Canlı Hücrelerde G Proteinine Bağlı Reseptör Aktivitesini Ölçmek için BRET Tabanlı G Protein Biyosensörleri

G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), hücre dışı uyaranları, spesifik biyolojik tepkilerle sonuçlanan hücre içi sinyal kaskadlarına dönüştürmekten sorumlu olan transmembran reseptörlerinin en büyük süper ailesini temsil eder. Bunlar, pazarlanan ilaçların yaklaşık %30'unun GPCR'lere etki ettiği önemli farmakolojik hedeflerdir¹. GPCR ligand bağlanması, reseptörde konformasyonel değişiklikleri indükleyerek heterotrimerik G proteinleri ve/veya GPCR kinazlar (GRK'ler) ve β-tutuklamalar ile etkileşimleri kolaylaştırır, böylece aşağı akış sinyalleşmesini veya reseptör içselleştirmesini başlatır².

Heterotrimerik G proteinleri, GPCR sinyallemesinin birincil hücre içi dönüştürücüleri olarak görev yapar ve üç alt birimden oluşur: G_α, G_β ve G_γ. Bu heterotrimerler, G_α alt tipine dayalı olarak dört aileye ayrılır - G_i/o, G_s, G_q ve G_12/13 - her biri farklı sinyal yollarını aktive eder: G_i/o alt tipi adenilat siklazı inhibe ederken G_s onu uyarır, G_q fosfolipaz C-β'i aktive eder ve G_12/13 Rho ailesi GTPazlarını düzenler.

GPCR aktivasyonu, konformasyonel yeniden düzenlemelerine yol açarak, saniyenin altındaki kinetik içinde hızlı G proteini etkileşimini mümkün kılar. Bu süreç, G proteini konformasyonel değişikliklerini indükleyerek G_α alt biriminde GDP-GTP değişimini teşvik eder. GTP bağlanması ayrıca G_α alt birim konformasyonunu değiştirerek G_βγ dimerinden ayrılmasına neden olarak sinyal yayılımına izin verir. Bu nedenle G proteinleri, adenilat siklaz veya iyon kanalları ^3,4,5 gibi çeşitli efektör proteinleri düzenleyerek hücresel yanıtların özgüllüğünü ve zamansal dinamiklerini modüle etmede çok önemlidir.

Bu protokol, canlı hücrelerde GPCR ligand stimülasyonu üzerine biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı biyosensörler kullanılarak G proteini aktivasyonunun veya inaktivasyonunun ölçümünü özetlemektedir. G protein biyosensörleri ^6,7,8,9 üzerindeki öncü çalışmalardan esinlenen Schihada ve ^ark.10 tarafından tanıtılan G-CASE (G protein tri-sistronik aktivite sensörleri) sistemi, etiketli G_α ve G_βγ alt birimleri arasındaki BRET'e dayanmaktadır ve yalnızca tek bir plazmit transfeksiyonu gerektiren modern bir yaklaşım sunar. Bu özellik, heterotrimerik G proteininin üç alt birimini (G_α, G_β ve G_γ) kodlayan çoklu plazmitlerin birlikte transfeksiyonu ile ilgili duyarlılığı arttırır ve zorlukları azaltır. Bu sensörler ticari olarak akademik araştırma gruplarının kullanımına sunulmuştur (bkz.

BRET, Förster Rezonans Enerji Transferi'ne (FRET) göre önemli avantajlar sunar. BRET'te enerji transferi, harici ışık kaynaklarına ihtiyaç duymadan biyolüminesans verici ile floresan alıcı arasında gerçekleşir. Bu içsel biyolüminesans, otofloresan ve ışık saçılımı gibi FRET ile ilişkili sorunları azaltır, bu da daha düşük bir arka plan sinyali ve gelişmiş tahlil hassasiyeti ^6,7,11 ile sonuçlanır.

BRET'te bu harici uyarılmanın olmaması, ışıkla ağartma ve fototoksik etkileri en aza indirerek FRET'e kıyasla daha düşük arka plan sinyallerine yol açar. Sonuç olarak, BRET tahlilleri çoğunlukla gelişmiş hassasiyet sergiler ve yapısal olarak aktif GPCR'lerin G protein aktivasyonunun ölçülmesine izin verir. BRET testlerinin gelişmiş hassasiyeti, reseptör aktivitesinin hassas ölçümünün çok önemli olduğu farmakolojik çalışmalarda özellikle değerli olan ince biyolojik etkileşimlerin saptanmasını kolaylaştırır.

