Yöntem makalesi

Canlı Etiketsiz Meme Kanseri Hücrelerinin Fenotiplemesini Geliştirmek için Multimodal Bir Görüntüleme Çerçevesi

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, canlı insan meme kanseri hücrelerinin etiketsiz, non-invaziv fenotiplemesi için Raman spektroskopisi ve tomografik faz mikroskobunu birleştiren multimodal bir yaklaşım sunar. Hızlı, kantitatif morfo-kimyasal analiz için kullanıcı dostu, insan yanlılığı içermeyen bir analiz hattı içerir ve kanser araştırmaları ve hücre biyolojisindeki uygulamalarla ayrıntılı moleküler ve yapısal bilgiler sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan meme kanseri hücrelerinin hızlı morfo-kimyasal fenotiplemesi için multimodal konfokal Raman mikrospektroskopisi (RS) ve tomografik faz mikroskobu (TPM) sunuyoruz (MDA-MB-231). Bu gelişmiş mikroskopi tekniklerinin bozulmayan doğasından yararlanarak, doğal fizyolojik ortamlarında yaşayan, etiketsiz hücrelerden ayrıntılı morfo-moleküler veriler elde ettik. Hiperspektral Raman görüntülerini (600 cm-1'den 1800 cm-1'e kadar uzanan, çok çeşitli moleküler bağları ve hücre altı yapıları benzersiz bir şekilde karakterize eden Raman modlarını kapsayan) ve ayrıca üç boyutlu kırılma indisi tomogramlarından (nanometre çözünürlükte hücre hacmi, yüzey alanı, ayak izi ve küresellik ölçümleri sağlayan) morfolojik verileri analiz etmek için insan önyargısız veri işleme boru hatları geliştirilmiştir. kuru kütle ve yoğunluğun yanı sıra). RS ve TPM'nin sunduğu zengin tek hücreli detayları sistematik olarak parçalayarak, tümöral meme kanseri hücrelerinin fenotiplendirilmesi için böyle bir multimodal mikroskopi yönteminin avantajını nicel bir şekilde gösteriyoruz. Araçlarımız ayrıca herhangi bir etiket kullanmadan hücre altı bilgiler hakkında daha fazla bilgi sağlar. Son olarak, RS ve TPM'den türetilen veri kümelerinin sahip olduğu benzersiz veya ilişkili bilgileri inceliyor ve tartışıyoruz. Araçlarımızın ve nicel veri analizi boru hatlarımızın, kültürdeki canlı hücreler üzerinde hızlı ve pertürbatif olmayan bir yönteme ihtiyaç duyulduğunda biyomedikal araştırmalarda fenotipleme görevlerinde devrim yaratabileceğine ve gelecekte klinik ve teşhis uygulamalarına çevrilme potansiyeline sahip olabileceğine inanıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre karakterizasyonu ve fenotipleme, biyomedikal araştırmanın önemli yönleridir1. Hücreleri hem morfolojik hem de moleküler seviyelerde karakterize edebilmek, hücre fonksiyonunu, farklılaşmasını ve patolojisini anlamak için çok önemlidir 1,2,3. Tümör teşhisi, hastalık evresinin belirlenmesi ve nihayetinde terapötik hedeflerin belirlenmesi için doğru hücre profillemesinin gerekli olduğu onkoloji alanında özellikle ilgi çekicidir2. Geleneksel hücre karakterizasyon yöntemleri zamansal dinamikler sağlayamaz ve genellikle hücrelerin doğal durumuna müdahale edebilecek ve veriler içinde potansiyel sapmalara neden olabilecek boyama veya etiketleme gibi invaziv tekniklere dayanır4. Bu nedenle, canlı hücrelerin doğal, bozulmamış hallerinde doğru ve kapsamlı fenotiplemesini sağlamak için invaziv olmayan stratejiler giderek daha fazla talep görmektedir.

Bu bağlamda, etiketsiz multimodal görüntüleme yöntemleri, hem morfolojik hem de moleküler bilgileri yakalamak için tamamlayıcı modaliteleri birleştirerek hücre biyolojisi araştırmalarında devrim yaratmıştır 2,5. Bu yaklaşımlar, bireysel geleneksel tekniklerin her zaman sağlayamayacağı hücrelerin entegre ve non-invaziv karakterizasyonuna izin verir 2,5,6. Örneğin, floresan mikroskobu gibi mikroskopi teknikleri, morfolojik ve fonksiyonel hücre görüntülemede yaygın olarak kullanılmasına rağmen, doğal sınırlamalara sahiptir. Floresan yöntemleri genellikle foto-ağartma, fototoksisite ve analitik potansiyeli kısıtlayan düşük miktarlarda hedeflenebilir moleküllerden muzdariptir4. Ek olarak, bu yaklaşımlar genellikle doğal hücre durumunu bozabilecek veya artefaktlara yol açabilecek eksojen etiketlerin veya boyaların kullanılmasını gerektirir7.

