Yöntem makalesi

Rose Bengal ile Fotodinamik Terapinin İn Vitro Uygulanması için Yenilikçi LED Tabanlı Aydınlatma Cihazının Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, Rose Bengal aracılı fotodinamik terapiyi in vitro incelemek için yeni, yenilikçi bir 3D baskılı aydınlatma cihazı sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, Rose Bengal (RB) aracılı FDT'nin in vitro etkinliğini değerlendirmek için yeni bir fotodinamik terapi (PDT) cihazını açıklamaktadır. CELL-LED-550/3 adı verilen cihaz, biri tek bir LED'den (ışık kaynağı kısmı) 550 nm yeşil ışık üreten, diğeri ise bu ışığı 96 oyuklu hücre kültürü plakasına (ışık dağıtıcı kısmı) dağıtan iki adet 3D baskılı parçadan oluşuyor. Işık kaynağı kısmı, üç farklı moda sahip bir sürücü tarafından kontrol edilir ve ışık dağıtıcı kısmının kuyuların alt dış yüzeyine üç farklı ışınım seviyesi iletmesini sağlar: 0.02 mW/cm2, 0.23 mW/cm2 veya 0.62 mW/cm2. Işık dağıtıcı kısmı kuyuları tek tek ve eş zamanlı olarak aydınlatmak için tasarlandı. CELL-LED-550/3 cihazının uygunluğunu göstermek için, HepG2 hepatoselüler karsinom hücrelerinde RB aracılı PDT ile hücre ölümünü indükleme yeteneği değerlendirildi. İlk olarak, HepG2 hücreleri, yaklaşık 550 nm'de bir absorpsiyon zirvesine (en yüksek olanı) sahip bir ışığa duyarlılaştırıcı olan artan Rose Bengal konsantrasyonları ile 2 saat boyunca tedavi edildi. Tedavi edilen hücreler daha sonra 0.3 J/cm2, 0.6 J/cm2 ve 1.2 J/cm2 ışık dozlarında maksimum ışınım seviyesine ayarlanmış CELL-LED-550/3 cihazı kullanılarak aydınlatıldı (sırasıyla 8 dakika ve 4 sn, 16 dk ve 8 sn ve 32 dk ve 16 sn). Son olarak, canlılık PDT'den 24 saat sonra Cell-Titer Glo kullanılarak ölçüldü. Deneysel sonuçlar, CELL-LED-550/3 cihazını kullanan RB aracılı PDT'nin, hem Rose Bengal konsantrasyonuna hem de uygulanan ışık dozuna bağlı bir şekilde HepG2 hücrelerinin canlılığında bir azalmaya neden olabildiğini göstermektedir. Bu makalede sunulan kavram kanıtına dayanarak, CELL-LED-550/3 cihazı, RB aracılı PDT çalışmasına başka bir araç ekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2020'de 905.000'den fazla yeni vaka ve 830.000 ölümle birincil karaciğer kanseri, dünya çapında en sık görülen yedinci kanser ve kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir1. Primer karaciğer kanserleri arasında hepatosellüler karsinom (HCC) en yaygın formdur ve vakaların yaklaşık %90'ını oluşturur2. Tespit edilemeyen kronik karaciğer hastalığı ve zayıf sürveyans uyumu nedeniyle, HCC'li hastaların sadece %25'i hastalığın erken evresinde teşhis edilmektedir3. Bu erken tanı hastalar tipik olarak karaciğer rezeksiyonu, karaciğer nakli veya küratif amaçlı lokal ablatif tedavilerle tedavi edilir ve %70'in üzerinde beş yıllık sağkalım oranı ile iyi prognoz gösterirler4,5. Hastaların diğer %75'i için (orta veya geç tanı almış HCC'si olanlar), hedefe yönelik tedaviler, immünoterapiler ve kombinasyon rejimleri dahil olmak üzere yenilikçi tedavi yöntemleri sağkalım yararı sağlasa da6, prognoz çok kötü olmaya devam etmektedir: beş yıllık sağkalım oranı aslında bu hasta grubu için %30'u geçmez ve metastatik hasta alt grubu için %2'ye düşer6. Bu nedenle, alternatif tedavi seçeneklerini araştırmak, orta veya ileri evre HCC'li hastalarda tedavi sonuçlarını iyileştirmek ve sağkalımı uzatmak için çok önemlidir. Dermatolojideyaygın olarak uygulanan bir antikanser tedavisi olan Fotodinamik Tedavi (FDT) 7 uygun bir alternatif aday olabilir.

