CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi

Summary

DNA parçalarının PCR amplifikasyonuna gerek kalmadan ilgilenilen DNA parçalarının vektörler arasında transferine izin veren yüksek verimli bir klonlama yöntemi olan CRISPR tabanlı mekik klonlama (CRISPRshuttle klonlama) için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Mevcut genomik depoları kullanarak genom çapında plazmit kütüphanelerinin geliştirilmesi, çeşitli biyolojik süreçler boyunca genlerin sistematik fonksiyonel karakterizasyonu için çok önemli bir ön koşul olarak hizmet eder. Bununla birlikte, vektörler arası DNA fragmanı transferi için mevcut yüksek verimli metodolojiler, klonlamadan önce hedef dizilerin PCR amplifikasyonunu gerektirir ve bu da genom ölçeğinde plazmit koleksiyonlarının oluşturulmasını teknik olarak zorlu ve zaman yoğun hale getirir. Bir CRISPRshuttle kasetinden yararlanarak, aynı omurga dizilerini paylaşan donör plazmitlerinden birçok DNA fragmanının, DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonu olmadan CRISPRshuttle uyumlu bir vektöre aktarılmasını kolaylaştıran yeni bir yüksek verimli klonlama yöntemi olan CRISPR tabanlı mekik klonlama (CRISPRshuttle klonlama) geliştirdik. Burada, CRISPRshuttle için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bakteriyel transformasyondan önce iki ardışık test tüpü reaksiyonunu içerir. İlk olarak, hedef DNA fragmanları, paylaşılan vektör omurga dizilerinin Cas9 aracılı bölünmesi ile donör plazmitlerinden eksize edilir. İkinci olarak, eksize edilen DNA parçaları, Gibson düzeneği aracılığıyla doğrusallaştırılmış CRISPRshuttle uyumlu vektörlere yerleştirilir. Sonuçlarımız, CRISPRshuttle'ın verimliliğinin %94'ü aştığını ve iki araştırmacının CRISPRshuttle kullanarak 7 günde yaklaşık 300 plazmit üretebileceğini gösteriyor. CRISPRshuttle, vektörler arasında verimli, uyarlanabilir ve uygun maliyetli DNA fragmanı transferini kolaylaştırarak genom çapında plazmit kütüphanesi üretimini önemli ölçüde kolaylaştırır.

Introduction

Mevcut kaynaklardan genom çapında plazmit kütüphaneleri oluşturmak, biyolojik süreçleri incelemek için fonksiyonel genomik kullanmanın temeli ve ön koşuludur. Gateway, In-Fusion, Creator ve Univector klonlama sistemleri dahil olmak üzere mevcut yüksek verimli klonlama yöntemleri, hedef DNA ^{fragmanlarının} 1,2,3,4,5 PCR amplifikasyonunu gerektirir. Bu ön koşul, oligonükleotid primer tasarımı, jel saflaştırma ve sıralama yoluyla dizi doğrulaması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birden fazla standartlaştırılmış işlemi kapsayan parçaya özgü işleme iş akışlarını gerektirir. Sonuç olarak, genom çapında plazmit kütüphaneleri (örneğin, cDNA/ORF aşırı ekspresyon kütüphaneleri) oluşturmak, emek yoğun ve zaman alıcı hale geldi ve fonksiyonel genomiğin ilerlemesini engelledi.

Daha önce, belirli DNA parçalarını (örneğin, UAS modülü) aynı vektör omurgalarını paylaşan çoklu plazmitlere entegre etmek için tasarlanmış yüksek verimli bir klonlama yöntemi olan CRISPRmass'ı geliştirdik⁶. CRISPRmass kullanarak, bir Drosophila cDNA / ORF kütüphanesi olan Drosophila Genomics Resource center (DGRC) Altın Koleksiyonu^6'dan 5.500'den fazla GAL4 / UAS tabanlı UAS-cDNA / ORF plazmidi oluşturduk. Bununla birlikte, CRISPRmass, DNA parçalarını vektörler arasında aktarma yeteneğinden yoksundur ve bu da yüksek verimli klonlamadaki uygulamasını kısıtlar.