Çoklu görüntüleme modalitelerinin güçlü yönlerini bir araya getiren multimodal görüntüleme platformları, canlı hücrelerden farklı türde verilerin etiketlemeye ihtiyaç duymadan elde edilmesini sağlayarak bu sınırlamaları aşıyor. Raman spektroskopisinin (RS) faz kontrast mikroskobu veya tomografik faz mikroskobu (TPM) gibi diğer görüntüleme modaliteleri ile entegrasyonu, tek tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için umut verici bir strateji olmuştur. Gerçekten de, multimodal görüntüleme, özellikle moleküler ve yapısal özelliklerin doğru karakterizasyon için çok önemli olduğu karmaşık biyolojik durumlarda ve kanser gibi patolojilerde hücresel fenotiplerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar 2,5.

Etiketsiz RS, hücrelerin kimyasal görüntülenmesi için çok uygundur8. RS, moleküler titreşim modlarını tespit ederek, 9,10,11 hücrelerinin moleküler bileşimi hakkında derinlemesine bilgi ortaya çıkarabilen biyokimyasal parmak izleri sağlar. Biyolojik örneklerden elde edilen Raman spektrumları, hücrelerin moleküler yapısını anlamada önemli rol oynayan lipitler, proteinler, nükleik asitler ve metabolitler gibi çeşitli biyomoleküller hakkında bilgi içerir 9,12. RS'nin temel güçlü yönlerinden biri, invaziv olmaması ve canlı hücrelerin fizyolojik durumlarını değiştirmeden doğal hallerinde karakterizasyonuna izin vermesidir.

Birçok avantajına rağmen, RS ayrıca bazı sınırlamalar sunar. Gerçekten de, RS ayrıntılı moleküler bilgi sağlamasına rağmen, hücrelerin morfolojisi veya yapısı hakkında nicel bilgiye izin vermez2. TPM gibi tamamlayıcı görüntüleme tekniklerinin çok önemli bir rol oynadığı yer burasıdır.

TPM, bir kantitatif faz görüntüleme (QPI) biçimidir13,14 ve hücre morfolojisi 15,16 hakkında yüksek çözünürlüklü, etiketsiz nicel bilgilerin görselleştirilmesini sağlar. TPM, kontrast madde gerektirmemesi bakımından geleneksel mikroskopi tekniklerinden farklıdır; bunun yerine, numunenin17 kırılma indisindeki (RI) değişikliklerden kaynaklanan faz kaymalarını ölçerek çalışır. Faz kaymaları, hücresinin hacmi, yüzey alanı, şekli ve iç yapısı dahil olmak üzere yapısal özellikleri hakkında bilgi sağlar 2,18. TPM, nanometre seviyesine kadar yüksek uzamsal çözünürlük elde edebilir ve bu nedenle canlı hücrelerin yüksek çözünürlüklü morfolojik ayrıntılarını kaydetmek için ideal bir tekniktir. Ayrıca, 3D RI tomogramlarını yeniden oluşturma yeteneği, hücre altı yapıların vivo ortamlarında18 görselleştirilmesini mümkün kılar ve 2D projeksiyonlara kıyasla daha doğru bilgiler sağlar. Bununla birlikte, TPM'nin ana sınırlamalarından biri, farklı kimyasal bileşenler arasında ayrım yapamadan veya biyokimyasal özellikleri tanımlayamadan, öncelikle hücrenin morfolojisi ve faz dağılımı hakkında bilgi sağladığı için kimyasal özgüllük eksikliğidir.

RS ve TPM'nin multimodal bir teknikte kombinasyonu, hücre fenotiplemesinde avantajlar sağlar. RS zengin moleküler bilgiye izin verirken, TPM, hücresel morfolojinin önemli ölçüde ayrıntılı olarak analiz edilmesine izin veren yapısal bir yön ekler. Son zamanlarda, RS'nin TPM ile kombinasyonu, kanser araştırmalarına odaklanan çeşitli çalışmalarda başarıyla gösterilmiştir 2,19,20. Örneğin, önceki çalışmalar, Raman spektroskopisinin holografik faz mikroskobu verileriyle birlikte kaydedilmesinin, farklı hücre tipleri ve tümör gelişim aşamaları arasında ayrım yapılmasına olanak tanıyan tamamlayıcı moleküler ve morfolojik bilgiler sağlayabileceğini bildirmiştir2. Bu araştırmalar, özellikle hücrelerin moleküler ve yapısal özelliklerinin maligniteleri ve davranışlarıyla yakından bağlantılı olduğu kanser bağlamında, hücre fenotiplemesinin doğruluğunu artırmak için multimodal görüntülemenin gücünü vurgulamıştır 2,20.

