Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma

Özet

Burada, hedef zenginleştirme kullanarak klinik örneklerden bakteriyel cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların tüm genom dizilimini sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yeni, sendromik panel tabanlı yöntem, bol miktarda insan DNA'sı ve düşük bakteri yüklerinin zorluklarının üstesinden gelerek Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ve Mycoplasma genitalium için genomik sürveyansı kolaylaştırır.

Özet

Bakteriyel cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların (CYBE) tam genomlarını doğrudan klinik örneklerden elde etmek, insan DNA'sı, mikrobiyota ve çok düşük bakteriyel patojen yüklerinin varlığı nedeniyle zordur. Kültür genellikle bir seçenek değildir, çünkü bu türler titizdir ve çoğu örnek, mikroorganizmaları parçalayan ve onları kültür için uygun olmayan hale getiren taşıma ortamlarında alınır. Bu sorunları ele almak için, bakteriyel CYBE'lerin tüm genom dizilerini oluşturmak için dört türde tasarlanmış bir prob paneli kullandık ve genom diziliminden önce iki ila üç günlük bir hibridizasyon prosedürü olan hedef zenginleştirme gerçekleştirdik. İlk sonuçlarımız, doğrudan dizilemenin başarılı olmadığı örnekleri kullanarak mükemmel genomik veriler üretti. Hedef zenginleştirmenin, özellikle patojen yükü yüksek olduğunda bakteriyel CYBE genomlarının dizilenmesi için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır (Ct < 30). Mycoplasma genitalium içeren test edilmiş numuneler sıklıkla 30'un üzerinde Ct değerlerine sahipti ve bu da daha düşük genom kurtarma başarı oranlarına yol açtı; hibridizasyon sıcaklığının 65 °C'den 62.5 °C'ye optimize edilmesinden sonra iyileşmeler gözlemlenmiştir. Genomik sürveyansı mümkün kılmanın yanı sıra, tam genomların mevcudiyeti, Neisseria gonorrhoeae ile ilişkili edinilmiş direnç belirleyicilerinin tanımlanması gibi antimikrobiyal direnç hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu yöntem, Buenos Aires'te yeni bir Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum soyunun tanımlanmasına yol açmış olup, ompA-genotip L4, bu yaklaşımın yeni genomik çeşitliliği ortaya çıkarma ve CYBE sürveyansını iyileştirme potansiyelini vurgulamaktadır.

Giriş

Yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin ortaya çıkışı, bakteriyel tüm genom dizilemesini (WGS) kolaylaştırarak, birçok insan bakteriyel patojen türü içinde klinik izolatların dizilenmesine izin vermiştir. Teknoloji, benzeri görülmemiş bir ölçekte tam genomların üretilmesi yoluyla çok sayıda karşılaştırmalı çalışmayı mümkün kılmıştır. Bunun klinik ve halk sağlığı mikrobiyolojisi üzerinde büyük bir etkisi olmuştur, çünkü WGS aracılığıyla klinik örneklerden genom verilerine erişmek, antimikrobiyal direnç genlerinin yazılmasını ve tespit edilmesini sağlar. Ek olarak, metagenomik yaklaşımlar, klinik örneklerden hastalıkla ilişkili patojenlerin doğrudan saptanmasına izin verir. Bu tür bilgiler, hastalar için kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için yeni fırsatlar yaratır. Ek olarak, WGS, belirli bir patojenin dolaşımdaki suşlarının evrimi ve bunların bulaşma modelleri hakkında bilgi sağlayan ve halk sağlığı yetkililerinin patojen salgınlarını daha iyi anlamasını ve bunlara yanıt vermesini sağlayan güçlü bir araçtır ^1,2,3.

WGS için yeterli dizileme kalitesini elde etmek için, gerekli mikrobiyal DNA miktarlarını ^4,5,6 elde etmek için tipik olarak kültür yoluyla bakteri izolasyonu gereklidir. Bu, kültürlenmesi zor olan organizmalar, uygun olmayan tanısal numune işleme nedeniyle yetiştirilemeyenler veya hasta tedavisi sırasında antibiyotiklere maruz kalanlar için sınırlayıcı bir faktörü temsil eder. Bu tür kültürlenmesi zor mikroorganizmaların örnekleri arasında Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ve Mycoplasma genitalium ^7,8,9 gibi cinsel yolla bulaşan bakteriyel patojenler bulunur. Bu türlerin hücre içi yapıları, kırılganlıkları, titiz büyüme gereksinimleri ve yavaş replikasyon oranları gibi çeşitli faktörler nedeniyle kültürlenmesi zordur. Bu nedenlerden dolayı, düşük DNA içeriğine rağmen WGS'yi mümkün kılan tekniklerin geliştirilmesi ve uygulanması - hasta örneklerinde sıklıkla olduğu gibi - klinik ortamlarda genomik analizler yapmak için çok önemlidir.

Hedef zenginleştirme, mikrobiyal DNA'nın kıt olduğu durumlarda genom dizilimi için en umut verici yöntemdir¹⁰. Örneğin, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlara (CYBE) neden olan patojenler bağlamında, bir hasta örneğinde bulunan DNA'nın sadece küçük bir kısmı patojenden kaynaklanır. C. trachomatis enfeksiyonları durumunda, patojen DNA'nın toplam DNA'nın maksimum% 0.6'sını oluşturduğu bulunmuştur, ancak değerler tipik olarak çok daha düşüktür¹¹. Hedef zenginleştirme yöntemi, NGS'den önce ilgilenilen mikrobiyal DNA'nın seçici olarak yakalanmasından oluşur. Bu, hedef mikrobiyal DNA'yı tamamlayan özel olarak tasarlanmış biyotin etiketli RNA probları kullanılarak elde edilir. Adaptör ligasyonu, hibridizasyondan önce bir genomik kütüphane oluşturmak için gerçekleştirilir ve bu sırada bu problar tamamlayıcı mikrobiyal DNA'ya bağlanır. Daha sonra, streptavidin kaplı manyetik boncuklar, güçlü biyotin-streptavidin etkileşiminden yararlanarak biyotin etiketli nükleik asit komplekslerini yakalamak için kullanılır. Son olarak, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), seçilen DNA fragmanlarını çoğaltır. Bu temel kavramsal adımlar, hedef zenginleştirme stratejisini anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, yıkama ve kalite kontrol gibi ek prosedür adımları da tam protokol^10,12'de yer almaktadır.