PDT, sitotoksik reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için ışığa duyarlılaştırıcı bir ajan (PS), görünür ışığın uygun bir dalga boyu ve moleküler oksijen kullanımını birleştiren fotokimyasal bir işlemdir8. PDT'nin antikanser etkileri, ROS ile indüklenen üç mekanizmadan9 türetilir: ilk olarak, malign hücreler10 üzerinde doğrudan sitotoksik etkiler, daha sonra tümör dokusu hipoksisini, besin yoksunluğunu ve regresyonunu11 indükleyen tümör damar sistemine hasar ve son olarak, hasarlı veya ölmekte olan tümör hücrelerinden tehlike sinyallerinin ve tümör antijenlerinin salınması yoluyla inflamatuar reaksiyonun indüklenmesi12. Otuz yılı aşkın bir süredir PDT, çeşitli kanser türlerini ve formlarını tedavi etme potansiyelini değerlendirmeyi amaçlayan yoğun bir araştırmaya konu olmuştur 13,14,15,16,17,18. Bu araştırmalardan 19,20,21 kanıtlanmış etkinliğine dayanarak, PDT günümüzde dermatolojide melanom dışı cilt kanserlerinin tedavisinde kullanılmaktadır 7. Diğer endikasyonlar için, son yıllarda klinik çalışmaların sayısı artmış olup, tek başına veya standart tedavilerle birlikte kullanılan FDT'yi klinik uygulamaya sokmak için önemli çabalar sarf edildiğini göstermektedir 22,23,24.

PDT25 için kullanılan çeşitli ışığa duyarlılaştırıcı ajanlar mevcuttur. Bunlar arasında Rose Bengal'in (RB) gırtlak tümör hücrelerine26, melanom hücrelerine27, meme kanseri hücrelerine28 ve prostat kanseri dokularına29 karşı etkili bir fotodinamik ajan olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Bu makalede sunulan çalışma, RB aracılı PDT'nin HCC hücreleri için de etkili olup olmadığını değerlendirme ihtiyacına dayanmaktadır.

Böyle bir değerlendirme gerçekten de 550 oyuklu hücre kültürü plakalarının 96 nm aydınlatmasına adanmış yeşil LED tabanlı bir cihazın önceden geliştirilmesini gerektiriyordu. Bu cihaz30 için iki parçadan oluşan bir tasarım uygulandı: bir ışık kaynağı parçası, tek bir LED'den 550 nm yeşil ışık üretirken, bir ışık dağıtıcı parçası, bu ışığı, bir fiber optik demeti kullanarak, ayrı ayrı ve LED'den uzağa 96 kuyuya dağıtır. Bu iki parçalı tasarım, ilk olarak hücrelerin LED içinde oluşan kontrolsüz ısı nedeniyle ortaya çıkabilecek zararlı termal etkilerden korunmasını ve ikinci olarak bir hücre kültürü inkübatörü içindeki hücrelerin aydınlatılmasını sağlarken, ışık kaynağı kısmını elektronik bileşenleri (LED dahil) ile dışarıda tutmayı sağlar. Bu yenilikçi özellikler, CELL-LED-550/3 olarak adlandırılan cihaza, çok kuyulu plaka aydınlatması 31,32,33,34,35 için özel olarak tasarlanmış, halihazırda yayınlanmış LED tabanlı sistemlere göre büyük avantajlar sağlar.

Bu yazıda ilk olarak CELL-LED-550/3 cihazı detaylı olarak anlatılmaktadır. Daha sonra, kavramın bir kanıtı olarak, bir hücre canlılığı çalışması, bir 2D HCC hücre kültürü modelinde (HepG2)30 CELL-LED-550/3 kullanılarak RB aracılı PDT'nin etkinliğini göstermektedir. Ucuz ve taşınabilir olmasının yanı sıra, CELL-LED-550/3 cihazı bu nedenle RB aracılı PDT deneyleri için özellikle uygun bir araçtır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Cihaz yapımı

NOT: CELL-LED-550/3 cihazının iki parçası ayrı ayrı üretilir ve sadece son adım olarak birbirine takılır.

