Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Canlı Hücrelerde G Proteinine Bağlı Reseptör Aktivitesini Ölçmek için BRET Tabanlı G Protein Biyosensörleri

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68463

⸱

7 Kasım 2025

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu protokol, G proteinine bağlı reseptör ligand stimülasyonu üzerine canlı HEK293 hücrelerinde G proteini aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümü için BRET tabanlı biyosensörlerin kullanımını açıklar. Burada, β2-adrenerjik reseptör ve kannabinoid tip 1 reseptörü, çeşitli G proteini alt tipleri ve çeşitli GPCR'ler için sensörlerin etkinliğini göstermek için örnek olarak hizmet eder.

Özet

G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), hücre dışı uyaranları hücre içi tepkilere dönüştürerek hücresel sinyalleşmede çok önemli bir rol oynayan, transmembran reseptörlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR aktivasyonu, heterotrimerik G proteinleri ile etkileşimleri mümkün kılan konformasyonel değişikliklere yol açar. Aktivasyon üzerine, Gα alt birimi, Gβγ dimerinden ayrılarak ve aşağı yöndeki sinyal basamaklarını tetikleyerek GDP-GTP değişimine uğrar. GPCR aracılı G proteini aktivasyonunu incelemek için, biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı biyosensörler oldukça hassas ve invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Schihada ve arkadaşları tarafından geliştirilen G proteini bazlı trisistronik aktivite sensörleri (G-CASE biyosensörleri), aktivasyon için bir vekil olarak heterotrimer ayrışmasını tespit eder ve tek bir plazmit transfeksiyonu kullanarak GPCR aktivitesinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayarak ko-transfeksiyon yaklaşımlarının sınırlamalarının üstesinden gelir. BRET testleri, floresan bazlı tekniklere göre daha düşük arka plan gürültüsü, azaltılmış ışıkla ağartma ve gelişmiş hassasiyet gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu protokolde, BRET tabanlı G-CASE biyosensörleri canlı hücrelerde ve 96 oyuklu plakalarda kullanıldı. Spesifik olarak, β2-adrenerjik reseptörün (β2-AR) ve kannabinoid tip 1 reseptörünün (CB1R) aktivitesini G proteini aktivasyonu açısından değerlendiriyoruz. β2-AR ile geçici olarak transfekte edilmiş HEK 293T vahşi tip hücreler ve CB2R'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücreleri kullanılarak, Gs ve Gi3 G-CASE biyosensörlerinin sağlamlığı doğrulanmıştır. Bu protokol, ligandların, örneğin önyargılı bir sinyalleme yoluyla spesifik yolları aktive etme yeteneğini daha iyi anlamak ve böylece yeni terapötik bileşiklerin keşfini kolaylaştırmak için farmakolojik çalışmalar ve yüksek verimli GPCR taraması için bu yaklaşımın faydasını desteklemektedir.

Giriş

G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), hücre dışı uyaranları, spesifik biyolojik tepkilerle sonuçlanan hücre içi sinyal kaskadlarına dönüştürmekten sorumlu olan transmembran reseptörlerinin en büyük süper ailesini temsil eder. Bunlar, pazarlanan ilaçların yaklaşık %30'unun GPCR'lere etki ettiği önemli farmakolojik hedeflerdir1. GPCR ligand bağlanması, reseptörde konformasyonel değişiklikleri indükleyerek heterotrimerik G proteinleri ve/veya GPCR kinazlar (GRK'ler) ve β-tutuklamalar ile etkileşimleri kolaylaştırır, böylece aşağı akış sinyalleşmesini veya reseptör içselleştirmesini başlatır2.

Heterotrimerik G proteinleri, GPCR sinyallemesinin birincil hücre içi dönüştürücüleri olarak görev yapar ve üç alt birimden oluşur: Gα, Gβ ve Gγ. Bu heterotrimerler, Gα alt tipine dayalı olarak dört aileye ayrılır - Gi/o, Gs, Gq ve G12/13 - her biri farklı sinyal yollarını aktive eder: Gi/o alt tipi adenilat siklazı inhibe ederken Gs onu uyarır, Gq fosfolipaz C-β'i aktive eder ve G12/13 Rho ailesi GTPazlarını düzenler.

