Yöntem makalesi

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bu makalede

Özet

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

Özet

Paramecium , mayotik üreme sırasında programlanmış genomik yeniden düzenlemeler ve transpozon eliminasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların incelenmesi için önemli bir model organizmadır. Bu sürecin birçok detayı, ilgili moleküler mekanizmanın karmaşıklığı ve geçici protein-protein etkileşimleri nedeniyle esrarengiz kalmaktadır. Burada, ilgilenilen bir hedef proteine yakın yerleştirilmiş biyotin ile proteinlerin zaman çözümlü etiketlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Biyotinilasyon, tasarlanmış bir biyotin ligaza kaynaşmış bir hedef proteini kodlayan bir DNA'nın enjeksiyonu ile elde edildiğinden, yöntem farklı hedeflere kolayca uyarlanabilir. Füzyon yapısı, endojen genin promotöründen eksprese edilir ve doğal proteininkine benzer bir aşamaya özgü ekspresyon profili sağlar. Özellikle, kovalent olarak bağlanan biyotin kısmı, streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak etiketli proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir. Ayrıca, immünofloresan boyama ile, verimli etiketlemenin kültürün biyotin ile desteklenmesini gerektirdiğini gösterdik. Tak ve çalıştır tasarlanmış ekspresyon vektörü, burada gösterilen verimli enjeksiyon prosedürü ile birleştiğinde, modifiye edilmiş bir proteini eksprese eden Paramecium hatlarının hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Burada gösterilen biyotinilasyon prosedürü, hedef proteinin etkileşen ortaklarını içeren zenginleştirilmiş proteinlerin tanımlanması için kütle spektrometrisi ile takip edilebilir. Yakınlık biyotinilasyonu, Paramecium'daki protein-protein etkileşimlerinin keşfini basitleştirme ve hızlandırma ve genom düzenleme mekanizmasını anlama çabalarını artırma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Kirpikli tek hücreli organizma Paramecium tetraurelia iki farklı çekirdek tipini barındırır: genetik bilginin uzun süreli depolanması için bir germ hattı çekirdeği ve hücre1'in fizyolojik işlevleri için somatik bir çekirdek. Bu organizmada eşeyli üreme, yeni bir somatik genomun oluşumunu gerektirir. Bu işlem, transpoze edilebilir elementler3 ve diğer tekrarları içeren somatik genom2'den 45.000'den fazla DNA parçasının geri dönüşümsüz eksizyonunu içerir. Özellikle çarpıcı olan, eksizyon olaylarının tek baz çifti1'e kadar bir doğrulukla yürütülmesidir. Bu doğruluk biyolojik olarak gereklidir, çünkü eksize edilen DNA fragmanları protein kodlayan bölgeleri4 bozar ve herhangi bir hatalı eksizyon, çerçeve kayması mutasyonlarını, erken durdurma kodonlarını uyandırabilir veya protein kodlama dizisini değiştirebilir. Karmaşık bir RNA karşılaştırma mekanizması, hücrenin yeni somatik genomda ihtiyaç duyulan dizileri ayırt etmesine izin verir. Tüm germ hattı genomunun5 transkripsiyonu ile başlatılır, ardından 25 bp6 boyutuna kırpılır, tüm tamamlayıcı RNA'ların atıldığı eski somatik genom7'ye taşınır8. Eski somatik genomda tamamlayıcı dizilerden yoksun kalan sRNA'lar, yeni gelişen somatik genoma taşınır, burada herhangi bir germ hattı sınırlı diziye hizalanırlar ve eksizyonlarınıyönlendirirler 9. Bu karmaşık çok adımlı süreç, birçok hücresel bileşenin kesin ve zamanında etkileşimini ve özellikle küçük RNA'lar farklı çekirdekler10,11 arasında geçiş yaparken geçici zayıf etkileşimleri gerektirir. Daha önce, sürecin moleküler mekaniğini anlama girişimleri, varsayılan bileşenlerin süreç için gerekli olup olmadığını belirlemek için yıkım deneyleri kullanılarak yapıldı, ardından temel proteinlerin 12,13,14 etkileşimlerini ortaya çıkarmak için immünopresipitasyon yaklaşımları yapıldı. Bu yöntem, aşağı çekme sırasında fizyolojik olmayan koşullara da dayanan güçlü ve sürekli bağlanmanın tespiti için yararlı olsa da, zayıf ve geçici etkileşimlerin tespiti sıkıcı optimizasyon gerektirebilir. Genom düzenleme sürecinde yer alan birçok etkileşimin potansiyel olarak geçici doğası nedeniyle, in vivo yöntemler bu tür etkileşimlerin tespitini iyileştirebilir. Ek olarak, bazı proteinler hücre dışı koşullarda verimli bir şekilde çözünemez15, bu da biyotin ile yakınlık etiketlemesi gibi in vivo etkileşime dayalı protein modifikasyonları yoluyla çözülebilecek bir sorunu temsil eder.