  1. Işık kaynağı parçasının yapımı
    1. 550 nm 3 W LED'in monte edildiği baskılı devre kartının (PCB) arka tarafına uygun boyutta bir fan ısı emici tertibatı takın.
    2. İlk olarak ışık huzmesini homojenleştirmek ve ikinci olarak ışın açısını 120°'den 10°'ye düşürmek için LED'i şeffaf bir PMMA (polimetil metakrilat) yönlendirme merceği ile kapatın. Böyle bir azalma, ışık dağıtıcı parçaya iletilen ışık miktarının artmasına izin verir.
    3. LED'i, farklı ışınım seviyelerinin iletilmesini sağlayan üç modlu karartma ile mevcut sürücüye bağlayın.
    4. 3D baskıda muhafazayı, gövde önünü ve gövde kapağını ayrı ayrı oluşturun ( Şekil 1'deki kırmızı kutular).
    5. Sürücüyü ve hem lens hem de fan ısı emici tertibatı ile donatılmış LED'i muhafazadaki özel yerlerine takın ( Şekil 1'deki mavi kutular).
    6. Güç jakını ve basmalı anahtarı mahfaza kapağındaki özel yerlerine takın ( Şekil 1'deki mavi kutular).
    7. Sürücüyü ve fan ısı emici tertibatını basmalı anahtar aracılığıyla güç jakına bağlayın.
    8. Muhafazayı, muhafaza kapağını ve muhafaza önünü monte edin.
    9. LED'in mahfaza ön tarafındaki silindirik açıklığın ekseni ile hizalandığını kontrol edin.
      NOT: Muhafaza ön kısmının silindirik açıklığı, ışık kaynağı parçasının (dişi konektör) ışık dağıtıcı parçası (erkek konektör) ile optik bağlantısı için tasarlanmıştır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Işık kaynağı parçasının üç boyutlu ön (A), arka (B) ve patlatılmış (C) görünümleri. Lefebvre, A. ve ark.30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

  1. Işık dağıtıcı parçasının yapısı
    1. 3D baskıda mahfaza alt kapağını, mahfazayı ve üst kapağı ayrı ayrı oluşturun (birlikte içi boş bir kutu oluştururlar) ( Şekil 2'deki kırmızı kutular).
    2. 96 oyuklu ara parçayı beyaz 3D baskıda ( Şekil 2'deki kırmızı kutu) 1.2.1'de belirtilen içi boş kutuya tam olarak uyacak şekilde oluşturun. Beyaz renk, ışık yansımasını en üst düzeye çıkarmayı ve böylece ışık dağılımını optimize etmeyi amaçlar.
      NOT: 96 oyuklu ara parçada bulunan dairesel açıklıkların çapı ve merkez aralığı, biyolojik tahliller için kullanılan 96 oyuklu plakanın kuyucuklarının çapına ve merkez aralığına eşit olmalıdır.
    3. İçi boş kutunun üst kapağına 96 küçük delik açın, böylece 96 oyuklu ara parçadaki 96 dairesel açıklığın merkeziyle hizalanırlar, ikincisi üst kapağa yerleştirildiğinde.
    4. Üst kapağın 96 küçük deliğinin her birine aşağıdan yukarıya doğru 0,5 mm çapında bir plastik optik fiber yerleştirin.
    5. 96 optik fiberi üst kapağa bağlamak için üst kapağın altına polyester reçine uygulayın.
    6. Reçine kuruduktan sonra, optik fiberlerin distal uçlarını üst kapağın üst kısmına oturana kadar parlatın.
    7. Adım 1.2.1'de bahsedilen içi boş kutunun içindeki optik fiberleri, kutunun yaklaşık iki metre dışına uzanan bir kılıfla korunan tek bir demet halinde toplayın.
      NOT: Kutunun yüksekliği, optik fiberlerin bükülmesini ve neden olabilecek optik zayıflamayı önlemek için yeterli olmalıdır.
    8. İçi boş kutuyu, elyaf demeti mahfazanın özel açıklığından geçecek şekilde monte edin.
    9. Optik fiberlerin proksimal uçlarını 3D baskılı bir erkek konektöre bir araya getirerek ışık kaynağı kısmına (dişi konektör) bağlantıya izin verin.
      NOT: Bu konektör, bu yapıştırıcının neden olabileceği ışık zayıflamasını önlemek için yapıştırıcıya ihtiyaç duymamalıdır.
    10. 96 oyuklu ara parçayı içi boş kutuya yerleştirin.
    11. Her bir optik fiber distal ucunda iletilen dar ışını biyolojik analizler için kullanılan 96 oyuklu plakanın kuyu çapı kadar büyük bir ışına yaymak için şeffaf bir PMMA plakası (alt yüz) ile çizilmez bir mylar levha (üst yüz) arasına bir aydınger kağıdı yerleştirerek bir ekran oluşturun.
    12. Ekran çerçevesini 3D baskıda ( Şekil 2'deki kırmızı kutu) oluşturun, böylece merkez açıklığı biyolojik analizler için kullanılan 96 oyuklu plakanın boyutuna tam olarak uyar ve böylece kuyucuklar 96 oyuklu ara parçanın dairesel açıklıklarıyla mükemmel şekilde hizalanır.
    13. Ekranı, ekran çerçevesiyle 96 oyuklu ara parçanın üstüne sabitleyin.

