Method Article

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

DOI:

10.3791/68483

⸱

July 8th, 2025

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA bazlı floresan ışıklı aptamerler (FLAP'ler), anlık nükleik asit tespiti için kullanılan geleneksel hibridizasyon problarının aksine, nükleik asit sinyal raportörlerinin floroforlar ve/veya söndürücülerle etiketlenmesine gerek kalmadan düşük maliyetli bir floresan sinyal okuması sağladıkları için biyoanalitik tahliller için umut vericidir. Bunun yerine, FLAP'lar, sulu çözeltilerde doğası gereği düşük floresan sergileyen, ancak FLAP bağlanması üzerine yüksek oranda yayılan boya ligandlarını kovalent olmayan bir şekilde bağlar. Bu protokol, şimdiye kadar bildirilen en verimli DNA FLAP'ı olan DAP-10-42'yi kullanan bölünmüş ışıklı aptamer sensörleri (SLAS'lar) tasarlamak için bir algoritmayı açıklar. İlgilenilen bir nükleik asit hedefini tamamlayan nükleik asit dizileri ile donatıldığında, SLAS, tek nükleotid ikamelerinin (SNS'ler) analizini mümkün kılmak için bir nükleotid'e kadar seçiciliğe sahip nükleik asit hedeflerinin diziye özgü tespitine izin veren nükleik asit analizi için umut verici bir araçtır. SLAS'lar, geleneksel küvet bazlı bir floresan spektrofotometre, taşınabilir bir florometre ile ölçülebilen veya elde taşınan bir ışık kaynağıyla uyarıldığında görsel olarak gözlemlenebilen, etiketsiz floresan tabanlı bir sinyal okuma avantajı sunar. SLAS yaklaşımı, hastalık teşhisi, çevresel izleme ve biyomoleküler araştırmalarda biyoalgılama uygulamaları için faydalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hibridizasyon probları kullanılarak yapılan nükleik asit analizi, spesifik DNA / RNA dizilerini tespit etmek ve ölçmek için rutin olarak gerçekleştirilir1. En başarılı hibridizasyon problarından biri, saç tokası şeklinde bir DNA olan Molecular Beacon (MB) probudur
Karşı terminaldebir florofor ve bir söndürücü ile işaretlenmiş oligonükleotid 2,3. Anında (prob-hedef kompleksini probun fazlalığından yıkamaya gerek kalmadan), probun döngü fragmanına tamamlayıcı bir nükleik asit dizisinin varlığını tespit eder ve kantitatif PCR'de (qPCR) yaygın olarak kullanılır. Probun oligonükleotid dizisine iki boyanın - florofor ve söndürücü - kovalent olarak bağlanma ihtiyacı, özellikle yeni bir nükleik asit dizisini hedefleyen yeni bir MB probuna ihtiyaç duyulduğunda maliyeti artırır. Alternatif olarak, MB probu, iki etiketlenmemiş oligonükleotidin hem hedef hem de MB prob raportörü4 ile etkileşime girdiği çok bileşenli (bölünmüş) bir hibridizasyon probu formatında bir sinyal raportörü olarak kullanılabilir. Çok bileşenli prob yaklaşımı, nükleik asit tanıma için seçiciliği artırır ve probun yapılandırılmış hedeflerebağlanmasını iyileştirir 5,6,7, Bununla birlikte, bu yaklaşım, raportörün bir florofor8 ile kovalent etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırmaz.

Floresan Işıklı Aptamerler (FLAP'ler)9, düşük floresan ortama duyarlı boyalara (florojenler) afiniteye sahip aptamerlerdir, burada FLAP ile bağlanma florojen manifoldunun floresansını arttırır. Floresan etiketli probların ve sinyal raportörlerinin aksine, FLAP'lar algılama elemanlarının bir veya daha fazla boya ile kovalent olarak etiketlenmesini gerektirmez ve bu nedenle etiketsiz floresan algılamaavantajı sunar 10. Bu, tatmin edici bir tahlil performansı elde etmek için düzinelerce nükleik asit yapısının test edilmesi gereken optimizasyon adımı sırasında özellikle önemlidir. Ayrıca, FLAP testleri, sensörün tasarımını değiştirmek yerine bir florojen ve/veya FLAP sensörünün konsantrasyonunu ayarlayarak optimize edilebilir. Bu avantajlar, düşük bütçeli araştırma ve öğretim laboratuvarları için önemli olabilir. DNA FLAP'ları, Bölünmüş Işıklı Aptamer Sensörleri (SLAS'lar) olarak adlandırılan çok bileşenli hibridizasyon problarının sinyal raportörleri olarak özellikle umut vericidir11. Şimdiye kadar bildirilen en verimli DNA FLAP, başlangıçta dapoksil sülfonil boyaların12 floresansını arttırmak için seçilen DAP-10-42'dir ve çeşitli aril metan boyalarının floresansını bağlamak ve geliştirmek için rastgele bir yetenek ile (örneğin, auramin O, AO; kristal menekşe, CV)13. DAP-10-42, nükleik asit analizi 13,14,15 için kullanılmak üzere SLAS'a dönüştürülmüştür.

