygundur ve aksi takdirde tipik bir seferde tek faktör deneysel tasarım yaklaşımıyla sorgulanması zor olacaktır. Ayrıca, bir biyosensörün bir yönünü tasarlama çabaları, dinamik aralık⁵¹ pahasına hassasiyeti artırmak gibi, genellikle istemeden başka bir parametrenin feda edilmesiyle sonuçlanır. DoE'nin bu tür gizli etkileşimleri haritalama ve biyosensör davranışını tahmin eden modeller oluşturma yeteneği sayesinde, derleme testi öğrenme döngüsü büyük ölçüde hızlandırılır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &mikro; L CO-RE Uçlar, steril filtresiz	Hamilton	235939
2.2 mL 96 Deepwell Plakası, V Şeklinde Tabanlı Kare Kuyular	Termo	11594754
300 &mikro; L CO-RE Uçlar, yığılmış NTR'ler, steril	Hamilton	235985
96 kuyucuklu şeffaf taban, siyah mikrotitre plakaları	Greiner	655097
Agaroz	Davetli	16500100
Birleştirilmiş Plazmit DNA	Kullanıcı Tarafından Sağlanan	NA
ClarioStar Plus Mikroplaka okuyucu	BMG	NA
Dexynucloetide (dNTP) çözelti karışımı	NEB	N0447L Serisi
Dimetil Sülfoksit (DMSO)	Fisher BioReaggents	BP231-100 Serisi
DNA Merdiveni 100bp	NEB	N3231L Serisi
DNA Merdiveni 1KB	NEB	N3232L Serisi
DNA Dizileme	Kaynak: Biyobilim	NA
DNA Sentezi	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Kopotent Hücreler	NEB	C2987H
Jel Yükleme Boyası, Mor X6 SDS Yok	NEB	B7025S
Gen pulser/Mikropulser Elektroporasyon Küvetleri, 0,2 cm boşluk	Biorad	1652082
Grafik Pad Prizma 10	Grafik Pedi	NA
Hamilton Star Sıvı Taşıyıcı	Hamilton	NA
HT multitron Plaka Shaker İnkübatörü	Bilgi HT	NA
JMP İstatistiksel Analiz Paketi	JMP	NA
LB Et Suyu (Miller)	Değirmenci	L3522 Serisi
LB Broth (Miller) agar	Sigma	L3147 Serisi
MicroPulser Elektroporatör	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi DNA Düzeneği Ana Karışımı	NEB	E2621S
Q5 Yüksek kaliteli DNA polimeraz	NEB	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kiti	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Kiti	QIAGEN	27104
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti	QIAGEN	28706X4
QIAquick PCR Arıtma Kiti	QIAGEN	28104
Qpix 420 Koloni Seçici	Moleküler Cihazlar İngiltere	NA
SOC Outgrowth Orta	NEB	B9020'LER
SYBR Güvenli DNA Jel Boyası	Davetli	S33102
TAE Tampon (Tris-asetat-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	B49
UltraPureTM Dnase/Rnase-Free Damıtılmış Su	Davetli	10977015