figure-protocol-2
Şekil 2: Işık dağıtıcı parçasının üç boyutlu görünümleri. Lefebvre, A. ve ark.30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

  1. Işık kaynağı parçasının ışık dağıtıcı parçası ile montajı
    1. Işık dağıtıcı parçasının erkek konnektörünü ışık kaynağı parçasının dişi konnektörüne takın.
      NOT: Erkek konektör dişi konektöre takıldıktan sonra, ışık kaynağı parçası tarafından iletilen ışık huzmesi, ışık dağıtıcı parçanın ışık alıcı elemanının yüzey alanından biraz daha fazlasını kaplamalı, böylece 96 optik fibere ışık beslemesi sağlanmalıdır.

2. Biyolojik analizler

  1. Hücre kültürü süreci
    1. Hepatokarsinom hücre dizisi HepG2'yi, ısıyla inaktive edilmiş sığır serumu ve %1 streptomisin ve penisilin ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında yetiştirin.
    2. HepG2 hücreleri içeren kültür şişelerini 37 °C'de %5 CO2 hücre kültürü inkübatöründe tutun.
    3. Kültür ortamını şişelerden aspire ederek ve daha önce 37 °C'ye ısıtılmış RPMI 1640 kültür ortamıyla değiştirerek kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin.






Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3'te gösterildiği gibi, CELL-LED-550/3 cihazı, 96 nm yeşil ışıkla 550 oyuklu bir plakanın alttan homojen bir şekilde aydınlatılmasını sağlar.

figure-results-1
Şekil 3: Oda ışığı AÇIK (A) veya KAPALI (B) olduğunda 550 oyuklu bir plakanın açıklayıcı aydınlatması sırasında CELL-LED-3/96 cihazının resimleri. Lefebvre, A. ve ark.30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Her kuyu, bir optik fiber demeti kullanılarak ayrı ayrı ve tek LED'den uzakta (iki metreye kadar) aydınlatılır (Şekil 4).

figure-results-2
Şekil 4: 96 oyuklu bir plakanın kuyularının tek LED'den uzakta ayrı ayrı aydınlatılmasını sağlayan fiber optik demet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

CELL-LED-550/3 cihazının etkinliğini belirlemek için, HepG2 hepatokarsinom hücre hattında RB aracılı FDT'yi indükleme yeteneği değerlendirildi. Hücreler, aydınlatmadan önce 2 saat boyunca 0-100 μM arasında değişen artan Rose Bengal konsantrasyonları ile muamele edildi. Bu tür bir konsantrasyon aralığının kullanılması, yeşil ışığa maruz kaldığında HepG2 hücrelerini öldürecek olan Rose Bengal'in etkili dozunu (EC50) belirlemeyi amaçladı. CELL-LED-550/3 cihazı tarafından verilen ışık dozunun HepG2 hücrelerinde hücre ölümünün indüklenmesi üzerindeki etkisi de incelenmiştir. Bunu yapmak için hücreler, 0.30 J/cm2, 0.60 J/cm2 ve 1.22 J/cm2 ışık dozları elde etmek için 0.62 mW/cm2 yoğunlukta 8 dakika 9 sn, 16 dakika 18 saniye veya 32 dakika 36 saniye ışığa maruz bırakıldı.