Burada açıklanan yöntemin amacı, etiketsiz SLAS iplikleri ve bir tampon bileşeni olarak florojenik bir boya kullanarak ilgilenilen nükleik asit hedeflerinin diziye özgü analizini mümkün kılmaktır. Bu protokol, DAP-10-42'ye dayalı SLAS tasarlamak için bir algoritmayı açıklar ve tek bir nükleotid kadar küçük bir farkla farklılık gösteren nükleik asit dizilerinin oldukça seçici tespiti için SLAS performansını vurgular.

SLAS nükleik asit tespit testi, maksimum performans için 0.5-1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılan iki özel sentezlenmiş modifiye edilmemiş DNA oligonükleotidi gerektirir. Burada açıklanan protokol, bir florojen olarak ticari olarak temin edilebilen bir Auramine O (AO) boyası kullanır. Testteki nihai AO konsantrasyonu, boşluk üzerinde belirli bir nükleik asit hedefinin varlığında yüksek floresan artışı sağlamak için 1-10 μM arasında değişir (hedefin yokluğu; Ek Şekil 1). Tahlil tamponunun gerekli bileşenleri potasyum ve magnezyum iyonlarıdır (Ek Şekil 2). Potasyum iyonları (1.25-40 mM), bir sinyal raportörü olarak kullanılan FLAP'ın önerilen G-dörtlü alanını stabilize eder. Magnezyum iyonları (2.5-50 mM), SLAS-hedef etkileşimleri üzerine negatif yüklü fosfat gruplarının itilmesini azaltır. Sinyal raporlama alanı için rapor edilen dizileri kullanan SLAS testinin sıcaklığı, performans kaybını önlemek için 28 °C'yi aşmamalıdır16.

SLAS, asimetrik PCR'nin DNA amplikonları veya bir izotermal DNA amplifikasyon reaksiyonu (örneğin, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu, RPA17), transkripsiyon aracılı amplifikasyondan (TMA) RNA ürünleri veya nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon (NASBA)18 ve miRNA, rRNA veya ncRNA gibi doğal RNA molekülleri) gibi tek sarmallı nükleik asit hedefleriyle uyumludur. Hedefin nükleotid dizisindeki tek bir nükleotid'e kadar olan varyasyonlar, SLAS yaklaşımı13,14 kullanılarak tespit edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sinyal muhabiri olarak DAP-10-42 ile Bölünmüş Işıklı Aptamer Sensörünün (SLAS) tasarımı

