Method Article

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak organoidlerinin doğru, etiketsiz görüntülenmesi, morfolojilerini, büyüme dinamiklerini ve çevresel uyaranlara tepkilerini incelemek için çok önemlidir. Holotomografi (HT), floresan işaretleyicilere ihtiyaç duymadan canlı organoidlerin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu (3D) görselleştirilmesini sağlar, böylece fototoksisiteyi en aza indirir ve numune bütünlüğünü korur. Gerçek zamanlı faz tabanlı görüntüleme, yapısal ve işlevsel değişikliklerin sürekli, etiketsiz izlenmesini sağlar. Bu yöntem, kırılma indisini içsel bir görüntüleme kontrastı olarak kullanarak, hacim, protein yoğunluğu ve protein içeriği gibi biyofiziksel özelliklerin nicelleştirilmesini sağlar. Görüntüleme verileri, tutarlı, yüksek aktarım hızına sahip analizi desteklemek için makine öğrenimi odaklı segmentasyon ve özellik ayıklama yoluyla daha fazla işlenir. Bu protokol, organoid araştırmalarında düşük tutarlılık HT kullanmak için organoid hazırlama, görüntüleme elde etme ve makine öğrenimi tabanlı veri analizini kapsayan eksiksiz deneysel iş akışını detaylandırır. Bu yaklaşım, hesaplamalı segmentasyon ve kantitatif değerlendirmeleri entegre ederek, canlılık, yapısal organizasyon ve ilaç yanıtı dahil olmak üzere temel organoid özelliklerinin tarafsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Hücre altı çözünürlükte gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri yakalama yeteneği, bu protokolü rejeneratif tıp, hastalık modellemesi ve farmasötik taramadaki organoid tabanlı çalışmalara oldukça uygulanabilir hale getirir. Burada özetlenen adım adım metodoloji, farklı organoid sistemler arasında tekrarlanabilirliği ve geniş adaptasyonu kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidler, gerçek organların temel yapısal ve işlevsel özelliklerini in vitro1 olarak özetleyebilen, kök hücrelerden yetiştirilen organların üç boyutlu (3D) minyatür versiyonlarıdır. Araştırmacılar, bağırsak, beyin, akciğer, karaciğer ve böbrek dahil olmak üzere çok çeşitli dokular için organoid sistemler geliştirdiler - her biri, in vivo muadilini anımsatan kendi kendini organize eden mimariyi ve hücre tipi çeşitliliğini gösterdi. Organoidler, doğal organ mimarisini ve çok hücreli karmaşıklığı yansıtarak, insan gelişimini, doku yenilenmesini ve hastalık mekanizmalarını incelemek için güçlü model sistemler olarak hizmet eder1. Hastalık modellemesi ve ilaç keşfi için çok önemli araçlar haline geldiler ve araştırmacıların hastalık yollarını keşfetmelerine ve laboratuvarda hastaya özgü 3D dokular üzerinde yeni terapötikler test etmelerine olanak sağladılar2. Özellikle, organoidler rejeneratif tıpta da umut vaat etmektedir3: organoid türevli dokular, bağırsak ve karaciğer organoidlerinde gösterildiği gibi, hasarı onarmak için in vivo olarak aşılanabilir ve organ fonksiyonunu geri kazanma potansiyellerinin altını çizer4. Bu çok yönlülük, organoidleri modern biyomedikal araştırmalarda ve kişiselleştirilmiş tıpta vazgeçilmez kılmaktadır.

Çok hücreli bileşimleri ve 3D yapısal karmaşıklıkları göz önüne alındığında, organoid dinamikleri yakalamak ve analiz etmek çok önemlidir. Bununla birlikte, geleneksel görüntüleme teknikleri, organoid yapıların ve dinamiklerin çözülmesinde önemli sınırlamalarla karşı karşıyadır ve genellikle tam fizyolojik durumlarını temsil edemeyen 2D anlık görüntüler üretir5.

