Yöntem makalesi

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Sınıf III reseptör tirozin kinaz olan FMS benzeri tirozin kinaz 3 (FLT3), akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında yaklaşık %30'luk bir mutasyon sıklığı sergiler ve kritik bir terapötik hedef oluşturur. Temsili tip I ve tip II FLT3 inhibitörleri olarak sırasıyla gilteritinib ve Quizartinib (AC220), FLT3-mutant AML tedavisinde klinik olarak kullanılmaktadır.

Gilteritinib, direncin üstesinden gelmeye yardımcı olmak için AXL hedeflerinin ek inhibisyonu ile hem aktive edilmiş hem de inaktive edilmiş FLT3 proteinlerini inhibe eder. AC220, aktive edilmiş FLT3'ü inhibe eder. Kuyruklu yıldız tahlili, mutant hücrelerde tip I ve tip II FLT3 inhibitörleri tarafından indüklenen DNA hasar modellerini ölçmek ve karşılaştırmak için sistematik olarak kullanıldı. Deneysel sonuçlar, AC220'nin neden olduğu DNA hasarının Gilteritinib'in neden olduğu hasardan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koydu. Güçlü DNA hasarı için, FLT3 inhibitörleri, DNA onarım kusurlarını hedeflemek için DNA hasarı onarım inhibitörleri ile birleştirilebilir. Sonuçlar, DNA hasarını hedefleyen ilaçların rasyonel kombinasyon stratejisi için deneysel destek sağlar.

Giriş

Akut miyeloid lösemi (AML), farklılaşmamış miyeloid progenitörlerin patolojik genişlemesi ile tanımlanan, hematopoietik supresyon ve kemik iliği yetmezliği ile sonuçlanan klonal hematopoietik kök hücre hastalığını temsil eder. AML'nin doğal moleküler heterojenliği önemli terapötik zorluklar ortaya çıkarmaktadır1. Özellikle klinik öneme sahip olan FMS benzeri tirozin kinaz 3 (FLT3) mutasyonları, AML'de vakaların yaklaşık %30'unda meydana gelen en yaygın genetik değişikliklerden birini oluşturur ve olumsuz klinik sonuçlarla güçlü bir korelasyon gösterir2. FLT3 reseptörü tirozin kinaz, PI3K/AKT ve RAS/MAPK sinyal kaskadlarına aracılık etmek için plazma zarında aktivasyona uğrarken, FLT3-ITD mutant varyantı endoplazmik retikulum içinde tutulur ve kalıcı Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 5 (STAT5) fosforilasyonunu indükler. Bu genetik değişiklikler, lösemogenezi, esas olarak sinyal iletim düzensizliği, kontrolsüz proliferatif sinyalleşme ve apoptotik direnç yoluyla çoklu onkojenik mekanizmalar yoluyla yönlendirir3.

AC220 ve gilteritinib, tipik FLT3 inhibitörleri olarak, FLT3 ekspresyonunu baskılayarak, ancak farklı etki mekanizmalarıyla hücre proliferasyonunu inhibe eder ve apoptozu indükler. Gilteritinib (bir tip I inhibitör) sadece FLT3 aktive edici mutasyonların daha geniş bir spektrumunu kapsamakla kalmaz, aynı zamanda FLT3 ile yakından ilişkili olan AXL tirozin kinazı da inhibe eder. İkili inhibisyon yoluyla gilteritinib, kanser hücrelerinin büyümesini daha kapsamlı bir şekilde engelleyebilir4. AC220 (bir tip II inhibitör), inhibitör etkisini, aktive edilmiş kinaz konformasyonuna rekabetçi bağlanma yoluyla, özellikle yüksek özgüllüğe sahip ATP bağlama cebini hedef alarak gösterir5. Bu inhibisyon, hücre döngüsünün durmasına ve DNA replikasyon stresinin artmasına neden olabilir.

Gilteritinib, düşük direnç riski ile ilişkilidir ve nükseden/dirençli FLT3-mutant AML'de monoterapi için endikedir. AC220, iyi klinik yanıt oranları ile FLT3-ITD mutasyonları için etkili ve seçicidir, ancak FLT3-TKD mutasyonları için etkisizdir ve ikincil FLT3-TKD mutasyonları nedeniyle FLT3-TKD mutasyonlarına dirençli olabilir (örneğin, D835 veya F691L) direnç geliştirmeye karşı. Bu inhibitörler, kanıtlanmış klinik etkinlik ve gelişmiş terapötik indekslere dayalı olarak AML terapötiklerinde önem kazanmıştır6. Bununla birlikte, bu ilaçların klinik kullanımı, kazanılmış direnç ve hedef dışı etkiler nedeniyle zorlanmaktadır. AC220'nin klinikte uzun süreli kullanımı FLT3-TKD mutasyonlarına bağlı dirence yol açarken, gilteritinib'in uzun süreli kullanımı, FLT3-TKD mutasyonlarına bağlı dirençle sonuçlanmasa bile bileşik mutasyonlar (örneğin, TKD ile kombine FLT3-ITD) için sınırlamalara sahip olabilir 7,8.