Burada, istenen hedef proteine yakın lokalize olan proteinlerin spesifik bir in vivo biyotinilasyonuna izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Kovalent biyotin modifikasyonu, streptavidin bazlı aşağı çekme yaklaşımları kullanılarak verimli zenginleştirme için kullanılabilir. Bu yöntemin geliştirilmesi, Paramecium tetraurelia'da protein etkileşim çalışmalarının gerçekleştirilmesi için biyotin ligaz TurboID16 kullanılarak sağlanmıştır. Yaklaşımımız, protokolde belirtilen adımları izleyerek herhangi bir hedef proteine kolayca uygulanabilir. Bu nedenle, bu makale, önde gelen bir protozoan model organizmada yüksek verimli proteomik çalışmalar için kullanılabilecek yakınlık biyotinilasyonu için verimli ve ölçeklenebilir bir strateji sunmaktadır.

Protokol

1. Genel yöntemler

  1. Tablo 1'de listelenen tamponları, reaktifleri ve diğer malzemeleri elde edin.
  2. Monoklonal Paramecium hatlarını daha önce açıklandığı gibi yetiştirin17. Kısaca, mayotik döngünün erken başlamasını önlemek için hücre yoğunluğunun 500 hücre/mL'den düşük kalması için bir hücreyi bakterinize hafif ortam (0.8 μg/mL β-sitosterol) içeren yeni bir çöküntü slayt kuyusuna aktarın. 50 hücre bölünmesinde, hücreleri bakterinize zengin bir ortam kültürüne (0.8 μg / mL β-sitosterol ile) aktarın ve tüm bakteriler tüketilene kadar bırakın, böylece eşeyli üremeyi (otogami) indükleyin18.
    NOT: Eşeyli üreme döngüsünün tamamlanmasının ardından, hücreler yeni bir besin kaynağı sağlanana kadar bölünmeyen otogam sonrası durumda kalacaktır.
  3. Yukarı akış kısıtlama enzimi kesme bölgeleri ile kodon için optimize edilmiş bir 3x HA turboID dizisi içeren bir vektör kullanarak hedef genlerin füzyon proteinlerini oluşturun.
    1. Uygun kısıtlama bölgelerini kodlayan çıkıntılarla tasarlanmış primerleri kullanarak genomik DNA'dan hedef genin ve promotör bölgesinin PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.
    2. Ürünü, standart kısıtlama sindirimini kullanarak, turboID kodlama bölgelerinin19 yukarısındaki çerçeve içi uyumlu kesim bölgelerine yerleştirin.
  4. E.coli DH5α'da oluşturulan plazmit DNA'sını sıralayın, doğrulayın ve çoğaltın. Bir plazmit midiprep kiti kullanarak plazmidi izole edin ve kısıtlama sindirimi ile 100 μg plazmit DNA'sını doğrusallaştırın.
  5. Fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak saflaştırın, ardından bir santrifüj filtredensüzün 12. Etanol çökeltme işlemini gerçekleştirin ve 5 mg/mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için DNA peletini suda çözün.
    NOT: DNA, aşağıdaki mikroenjeksiyon prosedürü kullanılarak Paramecium hücrelerinin somatik çekirdeklerine sokulabilir.