Brightfield mikroskobu, organoidleri yakalamak için yaygın olarak kullanılan, invaziv olmayan bir yöntemdir. Büyümeyi ve morfolojiyi uygun bir şekilde izler, ancak boyanmamış 3D örneklerde sınırlı kontrast sağlar. Ek olarak, optik kesitlerden yoksundur, bu da iç yapıların düşük çözünürlüğüne neden olur. Organoidler büyük ölçüde şeffaf görünür ve yüzeyin altındaki ince özelliklerin tespit edilmesini engeller6. Faz kontrastı, faz kaymalarını yoğunluk farklılıklarına dönüştürerek görünürlüğü artırır ve lekelenme olmadan genel mimariyi (örn. merkezi bir lümen) ortaya çıkarır. Gerçek zamanlı gözlem için faydasına rağmen, faz kontrastı halo artefaktlarından, düşük çözünürlükten ve sınırlı penetrasyon derinliğinden muzdariptir, bu da onu daha kalın organoidler için daha az etkili hale getirir7.

Seri kesitlemeyi takiben hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ve antikor bazlı immün boyama, organoid mikroyapıyı ve hücresel bileşimi analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır8. Formalinle sabitlenmiş parafin gömme (FFPE) ve kriyoseksiyon gibi gelişmiş doku işleme teknikleri, FFPE'nin üstün sonuçlar sunmasıyla morfolojinin korunmasını geliştirir9. Organoidlerin agaroz ve santrifüjleme gibi hidrojellere yerleştirilmesi, birden fazla numuneyi tek bir bölümde hizalayarak analiz verimliliğini artırır. Hasta kaynaklı tümör organoidlerinin H ve E ile boyanmış bölümleri orijinal tümör histolojisini yansıtırken, immünofloresan boyama, hücre tanımlaması için CK8 gibi belirteçleri vurgular10. Bununla birlikte, bu teknikler canlı organoidleri izleyemez ve kesit sırasında doku kırışması veya deformasyon gibi artefaktlara neden olabilir.

Konfokal floresan mikroskobu, organoid görüntüleme için yaygın olarak kullanılır ve organoid mimarisinin ve hücresel bileşimin ayrıntılı görselleştirilmesini sağlayan yüksek çözünürlüklü (mikrometre altı) optik kesitler sağlar11,12. Bununla birlikte, 3D organoidlerin konfokal görüntülemesi tipik olarak yüzeysel katmanlarla (100 μm derinliğe kadar) sınırlıdır ve nokta taramalı lazer aydınlatması nedeniyle zaman alıcı ve fototoksik olabilir13. Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), yalnızca görüntüleme düzlemini aydınlatarak, minimum fotoağartma ve fototoksisite ile tüm organoidlerin hızlı hacimsel görüntülemesini sağlayarak bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelir 14,15; Bununla birlikte, bu teknik genellikle kalın örneklerin optimal görüntülenmesi için doku temizliği gerektirir. Ek olarak, LSFM görüntüleme derinliği, uyarlanabilir optikler, çoklu görüntüleme ve optimize edilmiş uyarma dalga boyları16 ile hafifletilebilen ışık saçılımı ve kırılma indisi (RI) uyumsuzlukları ile sınırlıdır. Numune montajı aynı zamanda yapısal deformasyonlara neden olurken, büyük 3D veri kümeleri depolama ve analizde hesaplama zorlukları oluşturur. Gelişmiş genetik etiketleme teknikleri, yeni temizleme reaktifleri, uyarlanabilir optikler ve yapay zeka güdümlü görüntü analizi dahil olmak üzere son gelişmeler, bu sınırlamaları ele alarak LSFM'yi organoid araştırmaları için giderek daha uygun hale getiriyor7.

Bu gelişmelere rağmen, 3D floresan görüntüleme teknikleri, canlı organoidlerin uzun süreli izlenmesi için çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. İlk olarak, floresan etiketlemenin kullanımı fototoksik etkilere neden olur ve biyolojik süreçleri bozar, bu da uzun süreli canlı görüntüleme çalışmaları için zorluklar yaratır17. İkincisi, antikor bazlı etiketleme, birinci ve ikincil antikorların kullanımı için 10 günden daha uzun inkübasyon gerektiren gelişmiş geçirgenlik ve doku temizleme yöntemleri gerektiren yoğun organoid yapılar içindeki difüzyon bariyerleri nedeniyle sınırlı penetrasyondan muzdariptir18. Üçüncüsü, organoidlerdeki transfeksiyon ve kararlı floresan protein ekspresyonu, geleneksel gen iletim yaklaşımları 3D ortamlarla mücadele ettiğindenverimsiz kalmaktadır 19. Dördüncüsü, derin görüntüleme için gerekli olan optik temizleme teknikleri, genellikle floresan sinyal kaybına ve doku bozulmasına yol açar ve floresan20'nin şeffaflığını ve korunmasını dengeleyen optimize edilmiş temizleme protokolleri gerektirir.