Bu biyosensörler, yakın zamanda Scott-Dennis ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, 96 oyuklu veya 384 oyuklu plakalarda yüksek verimli taramaya çevrilebilir, burada bu biyosensörleri kullanan bir yöntem, kannabinoid reseptörleri CB1R ve CB2R12'nin aktivitesini analiz etmek için membran bazlı 384 oyuklu bir tahlilde geliştirilmiştir. Bu makale, β'nın aktivitesini ölçerek bu biyosensörlerin canlı hücrelerde 96 oyuklu plakalarda kullanımını açıklamaktadır.2-AR, G_{s proteinini} ve CB1R'yi bağlayan A sınıfı prototipik GPCR olarak-A GPCR'lere aittir ve G_i/o ailesi proteinini aktive eder. İki G-CASE biyosensörünün kullanımı doğrulanmıştır: GPCR ile HEK 293T hücrelerinde G_s ve G_i3 ya geçici olarak (β ile2-AR) ya da stabil olarak eksprese edilir (CB1R ile).

Bu deneyin çeşitli hücre dizilerinde gerçekleştirilebileceğini ve bu tekniğin çeşitli hücresel bağlamlarda çok yönlülüğünü ve sağlamlığını gösterdiğini belirtmek önemlidir. Bu, yöntemin çeşitli deneysel modellere uygulanabilmesini sağlar ve bu da onu farklı fizyolojik ve farmakolojik ortamlarda GPCR sinyalini incelemek için değerli bir araç haline getirir. Şekil 1 , BRET tabanlı G protein aktivite sensörlerinin prensibini göstermektedir.

Şekil 1: BRET tabanlı G protein aktivite sensörlerinin prensibi. G protein sensörleri üç alt birimden oluşur: G_α, doğal G_β ve G_γ. G_α alt birimi, küçük ve parlak NanoLuciferaz (Nluc) ile kaynaşırken, G_γ alt birimi, dairesel olarak permütasyonlu Venüs (cpVenus¹⁷³) ile N-terminal olarak etiketlenmiştir. Bu tasarlanmış G proteini alt birimlerini kodlayan genler, tek bir plazmitte birleştirilir. GPCR'lere ligand bağlanması, GPCR konformasyonel değişikliklerini indükler, G proteini alımını ve ardından ayrışmayı ve ardından GTP hidrolizini teşvik eder. Bu ayrışma, ortaklar arasındaki enerji transferini bozarak BRET sinyalinde bir azalmaya neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kuyu plakası tohumlama (1.

NOT: Steril koşulları korumak için steril bir laminer akış başlığındaki tüm hücre kültürü protokollerini izleyin. Şeffaf düz tabanlı beyaz kuyucuklu plakalar, hücre büyümesini ve canlılığını takip etmek için kullanılır. Adım 3.2.1'de çıkartma kullanmaktan kaçınmak için tam beyaz kuyucuk plakasını kullanın.

1. Kuyu plakası kaplaması
   NOT: Bu adımı atlamak için önceden kaplanmış plakalar kullanılabilir.
   1. Çok kanallı bir rezervuara yaklaşık 6 mL steril filtrelenmiş Poli-L-lizin (PLL) çözeltisi (%0.01) dökün. Çok kanallı bir pipetle, 96 beyaz oyuklu bir mikroplakanın her bir kuyucuğunu 60 μL PLL ile doldurun.
   2. Mikroplakayı karanlık bir yere koyun ve 20 dakika inkübe edin.
   3. İnkübasyon sırasında, 1.2.1-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi hücrelerin hazırlanmasına devam edin.
   4. PLL çözeltisini çok kanallı pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir tüpte 4 °C'de saklayın.
   5. Hücre bozulmasına neden olabilecek serbest PLL'yi çıkarmak için plakayı DPBS ile üç kez yıkayın.
2. Hücre hazırlama ve kaplama
   1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamındaki HEK293 hücrelerini, %5 CO 2 içinde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş olarak_{kültürleyin.}
      NOT: FBS, uygun hücre canlılığı için gerekli besinleri ve büyüme faktörlerini sağlamak için kültür ortamına eklenir.
   2. Ortamı çıkarın ve hücreleri 2 mL DPBS ile durulayın.
   3. 0.5 mL tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
   4. Tripsini nötralize etmek için şişeye 4.5 mL DMEM ekleyin, ardından hücreleri ayırmak ve yeniden süspanse etmek için tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.
   5. Ayrılan hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1000 x g'da (oda sıcaklığında, RT) 5 dakika santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı çıkarın ve peleti 2 mL DMEM'de yeniden süspanse edin.
   7. Hücreleri bir Malassez sayım odası ile sayın ve 300.000 hücre / mL'de 9 mL hazırlayın. Bunları çok kanallı bir rezervuara koyun ve çok kanallı pipetle (30.000 hücre/kuyu nihai yoğunluğu) kuyucuk başına 100 μL dökerek 96 oyuklu mikroplakayı tohumlayın.
   8. Mikroplakayı à 37 °C,% 5 CO₂ yaklaşık 24 saat inkübe edin.
      NOT: Etkili bir transfeksiyon için hücreler yaklaşık% 70-80 birleşmeye ulaşmalıdır.