Multimodal görüntülemedeki son ilerlemeye rağmen, özellikle veri işleme ve analizinde hala ele alınması gereken zorluklar bulunmaktadır21. Multimodal görüntüleme tekniklerinin sağladığı büyük miktarda verinin analiz edilmesi zahmetli olabilir ve anlamlı bilgiler elde etmek için basit prosedürler kullanılmalıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, verilerin karmaşıklığını ele almak ve analizdeki insan yanlılığını en aza indirmek için kullanıcı dostu veri işleme boru hatları oluşturulmalıdır. Bu tür boru hatları, sonuçların doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin elde edilmesi ve bu yaklaşımların klinik ve tanısal uygulamalara olası çevirisi için kritik öneme sahiptir.

Bu çalışmanın amacı, canlı tek kanser hücrelerinin etiketsiz, yüksek hızlı ve pertürbatif olmayan fenotiplemesi için RS'yi TPM ile birleştirme potansiyelini göstermektir. Bu iki sağlam görüntüleme yaklaşımını birleştirerek, insan meme kanseri hücrelerinin moleküler ve morfolojik özelliklerinin kapsamlı ve kantitatif bir karakterizasyonunu sağlıyoruz (MDA-MB-231). Çalışma ayrıca, çok modlu veri kümelerinden çıkarılan bilgilerin doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için insan yanlılığı içermeyen veri işleme boru hatları oluşturmanın önemini vurgulamaktadır. Burada, diğer hücre türlerine genelleştirilebilecek kanser hücresi fenotiplemesi için sağlam bir platform oluşturmaya çalışıyoruz. Bu yaklaşımın çok yönlülüğü ve hassasiyeti, onu temel hücre biyolojisi çalışmalarından teşhise kadar çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için potansiyel bir aday haline getirmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune hazırlama

  1. MDA-MB-231 hücrelerini kuvars Petri kaplarına tohumlayın.
    1. MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerini 3,5 cm kuvars cam tabanlı Petri kaplarına yerleştirin.
    2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ortamında, yüzeye tamamen yapışana kadar (tohumlamadan en az 12 saat sonra) inkübe edin.
  2. Hücreleri yıkayın ve ölçüm için hazırlayın.
    1. Petri kabına yapıştıktan sonra kültür ortamını hücrelerden çıkarın.
    2. Kalan ortamı çıkarmak için hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın.
    3. Taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve canlılıklarını sağlamak için hücreleri tüm ölçüm prosedürü boyunca ortamla kaplı tutun.
      NOT: Kültür ortamı olarak, bu çalışmada% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve penisilin (100 IU / mL) -streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş Fenol kırmızısı içermeyen DMEM / F-12 kullanılmıştır.

2. Yüksek verimli Raman mikroskop sistemi

NOT: MDA-MB-231 hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi ile ilgili mevcut çalışma için kullanılan ev yapımı Raman mikroskobunun teknik detayları daha önce açıklanmıştır22. Kısaca, kullanılan özel yapım yüksek verimli Raman mikroskop sistemi, 532 nm'lik bir lazerle pompalanan 785 nm'lik bir Ti-Safir lazere sahiptir (Şekil 1A). 785 nm Raman uyarma lazeri, ters çevrilmiş bir IX83 floresan mikroskobu gövdesine bağlanır ve uyarma, 749 nm dikroik ayna kullanılarak UPLSAPO60× 1.2 NA suya daldırma hedefi aracılığıyla numuneye yönlendirilir. Bir polarizör, mikroskobun arka portundaki ortalama lazer gücünü ayarlar. Parlak alan görüntüleme, beyaz ışığın benzer şekilde birleştirilmesiyle sağlanır. Sistem, dikroik filtreleri otomatik olarak değiştirerek Raman ve parlak alan modları arasında geçiş yapar. Sistem, yüksek verimli görüntüleme için galvo ayna tabanlı ve aşamalı taramayı birleştirir. Özel bir MATLAB komut dosyası, veri toplama sürecini otomatikleştirmek için açık kaynaklı mikroskop kontrol yazılımı, bir veri toplama (DAQ) kartı ve sinyal algılama sistemleriyle etkileşime girer. Geri saçılan Raman ışığı aynı amaç tarafından toplanırken, görünür ışık 785 nm dikroik bir ayna tarafından filtrelenir ve bir NIR spektrografına ve bir yük bağlantılı cihaz (CCD) dedektörüne yönlendirilir. Bu kurulum, çok boyutlu görüntülemeyi, çeşitli konumlarda parlak alan, floresan ve Raman sinyallerini yakalamayı ve z-yığınlarınısağlar 2,22.