Bu sınırlamaları ele almak için, birden fazla hedef DNA fragmanının donör plazmidleri^7'den hedef vektörlere transferini kolaylaştıran yeni bir yüksek verimli yöntem olan CRISPR tabanlı mekik klonlamayı (CRISPRshuttle) geliştirdik. Bu işlem sadece iki ardışık test tüpü reaksiyonu gerektirir, böylece ayrık DNA hedeflerinin^parçaya özgü işlenmesi gereksinimini ortadan kaldırır 7.

CRISPRshuttle protokolü, iki ardışık test tüpü reaksiyonu içerir (Şekil 1). İlk olarak, donör plazmitlerinin paylaşılan vektör omurga dizileri, hedef DNA fragmanlarını serbest bırakmak için Cas9/sgRNA tarafından parçalanır. Bu parçalar daha sonra son plazmitleri oluşturmak için Gibson düzeneği aracılığıyla CRISPRshuttle uyumlu bir vektörün CRISPRshuttle kasetine aktarılır. Bir CRISPRshuttle kaseti, donör plazmitlerinden kaynaklanan DNA fragmanlarının 5' ve 3' uçlarını çevreleyen ~ 20-40 bp'lik bir vektör omurga dizisi ve bu yan diziler arasında yer alan bir veya iki benzersiz kısıtlama enzimi tanıma bölgesi içerir. CRISPRshuttle uyumlu bir vektör, bir hedef vektöre bir CRISPRshuttle kaseti yerleştirilerek oluşturulur ve daha sonra kaset içindeki kısıtlama bölgelerinin sindirilmesiyle doğrusallaştırılır. Hedef vektör, donör plazmitlerindekinden farklı bir antibiyotik direnç geni taşımalıdır; Aynıysa, direnç geni kullanımdan önce farklı bir gen ile değiştirilmelidir.

Burada, bir UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesi oluşturmak için CRISPRshuttle kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu işlem, insan ORF'lerinin CCSB-Geniş Lentiviral Ekspresyon Kütüphanesinden Drosophila transgenez vektörü pBID-UASC ^8,9'a aktarılmasını içerir. CRISPRshuttle, genom çapında plazmid kütüphanelerinin inşasını kolaylaştırır ve böylece fonksiyonel genomik çalışmaları kolaylaştırır.