GPCR aktivasyonu, konformasyonel yeniden düzenlemelerine yol açarak, saniyenin altındaki kinetik içinde hızlı G proteini etkileşimini mümkün kılar. Bu süreç, G proteini konformasyonel değişikliklerini indükleyerek Gα alt biriminde GDP-GTP değişimini teşvik eder. GTP bağlanması ayrıca Gα alt birim konformasyonunu değiştirerek Gβγ dimerinden ayrılmasına neden olarak sinyal yayılımına izin verir. Bu nedenle G proteinleri, adenilat siklaz veya iyon kanalları 3,4,5 gibi çeşitli efektör proteinleri düzenleyerek hücresel yanıtların özgüllüğünü ve zamansal dinamiklerini modüle etmede çok önemlidir.

Bu protokol, canlı hücrelerde GPCR ligand stimülasyonu üzerine biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı biyosensörler kullanılarak G proteini aktivasyonunun veya inaktivasyonunun ölçümünü özetlemektedir. G protein biyosensörleri 6,7,8,9 üzerindeki öncü çalışmalardan esinlenen Schihada ve ark.10 tarafından tanıtılan G-CASE (G protein tri-sistronik aktivite sensörleri) sistemi, etiketli Gα ve Gβγ alt birimleri arasındaki BRET'e dayanmaktadır ve yalnızca tek bir plazmit transfeksiyonu gerektiren modern bir yaklaşım sunar. Bu özellik, heterotrimerik G proteininin üç alt birimini (Gα, Gβ ve Gγ) kodlayan çoklu plazmitlerin birlikte transfeksiyonu ile ilgili duyarlılığı arttırır ve zorlukları azaltır. Bu sensörler ticari olarak akademik araştırma gruplarının kullanımına sunulmuştur (bkz.

BRET, Förster Rezonans Enerji Transferi'ne (FRET) göre önemli avantajlar sunar. BRET'te enerji transferi, harici ışık kaynaklarına ihtiyaç duymadan biyolüminesans verici ile floresan alıcı arasında gerçekleşir. Bu içsel biyolüminesans, otofloresan ve ışık saçılımı gibi FRET ile ilişkili sorunları azaltır, bu da daha düşük bir arka plan sinyali ve gelişmiş tahlil hassasiyeti 6,7,11 ile sonuçlanır.

BRET'te bu harici uyarılmanın olmaması, ışıkla ağartma ve fototoksik etkileri en aza indirerek FRET'e kıyasla daha düşük arka plan sinyallerine yol açar. Sonuç olarak, BRET tahlilleri çoğunlukla gelişmiş hassasiyet sergiler ve yapısal olarak aktif GPCR'lerin G protein aktivasyonunun ölçülmesine izin verir. BRET testlerinin gelişmiş hassasiyeti, reseptör aktivitesinin hassas ölçümünün çok önemli olduğu farmakolojik çalışmalarda özellikle değerli olan ince biyolojik etkileşimlerin saptanmasını kolaylaştırır.

Bu biyosensörler, yakın zamanda Scott-Dennis ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, 96 oyuklu veya 384 oyuklu plakalarda yüksek verimli taramaya çevrilebilir, burada bu biyosensörleri kullanan bir yöntem, kannabinoid reseptörleri CB1R ve CB2R12'nin aktivitesini analiz etmek için membran bazlı 384 oyuklu bir tahlilde geliştirilmiştir. Bu makale, β'nın aktivitesini ölçerek bu biyosensörlerin canlı hücrelerde 96 oyuklu plakalarda kullanımını açıklamaktadır.2-AR, Gs proteinini ve CB1R'yi bağlayan A sınıfı prototipik GPCR olarak-A GPCR'lere aittir ve Gi/o ailesi proteinini aktive eder. İki G-CASE biyosensörünün kullanımı doğrulanmıştır: GPCR ile HEK 293T hücrelerinde Gs ve Gi3 ya geçici olarak (β ile2-AR) ya da stabil olarak eksprese edilir (CB1R ile).