2. Somatik çekirdeğe (MAC) mikroenjeksiyon

  1. Adım 1.2'de elde edilen otogam sonrası kültürden bir hücreyi, 0.8 μg/mL β-sitosterol içeren bakterinize hafif ortamla taze bir depresyon slaytına aktarın. Hücreleri geri kazanmak için enjeksiyondan önce iki gün boyunca 27 °C'de inkübe edin.
  2. Hücreleri geri kazanılan kültürden yıkama ortamıyla doldurulmuş taze hazırlanmış bir depresyon lamına aktarmak için bir stereomikroskop kullanın.
  3. Hücreler yıkama ortamındayken, bir cam slayt üzerine 20 μL ddH2O ekleyin ve bir kapak camı ile kaplayın.
  4. Kapak camının üzerine 200 μL mineral yağ ekleyin.
  5. Bundan sonra, tek tek yıkanmış hücreleri, mümkün olduğunca az sıvı hacmi kullanarak mineral yağın altına damlacıklar halinde aktarın. Slayt başına tek bir hücre içeren 20 adede kadar baloncuk yerleştirin ve ardından hazırlanan slaytı enjeksiyon mikroskobunun kaidesine yerleştirin.
  6. Aspirasyon iğnesini takın ve yerine getirin, ardından robotik kolu ve enjeksiyon makinesini çalıştırın.
  7. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak, adım 1.5'te hazırlanan DNA çözeltisinden 2-3 μL'yi enjeksiyon iğnesine ekleyin. İğneyi robotik kola takın ve yerine getirin, ardından enjeksiyon makinesinin basınç valfine bağlayın.
  8. Enjeksiyon iğnesini kızak üzerindeki boş bir su damlacığına yerleştirmek için robotik kolu kullanın. Ardından, DNA akışı gözlemlenene kadar enjeksiyon iğnesinde kalan havayı boşaltmak için Temizle'ye basın.
  9. Hücre içeren bir damlacığa geçin, ardından aspirasyon iğnesini indirin. Hücre hareketsiz hale gelene kadar sıvıyı (suyu) bu damlacıktan yavaşça çıkarın.
  10. Aspirasyon iğnesini kaldırın ve enjeksiyon iğnesini indirin, ardından daha yüksek bir büyütmeye geçin.
  11. Somatik çekirdeğin (MAC) artık enjeksiyon iğnesinin yerleştirilmesi gereken gıda vakuollerinden yoksun daha koyu bir bölge olarak görülebildiğinden emin olun (bkz. Şekil 1c).
  12. Enjeksiyon iğnesi ile MAC'e tamamen nüfuz etmeyi hedefleyin ve iğneyi birkaç saniye içinde yavaşça geri çekin.
    NOT: İğne MAC'in içine yerleştirildiğinde, enjeksiyon makinesi tarafından uygulanan sabit hava basıncı nedeniyle DNA MAC'de akacaktır. Enjekte edilen DNA'dan oluşan yaygın bir vakuol, MAC sınırları içinde görünür hale gelebilir.
    NOT: Başarılı bir enjeksiyon sağlamak için aynı hücreyi birden çok kez enjekte etmek mümkündür.
  13. Hücre enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, adım 2.9'da aspire edilen suyu içeren aspirasyon iğnesini indirin. Hücre tekrar hareket etmeye başlayana kadar damlacığa yeterli suyu geri döndürmek için akışı tersine çevirin.
  14. Hücre içeren tüm damlacıklar işlenene kadar devam edin.
  15. Damlacıkları slayttan toplayarak ve her birini 0,8 μg/mL β-sitosterol içeren bakterinize ışık ortamıyla doldurulmuş ayrı bir kuyuya aktararak enjekte edilen her hücreyi kurtarın.
  16. Gece boyunca 27 °C'de inkübe edin, her kuyucuktan tek bir hücreyi yeni bir kuyuya aktarın ve orijinal kuyuyu yedek olarak 18 °C'de tutun.
  17. Transfer edilen hücreleri gece boyunca 27 °C'de 1 gün boyunca kültürleyin ve ardından her monoklonal kuyudan 5 hücreyi bir PCR tüpüne aktarın. Hücrelerde enjekte edilen DNA'nın varlığını doğrulamak için amplifikasyon için yapıya özgü primerler kullanın.