Protocol

1. cDNA/ORF'yi çevreleyen optimal Cas9/sgRNA bölünme bölgelerinin belirlenmesi

1. cDNA/ORF plazmitlerinin hazırlanması
   1. Genel depolardan cDNA/ORF klonları edinin.
      NOT: Bu protokol, insan CCSB çapında Lentiviral ekspresyon kitaplığından⁸ pLX304 vektör tabanlı ORF klonlarını kullanır.
   2. Bir plazmid miniprep kiti kullanarak plazmidi izole edin ve konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
2. sgRNA tasarımı
   1. CHOPCHOP web sitesine erişin (https://chopchop.cbu.uib.no/). ORF 304' ucunu çevreleyen pLX304 vektör omurgasının 20-100 bp bölgesini hedef alana yapıştırın.
   2. Tür olarak Drosophila melanogaster'ı seçin ve Hedef Siteleri Bul'a tıklayın. %80'in üzerinde bir verimliliğe sahip olacağı tahmin edilen sgRNA adaylarını seçin.
3. sgRNA hazırlama
   1. (N)_20'ninsgRNA hedef dizisini temsil ettiği bir ileri primer (5'-TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3') ve bir ters primer sgRNA-REV (5'- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3") sentezleyin.
      NOT: PAGE ile saflaştırılmış astarlar önerilir.
   2. PCR aracılığıyla sgRNA in vitro transkripsiyon (IVT) için bir DNA şablonu oluşturun. Her biri 5 μL şablon pX330 (Addgene plazmidi 42230; 0.1 ng/μL), ileri primer (10 μM) ve sgRNA-REV primer (10 μM) içeren 100 μL'lik bir reaksiyon hazırlayın; 50 μL 2x yüksek kaliteli PCR ana karışımı; ve 35 μL dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış ultra saf su.
   3. Aşağıdaki programı kullanarak bir PCR Termal Döngüleyicide yükseltin: 30 saniye boyunca 98 °C; 8 sn boyunca 98°C, 15 sn boyunca 52 °C, 5 sn boyunca 72 °C'de 5 döngü; 8 sn boyunca 98 °C'de 30 döngü, 20 sn boyunca 72 °C; esnasında 72 °C 2 dk.
   4. PCR ürünlerini %0.8 agaroz jel üzerinde çözün. ~ 120 bp bandını kesin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
   5. 300 ng saflaştırılmış DNA fragmanı, 3.33 μL NTP tampon karışımı, 0.67 μL T7 RNA polimeraz karışımı ve DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su içeren 10 μL'lik bir IVT reaksiyonu hazırlayın. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
   6. Saflaştırılmamış sgRNA'yı spektrofotometri ile ölçün, DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su ile 20 ng/μL'ye seyreltin ve küçük alikotlarda -80 °C'de dondurun.
      NOT: Artık DNA aşağı akış reaksiyonlarına müdahale etmediği için DNaz tedavisi gereksizdir.
4. sgRNA değerlendirmesi
   1. Bir kısıtlama enzimi kullanarak pLX304 vektör omurgasını içeren bir cDNA/ORF plazmidini sindirin. Elde edilen DNA fragmanlarını% 0.8 agaroz jeli ile çözün. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA substratını saflaştırın.
   2. 0.2 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol DNA substratı, 0.5 μL 10x Cas9 Tamponu ve DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su içeren 5 μL'lik bir Cas9 bölünme reaksiyonu karışımı hazırlayın. Reaksiyonu 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   3. Bölünme ürünlerini% 0.8 agaroz jeli kullanarak çözün. Ayrılmamış DNA substratını negatif kontrol olarak dahil edin.
   4. Dijital bir görüntüleme sistemi kullanarak bölünme modellerini görselleştirin ve sonraki deneyler için minimum kalıntı ayrılmamış substrat ile sgRNA'yı seçin (Şekil 2).

2. Hedef vektörün antibiyotik direnç geninin değiştirilmesi

NOT: Bu protokolde, pBID-UASC hedef vektörünün ampisilin direnç geninin kloramfenikol direnç geni ile değiştirilmesi örneğini kullanıyoruz, böylece kloramfenikol içeren hedef vektör pBIDC-UASC üretiyoruz.