Bu deneyin çeşitli hücre dizilerinde gerçekleştirilebileceğini ve bu tekniğin çeşitli hücresel bağlamlarda çok yönlülüğünü ve sağlamlığını gösterdiğini belirtmek önemlidir. Bu, yöntemin çeşitli deneysel modellere uygulanabilmesini sağlar ve bu da onu farklı fizyolojik ve farmakolojik ortamlarda GPCR sinyalini incelemek için değerli bir araç haline getirir. Şekil 1 , BRET tabanlı G protein aktivite sensörlerinin prensibini göstermektedir.

figure-introduction-1
Şekil 1: BRET tabanlı G protein aktivite sensörlerinin prensibi. G protein sensörleri üç alt birimden oluşur: Gα, doğal Gβ ve Gγ. Gα alt birimi, küçük ve parlak NanoLuciferaz (Nluc) ile kaynaşırken, Gγ alt birimi, dairesel olarak permütasyonlu Venüs (cpVenus173) ile N-terminal olarak etiketlenmiştir. Bu tasarlanmış G proteini alt birimlerini kodlayan genler, tek bir plazmitte birleştirilir. GPCR'lere ligand bağlanması, GPCR konformasyonel değişikliklerini indükler, G proteini alımını ve ardından ayrışmayı ve ardından GTP hidrolizini teşvik eder. Bu ayrışma, ortaklar arasındaki enerji transferini bozarak BRET sinyalinde bir azalmaya neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kuyu plakası tohumlama (1.

NOT: Steril koşulları korumak için steril bir laminer akış başlığındaki tüm hücre kültürü protokollerini izleyin. Şeffaf düz tabanlı beyaz kuyucuklu plakalar, hücre büyümesini ve canlılığını takip etmek için kullanılır. Adım 3.2.1'de çıkartma kullanmaktan kaçınmak için tam beyaz kuyucuk plakasını kullanın.

  1. Kuyu plakası kaplaması
    NOT: Bu adımı atlamak için önceden kaplanmış plakalar kullanılabilir.
    1. Çok kanallı bir rezervuara yaklaşık 6 mL steril filtrelenmiş Poli-L-lizin (PLL) çözeltisi (%0.01) dökün. Çok kanallı bir pipetle, 96 beyaz oyuklu bir mikroplakanın her bir kuyucuğunu 60 μL PLL ile doldurun.
    2. Mikroplakayı karanlık bir yere koyun ve 20 dakika inkübe edin.
    3. İnkübasyon sırasında, 1.2.1-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi hücrelerin hazırlanmasına devam edin.
    4. PLL çözeltisini çok kanallı pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir tüpte 4 °C'de saklayın.
    5. Hücre bozulmasına neden olabilecek serbest PLL'yi çıkarmak için plakayı DPBS ile üç kez yıkayın.
  2. Hücre hazırlama ve kaplama
    1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamındaki HEK293 hücrelerini, %5 CO 2 içinde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş olarakkültürleyin.
      NOT: FBS, uygun hücre canlılığı için gerekli besinleri ve büyüme faktörlerini sağlamak için kültür ortamına eklenir.
    2. Ortamı çıkarın ve hücreleri 2 mL DPBS ile durulayın.
    3. 0.5 mL tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
    4. Tripsini nötralize etmek için şişeye 4.5 mL DMEM ekleyin, ardından hücreleri ayırmak ve yeniden süspanse etmek için tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.
    5. Ayrılan hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1000 x g'da (oda sıcaklığında, RT) 5 dakika santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve peleti 2 mL DMEM'de yeniden süspanse edin.
    7. Hücreleri bir Malassez sayım odası ile sayın ve 300.000 hücre / mL'de 9 mL hazırlayın. Bunları çok kanallı bir rezervuara koyun ve çok kanallı pipetle (30.000 hücre/kuyu nihai yoğunluğu) kuyucuk başına 100 μL dökerek 96 oyuklu mikroplakayı tohumlayın.
    8. Mikroplakayı à 37 °C,% 5 CO2 yaklaşık 24 saat inkübe edin.
      NOT: Etkili bir transfeksiyon için hücreler yaklaşık% 70-80 birleşmeye ulaşmalıdır.