  1. SLAS'ı oluşturan iki değiştirilmemiş DNA oligonükleotid zincirinin dizilerini tasarlayın. DAP-10-42'nin 4,6-39 nükleotidlerini (nts) içeren bir parça kullanın (Tablo 1, Şekil 1A).
  2. Kök 1 (nts 1-8 ve 36-42) dizisini, nt 5 konumunda şişkin bir timin kalıntısını çıkararak, gövdeyi 4 bp'ye kısaltarak (nts 4,6-8 ve 36-39) gövde 1'e dönüştürün ve bir terminal CG bp ekleyin (Şekil 1A, adım 1). Ek olarak, SLAS dizilerinden biri DAP-10-42 çekirdek dizisinin nts 9-29'unu içerirken, başka bir SLAS dizisi dizinin nts 30-35'ini içerir.
  3. nts 9-29 içeren fragmanın 3'-terminal dizisini d(GGTCAT) ile ve nts 30-35 fragmanının 5'-terminal dizisini d(ATGACC) ile 6-bp'lik bir gövde 2 oluşturacak şekilde genişletin (Şekil 1A, adım 2).
    NOT: Aptamerin aydınlatma işlevi için DAP-10-42'deki gövde 1'in T4-A39, A6-T38, C7-G37 ve G8-C36 baz çiftleri gereklidir. Kök 1' dizisi yalnızca terminal bp'de değiştirilebilir ve bir G-C, AT, T-A baz çifti olabilir veya gerektiği gibi 1-2 baz çifti ile genişletilebilir. Kök 2'nin sırası isteğe bağlıdır ve değiştirilebilir. Bununla birlikte, tahlil sıcaklığı 28 °C'nin üzerine çıkarılmadıkça gövde 2'nin termodinamik stabilitesinin korunması önerilir. Gövde 2'nin kısaltılması veya başka bir şekilde dengesizleştirilmesi, SLAS bazlı floresan testinin yüksek bir arka planı gözlenirse, hedef olmadan erken boya bağlanmasını önler. DAP-10-42 nükleotid dizisinin nts 29-30 yerine nts 28-29, 27-28 veya 26-27 arasında bölünmesine de izin verilir (Şekil 1B).
  4. Tasarlanan SLAS'ı bir nükleik asit hedefine veya ilgisine uyarlamak için, d(TT) bağlayıcıları aracılığıyla hedef-hedef bağlama fragmanlarına (kollar) tamamlayıcı DNA dizileri ile kök 1'i uzatın (Şekil 1A, adım 3). Bu, probu oluşturan SLAS-U ve SLAS-S dizilerini verir.
  5. SLAS-S'nin hedef bağlama kolunu, SNS bölgesini içeren hedefin 7-10 nt'lik bir fragmanına tamamlayıcı hale getirin ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolunu - SLAS-S'nin hedef bağlama koluna bitişik hedefin 15-25 nt'lik bir fragmanına tamamlayıcı hale getirin (Tablo 1).
    NOT: SLAS-S'nin hedef bağlama kolunun DAP-4-39 dizisinin nt 10 veya nt 42'una bağlanıp bağlanmayacağı isteğe bağlıdır (sırasıyla Şekil 1, kol 1 veya kol 2).
  6. UNAFold Web Sunucusunu (unafold.org)19 kullanarak, ilgilenilen hedef ile SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolları arasındaki dublekslerin erime sıcaklığını (Tm) değerlendirin.
    1. Web sayfasının üst kısmındaki DINAMelt sekmesine tıklayın; Uygulamalar'a gidin ve İki Durumlu Erime Hibridizasyonunu seçin (Ek Şekil 3A). İki Durumlu Erime Hibridizasyonu'nun (Two-State Melting Hybridization) sayfasında, etkileşim dizilerinden birini soldaki kutuya ve diğerini sağdaki kutuya girin (Ek Şekil 3B). Her iki dizinin de 5' ila 3' sırada olduğundan emin olun. Noktalı virgülle ayırarak birden fazla etkileşim dizisi çifti girebilirsiniz.
    2. Sayfanın alt kısmında, tahlil koşullarına uyması için tahlil sıcaklığını (22 °C), tek değerlikli ve iki değerlikli katyon konsantrasyonlarını (sırasıyla 20 mM ve 25 mM) belirtin. Etkileşen dizilerin konsantrasyonunu belirtin.
    3. Gönder'e basın (Ek Şekil 3B). Gibbs enerji değişimini, entalpi değişimini ve bağlamanın entropi değişimini ve ayrıca karşılık gelen dubleksler için Tm değerlerini içeren sonuçları gözlemleyin (Ek Şekil 3B).