3. Doğru protein lokalizasyonunun ve biyotin ligaz fonksiyonunun doğrulanması için immünofloresan boyama

  1. Seçilen PCR pozitif klonları 20 mL bakterinize ortamda 0.8 μg/mL β-sitosterol ile kültürleyin.
  2. Ortam daha az bulanık hale geldikten sonra, kültürden 50 μL'lik bir numune alın. Otogaminin başlayıp başlamadığını kontrol etmek için DNA boyaması için 1 μL DAPI çözeltisi (0.1 mg/mL) ve 1 μL EDTA (0.5 mM) ekleyin.
    NOT: Otogami genellikle 2.000 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğunda başlar.
  3. Biyotinilasyon isteniyorsa, hücreleri toplamadan önce kültür ortamını en az 1 saat boyunca 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar biyotin ile destekleyin.
  4. Hücreleri, armut biçimli tüplerle donatılmış bir yağ ölçüm santrifüjü kullanarak 280 x g'da 2 dakika boyunca uygun gelişim aşamasında hasat edin. Kültür ortamını atın ve tüplere PBS ekleyin, ardından tekrar santrifüjleyin ve PBS'yi çıkarın.
  5. Hücre peletini PBS'de yeniden süspanse edin ve şeffaf bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  6. %37'lik stok çözeltisinden PBS'de %3,7'lik bir PFA seyreltmesi hazırlayın.
  7. Hücre peletini 0.5 mL% 3.7 PFA içinde yeniden süspanse edin ve bir tüp döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  8. Görünür bir pelet oluşana kadar 1 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. PFA solüsyonunu belirlenen özel atık kabına atın.
  9. Peleti PBS'de 1 mL 50 mM Glisin içinde yeniden süspanse edin. Bir tüp döndürücü üzerinde 5-10 dakika inkübe edin.
  10. 1 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 0.8 mL 1x PBS ekleyin. İsteğe bağlı olarak PBS ile bir kez daha yıkayın.
    NOT: Bu noktada, gerekirse hücreler 4 °C'de saklanabilir.
  11. 1 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, PBS'yi çıkarın ve PBS'ye 500 μL %0,5 Triton X-100 ekleyin. Bir tüp döndürücü üzerinde 20 dakika inkübe edin.
  12. Pelet görünür hale gelene kadar santrifüjleyin (2 dakika boyunca 1.000 x g ), Triton X-100 çözeltisini çıkarın ve hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin.
  13. Gerekli antikor hacmine göre PBS'de %5'lik bir BSA çözeltisi hazırlayın.
  14. PBS yıkamasını hücrelerden çıkarın ve hücrelere PBS'de %5 BSA içinde seyreltilmiş 100 μL birincil antikor ekleyin. İnkübasyon süresini kullanılan antikora göre ayarlayın.
    NOT: Çoğu antikor için oda sıcaklığında 2 saat inkübe etmek yeterlidir.
  15. 600 x g'da santrifüjleyin, birincil antikor seyreltmesini çıkarın ve hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın.
  16. PBS'de %5 BSA içinde seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor ekleyin. Kuluçka süresini ayarlayın; Genellikle oda sıcaklığında 1 saat yeterlidir. Floroforu ışıktan korumak için tüpü alüminyum folyo ile örtün.
  17. İkincil antikorla inkübasyonun son 10 dakikası sırasında 1 μL DAPI çözeltisi (0.1 mg/mL) ekleyin.
  18. 600 x g'da 1 dakika santrifüjleyin, boyama solüsyonunu çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamanın 20 μL'sini tüpte bırakın ve hücreleri yeniden süspanse edin.
  19. Mikroskop altında inceleme için bir lam üzerine 10 μL monte edin.

4. Biyotinlenmiş proteinlerin seçici zenginleştirilmesi

  1. 1 x 106 hücreyi 3.4'te açıklandığı gibi doğru gelişim aşamasında hasat edin.
  2. Peleti 3 mL lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. Bir dounce homojenizatörüne aktarın ve hücreleri 100 havaneli darbesiyle parçalayın.
  4. Lizatı iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin.
  5. Streptavidin kaplı manyetik boncukları, 20 μL (numune başına) darbeli girdap yeniden süspanse edilmiş boncuk bulamacını bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL lizis tamponu ile karıştırarak ve 2 dakika inkübe ederek dengeleyin.
  6. Manyetik bir stand kullanarak lizis tamponunu boncuklardan çıkarın ve lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
  7. Adım 4.6'yı tekrarlayın.
  8. Lizis tamponunu çıkarın ve dengelenmiş boncukları adım 4.4'teki süpernatant (berraklaştırılmış lizat) ile karıştırın.
    NOT: Boncuklara bağlanmak için optimum tuz konsantrasyonları ve deterjan yüzdesi farklılık gösterebilir ve deneysel olarak doğrulanması gerekir. Ek olarak, çözünmeyen fraksiyondan proteinleri çıkarmak için peleti 60 ° C'de 10 dakika boyunca 50 μL% 2 SDS'de 4.4'ten inkübe etmek ve ardından 10 dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjlemek mümkündür. Bu özü berraklaştırılmış lizata ve boncuklara ekleyin.
  9. Bir tüp döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
  10. Tüm sıvıyı tüpün dibine geri kazanmak için tüpü kısaca santrifüjleyin (<1s), boncukları manyetik bir stand üzerinde toplayın ve ardından süpernatanı (akış) yıkama tamponu 1 ile değiştirin.
  11. Bir tüp döndürücü üzerinde 5 dakika inkübe edin ve ardından ikinci bir yıkama için adım 4.10'daki gibi tekrarlayın.
  12. İki ek yıkama için yıkama tamponu 1'i yıkama tamponu 2 ile değiştirin (yıkama 3 ve 4).
  13. İki son yıkama için yıkama tamponu 2'yi yıkama tamponu 3 ile değiştirin (yıkama 5 ve 6).
  14. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, sonraki işlemlerden önce boncukları -20 °C'de saklayın.
    NOT: Boncuklar, western blot analizi için Laemmli tamponu ile ayrıştırılabilir ve protein tanımlaması için boncuk üzerinde bir peptit preparatı için kütle spektrometrisi hizmetlerine gönderilebilir.