2. Plazmit transfeksiyonu (2.

NOT: Hücre transfeksiyonu, kaplamadan önce askıya alınmış hücreler üzerinde birinci günde, adım 1.2.7 sırasında ve 3. günde veri toplama sırasında gerçekleştirilebilir.

1. İstenen plazmit DNA'nın 10 μg'ını seyreltin (örneğin, 5 μg β2-adrenerjik reseptör ve 5 μg G_s (kısa)-CASE HEK wt hücrelerinde veya sadece 10 μg G_i3-CASE HEK CB1 hücrelerinde) ve 20 μL Lipofektamin 500 μL Opti-MEM ortamı içeren tüplerde. RT'de 5 dakika inkübe edin.
   1. Negatif bir kontrol için, β2-adrenerjik reseptörü aynı konsantrasyonda boş plazmit pcDNA 3.1 ile değiştirin. Çözeltileri bir tüpte birleştirin ve bir transfeksiyon karışımı (1 mL) elde etmek için karıştırın.
2. Transfeksiyon karışımını RT'de 20 dakika inkübe edin.
3. Adım 2.2'den itibaren her bir oyuğa damla damla 10 μL transfeksiyon karışımı ekleyin ve tam karışmayı sağlamak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın.
   NOT: Kuyu başına 100 ng DNA'lık nihai bir konsantrasyon elde edilir.
4. Mikroplakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C, %5_CO2'de 24 saat inkübe edin.