Bu sınırlamaları ele almak için, holotomografi (HT), etiketlenmemiş canlı organoidleri zaman içinde yüksek çözünürlükte görüntülemek için bir teknik olarak tanıtılmıştır. 3D kantitatif faz görüntüleme olarak da bilinen HT, doğal fizyolojik durumlarını korurken organoidlerin gerçek zamanlı, nicel görselleştirmesini sağlayan etiketsiz, yüksek çözünürlüklü bir modalitedir. HT'nin prensibi, X-ışını bilgisayarlı tomografiye benzer; çeşitli aydınlatma koşulları altında birden fazla 2D optik alan görüntüsü yakalayarak, etiketlenmemiş bir numunenin 3D RI dağılımı, ters dalga denklemi çözme 21,22,23 yoluyla yeniden oluşturulur. HT, hematoloji24,25, hücre biyolojisinde faz yoğunlaşması 26, mikrobiyoloji27 ve histopatoloji 28 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik alanlarda yaygın olarak uygulanmaktadır. Daha yakın zamanlarda, yüksek çözünürlüklü, etiketsiz 3D görüntüleme yeteneği, organoid araştırmaları için giderek daha fazla kullanılmaktadır 21,22,23,29 ve yapısal ve işlevsel dinamiklerini incelemek için invaziv olmayan bir yaklaşım sunmaktadır.

Bu çalışmada, fare ince bağırsak organoidlerinin (sIO'lar) uzun süreli, etiketsiz izlenmesinde düşük tutarlılıklı HT'nin kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, organoid hacmi, protein yoğunluğu ve protein içeriğinin kantitatif ölçümlerini sağlarken, organoid davranışının titiz, veriye dayalı analizini kolaylaştırırken, organoid büyümesinin ve ilaç yanıtlarının 24 saat boyunca gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Organoidlerdeki morfolojik değişiklikleri araştırmak için, numuneleri, DNA çapraz bağları oluşturarak ve hücresel replikasyonu inhibe ederek apoptozu indüklediği bilinen platin bazlı bir kemoterapötik ajan olan sisplatin ile tedavi ettik30. 3D RI görüntüleme yapısal ayrıntıları yakalarken, organoid dinamikleri ölçmek için sistematik analiz esastır. Bunu başarmak için, organoid bölgeleri arka plandan ayırt etmek için makine öğrenimi tabanlı bir segmentasyon araç seti olan ilastik'i31 entegre ediyoruz. Bu protokol, organoid kültür hazırlama, 3D HT elde etme, makine öğrenimi tabanlı segmentasyon ve RI tomogramlarından kantitatif analiz dahil olmak üzere tüm iş akışını ana hatlarıyla belirtir. Bu yaklaşım, ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve invaziv olmayan bir görüntüleme çerçevesi sunarak, hastalık modellemesi, rejeneratif tıp ve ilaç taramasında geniş uygulamalarla organoid araştırmaları için yeni bir standart oluşturur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda verilmiştir. Alternatif olarak farklı üreticilerin muadil ürünleri kullanılabilir. Tüm protokolün şematik bir süreci Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Numune hazırlama