2. Plazmit transfeksiyonu (2.

NOT: Hücre transfeksiyonu, kaplamadan önce askıya alınmış hücreler üzerinde birinci günde, adım 1.2.7 sırasında ve 3. günde veri toplama sırasında gerçekleştirilebilir.

  1. İstenen plazmit DNA'nın 10 μg'ını seyreltin (örneğin, 5 μg β2-adrenerjik reseptör ve 5 μg Gs (kısa)-CASE HEK wt hücrelerinde veya sadece 10 μg Gi3-CASE HEK CB1 hücrelerinde) ve 20 μL Lipofektamin 500 μL Opti-MEM ortamı içeren tüplerde. RT'de 5 dakika inkübe edin.
    1. Negatif bir kontrol için, β2-adrenerjik reseptörü aynı konsantrasyonda boş plazmit pcDNA 3.1 ile değiştirin. Çözeltileri bir tüpte birleştirin ve bir transfeksiyon karışımı (1 mL) elde etmek için karıştırın.
  2. Transfeksiyon karışımını RT'de 20 dakika inkübe edin.
  3. Adım 2.2'den itibaren her bir oyuğa damla damla 10 μL transfeksiyon karışımı ekleyin ve tam karışmayı sağlamak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın.
    NOT: Kuyu başına 100 ng DNA'lık nihai bir konsantrasyon elde edilir.
  4. Mikroplakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C, %5CO2'de 24 saat inkübe edin.