3. Veri toplama (3.

1. Ligand hazırlama
   NOT: Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) tamponu: NaCl 140 mM, Potasyum Klorür 5 mM, Kalsiyum Klorür 1 mM, Magnezyum Sülfat Heptahidrat 0.4 mM, Magnezyum Klorür Heksahidrat 0.5 mM, Sodyum Fosfat Dibazik Dihidrat 0.3 mM, Potasyum Fosfat Monobazik 0.4 mM, D-Glikoz (Dekstroz) 6 mM, Sodyum bikarbonat 4 mM, pH 7.4, filtrelenmiş 0.22 μm.
   1. Farklı ligandlar için uygun çözündürme çözücüsünde mümkün olan en yüksek konsantrasyonda bir stok çözeltisi hazırlayın (bu protokolde, izoproterenol H₂0 mQ ve WIN-55.212-2 DMSO içinde hazırlanır).
      NOT: Ligand stok çözeltisinin konsantrasyonunun, ligandın çözünürlüğüne ve bilinen ayrışma sabitine (K_d) bağlı olarak ayarlanması gerekir.
   2. Bu stoktan, uygun çözündürme çözücüsü içinde ligandın K_d değeri etrafında 10 μL'lik bir ligand seri seyreltme hazırlayın. Bu seri seyreltmeyi -20 °C'de saklayın.
      NOT: Liganda bağlı olarak, seri seyreltme aralığı, bozunma meydana gelmeden önce on defaya kadar dondurulabilir ve çözülebilir. Bir araç koşulunu (bu protokolde, H₂0 veya DMSO) içerecek şekilde yalnızca ligand çözünmesi için kullanılan çözücüyü içeren bir çözelti hazırlayın.
   3. Her ligand konsantrasyonu ve araç için, toplam 130 μL hacme her konsantrasyondan 1,3 μL ekleyerek HBSS'de 1/100 seyreltme gerçekleştirin. Bu, HBSS'de %1'lik bir nihai araç konsantrasyonu ile sonuçlanır.
      NOT: Bu son seyreltme aralığı, kuyu başına 100 μL toplam hacim elde etmek için 10 μL eklenerek deneyler için kullanılan aralıktır. Bu, tüm kuyularda %0,1'lik bir nihai araç konsantrasyonu ile sonuçlanır. 130 μL hacim, 96 oyuklu bir plakanın bir sırasını doldurmak için gereken miktara karşılık gelir: (10 x 12) ± %10. Her sıra farklı bir ligand konsantrasyonuna karşılık gelir ve son sıra araç kontrolü görevi görür.
   4. Stok çözeltisinden 980 μL Furimazine 1/100 seyreltme hazırlayın (toplam 980 μL hacim elde etmek için 970.2 μL HBSS içinde 9.8 μL).
      NOT: Taze bir furimazin çözeltisi hazırlayın ve en az 3 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, satın almadan hemen önce ekleyin. Sinyalin oda sıcaklığında yaklaşık 120 dakikalık bir yarı ömrü olduğu için çok erken hazırlanmamalıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için vivazin ve endurazin gibi uzun etkili furimazin türevleri kullanılabilir. Bu alt tabakalar, 48 saate kadar sabit bir BRET sinyali tutar.
2. Plaka okumaları
   NOT: Çok modlu bir plaka okuyucu kullanın. Ölçümü çalışılan koşullara ve tekrar sayısına göre ayarlayın. Burada veri toplama, 32 kuyuya karşılık gelen 4 sütundan oluşan üç okumaya bölünmüştür. Tüm okumalar, tampon buharlaşmasını önlemek için şeffaf kapaklı üst optiklerle yapılır. Tüm okumalardan önce ölçüm kazancını ayarlayın. Bu çalışmada kazanç 3600 olarak sabitlenmiştir. Birçok plaka okuyucuda bulunan otomatik bir enjektör veya şırınga sistemi kullanarak manuel ligand ilavesinden kaçınmak mümkündür.
   1. Ortamı 96 oyuklu plakanın ilk 4 sütunundan çıkarın. Her bir kuyucuğu 100 μL HBSS ile durulayın ve 80 μL HBSS ekleyin. Plakanın alt tarafına beyaz bir çıkartma yapıştırın. Bu, floresan ve/veya biyolüminesans ölçümlerini iyileştirir.
   2. G proteini lüminesans spektrumlarının kaydedilmesi: 96 oyuklu plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. ^535/30 nm monokromatör kullanarak cpVenus 173 emisyonunu kaydedin ve 2 nm çözünürlükle 500 ile 600 nm arasındaki lüminesans emisyonunu ölçün.
      NOT: Bu kayıt, cpVenus¹⁷³ uyarımı üzerine floresan yayılmasını sağlamak için bir kontroldür.
   3. G proteini lüminesans spektrumlarının kaydedilmesi: 450/40 nm monokromatör kullanarak Nluc emisyon yoğunluğunu kaydedin ve 400 nm ile 600 nm arasındaki lüminesans emisyonunu 5 nm çözünürlükle ölçün.
      NOT: Bu kayıt, Nluc substratı, furimazin ilavesinden önce biyolüminesans yayılmamasını sağlamak için bir kontroldür.
   4. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet yardımıyla her bir oyuğa önceden hazırlanmış furimazin çözeltisinden (adım 3.1.4.) 10 μL ekleyin.
   5. Adım 3.2.3'ü tekrarlayın.
      NOT: Bu kayıt, furimazin ilavesi üzerine biyolüminesansın yayılmasını sağlamak için bir kontroldür. Furimazin tüketimi ve/veya bozulması nedeniyle sinyal değişimini önlemek için bu ölçümden sonra doğrudan adım 3.2.6 ile devam edin. BRET sinyal varyasyonu, furimazin tüketimi ve/veya bozulması ve agonist stimülasyonunun neden olduğu yanıtı sonlandırmak için meydana gelen düzenleyici süreçler nedeniyle meydana gelebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, GRK inhibitörleri (CMPD101) ve içselleştirme inhibitörleri (dynasore) veya GRK'lardan veya tutuklamalardan yoksun gen düzenlemeli hücreler kullanılabilir.
   6. G proteini bazal BRET'in kaydı: GPCR ligandını eklemeden önce, sırasıyla 450/40-nm ve 535/30-nm monokromatör kullanarak Nluc ve cpVenus 173 emisyon yoğunluğunu kaydedin. 0,30 s'lik bir ölçüm aralığı süresiyle (toplam okuma süresi 3 dakika) 60 sn'lik 3 döngü ölçün.
      NOT: Ölçüm aralığı süresinin 0,90 sn'ye yükseltilmesi genellikle sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde iyileştirir ancak çok daha uzun bir okuma süresi sağlar. Deneyci, uygulamaları için daha yüksek zamansal çözünürlüğün mü yoksa geliştirilmiş sinyal-gürültü oranının mı daha önemli olduğuna karar vermelidir.
   7. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet yardımıyla bir sütunun her bir kuyucuğuna sırasıyla GPCR ligandının önceden hazırlanmış seyreltme aralığından (adım 3.1) 10 μL ekleyin. Diğer 3 sütun için aynı prosedürü izleyin.
   8. G protein ligandının neden olduğu BRET'in kaydı: Sırasıyla 450/40 nm ve 535/30 nm monokromatör kullanarak Nluc ve cpVenus 173 emisyon yoğunluğunu kaydedin. 0,30 sn'lik bir ölçüm aralığı süresiyle (toplam okuma süresi 16 dakika) 60 sn'lik 16 döngü ölçün.
      NOT: Sütunlardaki kuyuları ölçmek için ölçüm parametrelerini ayarlayın. Kopyalar 2,4 sn'lik bir zaman farkıyla okunur.
   9. Adım 3.2'yi tekrarlayın. sonraki dört sütun için 2 kez.