  1. Raman görüntüleme prosedürü
    1. Numunenin hazırlanması ve fizyolojik koşulların korunması
      1. Fizyolojik koşulları korumak için numuneyi sahnedeki inkübatöre yerleştirin. Sıcaklık kontrolü için gerçek zamanlı geri bildirim düzenlemesi ile inkübatörün 37 °C'ye ayarlandığından emin olun.
      2. Damıtılmış su ile doldurulmuş dahili çevresel banyo ünitesini kullanarak oda içindeki nem seviyelerini %>95'te tutun. CO2 gaz kontrol cihazını %5 CO2'yi %95 hava ile karıştıracak şekilde ayarlayın ve inkübatör odasına besleyin.
    2. Otomatik suya daldırma yönetimi
      1. Şırınga pompaları ve objektif ucuna yapıştırılmış şırınga iğneleri kullanarak objektif merceğine 2 μL/dk'lık bir akış hızında su sağlamak için ev yapımı otomatik suya daldırma besleyiciyi açın.
      2. Buharlaşmayı önlemek ve ölçümler boyunca tutarlı görüntüleme koşulları sağlamak için su seviyelerini düzenli olarak kontrol edin.
    3. Raman spektroskopisi veri toplama
      1. Pompa lazerini açın ve 75 mW'lık örnek düzlemde bir lazer gücü elde etmek için gücünü ayarlayın.
      2. Micro-manager açık kaynaklı mikroskop kontrol yazılımını açın. Yapılandırma ayarlarında BF'yi seçin ve parlak alan görüntüsünü görselleştirmek için yazılım penceresinin sol tarafındaki Canlı'ya tıklayın. Raman spektrumunun elde edileceği istenen tek hücreyi seçin. Ardından, parlak alan görselleştirmesini sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
      3. CCD kameradaki sinyal sayılarını en üst düzeye çıkararak Raman görüntüleme düzleminin Z koordinatını ayarlayın.
      4. Bunu yapmak için CCD kamera kontrol yazılımını (LightField) açın; Deney Ayarı'nda, Pozlama Süresi'ni 1,5 sn olarak ayarlayın. Ardından, Deney araç çubuğunda Çalıştır'a tıklayın ve lazer ışınını açın.
      5. Ardından, biyolojik imzalarla ilişkili Raman tepe noktalarının görselleştirilmesini optimize etmek için parmak izi bölgesindeki sinyal sayılarını en üst düzeye çıkarmak için Z konumunu 600 cm-1'den 1800 cm-1'e ayarlayın. Ardından lazeri kapatın ve CCD kamera yazılımının Deney çubuğunda Durdur'a tıklayın ve yazılımdan çıkın.
        NOT: CCD kameradaki maksimize edilmiş Raman sinyal sayılarının, kuvarsın oldukça içine düşen bir odak noktası nedeniyle, hücreyle ilgili Raman zirvelerinin herhangi bir izini göstermeyen görüntüleme düzlemine göre +8 μm ile çakışan Z ekseni boyunca konumla uyumlu olduğu gözlemlendi. Bu değer hücre tipine ve durumuna göre değişebilir.
    4. Çok boyutlu ölçümlerde Raman kanallarını otomatik olarak işleyecek ve hiperspektral Raman verilerini kaydedecek olan MATLAB komut dosyasını kullanarak veri toplama sürecini başlatın.
    5. Görüş alanını 50 × 50 μm2, 40 × 40 piksel olarak ayarlayın × her piksel alanı 1,25 μm2'ye karşılık gelir. Her Raman spektrumu için maruz kalma süresini 1,5 saniyeye eşit olarak ayarlayın.
      NOT: Bilinen Raman tepe noktalarına açıklama eklemek için asetamidofenol örneklerini kullanarak düzenli olarak dalga sayısı kalibrasyonu yapın. İkinci dereceden enterpolasyon yoluyla Raman kaydırma eksenini kalibre edin.
      DİKKAT: Lazerleri dikkatli kullanın. Kurulum ve çalıştırma sırasında her zaman lazer dalga boyuna göre derecelendirilmiş uygun koruyucu gözlük kullanın.