3. Veri toplama (3.

  1. Ligand hazırlama
    NOT: Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) tamponu: NaCl 140 mM, Potasyum Klorür 5 mM, Kalsiyum Klorür 1 mM, Magnezyum Sülfat Heptahidrat 0.4 mM, Magnezyum Klorür Heksahidrat 0.5 mM, Sodyum Fosfat Dibazik Dihidrat 0.3 mM, Potasyum Fosfat Monobazik 0.4 mM, D-Glikoz (Dekstroz) 6 mM, Sodyum bikarbonat 4 mM, pH 7.4, filtrelenmiş 0.22 μm.
    1. Farklı ligandlar için uygun çözündürme çözücüsünde mümkün olan en yüksek konsantrasyonda bir stok çözeltisi hazırlayın (bu protokolde, izoproterenol H20 mQ ve WIN-55.212-2 DMSO içinde hazırlanır).
      NOT: Ligand stok çözeltisinin konsantrasyonunun, ligandın çözünürlüğüne ve bilinen ayrışma sabitine (Kd) bağlı olarak ayarlanması gerekir.
    2. Bu stoktan, uygun çözündürme çözücüsü içinde ligandın Kd değeri etrafında 10 μL'lik bir ligand seri seyreltme hazırlayın. Bu seri seyreltmeyi -20 °C'de saklayın.
      NOT: Liganda bağlı olarak, seri seyreltme aralığı, bozunma meydana gelmeden önce on defaya kadar dondurulabilir ve çözülebilir. Bir araç koşulunu (bu protokolde, H20 veya DMSO) içerecek şekilde yalnızca ligand çözünmesi için kullanılan çözücüyü içeren bir çözelti hazırlayın.
    3. Her ligand konsantrasyonu ve araç için, toplam 130 μL hacme her konsantrasyondan 1,3 μL ekleyerek HBSS'de 1/100 seyreltme gerçekleştirin. Bu, HBSS'de %1'lik bir nihai araç konsantrasyonu ile sonuçlanır.
      NOT: Bu son seyreltme aralığı, kuyu başına 100 μL toplam hacim elde etmek için 10 μL eklenerek deneyler için kullanılan aralıktır. Bu, tüm kuyularda %0,1'lik bir nihai araç konsantrasyonu ile sonuçlanır. 130 μL hacim, 96 oyuklu bir plakanın bir sırasını doldurmak için gereken miktara karşılık gelir: (10 x 12) ± %10. Her sıra farklı bir ligand konsantrasyonuna karşılık gelir ve son sıra araç kontrolü görevi görür.
    4. Stok çözeltisinden 980 μL Furimazine 1/100 seyreltme hazırlayın (toplam 980 μL hacim elde etmek için 970.2 μL HBSS içinde 9.8 μL).
      NOT: Taze bir furimazin çözeltisi hazırlayın ve en az 3 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, satın almadan hemen önce ekleyin. Sinyalin oda sıcaklığında yaklaşık 120 dakikalık bir yarı ömrü olduğu için çok erken hazırlanmamalıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için vivazin ve endurazin gibi uzun etkili furimazin türevleri kullanılabilir. Bu alt tabakalar, 48 saate kadar sabit bir BRET sinyali tutar.
  2. Plaka okumaları
    NOT: Çok modlu bir plaka okuyucu kullanın. Ölçümü çalışılan koşullara ve tekrar sayısına göre ayarlayın. Burada veri toplama, 32 kuyuya karşılık gelen 4 sütundan oluşan üç okumaya bölünmüştür. Tüm okumalar, tampon buharlaşmasını önlemek için şeffaf kapaklı üst optiklerle yapılır. Tüm okumalardan önce ölçüm kazancını ayarlayın. Bu çalışmada kazanç 3600 olarak sabitlenmiştir. Birçok plaka okuyucuda bulunan otomatik bir enjektör veya şırınga sistemi kullanarak manuel ligand ilavesinden kaçınmak mümkündür.
    1. Ortamı 96 oyuklu plakanın ilk 4 sütunundan çıkarın. Her bir kuyucuğu 100 μL HBSS ile durulayın ve 80 μL HBSS ekleyin. Plakanın alt tarafına beyaz bir çıkartma yapıştırın. Bu, floresan ve/veya biyolüminesans ölçümlerini iyileştirir.
    2. G proteini lüminesans spektrumlarının kaydedilmesi: 96 oyuklu plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. 535/30 nm monokromatör kullanarak cpVenus 173 emisyonunu kaydedin ve 2 nm çözünürlükle 500 ile 600 nm arasındaki lüminesans emisyonunu ölçün.
      NOT: Bu kayıt, cpVenus173 uyarımı üzerine floresan yayılmasını sağlamak için bir kontroldür.
    3. G proteini lüminesans spektrumlarının kaydedilmesi: 450/40 nm monokromatör kullanarak Nluc emisyon yoğunluğunu kaydedin ve 400 nm ile 600 nm arasındaki lüminesans emisyonunu 5 nm çözünürlükle ölçün.
      NOT: Bu kayıt, Nluc substratı, furimazin ilavesinden önce biyolüminesans yayılmamasını sağlamak için bir kontroldür.
    4. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet yardımıyla her bir oyuğa önceden hazırlanmış furimazin çözeltisinden (adım 3.1.4.) 10 μL ekleyin.
    5. Adım 3.2.3'ü tekrarlayın.
      NOT: Bu kayıt, furimazin ilavesi üzerine biyolüminesansın yayılmasını sağlamak için bir kontroldür. Furimazin tüketimi ve/veya bozulması nedeniyle sinyal değişimini önlemek için bu ölçümden sonra doğrudan adım 3.2.6 ile devam edin. BRET sinyal varyasyonu, furimazin tüketimi ve/veya bozulması ve agonist stimülasyonunun neden olduğu yanıtı sonlandırmak için meydana gelen düzenleyici süreçler nedeniyle meydana gelebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, GRK inhibitörleri (CMPD101) ve içselleştirme inhibitörleri (dynasore) veya GRK'lardan veya tutuklamalardan yoksun gen düzenlemeli hücreler kullanılabilir.
    6. G proteini bazal BRET'in kaydı: GPCR ligandını eklemeden önce, sırasıyla 450/40-nm ve 535/30-nm monokromatör kullanarak Nluc ve cpVenus 173 emisyon yoğunluğunu kaydedin. 0,30 s'lik bir ölçüm aralığı süresiyle (toplam okuma süresi 3 dakika) 60 sn'lik 3 döngü ölçün.
      NOT: Ölçüm aralığı süresinin 0,90 sn'ye yükseltilmesi genellikle sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde iyileştirir ancak çok daha uzun bir okuma süresi sağlar. Deneyci, uygulamaları için daha yüksek zamansal çözünürlüğün mü yoksa geliştirilmiş sinyal-gürültü oranının mı daha önemli olduğuna karar vermelidir.
    7. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet yardımıyla bir sütunun her bir kuyucuğuna sırasıyla GPCR ligandının önceden hazırlanmış seyreltme aralığından (adım 3.1) 10 μL ekleyin. Diğer 3 sütun için aynı prosedürü izleyin.
    8. G protein ligandının neden olduğu BRET'in kaydı: Sırasıyla 450/40 nm ve 535/30 nm monokromatör kullanarak Nluc ve cpVenus 173 emisyon yoğunluğunu kaydedin. 0,30 sn'lik bir ölçüm aralığı süresiyle (toplam okuma süresi 16 dakika) 60 sn'lik 16 döngü ölçün.
      NOT: Sütunlardaki kuyuları ölçmek için ölçüm parametrelerini ayarlayın. Kopyalar 2,4 sn'lik bir zaman farkıyla okunur.
    9. Adım 3.2'yi tekrarlayın. sonraki dört sütun için 2 kez.