4. Veri analizi

NOT: Her okumanın verilerini ayrı veri elektronik tablo dosyalarında toplayın.

1. Kontrol okumaları
   1. Dalga boyuna karşı emisyon yoğunluğunu çizin.
2. Bazal BRET okumaları
   1. Her kuyu için, üç okumanın BRET oranını hesaplayın. BRET oranı, alıcı emisyonu/verici emisyonu olarak tanımlanır.
      
   2. Her kuyucuk için, ligand ilavesinden önceki üç BRET oranının ortalamasını hesaplayın. Bu değere ligand stimülasyonundan önceki bazal BRET oranı denir: Oran_bazal.
   3. Tüm kuyuların önceki BRET oranlarını normalleştirmek için, üç ölçümün her biri için sırasıyla araç kontrol kuyularından hesaplanan BRET oranı değerini, ilgili ölçüm zamanındaki BRET oranından çıkarın.
      NOT: Analiz edilen veriler, ligand ilavesinden önceki zaman noktalarına karşılık gelir. Ligandın eklendiği kuyular bilindiğinden, araç kontrol kuyuları buna göre tanımlanabilir.
3. G proteini ligandının neden olduğu BRET okumaları
   1. Her kuyucuk için, bölüm 4.2.1'de açıklandığı gibi her okumanın BRET oranını hesaplayın. Bu değerlere Oran_uyarımı denir.
   2. Ligand kaynaklı değişiklikleri ölçmek için, her bir kuyunun her bir Oran_uyarımı için ΔBRET'i bazal üzerinde bir yüzde olarak hesaplayın. Bunun için, daha önce bölüm 4.2.2'de hesaplanan ilgili_{Oran bazalını} kullanın.
      
   3. Her kuyucuğun ΔBRET değerlerini normalleştirmek için ΔBRET(%) değerini hesaplayın. Bunun için aracın ilgili ΔBRET değerlerini çıkarın.
   4. ΔBRET kinetiğini bir veri tablosunda görselleştirmek için, adım 4.2.3'te normalleştirilen üç bazal BRET okumasını ekleyin. bölüm 4.3.3'te her kuyu için hesaplanan karşılık gelen ΔBRET(%) değerlerinin önünde.
   5. Kinetik bir grafik elde etmek için önceki verileri okuma zamanına göre çizin.
   6. Bir platoya ulaşıldığında, seçilen bir zamanda ΔBRET(%) değerlerini alın ve her kuyu farklı bir ligand konsantrasyonuna karşılık geldiğinden, bunları kullanılan ligandın konsantrasyonuna göre çizin. Bir doz-yanıt eğrisi elde edilir.
      NOT: Platoya genellikle ligand stimülasyonundan yaklaşık 5 dakika sonra ulaşılır. Bu protokolde 15 dakikalık ligand stimülasyonundan sonra elde edilen değerler çizilir. Farklı deneylerden elde edilen verileri karşılaştırmak için, aktivasyonun kinetiğine bağlı olarak süreyi ayarlayın.
   7. Önceki verileri analiz yazılımında çizin ve aşağıdaki denkleme dayalı olarak sigmoidal doz-yanıt üç parametreli uyum kullanarak sığdırın:
      