Sıralama protokolünü başlatmadan önce, girdi DNA'sının miktarını değerlendirmek ve iş akışı boyunca koşulların bütünlüğünü koruduğundan emin olmak önemlidir. Üreticinin tavsiyelerine göre, standart protokol 7 μL'lik bir hacimde 10-200 ng DNA gerektirir, bu da yaklaşık 1.4 ila 28.6 ng/μL'lik bir konsantrasyon aralığına karşılık gelir. DNA konsantrasyonu daha düşük olduğunda, gerekli giriş miktarını 12 korurken 0.6 ila 11.8 ng / μL arasındaki konsantrasyonlara izin veren¹⁷ μL kullanan protokolün değiştirilmiş bir versiyonu tavsiye edilir. Genellikle klinik örneklerden elde edilen düşük konsantrasyonlar göz önüne alındığında, 17 μL protokol varyantını rutin olarak uyguladık. Hibridizasyon ve dizileme performansı, DNA kalitesi ile ilişkilidir ve nükleik asit bütünlüğünü korumak için uygun numune saklama ve taşıma koşullarının önemini vurgular. Bu nedenle, toplama ortamının stabilize edilmesi, hızlı işleme, soğuk zincir koşullarının korunması ve donma-çözülme döngülerinin en aza indirilmesi gibi uygun işleme uygulamaları, DNA kalitesini optimize etmek için önemli önlemlerdir. Gerekli DNA konsantrasyonlarının yanı sıra, DNA fragmanı uzunluğu da bütünlüğün bir göstergesidir. Daha uzun parçalar elde etmek ve dizileme sonuçlarını optimize etmek için numune işleme ve saklama sırasında DNA bozulmasını en aza indirmenizi öneririz. Bu, özellikle toplama yöntemlerinde, ortamında ve kullanımında değişkenliğin yaygın olduğu klinik ortamlarda geçerlidir. Bu protokolü, temsili sonuçlarda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, ortalama parça uzunlukları 1kb'ye kadar düşerek hem 2-SP ortamından hem de NAAT taşıma ortamından ekstrakte edilen DNA'ya başarıyla uyguladık. Son olarak, başarılı dizileme, 10x^10'u aşan ortalama okuma derinliği ile %95'ten fazla genom kapsamı elde etmek olarak tanımlandı.

Bugüne kadar, hedef zenginleştirme, çeşitli araştırma grupları tarafından cinsel yolla bulaşan hastalıklara neden olan patojenler, norovirüsler, çiftlik hayvanları virüsleri ve bitki patojenleri dahil olmak üzere çok çeşitli mikroorganizma ve virüslere başarıyla uygulanmıştır 10,13,14,15,16. Bununla birlikte, şimdiye kadar, prob tasarımı genellikle birden fazla sendromik olarak bağlı patojenin tam genomlarını hedefleyen bir panelden ziyade tek patojenlerle sınırlandırılmıştır. İdeal hedefler, aslında C. trachomatis, T. pallidum ve M. genitalium'u içeren küçük, korunmuş genomlara sahip organizmalardır. N. gonorrhoeae daha çeşitli bir genoma ve daha büyük pan-genoma sahip olsa da, onu kapsayacak problar, diğer üç bakteri ile bir tasarımda hala rasyonelleştirilebilir. Bu bakteriler arasında %G+C'de bir miktar farklılık vardır ve diğerleri sendromik olarak bağlantılı olabilir, bu da koşulların optimize edilmesi gerekebileceği anlamına gelir.

Bu protokolün amacı, filogenetik ve epidemiyolojik analizleri mümkün kılmak için doğrudan klinik örneklerden tam genomlar elde etmektir. Ürogenital ve anorektal sürüntüler gibi klinik örneklerden ekstrakte edilen DNA'yı kullanarak tam genomları kurtarmak için C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ve M. genitalium'a uyarlanmış bir prob paneli kullanarak yeni ve etkili bir strateji gösteriyoruz. Bu yaklaşımın başarılı olduğu gösterilmiştir ve Buenos Aires'teki lenfogranüloma venereum (LGV) salgınının karakterizasyonunda uygulanmış ve yeni bir C. trachomatis LGV^10,13 soyunun tanımlanmasını sağlamıştır.

C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ve/veya M. genitalium teşhisi konan hastalardan doğrudan klinik örneklerden tam genomlar elde etmek için kullanılan yeni nesil dizileme (NGS) için yakalama sonrası havuzlama ile ticari olarak mevcut bir DNA yakalama yönteminin kullanılması da dahil olmak üzere hedef zenginleştirme prosedürü açıklanacaktır Enfeksiyon. Optimum başarı için, daha yüksek Ct değerleri daha düşük patojen yüklerini yansıttığından ve tam genom verme olasılığı daha düşük olduğundan, Ct değeri 30'un altında olan örneklerin seçilmesi önerilir. Yöntem için DNA ekstraktı, çeşitli numune tiplerinin ve toplama ortamlarının klinik örneklerinden elde edilebilir. DNA ekstraksiyon prosedürleri, insan sürüntü örneklerinden patojen veya viral DNA'nın izolasyonu için tasarlanmış kitler kullanılarak manuel veya otomatik sistemlerle gerçekleştirilebilir (bkz.

Hedef zenginleştirme prosedüründe kullanılan prob seti (Malzeme Tablosuna bakınız), C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ve M. genitalium'un genomik çeşitliliğini yakalamak için özel olarak tasarlanmıştır. Her tür için birden fazla tam genom kullanılarak özel problar oluşturuldu ve bilinen pan-genomlarının kapsamını optimize etti¹⁰. Tasarım kriterleri, referans dizilere minimum %90'lık bir dizi homolojisi ve hedef yakalama verimliliğini artırmak için 1x-2x'lik bir döşeme frekansı içeriyordu. Maliyet etkinliğini optimize etmek için, prob tasarımında kullanılan algoritma, kapsamlı genomik temsili korurken prob sayısını en aza indirdi. Son prob seti , C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium ve T. pallidum'u hedefleyen multipleks tasarımlar için 242.000 probdan oluşuyordu. Hedef zenginleştirme protokolünün tamamı 2 veya 3 gün içinde gerçekleştirilebilir. Hem iki günlük hem de üç günlük iş akışı seçenekleri için durma noktalarının net göstergeleri sağlanmıştır.

ETİK BİLDİRİMİ
Bu çalışma, daha önce yayınlanmış protokollere dayalı metodolojik iyileştirmeler önermektedir^10,13. Açıklanan prosedürler yalnızca kimliksizleştirilmiş numuneleri içerir ve hasta verilerini içermez; bu nedenle, metodolojik yönler için özel bir etik onay gerekli değildi. Temsili sonuçlar, daha önce çalışılmış iki örnek setinden elde edilmiştir: Onaylanmış protokol Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, onay no. 201723) kapsamında toplanan Arjantin örnekleri, tüm katılımcılardan alınan yazılı bilgilendirilmiş onam ile; ve özel bir etik onay gerekmeyen anonimleştirilmiş Fin örnekleri. Elde edilen herhangi bir sıralama verisinin veritabanı gönderiminden önce, insan okumalarının kaldırılması gerekir.

Protokol

NOT: Kontaminasyonu önlemek için çalışma alanı, PCR öncesi bölgeye (amplikon içermeyen çalışma alanı) ve PCR sonrası bölgeye (amplikon işleme çalışma alanı) bölünmelidir. Aksi açıkça belirtilmedikçe, tüm adımlar denetlenen iki çalışma alanından birinde gerçekleştirilmelidir. Tüm ana karışımlar ve PCR reaksiyon karışımları, amplikon içermeyen çalışma alanında hazırlanırken, amplifiye edilmiş DNA'yı içeren sonraki tüm adımlar, amplikon işleme çalışma alanında gerçekleştirilmelidir. Bu protokoldeki tüm miktarlar sekiz numuneyi işlemek için hesaplanmıştır.