  1. sIO kültür ortamının hazırlanması
    1. Piyasada bulunan kültür ortamını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Kültür ortamını 0,22 μm'lik bir filtre ünitesinden süzerek sterilize edin.
      NOT: Ortam, bir hücre kültürü başlığında tamamen steril koşullar altında hazırlanmışsa ve tüm bileşenler önceden sterilize edilmişse (örneğin, steril şişelerde ve şişelerde sağlanmışsa), 0.22 μm'lik bir filtreden filtrasyon kesinlikle gerekli olmayabilir.
    2. 15 mL hazırlanmış besiyerini steril saklama tüplerine alın. Organoid kültürde kullanmadan önce aliquoted ortamını oda sıcaklığına (15 - 25 ° C) ısıtın.
  2. sIO stoğunun çözülmesi
    1. Dondurulmuş organoid stoğunu 37 °C'lik bir su banyosu kullanarak 2 dakika içinde hızla çözün. Çözülmüş organoid süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve organoidleri peletlemek için 3 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
    2. Potansiyel sitotoksik etkileri en aza indirerek DMSO'yu yıkamak için süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    3. 1:4 oranında ortam ve taze hücre dışı matris (ECM) ekleyin ve peletin düzgün bir şekilde yeniden süspansiyonunu sağlamak için hafifçe pipetleyin. 15 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda kubbe başına 48 μL dağıtın. Erken polimerizasyonu önlemek için ECM'yi buz üzerinde tutun.
    4. ECM polimerizasyonuna izin vermek için plakayı 37 °C, %5CO2 inkübatöre 1 saat boyunca baş aşağı yerleştirin. Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa dikkatlice 200 μL taze ortam ekleyin.
      NOT: Bu protokol, çeşitli ticari görüntüleme çanakları ve kuyu plakaları ile uyumludur. ECM dome'un tamamen suya daldırıldığından emin olmak için ortam sesini kuyu tipine göre ayarlayın.
  3. sIO'ların geçirilmesi
    NOT: Organoidler pipet uçlarına yapışma eğilimindedir. Yapışmayı en aza indirmek için, pipet uçlarını ortamla önceden ıslatın.
    1. Asspire edilen ortam. Her oyuğa 200 μL hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin ve ECM bozunmasını ve organoid alımını kolaylaştırmak için 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. Organoid süspansiyonu nazik pipetleme ile toplayın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 3 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    3. (İsteğe bağlı) Tek hücreler olarak geçiş yapmak için aşağıdaki ayrıştırma yöntemlerinden birini gerçekleştirin:
      1. Enzimatik yöntem: Pelete 100 μL tek hücreli ayrışma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de,% 5 CO2 inkübatörde 1-2 dakika inkübe edin. Nötralize etmek için 150 μL ortam ekleyin. Pipetleme veya hafif kılavuz çekme işlemi gerçekleştirin. 150 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın, geriye sadece pelet bırakın.
        NOT: Uzun süreli maruz kalma hücreler için oldukça zararlı olabileceğinden aşırı inkübasyondan kaçının.
      2. Mekanik ayrışma: Peletleri 200 μL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir P200 pipeti kullanarak, organoidleri mekanik olarak daha küçük parçalara veya tek hücrelere ayırmak için 20x-30x yukarı ve aşağı pipetleyin. 3 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin ve peleti tutun.
    4. 1:4 oranında medya ve taze ECM ekleyin ve peletin eşit şekilde yeniden süspansiyonunu sağlamak için nazikçe pipetleyin. 15 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda kubbe başına 48 μL dağıtın.
    5. ECM'nin polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C, %5CO2 inkübatöre 1 saat boyunca baş aşağı yerleştirin.
    6. Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa 200 μL taze kültür ortamı ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için boş dış kuyucukları PBS ile doldurun. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve organoidleri haftalık olarak geçirin. Geçiş aralığını istenen organoid boyutuna göre ayarlayın.
  4. İlaç tedavisi
    1. 3.00 mg sisplatin tozunu (MW ≈ 300.05 g / mol) 1 mL DMSO içinde çözerek 10 mM'lik bir sisplatin stok çözeltisi hazırlayın. Kısa bir süre girdap yapın ve çözeltiyi kehribar tüpler kullanarak veya alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun.
    2. Tedavi ortamını hazırlamak için, 10 μM sisplatin ve% 0.1 DMSO'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için 10 mM sisplatin stoğunu 1: 1.000 oranında tam sIO kültür ortamında seyreltin.
    3. Araç kontrolü için, sisplatin içermeyen nihai DMSO konsantrasyonuna uyacak şekilde kültür ortamında% 0.1 DMSO hazırlayın.
    4. Harcanan ortamı sIO kültürlerinden çıkarın ve yavaşça 10 μM sisplatin içeren ortam veya yalnızca DMSO kontrol ortamı ile değiştirin.
    5. Tedaviden sonra, numuneleri görüntüleme sistemi inkübatörüne aktarın.