    4. Tam eşleşen hedef (M) ile SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolları arasındaki dubleksler için Tm değerlerinin, mevcut protokolde 22 °C olan tahlil sıcaklığının üzerinde olduğundan emin olun. Burada, Tm değerleri sırasıyla 32.2 ° C ve 74.4 ° C idi (Ek Şekil 3C).
    5. SLAS-S ile SNS içeren eşleşmeyen bir hedef (MM) arasındaki çift yönlülüğün tahlil sıcaklığının altında bir Tm olduğundan emin olun. Bu, prob hedefi tanımanın yüksek seçiciliğini sağlar ve AO florojeninin, SLAS bağlayıcı fragmanda bir SNS içeriyorsa hedeflenen nükleik asit analitinin varlığını işaret etmesini önler (Şekil 2). Burada, Tm 21.3 °C idi (Ek Şekil 3C), bu da uyumsuzluğu eşleşen kompleksten ayırt etmek için yeterliydi.
    6. Belirtilen stabilite gereksinimlerini karşılamak için gerekirse, hedefi tamamlayan parçaları kısaltarak veya uzatarak hedef bağlama kollarının dizilerini ayarlayın.
  7. Tasarlanan SLAS-S ve SLAS-U ipliklerini, özel yapım DNA oligonükleotidleri tedarik eden herhangi bir ticari satıcıdan edinin veya otomatik bir oligonükleotid sentezleyici kullanarak DNA ipliklerini şirket içinde sentezleyin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Bir floresan ışıklı aptamer (FLAP) DAP-10-42'nin bölünmüş ışıklı aptamer sensörüne (SLAS) dönüştürülmesi. (Bir)DAP-10-4212'nin ikincil yapısı, UNAFold Web Sunucusu19'un 22 °C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+'da bir DNA katlama uygulaması ile tahmin edilir. Aptamer, muhtemelen gövde 1 tarafından stabilize edilmiş bir G-dörtlü motife katlanan bir çekirdeğe sahip bir saç tokası ikincil yapısına sahiptir. DAP-10-42'nin bir SLAS'a dönüştürülmesi için, (1) aptamerin 1 gövdesi 4 bp'ye kısaltılır ve gövde 1' yapmak için ek bir GC bp ile çevrelenir; (2) çekirdek dizi, NTS 29 ve 30 arasında bölünür, bölme bölgesinin 3'- ve 5' tarafları, gövde 2'yi yapmak için sırasıyla d(GGTCAT) ve d(ATGACC) tamamlayıcı dizileri ile genişletilir; (3) kök 1', hedef bağlama kolları ile probun sinyal raporlama alanı arasında bir d(TT)-bağlayıcı ile, ilgilenilen bir hedefin - hedef bağlama kollarının bitişik parçalarına tamamlayıcı dizilerle uzatılır. (B) Çekirdek ayrıca sinyalde önemli bir kayıp ve/veya floresan katlama artışı olmadan nts 28-29, 27-28 veya 26-27 arasında bölünebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: SLAS sinyal üretim mekanizması. SLAS, SLAS-U ve SLAS-S olmak üzere iki iplikten ve florojenik bir boyadan (örneğin, Auramine O; AO) tarafından desteklenmektedir. İlgilenilen bir nükleik asit hedefinin yokluğunda, her iki iplik de ayrışmış durumdadır ve boyayı bağlayamaz; Sinyal gözlenmiyor (ortada). Tam olarak eşleşen bir hedef M'nin varlığında, hem SLAS-U hem de SLAS-S, çekirdek parçaları yakınlaştırmak için M'nin bitişik parçasına hibritleşir. Bu, boya bağlama bölgesinin oluşumuna izin verir. AO'nun bağlanması, floresan sinyal okuması (solda) olarak ölçülen floresansını arttırır. SLAS-S ile etkileşime giren bir parçada tek nükleotid ikamesi (SNS) içeren eşleşmeyen bir hedef MM'nin varlığında, SLAS-S ayrışmış durumdayken, yalnızca SLAS-U MM hedefine hibritleştirebilir. Bu, boya bağlama bölgesinin oluşumunu önler ve hiçbir sinyal gözlenmez (sağda). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Hedeflenen dizinin amplifikasyonu