1. DNA parçalanması

1. Hassas, doğru, floresan bazlı bir yöntem kullanarak hedef patojen DNA (DNA) içeren klinik numunelerden elde edilen DNA ekstraktlarının DNA konsantrasyonunu ölçün (120 ng/μL'ye kadar algılama aralığı ile 1 μL numune kullanılarak çift sarmallı DNA [dsDNA] testi; bkz . Bu miktar belirleme yöntemi, DNA konsantrasyonu ölçüldüğünde protokol boyunca tutarlı bir şekilde kullanılır.
2. Her DNA örneğini nükleaz içermeyen su kullanarak 10 - 200 ng'lik bir konsantrasyona seyreltin ve her bir PCR tüp şeridinde 17 μL'lik bir nihai hacim sağlayın. Optimum dizileme sonuçları elde etmek için, önerilen aralıkta mümkün olan en yüksek miktarda girdi DNA'sı kullanın.
   NOT: Toplam DNA konsantrasyonunun 17 μL'de önerilen minimum 10 ng'nin altında olduğu durumlarda, üretici tarafından önerildiği gibi girdi gereksinimlerini karşılamak için arka plan DNA'sı (örneğin, insan genomik DNA'sı) ile takviye kullanılabilir. Bu, kütüphane hazırlama reaksiyonunu stabilize etmeye ve düşük girdili klinik numunelerde dizileme performansını iyileştirmeye yardımcı olabilir.
3. Parçalanma tamponunu (5x), girdabı çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
4. Termal döngüleyiciyi Tablo 1'e göre programlayın. Programı başlatın ve hemen duraklatın.
   NOT: 37 °C inkübasyon adımının süresi, başlangıçtaki DNA fragmanı boyutuna ve istenen NGS okuma uzunluğuna bağlı olarak değişebilir. Yüksek kaliteli DNA örnekleri için, 2 100x okuma için uygun 150 ila 200 bp'lik fragmanlar elde etmek için 15 dakikalık bir inkübasyon süresi ve 2 150x okuma için 180 ila 250 bp'lik fragmanlar elde etmek için 10 dakikalık bir inkübasyon süresi önerilir.
5. Parçalanma ana karışımı için gerekli şişeleri -20°C'lik depodan alın. Ana karışımı Tablo 2'ye göre hazırlayın. Tüpü kapatın ve girdabı 5-10 saniye boyunca yüksek hızda kapatın. Kabarcıkları çıkarmak için kısa bir süre döndürün ve ana karışımı buz üzerinde tutun.
6. 17 μL giriş DNA'sı içeren her oyuğa 3 μL parçalanma ana karışımı ekleyin. 20 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, PCR tüp şeridini kapatın, 5-10 saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın ve kısa bir süre döndürün.
7. PCR tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 1. adımın başında Tablo 1'de gösterilen programa devam edin.
8. 4 °C tutma adımına ulaşıldığında, PCR tüp şeridini termal döngüleyiciden çıkarın ve 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. PCR tüp şeridini buzun üzerine yerleştirin.

Tablo 1: Enzimatik parçalanma için termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Parçalanma Master Karışımının Hazırlanması Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kütüphane hazırlığı