Sonuçlar

Protokolümüz, bir hedef proteinin yakınındaki proteinlere kovalent bir biyotin modifikasyonunun eklenmesi için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Paramecium (Şekil 1A). Bu biyotinlenmiş proteinler daha sonra bir streptavidin pulldown kullanılarak daha da zenginleştirilebilir ve kütle spektrometrisi kullanılarak tanımlanabilir20. Yöntemin pratik bir kullanım durumunu göstermek için protokolü Nowa1 proteinine uyguladık. Bu protein, genomik yeniden düzenleme süreci için gereklidir ve lokalizasyonunda dinamik değişikliklere sahiptir12. Erken evrelerde eski somatik çekirdek ve fragmanlarda kalır, ancak daha sonra yeni gelişen çekirdekte bulunur. Özellikle, Nowa1 etkileşimli proteinlerinin etiket aracılı zenginleştirilmesi için önceki girişimlerimiz başarısız oldu (yayınlanmamış sonuçlar). Bunun nedeni muhtemelen, aşağı çekme prosedürü sırasında optimal olmayan koşullar altında kendi kendine agregasyona neden olabilecek prion proteini PrP27'ye benzerlik taşıyan karmaşık tekrarlardı21. PCR, Nowa1 kodlama bölgesini, promotörü içeren yukarı akış kodlamayan bölgesi ile birlikte amplifiye ettik. Ürün daha sonra kodon için optimize edilmiş bir turboID kodlama dizisi (Şekil 1B). Dairesel DNA enjeksiyonunun neden olduğu transgen kaynaklı susturmayı önlemek için Paramecium, vektör enjeksiyondan önce doğrusallaştırıldı. Doğrusallaştırılmış ve saflaştırılmış DNA daha sonra bu protokolde tarif edildiği gibi somatik çekirdeğe (MAC) mikroenjekte edildi. Somatik çekirdeğin daha karanlık bölgesi içinde hapsedilmiş dağınık bir damlacık, bazı başarılı enjeksiyonlarda görünür hale geldi (Şekil 1C). Başarılı enjeksiyon ve hücre bölünmesi sırasında DNA'nın hücreler tarafından amplifikasyonu daha sonra PCR ile doğrulandı. Beklendiği gibi, hücrelerin @-50'si Nowa1 yapısının enjekte edilen DNA'sı için pozitifti (beklenen ürün boyutu 685 bp) (Şekil 2). Bir sonraki adım, enjekte edilen DNA tarafından kodlanan proteinin varlığını doğrulamaktı. Alıcı vektör, üçlü bir HA etiketi ile çevrili turboID dizisini içerdiğinden, etiketi saptamak için immünofloresan boyama kullandık. Bu, enjekte edilen hücrelerin füzyon proteinini eksprese edip etmediğini ve uygun şekilde lokalize olup olmadığını doğrulamamıza izin verdi. Daha önce vahşi tip Nowa1 proteini için gözlemlendiği gibi, iki yeni gelişen çekirdekte füzyon proteininin lokalizasyonunu gösteren geç evre hücreler kullandık12. Enjekte edilen bireysel hücre hatları, füzyon proteininin farklı seviyelerini gösterdi (Şekil 3). Daha düşük bir ifade seviyesi, azaltılmış arka planın istendiği uygulamalar için faydalı olabilir, ancak bu durumda maksimum sinyali seçtik ve en yüksek ifadeyi gösteren klon 2 ile devam ettik. Daha sonra füzyon proteininin lokalizasyonunu izlemek için farklı gelişim aşamalarında örnekler topladık. Protein başlangıçta eski somatik çekirdekten oluşan çilelerde ve otogaminin erken aşamalarında ayrılmış nükleer parçalarda lokalize oldu. Nükleer anlajenin ortaya çıkması üzerine, füzyon proteini bu yeni gelişen çekirdeklere doğru geçiş yaptı (Şekil 4). Proksimal proteomun farklı aşamalarda biyotinilasyonunu teşvik etmek için, IF için hücreleri toplamadan önce kültürü 2 saat boyunca 500 μM biyotin ile destekledik. Biyotin etiketli proteinleri, floresan etiketli bir streptavidin kullanarak bir IF boyaması yoluyla görselleştirdik. Gözlenen sinyal, HA etiketli füzyon proteininin lokalizasyonuna karşılık geldi. Daha da önemlisi, biyotin ile kısa bir inkübasyon bile önemli biyotinilasyon elde etmek için yeterli olduğundan, farklı nükleer gelişim aşamalarına özgü biyotinilasyon lokalizasyonu elde etmek mümkündü (Şekil 4). Ek olarak, ek biyotin eklenmeden, enjekte edilen hücrelerde yalnızca ihmal edilebilir biyotinilasyon tespit edilebildi. Vahşi tip hücrelerde, ek biyotin ilavesi, saptanabilir bir biyotinilasyona neden olmadı (Şekil 5A). Özellikle, biyotin sadece gelişmekte olan çekirdekte birikmekle kalmadı, denatüre edici koşullarda bile proteinlere bağlı kaldı. (Şekil 5B). Streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, biyotinlenmiş proteinleri seçici olarak zenginleştirmek mümkün olmuştur (Şekil 6). Zenginleştirilmiş proteinler, kütle spektrometrisi kullanılarak tanımlanabilir. Bu müteakip protein tanımlama deneylerinde, takviye edilmemiş kültür ve ayrıca kaynaşmamış bir turboID proteini eksprese eden hücreler, arka plan kontrol grupları olarak kullanılabilir.