3. RS veri analizi

  1. RamApp web tabanlı araç (https://ramapp.io/) aracılığıyla işlem sonrası Raman hiperspektral haritaları:
    1. Web tabanlı araçta oturum açın.
    2. Hiperspektral verileri içe aktarın. Analizlerim sekmesinde Yeni'ye tıklayın ve uzamsal ve spektral veri değişkenini ve x ekseni değişkenini (yani Raman kayma değerleri) içeren .mat dosyasını yükleyin.
    3. Spektrumu Raman kaymasında belirtilen bölgelere kesmek için, Kırp ve döndür açılır menüsünde Spektral kırpma'ya tıklayın ve Raman kaydırma bölgesinin alt kenarlığını ve üst kenarlığını sırasıyla 600 cm-1 ve 1800 cm-1'e eşit olarak tanımlayın.
      NOT: Bu spektrum kesmeyi gerçekleştirerek, Petri kabının kuvars materyali ile ilgili geniş ve yüksek genlikli tepe noktası analizden çıkarılır.
    4. Kozmik ışınlar için Raman spektrumlarını düzeltmek için, Gürültü Giderme seçeneklerinde Despike'a tıklayın, Yöntem olarak Z-skorunu seçin ve Eşiği 8'e eşit olarak ayarlayın.
      NOT: Despike ön işleme işlevi, sinyallerinde kozmik ışınlardan kaynaklanan ani artışlar içeren pikseller sorununun ele alınmasına yardımcı olur.
    5. Spektrum boyunca yoğunlukların ilk ayrık farkını kullanarak aykırı değerleri bulmak için İlk farkı kullan seçeneğini işaretleyin ve Ani artışları düzelt seçeneğini işaretleyin. Her bozuk pikselin spektrumu, komşu piksellerinin medyan spektrumu ile değiştirilecektir.
    6. Ani artışları düzeltmek için Çalıştır'a tıklayın.
    7. Her bir dalga numarasına karşılık gelen haritalardaki gürültüyü gidermek için, Gürültü Giderme seçeneklerinde, Düzgün Harita'ya tıklayın, Medyan filtresini seçin ve haritanın her pikseline filtre uygulanırken dikkate alınan karenin kenarının boyutunu 3 piksele eşit olarak ayarlayın. Ardından Çalıştır'a tıklayın.
    8. Her pikselin spektrumunu düzgünleştirmek üzere bir filtre uygulamak için, Gürültü giderme seçimlerinde Düzgün spektrum'a tıklayın. Yöntem olarak Savitzky-Golay filtresini seçin ve filtre penceresinin uzunluğunu 7'ye ve filtrenin polinom sırasını 2'ye eşit olarak ayarlayın. Ardından, Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Bir Savitzky-Golay filtresi, filtre penceresinin uzunluğunun (pozitif bir tek tamsayı) ve polinomun sırasının belirtilmesini gerektirir.
    9. Ortalama arka plan sinyalini ön plandan kaldırmak için Optik alt tabaka kaldırma panelini açın ve Alt tabakayı tanımla'ya tıklayın. K-ortalamaları bir Yöntem olarak ayarlayın ve küme sayısını 2'ye eşit olarak ayarlayın.
      NOT: Bu işlev, bir kümeleme yaklaşımı kullanarak hücreleri ("ön plan") ve alt tabakalarını bölümlere ayırır. Daha sonra ortalama arka plan sinyalini ön plandan kaldırabilecek veya bazı adımları yalnızca ön plan piksellerinde çalışacak şekilde kısıtlayabileceksiniz. Seçilecek küme sayısı, belirli örneğe bağlı olarak değişebilir.
    10. Gelişmiş seçeneklerde, bazı küçük lekeleri ön plandan kaldırmak için Morfolojik temizleme'yi işaretleyin (örneğin, sahte hücre parçaları vb.). Ardından Çalıştır'a tıklayın.
    11. Optik alt tabaka kaldırma panelinde, ortalama arka plan sinyalini çıkarmak için Alt tabakayı kaldır'a tıklayın, ardından Genel ortalama'yı (değerlerin merkezi %95'inin ortalaması) seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: K-ortalamaları, deterministik olmasa da tipik olarak daha hızlıdır (ancak, rastgele tohum sabit olduğundan, her çalıştırmada aynı sonuç elde edilir, diğer her şey eşittir). Ön planın belirli bölümleri hala arka plan olarak tanınıyorsa, küme sayısı 2'nin üzerine çıkarılabilir. En düşük ortalama sinyale sahip küme arka plan olarak tanımlanır.
    12. Taban çizgisi floresansını düzeltmek için, Taban Çizgisi panelini açın ve Taban çizgisini düzelt'i tıklatın. asPLS'yi (Uyarlanabilir Pürüzsüzlük PLS) seçin ve λ'yı 5000000'e eşit olarak ayarlayın. Ardından, Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Seçilebilecek 7 mevcut yöntem vardır, bunlardan 5'i cezalandırılmış en küçük karelere (PLS) dayanmaktadır. Bu PLS yöntemlerinde, bir yumuşatma parametresi (λ) gereklidir. Daha yüksek bir λ değeri, daha düzgün taban çizgileri ile sonuçlanacaktır.
    13. Her Raman hiperspektral haritasını Frobenius normuna bölerek normalleştirmek için Çeşitli'ye tıklayın ve Normalleştir seçeneğini seçin. Ardından, Yöntem olarak Frobenius'u seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Frobenius normu, tüm veri matrisini normalleştirmek için kullanılır.
    14. Bir hücre altı bileşeninin uzamsal dağılımını gösteren sahte renkli bir görüntü elde etmek için, sağ taraftaki Görüntüler panelinde, Yoğunluk Görüntüsü'nde, Aç menüsü sembolünü tıklatın. Ardından Resmi düzenle düzenleme panelini açma seçeneği.
    15. Düzenleme panelinde Tek bant'ı seçin, ardından spektral aralığı tanımlayın (örneğin, sitoplazma için 715−725 cm-1). Renk haritasında Çift renk'i seçin, rengi, yoğunluk eşiğini ve opaklığı tanımlayın ve ardından Onayla'yı tıklayın.
    16. Tek noktalı bir spektrumu indirmek için, seçmek üzere görüntüdeki ilgilenilen piksele tıklayın. Ardından, Spektral gösterge panelinde, İmleç bölümünde, Spektrumu indir'e tıklayın. Farklı hücre altı bileşenler için aynı prosedürü tekrarlayın.
    17. Ön plan ve alt tabaka Raman spektrumlarını dışa aktarmak için, Spektral gösterge panelinde, Alt tabaka tanımlama bölümünde, hem Ön Plan hem de Alt Tabaka bölümleri için Spektrumu indir'e tıklayın.
      NOT: RS veri analizi için daha önce açıklanan protokolde, temel hücre altı bileşenlerin uzamsal dağılımını, hem ön plandan hem de substrattan Raman yoğunluk spektrumlarını ve hücre altı yapıların tek noktalı spektrumlarını gösteren sahte renkli görüntüler oluşturmak için ön işleme adımları ve tek değişkenli analiz açıklanmıştır. Aşağı akış analizi genellikle spesifik biyolojik soruya göre uyarlanmış olsa da, bu çalışma artık kullanılan web tabanlı aracın Harita analizi bölümü aracılığıyla erişilebilen temsili çok değişkenli ve sınıflandırma yöntemlerini vurgulamaktadır. Bunlar arasında Küme analizi, Temel Bileşen Analizi (PCA), Çok Değişkenli Eğri Çözünürlüğü (MCR), N-FINDR ve Spektral uydurma bulunur. Spektral uydurma, Pearson Korelasyon Katsayısı veya Spektral Açı Haritalayıcı gibi mesafeye dayalı yaklaşımları kullanarak spektral özelliklerin nicelleştirilmesini ve karşılaştırılmasını sağlar. Küme analizi, spektral benzerliğe dayalı olarak hiperspektral verilerin segmentasyonunu kolaylaştıran k-ortalamaları, Mini toplu k-ortalamaları veya hiyerarşik aglomeratif kümeleme gibi algoritmalar kullanılarak gerçekleştirilebilir. PCA, veri boyutsallığını azaltmak ve varyans modellerini vurgulamak için uygulanabilirken, MCR, karışık sinyallerin saf bileşen spektrumlarına ayrıştırılmasına izin verir. N-FINDR algoritması, boyutsallığı azaltmak için önce PCA uygulayarak uç üye spektrumlarının çıkarılmasına yardımcı olur ve bu da onu özellikle hiperspektral veri kümeleri için uygun hale getirir. Bu araçlar, Raman spektral verilerinde kodlanan biyolojik modellerin aşağı akış araştırması için sağlam bir çerçeve sağlar.