  1. SLAS testi ile analiz edilecek genin bir parçasını çoğaltın. PCR veya RPA amplifikasyonu için, tek sarmallı bir amplikon oluşturmak için asimetrik koşullar kullanın (örneğin, Ters Astar üzerine 10 kat fazla İleri Astar eklendiğinde). Üstel (LATE) PCR20 kullanarak NANOGP8 geninden 126 nt'lik bir fragmanı amplifiye etmek için, Tablo 2'de listelenen primer dizilerini kullanın. Burada, genin 126-nt fragmanına karşılık gelen tek sarmallı bir DNA şablonu (Şablon NANOGP8 veya Şablon G1423C, Tablo 2) kullanıldı. Şablon, Integrated DNA Technologies, Inc. tarafından özel olarak sentezlendi.
    1. 10 μL 10x Standart Taq Reaksiyon Tamponu, 2 μL 10 mM dNTP karışımı (0.2 mM nihai konsantrasyona sahip olmak için), 10 μL 10 μM İleri astar ve 10 μL 1 μM Ters Astarı (1 μM ve 0.1 μM nihai konsantrasyon için) karıştırarak 100 μL'lik bir PCR reaksiyonu hazırlayın, sırasıyla), 0.5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, DNA şablonu ve nükleaz içermeyen su. Şablon içermeyen bir denetim için şablon yerine su ekleyin.
    2. Aşağıdaki termodöngü koşullarını kullanın: 1 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 45 döngü (1) 15 saniye boyunca 95 ° C'de denatürasyon, (2) 30 saniye boyunca 60 ° C'de astar tavlama, (3) 30 saniye boyunca 68 ° C'de astar uzatma; ve son uzatma 68 ° C'de 5 dakika.
      NOT: NASBA18 gibi transkripsiyon tabanlı amplifikasyon teknikleri, özellikle amplifikasyon için bir RNA şablonu mevcutsa, PCR veya RPA yerine kullanılabilir. NASBA, mikromolar aralıkta nihai ürün konsantrasyonunda tek sarmallı bir RNA amplikonu üretir, bu da ürün konsantrasyonu olmadan aşağı akış SLAS testinde kullanılabilecek kadar yüksektir.
  2. 0.1x hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ve 3x hacim etanol ekleyerek amplifiye edilmiş numuneleri etanol ile çökeltin. -20 ° C'de 1 saat inkübe edin, 12.000-18.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  3. Peletleri p etanol ile yıkayın, yeniden santrifüjleyin ve süpernatanı tekrar atın. Peleti havayla kurutun ve SLAS tahlilinde kullanılmak üzere 10 μL nükleaz içermeyen suda çözün.