4. Veri analizi

NOT: Her okumanın verilerini ayrı veri elektronik tablo dosyalarında toplayın.

  1. Kontrol okumaları
    1. Dalga boyuna karşı emisyon yoğunluğunu çizin.
  2. Bazal BRET okumaları
    1. Her kuyu için, üç okumanın BRET oranını hesaplayın. BRET oranı, alıcı emisyonu/verici emisyonu olarak tanımlanır.
      figure-protocol-1
    2. Her kuyucuk için, ligand ilavesinden önceki üç BRET oranının ortalamasını hesaplayın. Bu değere ligand stimülasyonundan önceki bazal BRET oranı denir: Oranbazal.
    3. Tüm kuyuların önceki BRET oranlarını normalleştirmek için, üç ölçümün her biri için sırasıyla araç kontrol kuyularından hesaplanan BRET oranı değerini, ilgili ölçüm zamanındaki BRET oranından çıkarın.
      NOT: Analiz edilen veriler, ligand ilavesinden önceki zaman noktalarına karşılık gelir. Ligandın eklendiği kuyular bilindiğinden, araç kontrol kuyuları buna göre tanımlanabilir.
  3. G proteini ligandının neden olduğu BRET okumaları
    1. Her kuyucuk için, bölüm 4.2.1'de açıklandığı gibi her okumanın BRET oranını hesaplayın. Bu değerlere Oranuyarımı denir.
    2. Ligand kaynaklı değişiklikleri ölçmek için, her bir kuyunun her bir Oranuyarımı için ΔBRET'i bazal üzerinde bir yüzde olarak hesaplayın. Bunun için, daha önce bölüm 4.2.2'de hesaplanan ilgiliOran bazalını kullanın.
      figure-protocol-2
    3. Her kuyucuğun ΔBRET değerlerini normalleştirmek için ΔBRET(%) değerini hesaplayın. Bunun için aracın ilgili ΔBRET değerlerini çıkarın.
    4. ΔBRET kinetiğini bir veri tablosunda görselleştirmek için, adım 4.2.3'te normalleştirilen üç bazal BRET okumasını ekleyin. bölüm 4.3.3'te her kuyu için hesaplanan karşılık gelen ΔBRET(%) değerlerinin önünde.
    5. Kinetik bir grafik elde etmek için önceki verileri okuma zamanına göre çizin.
    6. Bir platoya ulaşıldığında, seçilen bir zamanda ΔBRET(%) değerlerini alın ve her kuyu farklı bir ligand konsantrasyonuna karşılık geldiğinden, bunları kullanılan ligandın konsantrasyonuna göre çizin. Bir doz-yanıt eğrisi elde edilir.
      NOT: Platoya genellikle ligand stimülasyonundan yaklaşık 5 dakika sonra ulaşılır. Bu protokolde 15 dakikalık ligand stimülasyonundan sonra elde edilen değerler çizilir. Farklı deneylerden elde edilen verileri karşılaştırmak için, aktivasyonun kinetiğine bağlı olarak süreyi ayarlayın.
    7. Önceki verileri analiz yazılımında çizin ve aşağıdaki denkleme dayalı olarak sigmoidal doz-yanıt üç parametreli uyum kullanarak sığdırın:
      figure-protocol-3
      burada X, kullanılan ligandın konsantrasyonu, Y, ΔBRET(%) değerleri, Üst ve Alt platoları temsil eder ve EC50 , maksimum etkinin %50'sine ulaşmak için gereken ligand konsantrasyonudur. Bu, Emax ve EC50'nin elde edilmesini sağlar.
    8. Parametrik olmayan bir Mann-Whitney testi kullanarak kontrol koşulundan elde edilen verileri karşılaştırın. Sonuçlar p < 0.05'te anlamlı kabul edilir.