4. TPM ölçüm protokolü

  1. Mikroskop kurulumunu hazırlayın.
    1. Mikroskobun objektif merceğine bir damla damıtılmış su koyun. Numuneyi mikroskobun çeviri aşamasına yerleştirin. Objektif lens ile hizalamak için örnek konumunu ayarlayın.
  2. Objektif ve kondansatör lenslerini hizalayın.
    1. Mikroskobu açın ve TomoStudio görüntüleme yazılımını başlatın. Araç çubuğundaki mikroskop simgesini tıklayın. Başlatmadan sonra, Yapılandırma'ya tıklayın. İş panelinde LiveCell'i ve Ortam olarak PBS'yi seçin.
      NOT: Orta panelindeki RI değeri, ortam olarak PBS seçildiğinde otomatik olarak 1,337'ye ayarlanır.
    2. Görüntüleme yazılımının kontrol panelindeki Kalibrasyon sekmesine erişin. Sırasıyla Odak ve Yüzey'i seçerek objektif ve kondansatör merceklerin eksenel konumlarını ayarlayın.
    3. Lensleri manuel olarak ayarlamak için Tarama modu'na tıklayın, böylece aydınlatma desenlerinin görüş alanının merkezinde yoğunlaştığından ve neredeyse hareketsiz göründüğünden emin olun.
  3. Örneği bulun.
    1. Normal mod'u tıklatın ve hücreyi görüş alanında konumlandırmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Numune sınırı ekranda neredeyse görünmez hale gelene kadar objektif merceğin eksenel konumunu ayarlayarak numuneye odaklanın.
    2. Hücresiz bir bölgeyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın ve engelsiz bir görünüm sağlayın.
  4. Sistemi kalibre edin.
    1. Farklı aydınlatma açılarında birden fazla 2B hologram yakalamak için görüntüleme yazılımında Ayarla'yı seçin.
  5. 3D RI tomogramını edinin.
    1. Hücreyi görüş alanı içinde ortalamak için çeviri aşamasını ayarlayın. Edinme sekmesine gidin ve hücrenin tomogramını yakalamak için 3B Anlık Görüntü'yü seçin.
      NOT: Tek bir hücrenin 3D RI tomogramı için alım süresi, RS verilerinin gerektirdiği alım süresine kıyasla önemli ölçüde daha kısadır (saniye mertebesinde); bu nedenle, TPM için sahnede bir inkübatörün benimsenmesi tipik olarak gerekli değildir. Bununla birlikte, çok sayıda hücre üzerinde veya belirli koşullarda ölçüm yapılacaksa, fizyolojik koşullar sağlayan özel ticari inkübasyon odaları mevcuttur ve TPM sistemine entegre edilebilir.