1. Ligasyon ana karışımının hazırlanması
   NOT: Ligation master karışımı bu noktada hazırlanmalıdır çünkü oda sıcaklığına dengelenmesi için 30-45 dakikaya ihtiyaç vardır.
   1. Ligasyon tamponunu -20 ° C'lik depodan alın ve buz üzerinde çözdürün. T4 DNA ligazını -20 ° C'lik depodan alın, şişeyi ters çevirerek karıştırın ve buz üzerinde tutun.
   2. Ligasyon ana karışımını Tablo 3'e göre hazırlayın. Tüpü kapatın ve girdabı 10-20 saniye boyunca yüksek hızda kapatın, kısa bir süre döndürün ve kullanmadan önce 30-45 dakika oda sıcaklığında tutun.
2. Uç onarımı ve dA-kuyruk parçaları
   1. Termal döngüleyiciyi Tablo 4'e göre programlayın.
   2. Son onarım atık tamponunu -20 ° C'lik depodan alın ve buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, yüksek hızda girdap, kısa bir süre döndürün. Son onarım-A atık enzimi karışımını alın, şişeyi ters çevirerek karıştırın ve buz üzerinde tutun.
   3. Son onarım/dA-kuyruk ana karışımını Tablo 5'e göre hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Tüpü ve vorteksi 10-20 saniye boyunca yüksek hızda güvenli bir şekilde kapatarak karıştırın, kısa bir süre döndürün ve buz üzerinde tutun.
   4. 50 μL DNA fragmanı içeren her bir oyuğa 20 μL uç onarım/dA-kuyruk ana karışımını pipetleyin (adım 1.1-1.8'den). PCR tüp şeridini kapatın, 5-10 saniye boyunca yüksek hızda girdap yaparak iyice karıştırın. PCR tüp şeridini kısaca döndürün ve termocycler'a yerleştirin. Tablo 4'teki programa devam edin.
3. MBC etiketli adaptörlerin ligasyonu
   1. Tablo 4'teki program son adımını tamamladığında, PCR tüp şeridini buzun üzerine yerleştirin. Termal döngüleyiciyi Tablo 6'daki parametrelere göre ayarlayın. Programı başlatın ve hemen duraklatın.
   2. Adım 2.1'de hazırlanan her numuneye 25 μL oda sıcaklığında ligasyon ana karışımı ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın, 5-10 saniye girdap yapın ve kısa bir süre döndürün.
   3. MBC etiketli kitaplıklar için adaptör oligo karışımını (Malzeme Tablosuna bakın) -20 °C depolamadan alın ve buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra 5-10 saniye yüksek hızda girdap. Kısaca döndürün ve buz üzerinde tutun.
   4. Her örneğe MBC etiketli kitaplıklar için 5 μL adaptör oligo karışımı ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın ve 5-10 saniye boyunca yüksek hızda girdap, kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini hemen termal döngüleyiciye yerleştirin ve programı Tablo 6'da belirtildiği gibi çalıştırmaya devam edin.
4. Ligasyonun temizlenmesi
   1. Manyetik boncuklar kullanarak DNA saflaştırması gerçekleştirin. Boncukları 4 °C'lik depodan alın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına ulaşmalarını bekleyin.
   2. Nükleaz içermeyen su kullanarak 4 mL %70 etanol hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Optimum performansı sağlamak için temizleme adımlarında kullanılmak üzere %70'lik bir etanol çözeltisinin taze olarak hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. % 70 etanol hazırlığı için, kullanmadan hemen önce nükleaz içermeyen su kullanın.
   3. Manyetik boncuk süspansiyonunu, karışım homojen olana ve renk tutarlı görünene kadar iyice girdaplayın.
   4. Tablo 6'daki program 4 °C tutma adımına ulaştığında, PCR tüp şeridini termal döngüleyiciden oda sıcaklığına aktarın. Her kuyucuğa 80 μL boncuk süspansiyonu ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdap, kısaca döndürün.
   5. Boncuk süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa aktarın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve çözelti berraklaşana kadar 5-10 dakika bekleyin.
   6. PCR tüp şeridini manyetik standda tutarken, boncuklarla temastan kaçınarak, temizlenmiş çözeltiyi her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve atın.
   7. PCR tüp şeridi manyetik standdayken, aşağıdaki şekilde %70 etanol ile iki yıkama gerçekleştirin: her numuneye 200 μL %70 etanol ekleyin. 1 dakika bekleyin ve% 70 etanolü çıkarın. Solüsyonu çıkarırken boncuklara dokunmaktan kaçının.
   8. İkinci yıkamadan sonra, PCR tüp şeridini kapatın ve artık etanolü toplamak için numuneleri kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini 30 saniye boyunca manyetik standa yerleştirin.
   9. Boncuklara dokunmaktan kaçınarak toplanan etanolü çıkarın. Kalan etanolü çıkarmak için, PCR tüp şeridini manyetik standdan çıkarın ve 5 dakikaya kadar mühürsüz (ideal olarak bir başlık içinde) tutun. Boncukların tamamen kuruduğundan, ancak görünüşte çatlamadığından emin olun; Bu, elüsyon işleminin verimliliğini azaltacaktır.
   10. Her numune kuyucuğuna 35 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek DNA'yı güçlendirin. 10x-15x yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın, tüpleri kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdap yapın. Görünür kümelerin olmadığını onaylayın. Varsa, çözünene kadar girdap.
   11. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin.
   12. Temizlenmiş süpernatanı (~ 34 μL) her bir oyuktan dikkatlice çıkarın ve yeni bir PCR tüp şeridi içinde karşılık gelen bir kuyucuğa aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve boncukları atın.
       NOT: 3 günlük bir protokol için bu, 1. günün sonunu işaret eder. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de saklayın.
5. Amplifikasyon ve çift indeks
   NOT: Sıralama sırasında doğru tanımlamayı sağlamak için her numune için uygun indeks primer çiftini seçin. Her indeks dizisi, yakalama öncesi kitaplıkların amplifikasyonu için kullanılan primerlere dahil edilmiş 8 bp'lik bir etiketten oluşur.
   1. -20 °C'lik depolamadan dNTP'li (5x) yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponunu alın ve buz üzerinde çözdürün. Seçilen indekslenmiş dizileme primerlerini -20 °C depodan alın ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Sıralama işlemi boyunca doğru tanımlama ve izlenebilirlik için her numuneye atanan özel barkodu kaydettiğinizden emin olun.
   2. Termal döngüleyiciyi Tablo 7'ye göre programlayın. Programı başlatın ve hemen duraklatın.
      NOT: Üretici, giriş DNA'sının kalitesine ve miktarına bağlı olarak 8 ila 14 yakalama öncesi PCR döngüsü gerçekleştirilmesini önerir. Bu protokolde, üreticinin tavsiyelerine göre 11 döngü uygulandı ve bu da yüksek kaliteli sıralama verileriyle^{sonuçlandı 10,12}.
   3. -20 °C depolamadan PCR amplifikasyonu için yüksek kaliteli füzyon enzimini alın. Aşırı çalkalamadan kaçınarak karıştırmak için enzimi yukarı ve aşağı pipetleyin ve homojenliği sağlamak için yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponunu girdaplayın. Yakalama öncesi PCR reaksiyon karışımını hazırlayın ( Tablo 8'de açıklandığı gibi). Son karışımı girdaplayın ve kısaca döndürün, buz üzerinde tutun.
   4. 11 μL yakalama öncesi PCR reaksiyon karışımını ( Tablo 8'de açıklandığı gibi hazırlanır) saflaştırılmış DNA kütüphanesini içeren her bir numune kuyucuğuna dağıtın. Her reaksiyona seçilen indeks primer çiftinden 5 μL ekleyin. PCR tüp şeridini ve girdabı 5 saniye boyunca kapatın ve ardından hızla aşağı döndürün.
   5. Termal döngüleyici programına Tablo 7'de belirtildiği gibi devam edin. Sıcaklık 98 °C'ye ulaştığında, PCR tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin ve kapağı güvenli bir şekilde kapatın.
6. Kütüphanenin temizlenmesi
   1. Kullanmadan önce manyetik boncukların en az 30 dakika oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin. Nükleaz içermeyen su kullanarak 4 mL %70 etanol hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
   2. Manyetik boncuk süspansiyonunu, karışım homojen olana ve renk tutarlı görünene kadar iyice girdaplayın.
   3. Tablo 7'deki program 4 °C tutma adımına ulaştığında, PCR tüp şeridini termal döngüleyiciden oda sıcaklığına aktarın. Her numuneye 50 μL boncuk süspansiyonu ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdap yapın, kısaca döndürün (manyetik boncukları peletlemeden).
   4. Boncuk süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa aktarın ve çözelti berraklaşana kadar 5-10 dakika bekleyin.
   5. PCR tüp şeridini manyetik standda tutarken, berrak çözeltiyi her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve atın. Solüsyonu çıkarırken boncuklara dokunmaktan kaçının.
   6. PCR tüp şeridi manyetik standdayken, aşağıdaki şekilde %70 etanol ile iki yıkama gerçekleştirin. Her numuneye 200 μL %70 etanol ekleyin. 1 dakika bekleyin ve% 70 etanolü çıkarın. Solüsyonu çıkarırken boncuklara dokunmaktan kaçının.
   7. İkinci yıkamadan sonra, PCR tüp şeridini kapatın ve artık etanolü toplamak için kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini 30 saniye boyunca manyetik standa yerleştirin. Boncuklara dokunmaktan kaçınırken kalan etanolü çıkarın.
   8. Kalan etanolü çıkarmak için, PCR tüp şeridini manyetik standdan çıkarın ve 5 dakikaya kadar mühürsüz (ideal olarak bir başlık içinde) tutun. Boncukların tamamen kuruduğundan, ancak görünüşte çatlamadığından emin olun, çünkü bu, elüsyon işleminin verimliliğini azaltacaktır.
   9. Her numune tüpüne 15 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek kütüphane DNA'sını güçlendirin. 10x-15x yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın, PCR tüp şeridini kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdaplayın. Görünür kümelerin olmadığını onaylayın. Varsa, çözünene kadar girdap.
   10. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin.
   11. Temizlenmiş süpernatanı (~ 15 μL) her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve yeni bir PCR tüp şeridinde karşılık gelen bir kuyuya aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve boncukları atın.
7. Kalite kontrol
   1. Saflaştırılmış kütüphane DNA'sının DNA konsantrasyonunu ölçün. Daha yüksek hassasiyet nedeniyle, DNA'yı 1 μL'de ölçmek için floresan bazlı bir yöntem kullanın.

Tablo 3: Ligasyon ana karışımının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Uç onarımı/dA-tailing için termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Uç onarım/dA atık ana karışımının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6 Ligasyon için termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 7: Yakalama öncesi PCR termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 8: Yakalama öncesi PCR reaksiyon karışımının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Örnek hibridizasyon/yakalama