figure-results-1
Şekil 1: P. tetraurelia'da yakınlık biyotinilasyonu prosedürüne genel bakış. (A) Protokolün genelleştirilmiş taslağı. (B) Tak ve çalıştır turboID alıcı vektörü için klonlama ilkesi ve Nowa1 füzyon proteini için ortaya çıkan yapı. Bu plazmitte kullanılan 3'UTR bölgesi CenH3a'dan türetilir. (C) Başarılı bir DNA enjeksiyonu üzerine somatik çekirdeğe (MAC) karşılık gelen daha koyu alan içinde bulunan görünür dağınık damlacık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Başarılı enjeksiyon için PCR testi. Ampisilin direncini kodlayan yukarı akış bölgesine özgü bir ileri primer (amp başlangıcı) ve Nowa1'i tamamlayıcı bir ters primer içeren bir ürün için PCR reaksiyonunun agaroz jel analizi. Ok ucu, beklenen ürün boyutunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: TurboID füzyon proteininin doğru lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan boyama. Tavşan-anti-HA birincil antikoru (1:100) ve keçi-anti-tavşan Alexa Fluor 568 kullanılarak immünofloresan boyama, bir Nowa1-HA-turboID füzyon proteinini kodlayan DNA için pozitif bir PCR sinyali ile monoklonal Paramecium hatlarının konjuge ikincil antikoru (1:1000). Ölçek 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Farklı gelişim aşamalarında Nowa1'e özgü biyotinilasyon. Yeni somatik çekirdeğin oluşumu sırasında ilerleyen aşamalarda monoklonal hat 2'nin immünofloresan boyaması. Kültür ortamı, optimal turboID aktivitesi için 500 μM biyotin ile desteklendi. Şekil 3'teki gibi HA-etiketi, Streptavidin-FITC (1:200) kullanılarak biotin tespit edildi. Ölçek 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: TurboID ile verimli yakınlık etiketlemesi, kültürde ek biyotin gerektirir. (A) Nowa1-HA-turboID ekspresyonunu ve 500 μM ek biyotin ile gözlenen biyotinilasyonu gösteren geç gelişim aşamasında wt ve enjekte edilen hücrelerin immünofloresan boyaması. HA-tag ve biotin Şekil 4'teki gibi tespit edildi. Ölçek 20 μm. (B) 500 μM biyotin ile kültürlenmiş ağırlık hücrelerinin HRP-streptavidin kullanılarak biyotin için Western blot analizi ve biyotinli ve biyotinsiz turboID enjekte edilmiş hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Biyotinlenmiş proteinlerin streptavidin manyetik boncuklarla zenginleştirilmesi. Streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yapılan bir aşağı çekme deneyinden elde edilen numunelerin biyotini için Western blot analizi. Numuneler şunlardır: Nowa1-HA-turboID hücre lizatı (giriş), bağlanmamış fraksiyon (akış), yıkama adımları (yıkama 1-6) ve boncuklara bağlı proteinler (çıkış). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, ilgilenilen proteinin yakınındaki proteinlere bir biyotin parçası eklemek için bir tekniği açıklamaktadır. Streptavidinin biyotin için güçlü afinitesine dayanarak, bu, modifiye edilmiş proteinlerin hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesine izin verir. İlgilenilen farklı proteinler için hızlı uyarlanabilirlik ile birleştiğinde, sunulan yöntem Paramecium'daki çoklu protein etkileşimleri çalışmalarını kolaylaştırabilir. Bu model organizma, mayotik üreme3 sırasında transpozon-konakçı etkileşimleri üzerine araştırmalar için iyi kurulmuştur. Ek olarak, programlanmış genomik yeniden düzenlemeleri sırasında 45.000'den fazla diziyi kestiği için hassas genom düzenlemesi için yeni moleküler araçlar sunabilir. İşlem, her nesilde tekrarlanabilir bir bölünme bölgesi ile bu DNA parçalarının hassas bir RNA yönelimli eksizyonuna izin veren karmaşık çok bileşenli bir makine tarafından düzenlenir. Burada sunulan yöntem, bu süreci incelemek için iki büyük avantaj sunmaktadır. Geçici protein-protein etkileşimlerinin keşfini kolaylaştırır. Ek olarak, tak ve çalıştır alıcı vektörü, birçok fonksiyonel füzyon proteininin hızlı bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Farklı aşamalarda sürece muhtemelen birden fazla faktör dahil olduğundan, uyarlanabilirlik, eksizyon mekanizmasının bir parçası olabilecek birçok proteinin interaktomlarının ortaya çıkarılmasına izin verir. Daha da önemlisi, füzyon yapıları, endojen genin promotöründen eksprese edilir ve bu nedenle, doğal ekspresyon zaman seyri ile dar bir şekilde eşleşir. Ayrıca, eksojen genetik materyalin bu model organizmaya iletilmesi için kanıtlanmış mikroenjeksiyon kullanımı, homojen monoklonal popülasyonların üretilmesine izin verir. Bu tür popülasyonlar, yeni bir somatik çekirdeğin gelişiminin gerçekleştiği otogami sürecinin daha senkronize bir şekilde başlatılmasını sağlar.