5. TPM veri analizi

  1. TomoStudio yazılımını kullanarak işlem sonrası TPM haritaları.
    1. Holografik tomogramları görselleştirmek için, Veri Gezintisi panelinde verileri seçin, verileri sağ tıklatın ve Aç'ı tıklatın. Araştırma sekmesi daha fazla analiz için otomatik olarak açılacaktır. Veri Yöneticisi panelinde, RI Tomogram'a tıklayın.
    2. Hacim Görselleştirme panelinde, RI'yi seçin ve RI tuvali içinde dört dikdörtgen renk kutusu çizin.
      NOT: Her renk kutusu, Ekran panelinde gösterilen tomogramda, RI tuvalindeki kutu tarafından tanımlanan RI aralığı ile karakterize edilen hücre bileşenleriyle belirli bir rengin ilişkilendirilmesine izin verir. Her renk kutusunu çizdikten sonra, ilgili bilgiler otomatik olarak RI tuvalinin altındaki tabloda görünür.
    3. RI tuvalinin altındaki panelde, her renk kutusu için RI Aralığı'nın minimum ve maksimum değerlerini ayarlayın (yani, ilk renk kutusu: MinRI = 1,3450 ve MaxRI = 1,3499, ikinci renk kutusu: MinRI = 1,3506 ve MaxRI = 1,3571, üçüncü renk kutusu: MinRI = 1,3586 ve MaxRI = 1,3650, dördüncü renk kutusu: MinRI = 1,3688 ve MaxRI = 1,3866). Her kutuyla bir opaklık değeri ve bir renk (her kutuyu çift tıklatıp bir renk seçerek) ilişkilendirin. Bu, tomogramların 3D RI dağılımlarına göre görselleştirilmesine izin verir.
    4. Tanımlı RI Aralıklarını ve renk kutularını kaydetmek için Kaydet'i tıklatın.
      NOT: RI aralıkları, belirli numunelere bağlı olarak ayarlanmalıdır.
    5. Hücre morfolojisinin kantitatif tanımlayıcılarını (yani, hacim [V], yüzey alanı [S], öngörülen alan [A], ortalama RI, yoğunluk [D], kuru kütle [DM] ve küresellik [Φ]) elde etmek için Analiz arayüzünü kullanın.
      NOT: Kantitatif parametrelerin teorik hesaplaması ile ilgili ayrıntılar burada bulunabilir 2,23.
      1. Araç çubuğunda, Analiz'i tıklatın. Sağdaki Analiz panelinde, Segmentasyon panelinde Manuel'i seçin ve 1,3450'yi RI Eşiği olarak ayarlayın. Ardından Uygula'yı tıklayın.
        NOT: RII (fl/pg) ve Baseline RI değerlerinin sırasıyla 0.19 (önceki araştırmalar24 tarafından yaygın olarak belirlenen kırılma artışı) ve 1.3370 (PBS arka plan kalibrasyonunun RI için kullanılan PBS RI) olduğundan emin olun. Görüntüleme yazılımı, ayarlanan RI eşiğine göre hedef hücrenin hacimsel bir segmentasyonunu gerçekleştirir ve morfolojik indeksleri (V, S, A, ortalama RI, D, DM ve Φ) hesaplar ve bunları Ölçüm panelindeki bir çıktı tablosunda raporlar.
      2. Hesaplanan morfolojik indeksleri kaydetmek için Kaydet'e tıklayın.
        NOT: Kullanılan yazılıma ek olarak, TPM verilerinden morfolojik özellikleri ölçmek için çeşitli açık kaynaklı araçlar kullanılabilir. CellProfiler (https://cellprofiler.org/), faz kontrastlı görüntülerle uyumlu segmentasyon ve özellik çıkarma dahil olmak üzere görüntü analizi için araçlar sağlar. Fiji (https://fiji.sc/), segmentasyon ve morfolojik parametrelerin hesaplanması için eklentiler içeren açık kaynaklı bir yazılımdır25. Napari (https://napari.org/), segmentasyon ve analiz için makine öğrenimi modellerini entegre etme desteğine sahip çok boyutlu bir resim görüntüleyicidir. Ilastik (https://www.ilastik.org/), makine öğrenimi tabanlı segmentasyon araçları sunar ve DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/), gelişmiş analiz için derin öğrenme modellerini ImageJ/Fiji ile entegre eder. Ayrıca, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) Fiji'de 2B ve 3B morfolojik işlemler için araçlar sağlar. Cellpose326 , faz kontrastlı görüntülemeye uygulanabilen hücre segmentasyonu için başka bir derin öğrenme tabanlı araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücrelerin etiketsiz morfo-kimyasal karakterizasyonu için konfokal RS ve TPM'ye dayalı bir iş akışı tanımladık. Önerilen iş akışının, insan meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231'in moleküler bileşimine ve morfolojik parametrelerine ulaşma yeteneğini test ettik (Şekil 1).