1. Araştırma için hibridizasyon kitaplıkları
   1. Termal döngüleyiciyi Tablo 9'a göre programlayın. Programı başlatın ve hemen duraklatın.
      NOT: Üretici, 65°C'lik bir hibridizasyon sıcaklığı önermektedir. Bu sıcaklık 62,5 °C'ye düşürüldü ve bu da daha iyi sonuçlarla sonuçlandı.
   2. Hibridizasyon tamponunu -20 °C'lik depolamadan alın, buz üzerinde çözdürün ve kullanıma kadar oda sıcaklığında tutun. Hem RNase blokerini hem de oligonükleotid bloker karışımını -20 ° C'lik depodan alın ve buz üzerinde çözdürün. Bu şişeleri kullanana kadar buz üzerinde tutun.
   3. Adım 2.7'de ölçülen DNA konsantrasyonuna bağlı olarak, her numunenin 500-1000 ng DNA kütüphanesi içermesi için gereken hacmi hesaplayın. Hesaplanan hacmi yeni bir PCR tüp şeridine aktarın ve toplam hacmi nükleaz içermeyen su ile 12 μL'ye ayarlayın.
   4. Vorteks ve hızlı bir şekilde oligonükleotid bloker karışımını döndürün. Her numune tüpüne 5 μL ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın ve termal döngüleyiciye aktarın. Tablo 9'da açıklanan termal döngü programına devam edin ve ek reaktiflerin doğrudan termal döngüleyicideki numune kuyucuklarına eklenmesi gereken Adım 3'e kadar çalıştırın.
   5. % 25 RNase blok çözeltisini Tablo 10'a göre hazırlayın. Tüpü kapatın ve girdabı 10-20 saniye boyunca yüksek hızda kapatın, kısa bir süre döndürün ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Prob içeren çözeltilerin oda sıcaklığına uzun süre maruz kalmasından kaçının. Sadece hazırlık adımları sırasında oda sıcaklığında tutun.
   6. Prob şişesini -80 ° C'lik depodan alın ve kullanılmadığı zaman şişeyi bir soğutma rafında saklayın. Çözülmesi için buza aktarın. Probların sağlandığı şekilde kullanılması tavsiye edilir, ancak test edilirse^{seyreltilebilir 10,13}.
   7. Tablo 11'de listelenen tüm reaktifler oda sıcaklığına ulaştığında, prob hibridizasyon karışımını hazırlamak için birleştirin. Çözeltiyi 5 saniye boyunca yüksek hızda girdap yaparak karıştırın, kısa bir süre döndürün ve hemen bir sonraki adıma geçin.
   8. Termal döngüleyici, Tablo 9'da açıklanan programın Adım 3'üne ulaştığında, her bir numune kuyucuğuna 13 μL oda sıcaklığında prob hibridizasyon karışımı ekleyin ve tüpleri işlem boyunca termal döngüleyicide tutun. 8x-10x yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   9. PCR tüp şeridini güvenli bir şekilde kapatın, kısa bir süre girdap yapın ve tüpleri aşağı doğru döndürün. Kabarcık olmadığından emin olun, ardından şerit tüplerini derhal termal döngüleyiciye geri koyun. Tüplerin uygun şekilde kapatıldığını iki kez kontrol edin.
   10. Hazırlanan kütüphane DNA örneklerinin problarla hibridizasyonunu gerçekleştirmek için termal döngü programına devam edin. Hibridizasyon bir gecede devam ediyor
       NOT: 2 günlük bir protokol için bu, 1. günün sonunu işaret eder. 3 günlük bir protokol için bu, 2. günün sonunu işaret eder.
2. Streptavidin boncuklarının hazırlanması
   1. Streptavidin kaplı manyetik boncukları (streptavidin boncukları) 4 ° C'lik depodan alın. Boncukların tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için şişeyi iyice sarın. Süspansiyon homojen olmalıdır.
   2. Her hibridizasyon numunesi için, 50 μL'lik tamamen yeniden süspanse edilmiş boncukları yeni bir PCR tüp şeridinin ayrı tüplerine aktarın.
   3. Streptavidin boncuklarını aşağıdaki şekilde yıkayın: her tüpe 200 μL bağlayıcı tampon ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüpleri kapatın, 5-10 saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın ve kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini manyetik bir standa yerleştirin. Çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Adımları 2 kez tekrarlayın ve toplam üç yıkamayı tamamlayın.
   4. Boncukları 200 μL bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin.
3. Hibritleştirilmiş kitaplıkların yakalanması
   1. Tablo 9'da gösterilen hibridizasyon termal döngü programı son adımını tamamladıktan sonra, PCR tüp şeridini oda sıcaklığına aktarın.
   2. Her tüpten tüm hacmi (~ 30 μL) 200 μL önceden yıkanmış streptavidin boncukları içeren ilgili tüplere aktarın. 5x-8x yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın, ardından şerit tüpünü güvenli bir şekilde kapatın.
   3. Şerit tüpünü 96 oyuklu bir plaka karıştırıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1800 rpm'de kuvvetlice karıştırın. Kuyucuk içindeki sıvının uygun şekilde karıştırıldığından emin olun.
      NOT: 96 oyuklu bir plakalı karıştırıcı mevcut değilse veya numuneler etkili bir şekilde karışmıyorsa, numune ajitasyonunu sağlamak için şerit tüplerini karıştırıcının üst yüzeyine yatay olarak sabitlemek veya sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcı (ısıtma seçeneği kapalıyken) kullanmak gibi alternatif yöntemleri göz önünde bulundurun.
   4. Bu inkübasyon süresi boyunca, her numune için 200 μL'lik yüksek sıcaklıkta yıkama tamponundan altı alikot hazırlayın (yani, bu durumda, her biri 200 μL'lik 6 x 8 şerit tüp). Tüpleri kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar 70 °C'de tutulan termal döngüleyicide inkübe edin.
   5. 30 dakikalık yakalama inkübasyonu tamamlandıktan sonra, sıvıyı toplamak için PCR tüp şeridini kısaca döndürün. Boncukları toplamak için PCR tüp şeridini manyetik bir standa yerleştirin. Çözelti berraklaşana kadar bekleyin (yaklaşık 2 dakika), ardından boncuklara dokunmaktan kaçınarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
   6. PCR tüp şeridini manyetik standdan çıkardıktan sonra, 200 μL oda sıcaklığında yıkama tamponu ekleyin. Streptavidin boncukları tamamen yeniden süspanse olana kadar (15x-20x) yukarı ve aşağı pipetleyin.
   7. PCR tüp şeridini manyetik standa yerleştirin ve süspansiyonun temizlenmesini bekleyin (yaklaşık 1 dakika). Ardından, süpernatanı çıkarın ve atın.
      NOT: Yakalama özgüllüğünü sağlamak için, aşağıda açıklanan yıkama prosedürü boyunca boncuk süspansiyonunu 70 °C'de tutmak çok önemlidir. Bu nedenle, kullanmadan önce yüksek sıcaklıktaki yıkama tamponunun 70 °C'ye önceden ısıtıldığını doğrulayın.
   8. Streptavidin boncuklarını 6x aliquoted ile yıkayın ve aşağıda açıklandığı gibi 70 ° C yüksek sıcaklıkta yıkama tamponuna önceden ısıtın.