Bu iki FLT3 inhibitörü sınıfı, FLT3'ün inhibisyonu ve proliferatif sinyal yolunun blokajı (RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5) yoluyla dolaylı olarak replikatif stresi indükleyerek ikili bir terapötik etki gösterir. Hücre proliferasyonunun blokajı genellikle hücre döngüsünün durmasına, metabolik bozukluklara (redoks homeostazının düzensizliği) ve nihayetinde apoptoza yol açar 9,10. Bu mekanizma sonuçta dirençli hücre popülasyonlarında telafi edici DNA onarım adaptasyonlarını aktive eden DNA lezyonları üretir. Kuyruklu yıldız tahlili, FLT3-mutant hücrelerde inhibitöre özgü DNA hasar profillerinin kantitatif karşılaştırmasını sağlar. Bu deneysel yaklaşım, DNA hasarına karşı hassasiyetlerden yararlanan ve böylece edinilmiş terapötik direncin üstesinden gelen rasyonel kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesi için kritik bilgiler sağlar.

DNA hasar tespiti için çağdaş metodolojiler, her biri yüksek analitik duyarlılık ve özgüllük gösteren immünohistokimyasal analiz, DNA fragmanlarının agaroz jel elektroforezi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve yeni nesil dizilemeyi (NGS) kapsar11. Ancak bu yaklaşımlar önemli mali gereksinimler, uzun işlem süreleri ve sıkı deneysel koşullar nedeniyle kısıtlanmaktadır. Bu, analitik hassasiyeti operasyonel basitlikle dengeleyen tespit stratejilerinin benimsenmesi zorunluluğunun altını çiziyor.

Kuyruklu yıldız tahlili, üstün duyarlılığı, teknik erişilebilirliği, görselleştirilmiş DNA hasar ölçümü ve biyolojik sistemler arasında geniş uygulanabilirliği nedeniyle çevresel toksikoloji ve genotoksisite değerlendirmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır12,13. Üç temel metodolojik varyant oluşturulmuştur: tek/çift sarmal kopma tespiti için alkali kuyruklu yıldız tahlili, çift sarmal kopma analizi için nötr kuyruklu yıldız tahlili ve spesifik DNA lezyon tanımlaması için enzimle modifiye edilmiş kuyruklu yıldız tahlili. 14

Metodolojik ilke şunları içerir: (1) DNA zincirinin indüksiyonu, deneysel tedavi yoluyla kırılır; (2) Hücresel ve nükleer membranların lizis tamponu aracılı çözünmesi, sitoplazmik/nükleer protein ve RNA'nın elektroforez tamponuna difüzyonuna izin verirken, yüksek moleküler ağırlıklı DNA, agaroz matrisinde hareketsiz kalır; (3) DNA'nın çözülmesini ve hasarlı DNA parçalarının serbest bırakılmasını indükleyen alkali denatürasyon (pH > 13); (4) Küresel nükleoid yapıyı koruyan bozulmamış DNA ile karakteristik kuyruklu yıldız morfolojisi oluşturan parçalanmış DNA'nın elektroforetik alan güdümlü anodik göçü15,16. DNA hasarı ölçümü, kuyruk DNA yüzdesinin (TDP) bilgisayarlı analizi yoluyla elde edilir ve tek hücre çözünürlüğünde17 genotoksik etkinin hassas ölçümünü sağlar.

Bu araştırma, doğrulanmış FLT3-mutant 32D hücrelerinde gilteritinib ve AC220'nin diferansiyel genotoksik etkilerini karşılaştırmak için sistematik bir deneysel çerçeve kullandı. Deneysel tasarım iki ana bileşenden oluşuyordu: (i) FLT3 mutasyonuna özgü bir DNA hasar modelinin oluşturulması ve (ii) alkalin kuyruklu yıldız tahlili metodolojisi yoluyla ilaca bağlı DNA hasarının nicel değerlendirmesi. FLT3-mutant 32D hücre hattı, seri olarak seyreltilmiş FLT3 inhibitörlerine maruz kalmadan önce standart in vitro koşullar altında tutuldu. Hücresel canlılık, CCK-8 tahlilleri kullanılarak değerlendirildi ve ardından doğrusal olmayan regresyon analizi yoluyla yarı maksimum inhibitör konsantrasyon (IC50) değerlerinin hesaplanmasıyla değerlendirildi. DNA hasarı indüksiyon eşiği olarak beş kat IC50 değeri seçildi. İlaçla tedavi edilen hücreler toplandı ve sonraki analizler için slaytlar üzerinde düşük erime noktalı agaroz içine gömüldü. Elektroforetik ayırma, alkalin tamponda 30 dakika boyunca 24 V (~0.74 V/cm) ve 300 mA'da gerçekleştirildi, bu sırada parçalanmış DNA, karakteristik kuyruklu yıldız morfolojisi oluşturmak için anodik olarak göç ederken, bozulmamış DNA küresel nükleoid konfigürasyonunu korudu. DNA hasarı ölçümü, kuyruk momentini ölçen bilgisayarlı görüntü analizi kuyruklu yıldız tahlili yazılım projesi (CASP) yoluyla elde edildi ve artan Zeytin kuyruğu momenti değerleri, DNA parçalanmasının derecesi ile doğrudan ilişkilidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. FLT3-ITD mutasyonlarına sahip 32D hücrelerde bir DNA hasar modelinin oluşturulması 18