MDA-MB-231 hücreleri, kuvars cam tabanlı Petri kaplarına ekildi. 785 nm sürekli dalga lazer uyarımında çalışan özel yapım bir konfokal Raman mikroskobu (Şekil 1A)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki gelişmiş, etiketsiz görüntüleme tekniğini entegre eden çok modlu bir yaklaşım ve basit bir analiz hattı sunduk: RS ve TPM. Açıklanan iş akışı, harici etiketlemeye ihtiyaç duymadan canlı insan meme kanseri tek hücrelerinin (MDA-MB-231) hızlı, invaziv olmayan morfo-kimyasal fenotiplemesini mümkün kılmıştır.

RS,moleküllerin 9,27,34,35 titreşim modlarının tespiti yoluyla biyolojik numunelerin biyokimyasal bileşiminin karakter...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, MIT-İtalya vakfının Progetto Rocca'sı, NIH hibeleri (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seul, Güney Kore) ve Kore Ulusal Kanser Merkezi (NCC-24H1170) tarafından finanse edilmiştir. Leonardo Bianchi, Massachusetts Institute of Technology ve Politecnico di Milano'da ortak araştırma yürütmek için Progetto Rocca Doktora Sonrası Bursu ödülünü kabul etti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CCD kameraPrinceton EnstrümanlarıPIXIS 100BR eXcelonRaman saçılma sinyali için dedektör.
CCD kamera kontrol yazılımıPrinceton EnstrümanlarıIşık Alanı
Sürekli dalga Ti-Safir lazer (dalga boyu: 785 nm)Spektrum-Fizik3900 SaniyeRaman mikroskobu uyarımı için kullanılır.
Dikroik aynaThorLaboratuvarlarıDMSP750B749 nm dikroik ayna, örnekleme için 785 nm Raman uyarımını saptırır, floresan ve parlak alan sinyallerini filtreler.
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher BilimselA5256701
Floresan mikroskop gövdesiOlympusIX83
Lazer (dalga boyu: 532 nm)Spektrum-FizikBin yıl eV785 nm Ti-Sapphire lazer sistemi için pompa lazeri.
MATLAB yazılımıMatematik İşleri2023a
MDA-MB-231 hücre hattıATCCHTB-26 Serisi
NIR spektrografıAndrorHolospec HS-HSG-785-LFGeri saçılan ışığın spektral analizi için kullanılır.
Objektif lens (60&kez; 1.2 NA suya daldırma)OlympusUPLSAPO60&zamanlar;
Sahne kuluçka odasıTokai Vuruşustxg-welsx-seti
Açık kaynaklı mikroskop kontrol yazılımı&mikro; MüdürMikro Yönetici-2.0
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Bilimsel15140122
Fenol içermez DMEM/F-12Thermo Fisher Bilimsel21041025
Fosfat tamponlu salinGibco10-010-023
Kuvars cam tabanlı Petri kaplarıB Teknolojisini UyandırSF-S-D12
Raman veri analiz yazılımıRam UygulamasıRaman hiperspektral veri işleme için web tabanlı araç.
sCMOS kameraHamamatsu FotonikOrca Flaş 4.0 v2
Şırınga pompasıKimyasalFüzyon 720
Tomografik faz mikroskobuTomocube, Inc.HT-2HKantitatif faz görüntüleri elde etmek için ticari sistem.
TPM veri analizi yazılımıTomocube, Inc.TomoStudioTomografik faz mikroskobu (TPM) verilerini analiz etmek için kullanılan yazılım.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Raman MikrospektroskopiTomografik Faz MikroskopisiMark rs z G r nt lemeMorfo Kimyasal FenotiplemeHiperspektral Raman G r nt lemeK r lma ndeksi TomografisiH cre Morfolojisi AnaliziSubsel ler Haritalama

İlgili makaleler