      1. Boncukları içeren PCR şerit tüpünü manyetik standdan çıkarın. Boncukları içeren her tüpe 200 μL 70 °C önceden ısıtılmış yüksek sıcaklıkta yıkama tamponu ekleyin. Boncuklar tamamen yeniden süspanse olana kadar (15x-20x) yukarı ve aşağı pipetleyin. PCR tüp şeridini dikkatlice kapatın, 8 saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın ve boncukları peletlemeden hızlı bir şekilde döndürün.
      2. Yeniden asılı boncukları içeren numune şeridi tüpünü 70 °C'de 5 dakika boyunca termal döngüleyici bloğuna yerleştirin. Şerit tüpünü termal döngüleyiciden oda sıcaklığında manyetik standa aktarın.
      3. Çözeltinin temizlenmesi için 1 dakika bekleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve atın. Toplam altı yıkama için 5x tekrarlayın.
   9. Tüm yıkama tamponunun tamamen çıkarıldığından emin olun, ardından her numune tüpüne 25 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemeye çalışarak 8 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek boncukları yavaşça yeniden süspanse edin.
   10. Numuneleri içeren PCR şeridini, aşağıda açıklanan PCR reaksiyonlarında kullanılmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
4. Amplifikasyonla zenginleştirilmiş kütüphaneler
   1. Termal döngüleyiciyi Tablo 12'ye göre programlayın. Programı başlatın ve hemen duraklatın.
      NOT: Üretici, prob tasarımının boyutuna bağlı olarak 10 ila 16 yakalama sonrası PCR döngüsü gerçekleştirilmesini önerir. Bu protokolde 22 döngü uygulandı ve başarılı patojen genom geri kazanımı ile sonuçlandı^10,12.
   2. Hem dNTP'li (5x) yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponunu hem de yakalama sonrası astar karışımını (Malzeme Tablosuna bakınız) -20 °C'den alın, çözün ve buz üzerinde tutun. Yüksek hızda girdap yapın ve kullanmadan önce hızla aşağı dönün.
   3. PCR amplifikasyonu için yüksek kaliteli füzyon enzimini -20 °C depolamadan alın ( Malzeme Tablosuna bakın). Enzim çözeltisini düzgün bir şekilde karıştırmak için, aşırı çalkalamayı önlemek için sıvıyı yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, tüm reaktifleri Tablo 13'e göre birleştirerek yakalama sonrası PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Son karışımı girdaplayın ve kısaca döndürün, buz üzerinde tutun.
   4. Her numune tüpüne (her biri 25 μL boncuk bağlı hedefle zenginleştirilmiş DNA içeren) 25 μL yakalama sonrası PCR reaksiyon karışımı ekleyin. Boncuk süspansiyonu homojen olana kadar reaksiyonları karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. PCR tüp şeridini güvenli bir şekilde kapatın. Bu aşamada PCR tüp şeridini aşağı doğru sıkmayın.
   5. PCR tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Tablo 12'de belirtildiği gibi termal döngüleyici programına devam edin. Program son adımına ulaştığında, PCR tüp şeridini kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini manyetik standa yerleştirin, çözeltinin temizlenmesi için yaklaşık 2 dakika bekleyin.
   6. Her bir PCR tüp şeridinden yaklaşık 50 μL süpernatanı yeni bir PCR tüp şeridinin karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Streptavidin boncuklarını içeren şerit tüp atılabilir.
5. Son kütüphanelerin temizlenmesi
   1. Kullanmadan önce manyetik boncukların en az 30 dakika oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin. Nükleaz içermeyen su kullanarak 4 mL %70 etanol hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
   2. Manyetik boncuk süspansiyonunu, karışım homojen olana ve renk tutarlı görünene kadar iyice girdaplayın.
   3. Her numune tüpüne 50 μL boncuk süspansiyonu ekleyin. Tüpleri kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdap yapın, kısaca döndürün (manyetik boncukları peletlemeden).
   4. Boncuk süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa aktarın ve çözelti berraklaşana kadar 5-10 dakika bekleyin.
   5. PCR tüp şeridini manyetik standda tutarken, berrak çözeltiyi her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve atın. Solüsyonu çıkarırken boncuklara dokunmaktan kaçının.
      1. PCR tüp şeridi manyetik standdayken, aşağıdaki şekilde %70 etanol ile iki yıkama gerçekleştirin: her numuneye 200 μL %70 etanol ekleyin. Rahatsız edici boncukların yerleşmesi için 1 dakika bekleyin ve %70 etanolü çıkarın. Solüsyonu çıkarırken boncuklara dokunmaktan kaçının.
   6. İkinci yıkamadan sonra, tüpleri kapatın ve artık etanolü toplamak için PCR tüp şeridini kısa bir süre döndürün. PCR tüp şeridini 30 saniye boyunca manyetik standın üzerine yerleştirin.
   7. Kalan etanolü çıkarmak için, PCR tüp şeridini manyetik standdan çıkarın ve maksimum 5 dakika boyunca mühürsüz (ideal olarak bir başlık içinde) tutun. Boncukların tamamen kuruduğundan ancak görünüşte çatlamadığından emin olun, bu elüsyon işleminin verimliliğini azaltacaktır.
   8. Her numune tüpüne 25 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek kütüphane DNA'sını güçlendirin. 10x-15x yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın, PCR tüp şeridini kapatın ve 5-10 saniye boyunca girdaplayın. Görünür kümelerin olmadığını onaylayın.
   9. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini manyetik bir standa yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin.
   10. Temizlenmiş süpernatanı (yaklaşık 25 μL) her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve yeni bir PCR tüp şeridinde karşılık gelen bir kuyuya aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve boncukları atın.
6. Kalite kontrol
   1. Saflaştırılmış kütüphane DNA'sının DNA konsantrasyonunu ölçün. Daha iyi hassasiyet elde etmek için, DNA'yı 1 μL'de ölçmek için floresan bazlı bir yöntem kullanın.
7. Yeni nesil dizileme
   NOT: Kullanılan platformun kapasitesine ve örnek başına gereken sıralama verisi miktarına bağlı olarak, birkaç partiden dizinlenmiş kitaplıklar tek bir sıralama çalışmasında çoğullanabilir.
   1. Numuneleri bir araya getirmeden önce, her bir numunenin DNA konsantrasyonunu 5 ng/μL'ye ayarlayın. Dengeli bir temsili sürdürmek için kitaplıkları eşmolar miktarlarda bir araya getirin.
   2. Hazırlanan kitaplıkları, örneğin 150 bp eşleştirilmiş uçlu okuma konfigürasyonuna sahip yüksek verimli bir kısa okuma sıralama sistemi kullanarak sıralayın (bkz. Malzeme Tablosu).