İlk olarak, Rose Bengal'in yokluğunda (Işık durumu, Şekil 5) tek başına aydınlatmanın, alınan ışık dozundan bağımsız olarak HepG2 hücrelerinin canlılığı üzerinde hiçbir etkisinin olmadığı gözlemlendi. Ayrıca, ışığın yokluğunda (RB durumu, Şekil 5) tek başına Bengal Gülünün, test edilen koşulların hiçbiri için hücre canlılığında herhangi bir değişikliğe neden olmadığı da gözlemlendi. Buna karşılık, sonuçlar, CELL-LED-550/3 kullanan RB aracılı PDT'nin HepG2 hücrelerini öldürebildiğini göstermektedir. Ayrıca, 0.30 J/cm2'lik bir hafif doz için 34.3 μM, 0.60 J/cm2'lik bir doz için 26.6 μM ve 1.2 J/cm2'lik bir doz için 6.8 μM maksimum etkili konsantrasyon (EC50) ile artan ışık dozu ile ilişkili olarak artan etkinlik gözlenmiştir.

Bu sonuçlar, bu yeni PDT cihazının RB aracılı FDT için etkinliğini doğruladı (Şekil 5).

figure-results-3
Şekil 5: HepG2 hücre hattının canlılığı ile ilgili olarak cihazın etkinliği. HepG2 tedavisinden 24 saat sonra canlılık yüzdesi. NT, işlenmemiş; RB, yalnızca ışığa duyarlılaştırıcı (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM ve 100 μM); ışık, 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 ve 1,22 J/cm2 için aydınlatma; PDT, RB tedavisi ile aydınlatma. Sonuçlar, NT'nin yüzdesi olarak ifade edilen üç bağımsız deneyin ± SEM'inin araçları olarak sunulur. İki yönlü bir ANOVA testi yapıldı ve p ≤ 0.01 (**); p ≤ 0.0001 (****) istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi ve p ≥ 0.05 anlamlı değil (NS) olarak kabul edildi. Lefebvre, A. ve ark.30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, hem in vitro RB aracılı PDT'ye adanmış yenilikçi bir aydınlatma cihazı geliştirme protokolünü hem de CELL-LED-550/3 cihazı için bir kavram kanıtı uygulama protokolünü açıklamaktadır, bu nedenle30 geliştirilmiştir.

CELL-LED-550/3, her biri belirli bir işleve sahip iki parçadan oluşur. Işık kaynağı kısmı olarak adlandırılan birinci kısmın amacı, tek bir LED'den, ikinci kısmın fiber optik demetinden daha yüksek çapa sahip homojen bir yeşil ışık demeti üretmektir. Işık dağıtıcı kısmı olarak adlandırılan bu sonuncusu, ışık kaynağı kısmı tarafından sağlanan ışığı, fiber optik demeti aracılığıyla 96 oyuklu bir plakanın kuyularına ayrı ayrı ve LED'den uzağa dağıtmayı amaçlamaktadır. LED'den 2,5 m'ye kadar bir mesafede, LED içinde oluşan kontrolsüz ısı nedeniyle ortaya çıkabilecek zararlı termal etki riski olmadan hücreler ihtiyaç duyulduğu sürece aydınlatılabilir.