1. Ampisilin direnç genini pBID-UASC'den çıkarın.
   NOT: pBID-UASC'nin ampisilin direnç geni, iki sgRNA, f1Ori5-G4 (hedef dizi: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') ve Amp3-G2 (hedef dizi: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3') ile birlikte Cas9 sindirimi ile uzaklaştırıldı, bu da 7,687 bp doğrusal pBID-UASC vektör omurgası ile sonuçlandı. Bu iki sgRNA, ampisilin direnç geninin sırasıyla 5' yukarı ve 3' aşağı akışını hedefler.
   1. 0.03 pmol pBID-UASC, 0.25 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 20 ng f1Ori5-G4, 20 ng Amp3-G2, 1 μL 10x Cas9 Tamponu ve DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su içeren 10 μL'lik bir bölünme reaksiyonu hazırlayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Cas9 ile bölünmüş plazmit, saflaştırılmadan doğrudan Gibson düzeneğine tabi tutulur.
2. Kloramfenikol direnç genini PCR ile çoğaltın.
   NOT: 840 bp'lik bir kloramfenikol direnç geni, f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC) kullanılarak PCR ile plazmid pMartini-Cam^6'dan amplifiye edildi.
   GTCGCGTATGTATGATATAAGGTT-3') ve Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
   GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') astarlar.
   1. 840 bp kloramfenikol direnç genini PCR ile çoğaltarak kloramfenikol direnç genini hazırlayın. 2 μL pMartini-Cam (0.1 ng/μL), 1 μL f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL 5x tampon, 0.4 μL dNTP (10 mM), 0.4 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz (2.5 birim/μL), 11.2 μL ultra saf su içeren 20 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
   2. Aşağıdaki termodöngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin: 1 dakika boyunca 95 °C'lik 1 döngü; 15 sn boyunca 95 °C, 15 sn için 46 °C, 20 sn için 72 °C'lik 5 döngü; 15 sn boyunca 95 °C'de 30 döngü, 15 sn için 61 °C, 20 sn boyunca 72 °C; 2 dakika boyunca 72 °C'lik 1 döngü. Reaksiyonu bir termal döngüleyicide gerçekleştirin.
   3. Bölünme ürünlerini %0,8 agaroz jel ile çözün ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak 840 bp'lik bir DNA parçasını saflaştırın.
3. Kloramfenikol direnç genini doğrusallaştırılmış pBID-UASC vektör omurgasına yerleştirin ve pBIDC-UASC ile sonuçlanın.
   1. 2 μL'lik bir Gibson montaj reaksiyonu gerçekleştirin: 0.008 pmol 840 bp kloramfenikol direnç geni, 0.002 pmol doğrusallaştırılmış pBID-UASC (adım 2.1.1), 1.0 μL 2x Gibson montaj ana karışımı. Reaksiyonu 50 °C'de 1 saat boyunca gerçekleştirin.
   2. 10 μL E. coli yetkin hücreyi 1 μL ligasyon reaksiyonu ürünü ile dönüştürün. 15 μg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş bir LB plakası üzerindeki transformatörleri seçin.
   3. Tek bir koloni seçin ve onu sonraki bakteri kültürüne ve plazmid mini hazırlığına tabi tutun. Kloramfenikol içeren hedef vektör pBIDC-UASC'yi kısıtlama analizi ve DNA dizilimi ile doğrulayın.

3. CRISPRshuttle uyumlu hedef vektörün oluşturulması

NOT: Bir CRISPRshuttle kaseti, hedef DNA fragmanlarının hem 5' hem de 3' uçlarını çevreleyen ve aralarında bir veya iki benzersiz kısıtlama bölgesi bulunan yaklaşık 20-40 bp vektör omurga dizisi içerir.

1. Aşağıdaki programa sahip bir termal döngüleyici kullanarak tavlama oligonükleotidleri: 2 dakika boyunca 94 °C; (70-N) °C'de 52 s'lik 95 döngü, burada N döngü numarasını temsil eder.
   NOT: Tavlanmış CRISPRshuttle kaseti, EcoRI ve XbaI'yi tamamlayan 5' çıkıntılar içerir.
2. CRISPRshuttle uyumlu hedef vektör pBIDC-UASC-pLXvect'i oluşturmak için tavlanmış CRISPRshuttle kasetini EcoRI/XbaI-sindirilmiş hedef vektör pBIDC-UASC'ye aktarın.
   NOT: Bu ligasyon, çoklu klonlama bölgeleri içindeki orijinal EcoRI ve XbaI bölgelerini ortadan kaldırarak, CRISPRshuttle kasetinin ortasındaki EcoRI ve XhoI bölgelerini son vektörde benzersiz hale getirir. CRISPRshuttle kasetindeki benzersiz kısıtlama bölgeleri, CRISPRshuttle uyumlu hedef vektörün doğrusallaştırılmasını sağlar.
   1. 14 ng 8.451 bp EcoRI/XbaI ile sindirilmiş pBIDC-UASC, 0.02 pmol tavlanmış CRISPRshuttle kaseti, 0.5 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 0.3 μL T4 DNA ligaz içeren 5 μL'lik bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyonu gece boyunca 16 °C'de inkübe edin.
   2. 10 μL E. coli yetkin hücrelerini 1 μL ligasyon reaksiyonu ürünü ile dönüştürün. 15 μg/mL kloramfenikol ile takviye edilmiş bir LB plakasındaki transformatörleri seçin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   3. Tek bir koloni seçin ve onu sonraki bakteri kültürüne ve plazmid mini hazırlığına tabi tutun. Kısıtlama analizi ve DNA dizilimi ile CRISPRshuttle uyumlu hedef vektör pBIDC-UASC-pLXvect'i doğrulayın.