      burada X, kullanılan ligandın konsantrasyonu, Y, ΔBRET(%) değerleri, Üst ve Alt platoları temsil eder ve EC₅₀ , maksimum etkinin %50'sine ulaşmak için gereken ligand konsantrasyonudur. Bu, E_max ve EC_50'nin elde edilmesini sağlar.
   8. Parametrik olmayan bir Mann-Whitney testi kullanarak kontrol koşulundan elde edilen verileri karşılaştırın. Sonuçlar p < 0.05'te anlamlı kabul edilir.

Şekil 2: BRET testini gerçekleştirmek için temel adımlar. Bu protokolde özetlenen üç ana deneysel adıma (hücre tohumlama, hücre transfeksiyonu ve BRET sinyal edinimi) genel bakış ve veri toplama için ayrıntılı adım adım kılavuz. Deney düzeneği: 1. günde, hücreler, 30.000 hücre/kuyu yoğunluğunda düz, berrak bir tabana sahip PLL önceden kaplanmış beyaz 96 oyuklu bir plakaya ekilir. 2. günde hücreler, incelenen GPCR veya pcDNA3.1 plazmitleri ile birlikte seçilen G protein sensörü ile transfekte edilir. 24 saatlik inkübasyondan sonra, G protein sensörü aktivitesi, ligand ilavesi üzerine biyolüminesans ve floresan okumaları yoluyla ölçülür. Veri toplama: Hücrelerin HBSS yıkamasından sonra kuyucuklara 80 μL HBSS eklenir ve cpVenus¹⁷³ floresan emisyonu 535/30 nm monokromatör kullanılarak 500 nm ile 600 nm arasında ölçülür (1). Daha sonra, Nluc biyolüminesansı, furimazin ilavesinden önce (2) ve sonra (3) 450/40 nm'lik bir monokromatör kullanılarak 400 nm ile 600 nm arasında ölçülür. Son olarak, bazal ve ligand kaynaklı G protein aktivitesi için BRET sinyali, sırasıyla 450/40-nm ve 535/30-nm monokromatörler kullanılarak 3 dakika (0.30 sn ölçüm aralığı ile 60 sn'lik 3 döngü) (4) ve 16 dakika (0.30 s'lik bir ölçüm aralığı ile 60 s'lik 16 döngü) (5) kullanılarak ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Deney düzeneği ve yürütmenin genelleştirilmiş bir şeması Şekil 2'de detaylandırılmıştır. İki GPCR'nin ligand aktivasyonunu takiben Gs veya Gi/o ailesi proteinlerinin aktivasyonu, G-CASE biyosensörleri kullanılarak değerlendirildi. İlk olarak, prototipik bir A GPCR ailesi incelendi, β2-AR, HEK 293T hücrelerinde geçici olarak transfekte edildi. β'yı eksprese eden HEK wt hücrelerine bir agonist (yani izoproterenol) uygulandığında2-AR Gs(kısa)-CASE protein sensörü ile birlikte, BRET sinyalinde konsantrasyona bağlı bir azalma gözlendi, bu da Gs proteininin aktivasyonunu gösterdi (Şekil 3B). ΔBRET değerleri, doygunluğa ulaşılana kadar ligand konsantrasyonu üzerine azaldı ve ligand stimülasyonundan yaklaşık 5 dakika sonra bir plato gözlendi. Buna karşılık, boş pcDNA3.1 plazmidi ve Gs(kısa)-CASE protein sensörü ile transfekte edilen HEK wt hücreleri, izoproterenol stimülasyonuna ters fakat düşük ve anlamlı olmayan bir yanıt sergiledi (Şekil 3B). Bu protokolde, 15 dakikalık ligand stimülasyonundan sonra elde edilen değerler çizilir. Sonuçların tutarlılığını ve zaman seçiminden bağımsızlığını sağlamak için, dengeye ulaşıldığından emin olunarak diğer zaman noktaları test edilmelidir. Ek olarak, farklı deneylerdeki sonuçları karşılaştırmak için zaman seçimi, her deneyin aktivasyon kinetiğine göre ayarlanmalıdır.