Bu özellik, CELL-LED-550/3'ün 96 oyuklu plaka aydınlatması 31,32,33,34,35,36 için özel olarak tasarlanmış diğer LED tabanlı sistemlere göre ilk önemli avantajını sunar. Gerçekten de, diğer tüm sistemler, LED'lerin hücrelerin yalnızca birkaç santimetre altına (genellikle 5 cm'nin altında) konumlandırılmasını içerir, bu da hücreler için LED ile ilgili zararlı termal etki riskini ortadan kaldırmak için yetersizdir. Bu tür bir riski sinirlamak için, bu diger sistemlerin çogu (maalesef bazilari yoktur), bazen hücrelere çok (çok) yakin konumlandirilan ve daha sonra ortaya çikan termal dalgalanmalardan ters etki yapabilen bir LED soğutma sistemi 32,34,35 içerir. CELL-LED-550/3 cihazının iki parça halinde tasarımı, mevcut diğer LED tabanlı sistemlerinçoğuna göre bir başka önemli avantaj sağlar 31,32,33,35,36: bu, cihaz için herhangi bir risk olmadan bir hücre kültürü inkübatörü içindeki hücrelerin aydınlatılmasına izin verir. Hiçbir elektronik bileşen içermeyen ışık dağıtıcı kısmı gerçekten de inkübatörün içine yerleştirilebilirken, nemli ortamlara duyarlı elektronik bileşenleri içeren ışık kaynağı kısmı korozyon veya arıza riskini önlemek için dışarıda tutulur. Elektronik bileşenler de dahil olmak üzere bazı mevcut LED tabanlı sistemler, bir inkübatör içinde bir aydınlatma sağlar, ancak böyle bir kullanım, ilk olarak, tasarımcılar/üreticiler tarafından tavsiye edilmez ve ikincisi, kullanımdan sonra "yeterli" bir kuru gerektirir33,34. Bir inkübatör içindeki hücreleri aydınlatma ve böylece hücreleri aynı fizyolojik koşullar altında tutma yeteneği (sıcaklık, nem ve CO2 konsantrasyonu) protokol sırasında, özellikle uzun aydınlatma süreleri gerektiren protokoller için, PDT sonrası hücre canlılığının değerlendirilmesinde potansiyel önyargılardan kaçınmak için çok önemlidir. CELL-LED-550/3 cihazının 96 kuyunun tamamını ayrı ayrı ve aynı anda aydınlatmak için tek bir LED içerdiğini de vurgulamak gerekir. Bu orijinal ve yenilikçi özellik, yukarıda belirtilen diğer LED tabanlı sistemlerin 31,32,33,34,35,36 hiçbirinde mevcut değildir. Bu sistemlerin çoğu, her kuyucuğun altına bir LED yerleştirilmiş 96 LED içerir ve bu nedenle 96 ayrı ışın 31,33,34,36 iletirken, geri kalan sistemler kuyu plakasından birkaç santimetre uzağa yerleştirilmiş 6 ila 25 LED, kuyuların tamamını veya bir kısmını kaplayan küresel bir ışın 31,32,35. Literatüre göre, CELL-LED-96/550'ün bir fiber optik demeti kullanarak yaptığı gibi, tek bir LED'den 3 ayrı ışın üretmek daha önce hiç önerilmemişti.

Işık kaynağı kısmında iki ana kritere göre seçilen 550 nm 3 W LED bulunmaktadır. İlk olarak, LED'in emisyon spektrumu (ve dolayısıyla merkezi dalga boyu), RB ışığa duyarlılaştırıcının absorpsiyon spektrumuyla örtüşmelidir. Seçilen LED ile mükemmel bir şekilde elde edilen böyle bir örtüşme (merkezi dalga boyu: 554,4 nm; FWHM: 106.4 nm; her ikisi de Lefebvre ve ark.30'da açıklanan metodolojiye göre tahmin edilmiştir) (Şekil 6), RB foto-aktivasyonu ve dolayısıyla RB aracılı bir FDT'nin indüklenmesi için gereklidir. İkincisi, LED'in optik gücü 5 W'tan düşük olmalıdır. Bu güç sınırlaması, ışık kaynağı kısmında bulunan yönlendirme merceğinin ve ışık dağıtıcı kısmında bulunan fiber optik demetinin izin verilen gücü tarafından uygulanır.