4. CRISPRshuttle kullanılarak UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin üretilmesi

NOT: CRISPRshuttle protokolü, bakteri dönüşümünden önce paralel olarak gerçekleştirilen iki aşamalı test tüpü reaksiyonlarını içerir (Şekil 1).

1. Test tüpü reaksiyonu adım 1
   1. İki sgRNA, pLX304-CMV-G1⁶ (hedef dizi: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', ORF 5' ucunu çevreleyen pLX304 vektör omurgasında lokalize) ve pLX304-3'-G1 (hedef dizi: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', ORF 3'ün ucunu çevreleyen pLX304 vektör omurgasında lokalize) ile birlikte Cas9 kullanarak vektör omurgasını parçalayarak pLX304-ORF plazmitlerinden ORF'leri çıkarın.
      1. Belirli bir (N) sindirim reaksiyonu sayısı için aşağıdaki gibi bir ana karışım hazırlayın: (N + 1) x 0.4 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, (N + 1) x 0.5 μL 80 ng / μL pLX304-CMV-G1, (N + 1) x 0.5 μL 80 ng / μL pLX304-3'-G1, (N + 1) x 0.4 μL 10x Cas9 Tamponu ve (N + 1) x 1.45 μL DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su.
      2. İyice karıştırın ve ana karışımı aşağı doğru döndürün. Her tüpe 3.75 μL ana karışım ekleyin. Her tüpe 0.75 μL 0.03 μM pLX304-ORF plazmit ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
         NOT: Her bir pLX304-ORF plazmidini DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su ile 0.03 μM'lik bir konsantrasyona seyreltin. Konsantrasyon 0.03 μM'den azsa, plazmit DNA'yı doğrudan reaksiyona ekleyin. Cas9 ile bölünmüş plazmitlerin bölünme reaksiyonlarından sonra saflaştırılmasına gerek yoktur ve sonraki Gibson montajı için doğrudan kullanılabilir.
2. Test tüpü reaksiyonu adım 2
   1. Eksize edilen ORF'leri Gibson düzeneği aracılığıyla CRISPRshuttle uyumlu hedef vektör pBIDC-UASC-pLXvect'e yerleştirin, böylece UAS-cDNA/ORF plazmitleri elde edilir.
      1. EcoRI ve XbaI ile pBIDC-UASC-pLXvect'i sindirin. Doğrusallaştırılmış pBIDC-UASC-pLXvect'i agaroz jel elektroforezi ile ayırın ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
      2. Belirli bir (N) Gibson montaj reaksiyonu sayısı için aşağıdaki gibi bir ana karışım hazırlayın: (N+1) x 0.14 μL 3.36 μM doğrusallaştırılmış pBIDC-UASC-pLXvect ve (N+1) x 1.8 μL Gibson montaj ana karışımı.
      3. İyice karıştırın ve ana karışımı aşağı doğru döndürün. Her tüpe 1.94 μL ana karışım ekleyin. Her tüpe 1.66 μL Cas9 parçalanmış plazmit ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları 50 ° C'de 1 saat inkübe edin.
         NOT: İnkübasyondan önce ana karışımı ve tüp buzunu 50 °C'de tutun.
3. E. coli'yi Gibson montaj ürünleriyle dönüştürün.
   NOT: Gibson montajının ürünleri, E. coli dönüşümünden önce saflaştırma gerektirmez.
   1. Bakteriyel yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün. Her önceden soğutulmuş 1.5 mL tüpe 10 μL hücre ekleyin.
      NOT: En az 1 × 10⁸ CFU/μg pUC19 DNA'sı dönüşüm verimliliğine sahip yetkin bakteri hücreleri önerilir.
   2. 10 μL yetkin hücreleri 1 μL Gibson montaj ürünleriyle nazikçe karıştırın. 30 dakika buzun üzerine koyun.
   3. 42 °C'de 1 dakika ısı şoku uygulayın ve ardından 2 dakika buz üzerinde soğutun.
   4. Her tüpe 100 μL önceden ısıtılmış SOC ortamı (37 °C) ekleyin. 37 °C'de 1 saat boyunca 250 rpm'de çalkalayın.
   5. Hücreleri 15 μg/mL kloramfenikol içeren LB plakalarına yerleştirin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Bu prosedürlerin büyük ölçekte yürütülmesi genellikle birkaç saat gerektirir. Aksi belirtilmedikçe, hem reaktifleri hem de reaksiyon kurulumlarını buz üzerinde tutun.
4. UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin doğrulanması.
   1. Tek bir koloniyi 4.5 mL LB ortamında 15 μg / mL kloramfenikol ile aşılayın. Gece boyunca 250 °C'de 37 rpm'de çalkalayın.
   2. Bir plazmit mini hazırlık kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin.
   3. 300-500 ng plazmit DNA, 0.3 μL PvuII, 2 μL 10x tampon ve ultra saf su içeren her plazmit için 20 μL'lik bir kısıtlama sindirim reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyonları 37 °C'de 1 saat boyunca gerçekleştirin.
   4. DNA fragmanlarını% 0.8 agaroz jeli ile çözün. UV ışığı altındaki görüntü (Şekil 3).