3. SLAS kullanarak floresan deneyi

  1. AO (DMSO'da 0.1 mM, 10x), SLAS-S (nükleaz içermeyen suda 10 μM, 10x), SLAS-U (nükleaz içermeyen suda 10 μM, 10x) ve 4x tahlil tamponu (80 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl) stok çözeltileri hazırlayın.
    NOT: Potasyum iyonları, boya bağlama bölgesinin bir parçası olan aptamerin varsayılan G-dörtlü motifini stabilize etmek için gereklidir. 1x tahlil tamponunda 1 mM KCl (25 mM MgCl2'de) kadar az, boşluk üzerinde spesifik hedef M'nin varlığında ~ 14 kat floresan artışı sağlamak için yeterlidir (hedefsiz numune; Ek Şekil 2B). Magnezyum iyonları, nükleik asit ipliklerinin etkileşimlerini stabilize eder (SLAS-S, SLAS-U ve hedef arasında). 1x Test Tamponundaki Mg2 + konsantrasyonu en az 5 mM olmalıdır (20 mM KCl'de; Ek Şekil 2C,D). AO'nun stok çözeltisi (~ 1 mM) DMSO'da hazırlanır. SLAS-S ve SLAS-U'nun stok konsantrasyonları isteğe bağlıdır ve tellerin nihai konsantrasyonları korunduğu sürece gerekirse ayarlanabilir (Tartışmadaki nihai SLAS konsantrasyonunun seçilmesi için gerekçeye bakın).
    DİKKAT: AO yutulduğunda zararlıdır, cilt ile temasında toksiktir ve kansere neden olduğundan şüphelenilir. AO çözümleriyle çalışırken daima eldiven giyin. AO'nun tartılması ve stok çözeltilerinin hazırlanması kimyasal davlumbaz altında yapılmalıdır.
  2. Hedef dışındaki tüm tahlil bileşenlerini içeren ana karışımı hazırlayın. Numune hacmini (60 μL) numune sayısı artı bir (n+1) ile çarparak ana karışım hacmini (Vkarışımı) hesaplayın:
    figure-protocol-3
    Numune sayısı n, gerekli negatif ve pozitif kontrolleri içermelidir.
  3. 0.25x Vkarışımı μL 4x Tahlil Tamponu, 0.1x Vkarışımı μL 0.1 mM AO, 0.1x Vkarışımı μL 10 μM SLAS-S ve 0.1x Vkarışımı μL 10 μM SLAS-S'yi birleştirin. Adım 3.4'te figure-protocol-4 eklenen hedef hacmi barındıracak şekilde son hacmine nükleaz içermeyen su ekleyin. Ana karışımı girdap haline getirin ve kısaca santrifüjleyin. Ana karışımın 50 μL'sini n numune tüpüne ekleyin.
    NOT: Numune hacmi, floresan sinyalini algılamak için kullanılan cihazın özelliklerine bağlı olarak ayarlanabilir. Numune tüplerine aktarılan ana karışımın hacmi, adım 3.4'te eklenen hedef hacme göre ayarlanabilir. Ana karışımı yapmak için eklenen nükleaz içermeyen su hacmi buna göre ayarlanmalıdır. Örneğin, hedef içeren numune, nihai numune hacminin 'unda (V/V) eklenirse, ana karışıma 0,9x Vkarışıma kadar su eklenmelidir.
  4. Bir örneği hedefsiz kontrol (boş) ve bir örneği pozitif kontrol olarak kullanın. 10-1000 nM hedef içeren 60 μL'lik nihai numune hacmini elde etmek için ana karışıma (50 μL) 10 μL hedef içeren numune ekleyin. Boşluk için hedef yerine nükleaz içermeyen su (10 μL) kullanın. Pozitif kontrol için, hedeflenen diziyi içeren sentetik bir DNA oligonükleotidi kullanın (örneğin, hedef M, Tablo 1). 0.1-0.5 μM nihai konsantrasyon yapmak için 10 μL 0.6-3 μM kontrol ekleyin.
    NOT: Bu pozitif kontroldeki yüksek floresan, test edilen bilinmeyen numuneler için negatif bir sinyal gözlense bile testin beklendiği gibi çalışmasını sağlar.
  5. Numuneleri karıştırın ve bir mikrosantrifüj kullanarak döndürün. Numuneleri 22 °C'de 10-60 dakika inkübe edin. Sinyal, 40 dakika ile 60 dakika arasında yalnızca %<15 oranında artar (Şekil 3).
  6. Bir floresan spektrofotometre kullanarak 475 nm'de uyarma üzerine numunelerin floresansını 540 nm'de ölçün.
    NOT: İnce duvarlı PCR tüplerinde floresanı ölçen portatif bir florometre kullanmak mümkündür. Florometrenin, AO floresansını tespit etmek için uygun uyarma ve emisyon filtrelerine sahip olması gerekir. Uygun bir uyarma filtresine bir örnek, 495 nm'lik bir kısa geçiştir. Uygun bir emisyon filtresi örneği 510-580 nm'dir. Alternatif olarak, numunedeki AO floresansının bir UV veya Mavi ışık kaynağı ile uyarılması üzerine sinyal görsel olarak gözlemlenebilir.
    DİKKAT: UV lambası kullanılıyorsa, UV koruyucu gözlük takın.

figure-protocol-5
Şekil 3: SLAS-29U/30S için sinyal üretiminin zamana bağımlılığı. AO, SLAS-29U ve SLAS-30S içeren bir numune, 60 dakika boyunca bir floresan spektrofotometrenin kinetik modu (475 nm'de uyarma, 540 nm'de emisyon, 5 nm uyarma/emisyon yarıkları) kullanılarak analiz edildi. 5 dakikalık bir sürede (bir okla gösterilir), numuneye hedef M eklendi. Verilerin ortalaması iki bağımsız denemeden alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinyal muhabiri olarak DAP-10-42 çekirdeğini kullanan SLAS'ın performansı, agresif bir beyin kanseri formu olan glioblastoma multiforme'nin (GBM) ilerlemesi için önemli olan NANOGP8 genin bir parçasını sorgulamak için tasarlanmış bir prob kullanılarak gösterildi21. Bu parçanın, kanser hücrelerinden türetilen eksozomların DNA kargosunda SNS'ler içerdiği bildirildi22. Bu nedenle, SLAS, genin SNS bölgesine göre uyarlandı. Bu protokoldeki SLAS performansını göstermek i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rapor edilen protokolde, kritik adımlar şunları içerir: (i) SLAS tasarımı; (ii) tahlil sıcaklığı; (iii) tek ve iki değerlikli metal katyonlarının varlığı (K+ ve Mg2 +); (iv) SLAS ipliklerinin konsantrasyonları.