figure-discussion-1
Şekil 6: Rose Bengal'in sudaki absorpsiyon spektrumu. Rose Bengal'in sudaki maksimum normalleştirilmiş absorpsiyon spektrumu sol eksene göre çizilir ve CELL-LED-550/3'ün ortalama spektral ışınımı sağ eksene göre ölçeklendirilir. Ortalama spektral ışınımın profili, üreticinin web sitesinde bulunan LED'in profili ile tutarlıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Cihazın iki parçası arasındaki optik bağlantı kritik bir faktördür. Bu bağlantı, bir yandan 3 W LED'in yaydığı ışığın maksimumunu dar bir ışında toplamayı, diğer yandan bu ışını fiber optik demete enjekte etmeyi amaçlamaktadır. İlk amaçla ilgili olarak, PCB (Baskılı Devre Kartı) monteli LED için özel olarak tasarlanmış, kısa odak uzaklığına sahip küresel olmayan bir yönlendirme merceği, 120 derecelik LED ışınının uzamsal olarak düzgün dağılıma sahip 10 derecelik dar bir ışın halinde yoğunlaşmasına olanak tanır. Üstelik ortaya çıkan ışın, ilk ışınla elde edilenlere kıyasla daha fazla netlik ve azaltılmış optik sapmalar sergileyen kare LED çipinin görüntülerini yansıtıyor. Bu dar ışının fiber optik demetine enjeksiyonu ile ilgili olarak dört önemli noktanın ele alınması gerekir. İlk olarak, 96 adet 0,5 mm çaplı PMMA (polimetil metakrilat) optik fiberlerin proksimal uçları (sayısal açıklık: 0,2), 5 mm'lik kenarların kare ışık alıcı yüzeyini oluşturacak şekilde ev yapımı bir konektör halinde bir araya getirilir (Şekil 7). Işık kaybını sınırlamak için konektör için normal yuvarlak olana göre, LED çipinin ışın tarafından kare çıkıntılarına uygun bir kare şekli tercih edildi. İkincisi, ev yapımı konektör hem yapıştırıcı gerektirmeyecek şekilde tasarlandı hem de ışık emilimini sınırlamak ve böylece malzemenin aşırı ısınmasını/karbonizasyonunu önlemek için kristal berraklığında bir reçine kullanılarak 3D olarak basıldı. Üçüncüsü, ışığı alan yüzey ve konektörün son yüzeyi, maksimum ışığın içlerinden geçmesi için bir parlatma tekerleği kullanılarak parlatıldı. Dördüncü ve son olarak, mercek ile kare ışık alıcı yüzey arasındaki mesafe teorik olarak belirlendi ve daha sonra kare LED projeksiyonunun en homojen orta kısmı, ışığı alan yüzeyden biraz daha fazla örtüşecek şekilde optik bir tezgah üzerinde ayarlandı.

Böyle bir bağlantı ile 10 derecelik dar ışın için 1,25 W'lık bir güç elde edilirken, 96 optik fiber demeti tarafından iletilen toplam güç 0,12 W'tır (LED ışığa uygun bir fotodiyot sensörü (OPHIR) kullanılmıştır).

figure-discussion-2
Şekil 7: 96 optik fiberin ev yapımı bir konektörde bir araya getirilmesiyle elde edilen kare ışık alıcı yüzey. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

CELL-LED-550/3, kuyuların alt dış yüzeyinde ortalama 0,62 mW/cm2 (standart sapma: 0,09 mW/cm2) (Şekil 8) ışınım sağlar. Yukarıda belirtilen kuplaj verimliliğini hesaba katan bu ortalama değer, Lefebvre ve ark.30'da ayrıntılı olarak açıklanan metodolojilere göre zaman içinde stabil olduğu tahmin edilmiş ve kanıtlanmıştır (%0,6'dan düşük varyasyon katsayısı). Bu kadar düşük bir ışınımla (yukarıda tartışılan 96 oyuklu plaka aydınlatması için özel olarak tasarlanmış diğer LED tabanlı sistemler tarafından sağlananlardan daha düşük), tek başına aydınlatmanın HepG2 hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmadığı kanıtlanırken, RB aracılı PDT için çok yüksek bir verime ulaşılmıştır. Verimliliği sağlamak için daha yüksek ışınımlar gerektiren PDT protokolleri için, birden fazla LED kullanılabilir ve bu nedenle, her bir optik fibere enjekte edilen ışık gücünün birkaç düzine miliwatt'lık izin verilen gücü aşmaması koşuluyla, birden fazla ışık kaynağı parçası uygulanabilir.