Results

Drosophila^7'de

Discussion

CRISPRshuttle protokolündeki kritik bir adım, doğrusallaştırılmış CRISPRshuttle uyumlu hedef vektörlerin hazırlanmasıdır. Tam sindirimi sağlamak için, vektörleri sindirmek için fazla miktarda kısıtlama enzimi kullanın ve sindirilmiş vektörlerin jel saflaştırılması şiddetle tavsiye edilir. Bir diğer önemli adım, cDNA/ORF plazmitlerinin Cas9 ile sindirilmesidir. Plazmit yapımı başarısız olursa, donör plazmitlerinden en azından kısmi cDNA'ların / ORF'lerin salınıp salınmadığını kontrol etme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Tozu	Kimya tabanı	KBS-001H Serisi
Agaroz	Sangon Belediyesi	A600014-0100
Otomatik Dijital Jel Görüntü Analiz Sistemi	Tanon	Tanon-2500B
Kloramfenikol	Sangon Belediyesi	A100230-0010
E.Z.N.A. Jel Ekstraksiyon Kiti	Omega	D2500-02 Serisi
E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini Kiti I	Omega	D6942-02
EcoRI-HF Serisi	NEB	R3101S
Gibson Montaj Ana Karışımı	NEB	E2611S
HiScribe T7 Hızlı Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti	NEB	E2050 Serisi
NEBuilder HiFi DNA Düzeneği Ana Karışımı	NEB	E2621X
PCR Termal Döngüleyici	Uzun Gen	T20
Platin SuperFi II DNA Polimeraz	Termo Bilimsel	12361010
PvuII-HF	NEB	R3151L Serisi
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2x Ana Karışım	NEB	M0494 Serisi
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386 Serisi
Çalkalama İnkübatörü	Zhichu Hakkında	ZQLY-180V
Spektrofotometre	Şimadzu	BioSpec-nano
T4 DNA ligaz	Promega	M1801 Serisi
Trans 10 Kimyasal Olarak Yetkin Hücre	TransGen	CD101-02 (İngilizce)
Tripton	Oksoid	LP0042 Serisi
XbaI	NEB	R0145S
Maya Özü	Oksoid	LP0021 Serisi