Şekil 3C'de gösterilen sigmoidal doz-yanıt eğrilerini oluşturmak için, stimülasyondan 15 dakika sonra (plato stabilize edildiğinde) ölçülen ΔBRET değerleri, farklı ligand konsantrasyonlarına karşı çizildi. Gözlenen EC50 (9.4 nM ± 2.1 nM), reseptörün izoproterenol için bilinen Kd (13 nM ± 6 nM)13,14 aralığındadır (Şekil 3C, D). Bu sonuçlar, G-CASE sensörlerinin, özellikle β2-AR'nin varlığıyla ilişkili gözlemlenen bir yanıtla G protein aktivasyonunu değerlendirmedeki etkinliğini göstermektedir.

Şekil 3: HEK wt hücrelerinde Gs protein sensörünün değerlendirilmesi. Gs protein sensörü ve β2-AR (A) veya pcDNA3.1 (B) ile transfekte edilmiş HEK wt hücrelerine agonist izoproterenol eklenmesi üzerine kinetik ΔBRET okumaları. (C) Değişen ligand konsantrasyonlarında 15 dakikalık ligand stimülasyonundan sonra ΔBRET (%) değerlerinin takılmasıyla elde edilen doz-yanıt eğrileri. (D) Kontrol pcDNA3.1 ve β2-AR transfekte edilmiş izoproterenol ile uyarılmış hücreler arasındaki ΔBRET maksimum değerlerin karşılaştırılması. pcDNA3.1 koşuluna istatistiksel fark, parametrik olmayan bir Mann-Whitney testi kullanılarak test edildi (**p < 0.01). Veriler, iki kopya halinde gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İkinci olarak, biyosensörler, CB1R'yi kararlı bir şekilde eksprese eden bir HEK 293T hücre dizisi olan HEK CB1 hücrelerinde test edildi. Bu hücreler, Gi3-CASE protein sensörü ile geçici olarak transfekte edildi. CB1R agonisti WIN-55,212-2 ile stimülasyon, Gi3 yolunun aktivasyonunu gösteren konsantrasyona bağlı bir ΔBRET sinyalini indükledi (Şekil 4A). Buna karşılık, Gi3-CASE protein sensörü ile transfekte edilen ve aynı koşullar altında uyarılan HEK wt hücreleri, CB1R aktivasyonunun özgüllüğünü doğrulayan herhangi bir yanıt göstermedi (Şekil 4B). Ligand aktivasyonundan yaklaşık 5 dakika sonra bir platoya ulaşıldı. Karşılık gelen doz-yanıt eğrisi, HEK-CB1 hücrelerinde WIN-55.212-2 stimülasyonu tarafından indüklenen konsantrasyona bağlı ΔBRET yanıtını vurgularken, HEK wt hücrelerinde böyle bir yanıt gözlenmedi (Şekil 4C). Gözlenen EC50 (112 nM ± 25 nM), reseptörün WIN-55.212-2 (354 nM ± 62 nM)15 için bilinen EC50 aralık değerlerindedir (Şekil 4C, D). Son olarak, HEK CB1 ve HEK wt hücrelerinde 10 μM WIN-55.212-2 ile agonist stimülasyonu üzerine 15 dakika elde edilen ΔBRET değerlerinin karşılaştırılması, Gi3 sinyal yolunun CB1R'ye bağlı aktivasyonunu göstermektedir (Şekil 4D).

Şekil 4: HEK CB1 hücrelerinde Gi3 protein sensörünün değerlendirilmesi. Agonist WIN-55,212-2'nin HEK CB1 (A) veya HEK wt hücrelerine (B) eklenmesi üzerine kinetik ΔBRET okumaları. Ligand konsantrasyonuna (C) karşı 15 dakikalık ligand stimülasyonundan sonra ΔBRET (%) değerlerinin uydurulmasıyla elde edilen doz-yanıt eğrileri. WIN-55.212-2 (D) ile uyarılan kontrol HEK wt ve HEK CB1 hücreleri arasındaki ΔBRET maksimum değerlerin karşılaştırılması. HEK ağırlık koşuluna istatistiksel fark, parametrik olmayan bir Mann-Whitney testi (****p < 0.0001) kullanılarak test edildi. Veriler, iki kopya halinde gerçekleştirilen beş bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.