Tablo 9: Hibridizasyon için termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 10: RNaz blok çözeltisinin hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 11: Prob hibridizasyon karışımının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 12: Yakalama sonrası PCR termal döngüleyici programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 13: Yakalama Sonrası PCR Reaksiyon Karışımının Hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Arjantin, Buenos Aires'te C. trachomatis LGV salgını üzerine yapılan bir araştırma, örneklerde bazı yeni özellikler gösterdi, yani ompA-genotip L1'e kıyasla ompA geninde 10 nükleotid ikamesi ve olağandışı bir Çok Lokus Dizi Tiplemesi (MLST) dizi tipi 2 17,18,19. Bu klinik örneklerden elde edilen genomları araştırmayı ve bunları küresel veriler bağlamına yerleştirmeyi amaçladık. Bunu başarmak için, düşük bakteri yükleri ve bol miktarda insan ve mikrobiyal DNA'nın ortaya çıkardığı zorlukların üstesinden gelmek amacıyla, klinik örneklerden bakteriyel CYBE'lerin WGS'si için doğrudan metagenomik dizileme ile bir hedef zenginleştirme yaklaşımının performansını karşılaştırdık.

Kullanılan DNA, 2017 ve 2023 yılları arasında Arjantin, Buenos Aires'te toplanan rektal sürüntü örneklerinden, %2 fetal buzağı serumu (FCS) ve antibiyotiklerle (gentamisin 25 μg/mL, vankomisin 0.5 mg/mL ve amfoterisin B 2.5 μg/mL) takviye edilmiş 2-SP ortamına (sakaroz-fosfat ortamı) yerleştirildi ve -80 °C'de saklandı veya havuzlanmış üretral, anorektal, ve Zürih Üniversite Hastanesi'nde (USZ) NAAT'ler (Nükleik Asit Amplifikasyon Testleri) tamponunda toplanan faringeal sürüntüler. Buenos Aires örneklerinden alınan DNA, silika bazlı bir manuel ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edilirken, USZ örneklerinden alınan DNA, otomatik manyetik boncuk bazlı bir sistem kullanılarak ekstrakte edildi.

Bu çalışmaya dahil edilen tüm klinik örnekler, qPCR döngü eşiği (Ct) değerleri aşağıdaki gibi değişen, kurum içi geliştirilen bir multipleks gerçek zamanlı PCR testi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile pozitif olarak doğrulanmıştır: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 ve M. genitalium:  30-37. DNA konsantrasyonu, klinik örneklerin giriş materyalini karakterize etmek için dizilemeden önce yüksek hassasiyetli bir florometrik test kullanılarak ölçüldü (bkz. Malzeme Tablosu).

Doğrudan metagenomik dizilemeyi hedef zenginleştirme ile karşılaştırmak için, 29'u C. trachomatis, dokuzu N. gonorrhoeae, beşi T. pallidum ve üçü M. genitalium için pozitif olan 32 örnek kullandık. Doğrudan metagenomik dizileme, herhangi bir tam genomla sonuçlanmadı ve gerçekten de negatif örneklerde görülen taban çizgisinin üzerinde hedef verilere zar zor ulaşıldı. 65 °C'de hibridizasyon ile hedef zenginleştirme, her patojen için çok daha iyi sonuçlarla sonuçlandı ve bu yöntemden birçok durumda başarılı genomlar elde edildi (Şekil 1).

Hedef zenginleştirme için optimum örnek seçimini değerlendirmek için, hedef üzerindeki okumaların yüzdesi (%OTR) ile ölçülen tanısal qPCR Ct değerleri ile genom geri kazanımının etkinliği arasındaki ilişkiyi değerlendirdik. Bu ölçüm, hedef organizmanın genomuyla eşleşen dizileme okumalarının oranını yansıtır ve zenginleştirme performansını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. C. trachomatis için patojen yükü ile dizileme başarısı arasında anlamlı bir korelasyon bulundu ve Ct30 civarında başarı için bir Ct kesintisi oldu. Diğer hedef patojenler için veriler sınırlı olmasına rağmen, genom dizileme başarısının ağırlıklı olarak patojen yükü Ct30'un altında olan örneklerde meydana geldiği benzer bir eğilim gözlenmiştir (Şekil 2).

65 °C'lik bir hibridizasyon sıcaklığına sahip bu deney, Ct değerleri 30'un altında olan örneklere dayalı olarak C. trachomatis, N. gonorrhoeae ve T. pallidum için u-80'lik hedef zenginleştirme ile genom dizileme başarı oranları verdi. Üç M. genitalium pozitif numunenin Ct değerleri 30-37 idi ve daha düşük genom kapsamı ve ortalama okuma derinliği elde etti. Bu sonuçları iyileştirmek için, M. genitalium genomundaki düşük %G+C içeriği nedeniyle hibridizasyonun iyileştirildiği hibridizasyon sıcaklığının düşürülmesini denedik. Şu anda önerilen 62.5 ° C sıcaklık gibi daha düşük hibridizasyon sıcaklıkları kullanarak, diğer genomların geri kazanımından ödün vermeden M. genitalium genomlarının geri kazanımını iyileştirebiliriz (Şekil 3). Bu sonuçlar, hedef zenginleştirmenin klinik örneklerden değerli genomik bilgiler elde etmek için etkili bir yaklaşım olduğunu ve panel tabanlı bir tasarımda da çok çeşitli genomlara uyarlanabileceğini göstermektedir.

Başarılı bir şekilde zenginleştirilmiş C. trachomatis genomlarının filogenetik analizi, Buenos Aires'ten alınan örneklerin çoğunun ompA-genotip L2b sınıfı içinde kümelendiğini gösterdi ve bu da küresel dolaşım ile başarılı bir soy olduğunu düşündürdü. Analiz ayrıca Arjantin'de LGV'ye neden olan yeni, farklı bir soyun varlığını da ortaya çıkardı. Bu daldan alınan örnekler, diğer LGV soylarından yaklaşık 600 SNP farklıdır ve bu soy, ompA-genotip L4 olarak önerilmiştir (Şekil 4). Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 4'te kullanılan örneklerin ayrıntılı bir açıklaması Ek Tablo 1'de verilmiştir.

Bu bulgular, patojen çeşitliliğinin incelenmesinde hedef zenginleştirmenin değerinin altını çizmekte ve klinik örneklerden yüksek derecede genom dizileme başarısı göstermektedir.

Şekil 1: Doğrudan metagenomik dizileme ile karşılaştırıldığında hedef zenginleştirme kullanılarak genomların zenginleştirilmesi.

Tartışma

Klinik örneklerden tam bakteri genom verileri oluşturmak özellikle zordur. Yine de, dolaşımdaki klonlar hakkında bilgi edinmek ve özellikle titiz ve kültürlenmesi zor bakterilerde antimikrobiyal direnç profillerini araştırmak için bu verilere ihtiyacımız var. Oxford Nanopore Teknolojileri ile derin dizileme veya adaptif dizileme gibi alternatif yöntemler kullanılarak, tüm genom dizi analizi için yeterli veri elde edilememektedir. CYBE örnekleri gibi durumlarda, hedef zenginleştirme, tam genoma erişmek için en uygun tekniktir ve bu yöntem, bakteriyel CYBE patojenlerinin bir panelinde kullanılabilir. Ucuz bir işlem olmamakla birlikte, sunabileceği sonuçlar başka hiçbir şekilde elde edilemez¹⁰.

İdeal olarak teşhis ve araştırmada ilgili ve önemli soruları yanıtlamak için uygun numuneler dikkatlice seçilmelidir. Toplama için kullanılan ortam, hem 2-SP hem de NAAT ortamından elde edilen başarılı dizilerle mutlaka kritik bir rol oynamaz. DNA bütünlüğünü korumak amacıyla numune saklama önemlidir. En önemli faktör, Ct30'un altındaki yaklaşık Ct değerlerini hedefleyen tanısal yük olarak bulundu. Ct değerleri 30'un üzerinde olan örnekler için, tam genom dizileme başarısı daha az olasıdır, ancak kısmi veriler bazı durumlarda ilgili bilgileri sağlayabilir.

Prosedür önemsiz değildir, PCR döngüleri, hibridizasyon ve birçok boncuk yıkama dahil olmak üzere birçok adımı içerir. En iyi sonuçlar için prosedüre dikkat edilmesi gerekir. Protokolün kritik adımları - DNA parçalanması, yakalama probları ile hibridizasyon ve yıkama ile manyetik boncuk tabanlı yakalama - dikkatli bir uygulama ve uygun kullanım gerektirir. Protokol, birkaç denemeden sonra araştırmacılar ve teknisyenler tarafından öğrenilebilir. İlk turlarda öğrenirken 3 günlük protokol bir avantaj olabilir; Daha deneyimli kullanıcılarla, 2 günlük protokol sonuçları hızlandırabilir. Reaktifler pahalı olduğundan, örneğin problar gibi pahalı bileşenler olmadan bir test çalıştırması yapmaya değer olabilir. Alternatif yem setleri için, hibridizasyon sıcaklığı ayarlanabilir, bu da zenginleştirmenin hassasiyetini veya özgüllüğünü artırabilir. Yeterli veri üretilirse ve PCR mükerrerlerinin önemli bir kısmı gözlemlenirse, yakalama öncesi ve yakalama sonrası PCR döngülerinin sayısı da ayarlanabilir.