figure-discussion-3
Şekil 8: Bir plakanın 96 kuyusuna iletilen ışınımların dağılımını temsil eden histogram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Sadece ışık kaynağı kısmındaki LED'in uygun bir LED'le değiştirilmesi, başka bir CELL-LED cihazının elde edilmesini mümkün kılar. Bir LED, görünür aralıkta (fiber optik demetinin özelliklerine göre) 5 W'tan daha düşük bir optik güç yayıyorsa (yukarıda belirtilen nedenlerle) uygun kabul edilecektir. Bu tür LED'lerin önemli bir kısmı mevcut olduğundan, çok çeşitli CELL-LED cihazları geliştirilebilir ve böylece birçok PDT protokolü in vitro olarak değerlendirilebilir. Bir PDT protokolü verildiğinde, tüm uygun LED'ler arasında, dikkate alınan ışığa duyarlılaştırıcının absorpsiyon spektrumu ile en iyi örtüşmeyi sağlayan LED'in açıkça tercih edilmesi gerekir. LED'in değişmesi durumunda, fan ısı emici tertibatına özellikle dikkat edilmelidir. Aslında, bu düzenek, hem LED'in hem de sürücünün aşırı ısınmasını ve ardından bozulmasını önlemek için uygun boyutta olmalıdır. Ayrıca, herhangi bir LED değişikliği için yeni bir optik ve termal karakterizasyon gerekecektir.

Hem tek bir LED'in basit bir şekilde değiştirilmesiyle çoğu ışığa duyarlılaştırıcıyı ışıkla etkinleştirme olasılığı hem de bir inkübatör içindeki hücreleri aydınlatma olasılığı, mevcut cihazlara kıyasla bu cihaza gerçek bir katma değer sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, çalışmamıza verdikleri destek için Fransa'nın Lille Merkez Hastanesi'ne ve INSERM'e teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
550  nm 3  Baskılı devre kartına monte edilmiş W LED OSRAMOSTAR KP CSLPM1. F1
75 cm2 Kültür hücre şişesiSarstedt3911002
100 plastik fiber optik paketi (0,5 mm çap)ARCENCIEL LEDelyaf05egmGlow End PMMA 0,5 dia - Lng  200 m        http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Hücre sayacıTermo FisherAMQAF2000İsteğe bağlı, mikroskop altında sayabilirsiniz
Hücre Kültürü inkübatörüPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Hücre Titresi GloPromegaG7571 Serisi
PMMA yönlendirme lensini temizleyinGlecc mağazası14mm Lens 10°Aliexpress - 14 mm destekli DEL yönlendirme lensi
Colorfab Ngen SiyahRenkli Fabrika  SKU 020014FDA gıda ile temas uyumluluğu
Colorfab Ngen BeyazRenkli Fabrika  SKU 020013FDA gıda ile temas uyumluluğu
Üç modlu karartmalı mevcut sürücü (CDM Sürücüsü)CDM SürücüsüBD39 Serisi2200 mA
Epoksi reçine Clé opatreCrystal'DiamondCristal Elmas 150 mL
Fan ısı emici tertibatıBOYD
HepG2 hücreleriATCCHB-8065 Serisi
Çok Modlu Okuyucu (CLARIOstar Plus)BMG Laboratuvar Teknolojisi430-2927
Fosfat Tampon çözeltisiTermo Fisher20012-068
PMMA (polimetil metakrilat) optik fiberler (sayısal açıklık: 0,2)Guangzhou Mayki Aydınlatma Limited Şirketi
Güç girişiRSpro907-5680
RMPI 1640Termo Fisher21875-091
Rocker anahtarı RSpro419-744
Gül BengalceThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Çizilmez mylar levhaRSproRS: 785-0802
KılıfAUPROTECTØ 8,5 mm / Ø harici 11 mmPP Polipropilè ne UV ışınlarına dayanıklı siyah oluklu kılıf bölünmemiş
SVFEurobioCVF SVF00-01
Aydınger kağıdıCanson79368730
Şeffaf PMMA plakasıRSproRS: 284-6269
Tripan mavisiTermo Fisher15250061
TripsinTermo Fisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
Beyaz Şeffaf Alt 96 Kuyucuklu PlakaDutscher655098

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Photodynamic TherapyRose BengalLED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

İlgili makaleler