TurboID füzyon yapılarını tanıtmak için gösterilen prosedür sağlam olsa da, biyotinilasyon mekanizması nedeniyle aşağı akış protein zenginleştirme protokollerinde spesifik optimizasyon gerekli olabilir. Kaynaşmış turboID enzimi, enzimden uzaklaşan reaktif biyotin-AMP kısımları ürettiğinden, bunlar potansiyel olarak civardaki herhangi bir nükleofilik kısımla reaksiyona girebilir. Bu nedenle, bu metodolojideki önemli bir adım, gerçek etkileşim ortaklarının arka plan vuruşlarından ve gerçek etkileşim ortakları olmayan turboID füzyon proteininin genel çevresinde lokalize olan proteinlerden tanımlanmasıdır. Bunu başarmak için, biyotin16 ile inkübasyon süresi gibi çeşitli parametreler ayarlanabilir. Ayrıca, ortamda ek biyotin içermeyen bir kontrol grubu içeren bir deney düzeneği, arka plan bağlanmasını gösterebilir. Gösterildiği gibi, böyle bir kontrol grubu genetik olarak gerçek deneyle aynı olacaktır, ancak düşük biyotin bolluğu nedeniyle turboID ile biyotinilasyon güçlü bir şekilde azalır. Ek önemli kontrol grupları, her ikisi de biyotin ile desteklenmiş ortamda kültürlenmiş, kaynaşmamış bir turboID proteininin yanı sıra vahşi tip bir grubu içerebilir. Ek olarak, streptavidinin biyotin için güçlü afinitesi, antikor bazlı pulldown'lara göre önemli bir avantaj olsa da, farklı tuz ve deterjan konsantrasyonlarının, zenginleştirmenin saflığı ve verimliliği üzerinde bir etkisi olması muhtemeldir.