SLAS tasarımı
SLAS ipliklerinin tasarımında, hedeflerin yokluğunda ve spesifik veya spesifik olmayan hedefin varlığında (SNS-farklılaşması gerekiyorsa) SLAS-S ve SLAS-U iplikleri tarafından oluşturulan kompleksl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UCF Lisans Araştırma Ofisi'nden (OUR) AK için sağlanan fonlar büyük beğeni topluyor. NANOGP8 geni için LATE-PCR koşullarının optimizasyonu üzerine yapılan çalışmalar, Florida Kanser İnovasyon Fonu (hibe MOABC) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Auramin OMP Biomedicals 195064sinyal raporlaması için kullanılan florojenik bir boya
Cary Eclipse FlorometreAgilent TeknolojileriG9800A Serisinumunelerin floresan sinyalini ölçmek için
Dimethy SülfoksitMP Biomedicals 196055Auramine O'nun stok çözeltilerini hazırlamak için çözücü
DNA oligonükleotitleri (primerler, SLAS iplikleri, PCR için sentetik şablon)IDTYOKsatıcı tarafından özel olarak yapılmış ve tuzdan arındırılmış, daha fazla saflaştırma yapılmadan kullanılmış
dNTP karışımı, 10 mMThermoFisher BilimselR0191GEÇ PCR reaksiyonu için
Magnezyum klorürInvitrogenAM9530Gtampon bileşeni; probun ipliklerinin analiz edilen hedefle doğru ilişkisi için gereklidir
Mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)Balıkçı markası02-681-320Numune hazırlama için plastik
Mikropipet (0.1-2.5 &mikro; L)EppendorphK56877GNumune hazırlama için kullanılır
Mikropipet (100-1000 &mikro; L)EppendorphK13160FNumune hazırlama için kullanılır
Mikropipet (20-200 &mikro; L)EppendorphJ05253MNumune hazırlama için kullanılır
Mikropipet (2-20 &mikro; L)EppendorphG24675GNumune hazırlama için kullanılır
Mini SantrifüjCorning 6770örnekleri döndürmek için kullanılır 
Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile İşlenmemiş)ThermoFisher BilimselAM9932PCR ve SLAS testindeki numuneler için kullanın
PCR tüpleri (0,5 mL)InvitrogenAM9932Quantus florometre kullanarak floresansı ölçmek için
Pipett uçları (20-200 &mikro; L)VWR76322-150Numune hazırlama için plastik
Pipet uçları (1-10 uL)VWR76322-528Numune hazırlama için plastik
Potasyum Klorür DavetliAM9640Gtampon bileşeni; probun floresan ışıklı aptamer alanının doğru katlanması için gereklidir
Quantus FlorometrePromegaE6150 SerisiFloresan ölçümleri için kullanılabilen taşınabilir düşük maliyetli florometre
Kuvars küvetYıldız16.50F-Q-10/Z15Cary Eclipse florometre kullanılarak floresan ölçümü için kullanılacak
Standart Taq Tamponlu Taq DNA PolimerazNew England Biyo LaboratuvarlarıM0273SSLAS tahlili ile analiz edilecek bir gen parçasının amplifikasyonu için 
Tris-HCl tamponu (pH 7.4)Boston BiyoürünleriR-314 Serisitampon bileşeni
UV lambasıUVP'nin95-0016-14görsel sinyal gözlemi için AO'yu uyarmak için
Vorteks KarıştırıcıVWR10153-838numuneleri karıştırmak için kullanılır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).
  3. Kolpashchikov, D. M. An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions. Scientifica. 2012, 928783(2012).
  4. Kolpashchikov, D. M. A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition. J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).
  5. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).
  6. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  7. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  8. Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences. Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).
  9. Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications. Analyst. 145, 701-718 (2020).
  10. Du, Y., Li, B., Wang, E. "Fitting" makes "sensing" simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers. Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).
  11. Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. Binary (split) light-up aptameric sensors. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).
  12. Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors. Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).
  13. Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing. Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).
  14. Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons. Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).
  15. Wang, L., et al. MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform. Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).
  16. Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids. Methods. 197, 82-88 (2021).
  17. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clin Chem. 62, 947-958 (2016).
  18. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).
  20. Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).
  21. Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review. Cancers. 14, 2412(2022).
  22. Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker. PLoS One. 13, e0197782(2018).
  23. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).
  24. Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. Metal cations in G-quadruplex folding and stability. Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).
  25. Chen, R. F. Fluorescence of free and protein-bound auramine O. Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).
  26. Klymchenko, A. S. Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications. Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

Related Articles