  1. Hücre kurtarma
    1. Forseps kullanarak, dondurularak saklanan FLT3-ITD mutant 32D hücrelerini (-80 ° C'de saklanır) hızla aktarın. Forseps kullanarak dondurarak saklama şişelerini alın ve kontrollü çözülmeyi tamamlamak için hemen sıcaklığı ayarlanmış bir su banyosuna (37 °C ± 0,5 °C) tam olarak 60 saniye daldırın.
      NOT: Çözdürme sırasında, eşit ısıtma sağlamak için dondurarak saklama şişelerini su banyosunda aralıklı olarak çalkalayın.
    2. Dondurularak saklanan numuneleri 150 × g'da 25 °C ± 1 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücresel peleti tutarken steril serolojik pipetler kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    3. Kriyoprezervasyon tüpüne 1 mL tam büyüme ortamı (RPMI 1640 +% 10 fetal sığır serumu +% 1 penisilin / streptomisin) ekleyin. Tam yeniden süspansiyon sağlamak için 10 ardışık pipetleme döngüsü (1 mL hacim) boyunca nazik öğütme gerçekleştirin. Hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve 8 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için 7 mL tam ortam ekleyin.
    4. Kültür kabını beş yatay ve beş dönme hareketiyle hafifçe çalkalayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37.0 °C ± 0.2 °C'de %5CO2





    8. figure-protocol-1

      4. figure-protocol-2


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kuyruklu yıldız tahlili, FLT3-mutant hücre hatlarında gilteritinib ve AC220 tarafından indüklenen diferansiyel DNA hasar profillerini ölçmek için sistematik olarak kullanıldı. Analizler, gilteritinib ve AC220 ile tedavi edilmeyen hücre popülasyonları arasındaki DNA hasarındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını gösterdi (P > 0.05). Kuyruk DNA'sında (%) ve Zeytin Momenti Kuyruğunda (OMT) doza bağlı artışlar, 2-6 saatlik maruziyetlerden sonra istatistiksel anlamlılığa (P < 0.05) ulaştı. OMT, kuyruktaki % ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kuyruklu yıldız tahlili, genotoksisite değerlendirme metodolojilerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu teknik, teknik erişilebilirliği, tek hücreli çözünürlüğü ve elektroforetik migrasyon profilleri aracılığıyla hasar modellerinin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla geleneksel yaklaşımlara göre belirgin avantajlar sunar. AML terapötik geliştirmede, kuyruklu yıldız testi, hedef doğrulama aşamaları sırasında aday ajanların genotoksik profillerinin sistematik olarak değerlendiri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğrenim Kurumu Bilim ve Teknoloji için Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021), Jiangsu Meslek Yüksekokulu Mühendislik Teknoloji Araştırma Merkezi Programı (2023), Zhejiang İl Tıp ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Programı (2025KY1861), Çin Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Anahtar Vakfı (Hibe No. 24KJA310008), Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Programları (Hibe No. SZWZYTD202201, szwzy202406) ve Soochow Üniversitesi (GZK12023013) Devlet Anahtar Radyasyon Tıbbı ve Korunma Laboratuvarı Projesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTABeyotimeST066 Serisi
1x YeaRed nükleik asit boyasıEvet10202ES
32D HÜCREBiyoCBP60995
AC220 SerisiHedef MolT2066 Hakkında
Hücre Sayım Kiti-8DojindoCK04
Hücre Sayma PlakasıQiuJing HakkındaXB-K-25 Serisi
CO2 inkübatörTermo51032872
Comet tahlil yazılımı projesi (CASP)
CometAssay Kit Trevigen4250-050-K
Sitasyon 5BioTek16280004
FBS'ninTAVAST30-3302 Serisi
GilteritinibHedef MolT4409 Serisi
GraphPad Prizma 9.0
Yüksek Hızlı SantrifüjTermo  9AQ2861
L-1000XLS+ PipetlerYağmur17014382
L-20XLS+ PipetlerYağmur17014392
Sıvı Azot TankıKanserYDS-175-216
Multiskan FC mikroplaka fotometreTermo1410101
Na2OHDAMAO1588
PBSGüneş EnerjisiP1020
Penisilin-Streptomisin Solüsyonu, 100xBeyotimeC0222 (İngilizce)
RPMI 1640 ortaGibcoC22400500BT
Trinoküler canlı hücre mikroskobuMotik1.1001E+12
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucuHayatV118574

Kaynaklar

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FLT3 Mutant H creleriAkut Miyeloid L semiTip I nhibit rleriTip II nhibit rleriGenotoksisite De erlendirmesiKombinasyon TedavisiAlkalin Elektroforez

İlgili makaleler