Üstün proteomik yaklaşımlar, Paramecium'un benzersiz moleküler makineleri ve potansiyel olarak diğer siliatlar hakkındaki anlayışımızı artırabilir. Yeni işlevlere sahip moleküler bileşenler, sentetik biyolojide araçlar olarak yeniden kullanılma sözü veriyor ve böylece biyoteknolojik gelişmeleri teşvik edebilir22,23. Tasarlanmış sentetik proteinler genellikle, daha önce uygulanamayan terapötik uygulamalara izin veren yeni özelliklere sahip fonksiyonel alanların kombinasyonlarından oluşur. Tasarlanmış proteinler, farmasötik üretim süreçlerinde de kullanım alanı bulabilir24. Paramecium'dan RNA'ya yönelik genom eksizyon sistemi, bu tür gelişmeler için özellikle ilgi çekicidir. Bu sistem, tek nükleotid25'e kadar bir hassasiyetle binlerce DNA parçasının RNA'ya bağlı eksizyonunu gerçekleştirir. Bu tür parametreler, insan hücrelerinde genom düzenlemenin doğruluğunu artırmayı ilginç kılmaktadır. Sunulan yakınlık biyotinilasyon yöntemi, yeni protein bileşenlerinin ve bunların multiprotein moleküler makineler içindeki etkileşimlerinin keşfini hızlandırmak ve teşvik etmek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Bern Üniversitesi DigiK hibesi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibesi tarafından finanse edildi 229074 BAS'ye verildi. ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibesi 214853 M.N.'ye verildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mikroskop Axiovert 40 CFL (10x, 40x lensler)ZeissNa
B-sitosterolSigma Aldrich567152
sığır serum albümini (BSA)Sigma AldrichA9647 Serisi
CellTram YağıEpendorf HakkındaNa
kodon optimize edilmiş 3xHA-turboID DNA dizisiBüküm biyobilimiNaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
2 TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542 Serisi
EDTAFischer BilimselAAA151610B
epT.I.P.S. mikro yükleyici uçlarıEpendorf Hakkında5242956003
EtanolGrogg Kimyası1009832500
FemtoJet 4iEpendorf HakkındaNa
Femtotip IIKalibre Bilimsel5242957000
Formaldehit çözeltisiSigma AldrichF8775 Serisi
GlisinUygulama Kimyası10021259
Keçi anti-tavşan IgG antikoru, Alexa Fluor 568Thermo Fischer BilimselA-11011
HA-tag (C29F4) tavşan mABHücre Sistemleri3724
InjectMan NI 2Ependorf HakkındaNa
hafif ortaNaNa2,5 mM Na2HPO4 içinde 0,2x buğday çimi tozu çözeltisi
Mineral yağSigma AldrichM8691 Serisi
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Fenol-Kloroform-İzoamilalkoholSigma Aldrich77617
fosfor tamponlu salin Fischer Bilimsel10722497
Plazmit artı midiprep kitiQiagene12945
zengin ortamNaNa2,5 mM Na2HPO4 içinde 1x buğday çimi tozu çözeltisi
Streptavidin-FITCThermo Fisher Bilimsel11-4317-87
Ultrafree-MC GV santrifüj filtre EMD MiliporeUFC30GV00
Yıkama solüsyonuNaNaVolvic suyunda %0.1 BSA 
buğday çimi tozu çözeltisiPines uluslararasıNaDaha önce açıklandığı gibi tozdan 20x stok olarak hazırlayın (0,5 g/10 mL)
Streptavidin-HRPABCAMAB7403
Streptavidin kaplı manyetik boncuklarSigma AldrichLSKMAGT02
Aşağı çekme için lizis tamponuNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; %0,5 Sodyum deoksikolat; %1 Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete proteaz inhibitörü (Roche);  
Aşağı çekme için yıkama tamponu 1NaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; %0,5 Sodyum deoksikolat; %1 Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Aşağı çekme için yıkama tamponu 2NaNa10 mM Tris pH 7.4; 150 mM NaCl; %0,01 NP40; 1 mM MgCl2
Aşağı çekme için yıkama tamponu 3NaNa10 mM Tris pH 7.4; 150 mM NaCl;

Kaynaklar

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyotin aretlemeTurboID LigazDNA Mikroenjeksiyonumm nofloresan BoyamaStreptavidin BoncuklarWestern BlotProtein Zenginle tirme
İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.