Bu deneylerden elde edilen veriler, MLST ve diğer ilgili hedefler çıkarılarak yazmak için kullanılabilir. Epidemiyolojik bir bağlamda, küresel veya yerel olarak, çağdaş içgörüler için ilgili genomlarla karşılaştırılarak daha fazla analiz edilebilir. Genom boyunca rekombinasyon ve mobil element analizi, zaman içinde ve seçici baskı altında değişiklikleri ve olası ko-enfeksiyonları da ortaya çıkarır. Yeterli veri ve ilgili meta verilerle, zamansal hesaplamalar yapılabilir ve belirli özelliklerin ve soyların atalarının yanı sıra olası iletim yolları ve mekanizmalarının çıkarımı yapılabilir. Önemli bir patojen grubu hakkındaki bilgimizdeki tüm bu ilerlemeler, halk sağlığı stratejilerini bilgilendirebilir. Protokolümüz ve temsili sonuçlarımız, bakteriyel CYBE örneklerinde etkili olan ve ek örnek tiplerine genişletilebilen sendromik panel hedef prob setlerinin kullanımını göstermektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
8-kanallı pipet 0.5-10 µ L	Eppendorf Belediyesi	3125000010	Eppendorf Research  artı, 8-kanal, 0.5-10 &mikro; L, orta gri, değişken hacimli.
8-kanallı pipet 10-100 &mikro; L	Eppendorf Belediyesi	3125000036	Eppendorf Research  artı, 8-kanal, 10-100 &mikro; L, sarı, değişken hacim.
MBC etiketli kitaplıklar için Oligo Mix adaptörü	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
Viral/patojen DNA ekstraksiyon kiti kullanan otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi	Qiagen	937036 (Kit) / 9001297 (Enstrüman)	Otomatik DNA ekstraksiyonu için QIAamp DSP Virüs/Patojen Kiti ile birlikte kullanılan QIAsymphony SP/AS cihazı.
Bağlama Arabelleği	Agilent Teknolojileri	5190-9687	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1'in (PCR Sonrası) bir parçası.
DNA ekstraksiyon kiti ve otomatik cihaz	Zymo Araştırma Şirketi	D3024/D3025	Klinik örneklerden toplam DNA ekstraksiyonu için kullanılan Quick-DNA Miniprep Kiti. Manuel veya otomatik iş akışı uyumlu.
Son Onarım - Bir Kuyruk Enzim Karışımı	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
Son Onarım Kuyruk Tamponu	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
Etanol	VWR Kimyasalları BDH	20816.298	Etanol mutlak ≥ %99,5 Ph. Eur., USP
Yüksek Hassasiyetli dsDNA Testli Florometre / DNA'yı ölçmek için floresan tabanlı yöntem	Thermo Fisher Bilimsel (Invitrogen)	Q33238, Q33231	1X dsDNA Yüksek Hassasiyetli (HS) Test Kitine sahip Qubit 4 Florometre.
Parçalanma Arabelleği	Agilent Teknolojileri	5191-4080	SureSelect Enzim Fragmantasyon Kitinin ''5X Fragmantasyon Tamponu'' adlı parçası.
Parçalanma Enzimi	Agilent Teknolojileri	5191-4080	SureSelect Enzim Parçalanma Kitinin bir parçası.
Yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponu	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kütüphane Hazırlama Kitinin ''Herculase II Buffer'' adlı parçası.
dNTP'li yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponu (5X)	Agilent Teknolojileri	5190-9687	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Herculase II Buffer'' adlı parçası.
PCR amplifikasyonu için yüksek kaliteli füzyon enzimi	Agilent Teknolojileri	5191-5688	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Herculase II'' adlı parçası.
Yüksek Sıcaklıkta Yıkama Tamponu	Agilent Teknolojileri	5190-9687	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Yıkama tamponu 2'' adlı parçası.
Hibridizasyon Tamponu	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
İndekslenmiş dizileme primerleri	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR için) için SureSelect XT HS2 İndeks Primer Çiftleri 1-96'nın bir parçası.
Şirket içi multipleks gerçek zamanlı PCR testi	Tib Molbiol	YOK	CYBE tespiti için Lightmix Kitlerine dayalı şirket içi geliştirilmiş ve akredite edilmiş test
Ligasyon Tamponu	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
Temizlik için manyetik boncuklar	Agilent Teknolojileri	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XP Boncukları.
Manyetik stand	Permagen Laboratuvar Gereçleri	MSRLV08	0.2mL PCR 8 Şerit Manyetik Ayırıcı 5 µ L ~0.2mL Hacim.
Sonraki nesil dizileme (NGS): Yüksek verimli kısa okuma dizileme sistemi	Illumina, Inc.	YOK	Illumina NextSeq150 ve MiSeq platformlarında gerçekleştirilen çift uçlu 150 bp dizileme (PE1000).
Nükleaz içermeyen su	Biyolojik Konsept	3-07F04-H	Moleküler Biyoloji için Su, DNA/DNAse/RNaz içermez, steril, PCR İnhibitörü içermez.
Oligonükleotid Bloker Karışımı	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
PCR tüp şeridi	avantor, VWR  tarafından teslim edildi;	732-3608	Ekli Düz Kapaklı PCR tüp şeritleri.
Yakalama Sonrası Astar Karışımı	Agilent Teknolojileri	5190-9687	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1'in (PCR Sonrası) bir parçası.
RNA Probu	Agilent Teknolojileri	5191-6916	SureSelect Özel Tier4 6Mb-11.9Mb Probu, örneğin Tasarım Kimliği S3465164).
RNase Engelleyici	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.
Oda Sıcaklığında Yıkama Tamponu	Agilent Teknolojileri	5190-9687	SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1 (PCR Sonrası) ''Yıkama tamponu 1'' adıyla.
Streptavidin boncuklar	Agilent Teknolojileri	5191-5742	SureSelect Streptavidin Boncuklar.
T4 DNA Ligaz	Agilent Teknolojileri	5500-0147	ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kütüphane Hazırlama Kitinin bir parçası.
Hedef zenginleştirme yöntemi / DNA yakalama yöntemi	Agilent Teknolojileri	G9983-90000 Serisi	Kitaplık Hazırlama, Hızlı Hyb Hedef Zenginleştirme ve Yakalama Sonrası Havuzlama İş Akışı ile SureSelect XT HS2 DNA Kiti. Protokol Sürümü F0, Mayıs 2023. Illumina Platformu NGS için
C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ve M. genitalium	Agilent Technologies / Zenginleştirici Mikrobiyoloji Laboratuvarı (İBB, UZH)	Tasarım Kimliği S3465164	Dört CYBE patojeninin multipleks yakalanması için özel olarak tasarlanmış prob seti (~242.000 prob). Çoklu referans genomlara dayalı tasarım.
Termal döngüleyici	Termal Kompresör	4375305	Veriti 96-Kuyulu Termal Döngüleyici.