Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Sınıf III reseptör tirozin kinaz olan FMS benzeri tirozin kinaz 3 (FLT3), akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında yaklaşık %30'luk bir mutasyon sıklığı sergiler ve kritik bir terapötik hedef oluşturur. Temsili tip I ve tip II FLT3 inhibitörleri olarak sırasıyla gilteritinib ve Quizartinib (AC220), FLT3-mutant AML tedavisinde klinik olarak kullanılmaktadır.
Gilteritinib, direncin üstesinden gelmeye yardımcı olmak için AXL hedeflerinin ek inhibisyonu ile hem aktive edilmiş hem de inaktive edilmiş FLT3 proteinlerini inhibe eder. AC220, aktive edilmiş FLT3'ü inhibe eder. Kuyruklu yıldız tahlili, mutant hücrelerde tip I ve tip II FLT3 inhibitörleri tarafından indüklenen DNA hasar modellerini ölçmek ve karşılaştırmak için sistematik olarak kullanıldı. Deneysel sonuçlar, AC220'nin neden olduğu DNA hasarının Gilteritinib'in neden olduğu hasardan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koydu. Güçlü DNA hasarı için, FLT3 inhibitörleri, DNA onarım kusurlarını hedeflemek için DNA hasarı onarım inhibitörleri ile birleştirilebilir. Sonuçlar, DNA hasarını hedefleyen ilaçların rasyonel kombinasyon stratejisi için deneysel destek sağlar.
Giriş
Akut miyeloid lösemi (AML), farklılaşmamış miyeloid progenitörlerin patolojik genişlemesi ile tanımlanan, hematopoietik supresyon ve kemik iliği yetmezliği ile sonuçlanan klonal hematopoietik kök hücre hastalığını temsil eder. AML'nin doğal moleküler heterojenliği önemli terapötik zorluklar ortaya çıkarmaktadır1. Özellikle klinik öneme sahip olan FMS benzeri tirozin kinaz 3 (FLT3) mutasyonları, AML'de vakaların yaklaşık %30'unda meydana gelen en yaygın genetik değişikliklerden birini oluşturur ve olumsuz klinik sonuçlarla güçlü bir korelasyon gösterir2. FLT3 reseptörü tirozin kinaz, PI3K....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. FLT3-ITD mutasyonlarına sahip 32D hücrelerde bir DNA hasar modelinin oluşturulması 18
- Hücre kurtarma
- Forseps kullanarak, dondurularak saklanan FLT3-ITD mutant 32D hücrelerini (-80 ° C'de saklanır) hızla aktarın. Forseps kullanarak dondurarak saklama şişelerini alın ve kontrollü çözülmeyi tamamlamak için hemen sıcaklığı ayarlanmış bir su banyosuna (37 °C ± 0,5 °C) tam olarak 60 saniye daldırın.
NOT: Çözdürme sırasında, eşit ısıtma sağlamak için dondurarak saklama şişelerini su banyosunda aralıklı olarak çalkalayın. - Dondurularak saklanan numuneleri 150 × g'da 25 °C ± 1 °C'de 5 dakik....
- Forseps kullanarak, dondurularak saklanan FLT3-ITD mutant 32D hücrelerini (-80 ° C'de saklanır) hızla aktarın. Forseps kullanarak dondurarak saklama şişelerini alın ve kontrollü çözülmeyi tamamlamak için hemen sıcaklığı ayarlanmış bir su banyosuna (37 °C ± 0,5 °C) tam olarak 60 saniye daldırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kuyruklu yıldız tahlili, FLT3-mutant hücre hatlarında gilteritinib ve AC220 tarafından indüklenen diferansiyel DNA hasar profillerini ölçmek için sistematik olarak kullanıldı. Analizler, gilteritinib ve AC220 ile tedavi edilmeyen hücre popülasyonları arasındaki DNA hasarındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını gösterdi (P > 0.05). Kuyruk DNA'sında (%) ve Zeytin Momenti Kuyruğunda (OMT) doza bağlı artışlar, 2-6 saatlik maruziyetlerden sonra istatistiksel anlamlılığa (P < 0.05) ulaştı. OMT, kuyruktaki % .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kuyruklu yıldız tahlili, genotoksisite değerlendirme metodolojilerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu teknik, teknik erişilebilirliği, tek hücreli çözünürlüğü ve elektroforetik migrasyon profilleri aracılığıyla hasar modellerinin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla geleneksel yaklaşımlara göre belirgin avantajlar sunar. AML terapötik geliştirmede, kuyruklu yıldız testi, hedef doğrulama aşamaları sırasında aday ajanların genotoksik profillerinin sistematik olarak değerlendiri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğrenim Kurumu Bilim ve Teknoloji için Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021), Jiangsu Meslek Yüksekokulu Mühendislik Teknoloji Araştırma Merkezi Programı (2023), Zhejiang İl Tıp ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Programı (2025KY1861), Çin Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Anahtar Vakfı (Hibe No. 24KJA310008), Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Programları (Hibe No. SZWZYTD202201, szwzy202406) ve Soochow Üniversitesi (GZK12023013) Devlet Anahtar Radyasyon Tıbbı ve Korunma Laboratuvarı Projesi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA | Beyotime | ST066 Serisi | |
| 1x YeaRed nükleik asit boyası | Evet | 10202ES | |
| 32D HÜCRE | Biyo | CBP60995 | |
| AC220 Serisi | Hedef Mol | T2066 Hakkında | |
| Hücre Sayım Kiti-8 | Dojindo | CK04 | |
| Hücre Sayma Plakası | QiuJing Hakkında | XB-K-25 Serisi | |
| CO2 inkübatör | Termo | 51032872 | |
| Comet tahlil yazılımı projesi (CASP) | |||
| CometAssay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| Sitasyon 5 | BioTek | 16280004 | |
| FBS'nin | TAVA | ST30-3302 Serisi | |
| Gilteritinib | Hedef Mol | T4409 Serisi | |
| GraphPad Prizma 9.0 | |||
| Yüksek Hızlı Santrifüj | Termo | 9AQ2861 | |
| L-1000XLS+ Pipetler | Yağmur | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipetler | Yağmur | 17014392 | |
| Sıvı Azot Tankı | Kanser | YDS-175-216 | |
| Multiskan FC mikroplaka fotometre | Termo | 1410101 | |
| Na2OH | DAMAO | 1588 | |
| PBS | Güneş Enerjisi | P1020 | |
| Penisilin-Streptomisin Solüsyonu, 100x | Beyotime | C0222 (İngilizce) | |
| RPMI 1640 orta | Gibco | C22400500BT | |
| Trinoküler canlı hücre mikroskobu | Motik | 1.1001E+12 | |
| Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu | Hayat | V118574 |
Kaynaklar
- Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
- Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