figure-protocol-4
Şekil 2: BRET testini gerçekleştirmek için temel adımlar. Bu protokolde özetlenen üç ana deneysel adıma (hücre tohumlama, hücre transfeksiyonu ve BRET sinyal edinimi) genel bakış ve veri toplama için ayrıntılı adım adım kılavuz. Deney düzeneği: 1. günde, hücreler, 30.000 hücre/kuyu yoğunluğunda düz, berrak bir tabana sahip PLL önceden kaplanmış beyaz 96 oyuklu bir plakaya ekilir. 2. günde hücreler, incelenen GPCR veya pcDNA3.1 plazmitleri ile birlikte seçilen G protein sensörü ile transfekte edilir. 24 saatlik inkübasyondan sonra, G protein sensörü aktivitesi, ligand ilavesi üzerine biyolüminesans ve floresan okumaları yoluyla ölçülür. Veri toplama: Hücrelerin HBSS yıkamasından sonra kuyucuklara 80 μL HBSS eklenir ve cpVenus173 floresan emisyonu 535/30 nm monokromatör kullanılarak 500 nm ile 600 nm arasında ölçülür (1). Daha sonra, Nluc biyolüminesansı, furimazin ilavesinden önce (2) ve sonra (3) 450/40 nm'lik bir monokromatör kullanılarak 400 nm ile 600 nm arasında ölçülür. Son olarak, bazal ve ligand kaynaklı G protein aktivitesi için BRET sinyali, sırasıyla 450/40-nm ve 535/30-nm monokromatörler kullanılarak 3 dakika (0.30 sn ölçüm aralığı ile 60 sn'lik 3 döngü) (4) ve 16 dakika (0.30 s'lik bir ölçüm aralığı ile 60 s'lik 16 döngü) (5) kullanılarak ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deney düzeneği ve yürütmenin genelleştirilmiş bir şeması Şekil 2'de detaylandırılmıştır. İki GPCR'nin ligand aktivasyonunu takiben Gs veya Gi/o ailesi proteinlerinin aktivasyonu, G-CASE biyosensörleri kullanılarak değerlendirildi. İlk olarak, prototipik bir A GPCR ailesi incelendi, β2-AR, HEK 293T hücrelerinde geçici olarak transfekte edildi. β'yı eksprese eden HEK wt hücrelerine bir agonist (yani izoproterenol) uygulandığında2-AR G

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, spesifik ligandlarla GPCR stimülasyonuna yanıt olarak canlı hücrelerde G protein aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümü için BRET biyosensörlerinin kullanımını açıklamaktadır. Biyolüminesans donör-alıcı enerji transferi prensibini kullanan bu yaklaşım, reseptör aktivasyonu üzerine heterotrimerik G proteinlerinin konformasyonel değişikliklerinin ve ayrışmasının saptanmasına olanak tanır ve GPCR sinyalini incelemek için sağlam ve hassas bir platform sağlar. Bu protokol, B sı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

HEK-CB1 hücreleri, M. Guzman'ın (Complutense Üniversitesi, Madrid, İspanya) nazik bir hediyesiydi ve β2-adrenerjik reseptör plazmidi, D. Perrais'in (IINS, Disiplinlerarası Sinirbilim Enstitüsü, Bordeaux, Fransa) nazik bir hediyesiydi. Gi3-CASE ve Gs(kısa)-CASE, Gunnar Schulte'nin bir hediyesiydi (Addgene plazmidi # 168122; Addgene plazmidi # 168124). Resimlerden bazıları BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma, Fransız Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche tarafından desteklenmektedir ve Fransız ulusal araştırma ajansı (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) ve SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş 96 kuyu kültür plakası, beyaz şeffaf düz tabanlı, kapaklı, Greiner bio-oneDutscher655983
BrightMax ClearLine Beyaz FilmDutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD4540
DPBS Modifiye edilmiş, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeden, sıvı, steril filtrelenmiş, hücre için uygunSigma D8537
Dulbecco' ' modifiye edilmiş Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAXSigmaD082237 derece ve derecede sıcak; Kullanımdan önce C su banyosu
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-VenusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Gunnar Schulte'den hediye
Galphalar (kısa izoform)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-VenüsAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Gunnar Schulte'den hediye
HEK-293T CB1R'yi istikrarlı şekilde ifade ediyor (HEK CB1)M. Guzman'dan nazik bir hediye (Complutense Üniversitesi, Madrid, İspanya)
HEK-293T vahşi tip (HEK wt)
İzoproterenolSigmaI6504H20 içinde çözünürülmüş ve &ndash olarak depolanmıştır; 20 derece ve derece; C
Lipofektamin 2000Invitrogen 11668019
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Orta GlutaMAX TakviyesiFischer11564506
pcDNA3 Bayrak beta-2-adrenerjik-reseptör etiketi FLAG C-terD. Perrais'in (IINS, Bordeaux) nazik hediyesi
pcDNA3.1-(boş)-TAGAddgene138209
Penisillin/streptomisinSigma P4333
Poli-L-lizin çözeltisi (PLL)SigmaRNBL7086
Tripsin-EDTA Sigma T3924
WIN-55,212-2Cayman Chemicals10009023DMSO'da çözülür ve &ndash adresinde saklanır; 20 derece ve derece; C

Kaynaklar

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).
  3. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. protein pathways. Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).
  5. Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).
  6. Van Unen, J., et al. A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells. PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).
  7. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  8. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2411 (2001).
  9. Galés, C., et al. Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).
  10. Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors. Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).
  11. Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors. Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).
  12. Scott-Dennis, M., et al. Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors. Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).
  13. Violin, J. D., et al. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics. J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).
  14. Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics. Life Sci. 38, 309-315 (1985).
  15. Thomas, B. F., et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).
  16. Schihada, H., et al. Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias. J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

Etiketler

GPCR AktivitesiBRET AnaliziCanl H cre G r nt lemeG Proteini AktivasyonuLigand Yanl Sinyal iletimi96 Kuyucuklu PlakaHEK293T H creleriBeta2 Adrenerjik Resept rKanabinoid Resept r CB1
Canlı Hücrelerde G Proteinine Bağlı Reseptör Aktivitesini Ölçmek için BRET Tabanlı G Protein Biyosensörleri
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.