2. İşletim yazılımı kullanarak düşük tutarlı holotomografi görüntüleme

  1. Görüntüleme için numune hazırlama
    1. Adım 1.3.1-1.3.4'te açıklanan prosedürü izleyerek #1.5 lamel tabanlı görüntüleme kabına 15 μL organoid-ECM kubbesi dağıtın. Optimum görüntüleme için her kubbeyi tabağın içine mümkün olduğunca merkeze yakın yerleştirin.
    2. Polimerizasyondan önce, organoidlerin dibe çökmesini sağlamak için oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
    3. ECM'yi polimerize etmek için plakayı 37 °C, %5CO2 inkübatöre 1 saat boyunca baş aşağı yerleştirin. Ardından, organoidleri tamamen batırmak için yavaşça yeterli kültür ortamı ekleyin.
      NOT: Lameli tabanlı görüntüleme kabının boyutuna göre organoidlerin tamamen suya daldırıldığından emin olmak için orta ses seviyesini ayarlayın.
    4. Geçişten 5 gün sonra, kalıntıları gidermek ve optik artefaktları azaltmak için görüntülemeden hemen önce numuneyi 2x-3x PBS ile yıkayın.
  2. Görüntüleme kurulumu
    1. Numunenin canlılığını korumak için çevre denetleyicisini açın. Oda kontrol ünitesi, sıcaklığı otomatik olarak 37 °C'ye ve CO2 konsantrasyonunu %5'e ayarlar.
    2. Kapıyı açmak için cihazın önündeki Kapı düğmesine basın. Kültür ortamının kurumasını önlemek için hazne kuyusunun içinde ince bir tabaka oluşturacak şekilde su ekleyin.
    3. Görüntüleme kabını uygun bir kap tutucuya yerleştirin, görüntüleme haznesine yerleştirin ve hareketi önlemek için bir pim kullanarak sabitleyin. Çanağın eğilmeden kap tutucuya sıkıca takıldığından emin olun.
    4. Harici ışık girişimini engellemek için Kapı düğmesini kullanarak cihazın kapısını kapatın.
    5. TomoStudio X yazılımını başlatın ve oturum açın. Ana pencereyi açmak için Başlat'a tıklayın.
    6. Sol üst köşedeki Proje Ekle'ye tıklayın ve deneysel parametreler atayın (ör. proje adı, ortam türü, örnek türü vb.). Numune paneli otomatik olarak oluşturulacaktır. Denemede uygun RI'nin kullanımı için doğru ortam türünün atandığından emin olun.
    7. Panelde İstenen kuyuya tıklayın ve kuyucukları numune olarak kaydetmek için üst kısımdaki Oluştur'a tıklayın.
    8. Çanaktaki ilgi bölgesini (ROI) tanımlamak için sağ üst köşedeki ROI Kurulumu'na tıklayın. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, görüntü alma penceresini açmak için sağ alt köşedeki Denemeyi Çalıştır'a tıklayın.
    9. Sağ üst köşedeki Load Vessel'e tıklayın. Parlak bir alan görüntüsü görünecektir. Odaklamak için +Z ve -Z düğmelerini kullanarak Z konumunu ayarlayın.
    10. Tek görüntüleme sekmesinde ROI boyutunu ayarlayın. 160 μm x 160 μm'lik bir görüş alanı içindeki organoidleri yakalayın ve 140 μm derinliğe kadar eksenel yığınlar elde edin. Daha büyük organoidler için, birden fazla RI tomogramı edinin ve alttaki Döşeme Görüntüleme onay kutusunu seçerek görüntüleri birleştirin.
    11. Uzun süreli görüntülemeyi yapılandırmak için Hızlandırılmış Görüntüleme sekmesine gidin. Süreyi ve aralık süresini gerektiği gibi ayarlayın. Bu deneyde, 24 saatlik bir süre boyunca 10 dakikalık aralıklarla hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirildi ve aynı süre boyunca 2 saatlik aralıklarla analiz yapıldı.
    12. Mevcut ROI konumunu yakalamak için Tara simgesine tıklayın. Parlak alan görüntülemeyi kullanarak ECM dome'u manuel olarak ortalayın. Parlak alan görüntüleme için yoğunluk ve pozlama değerlerini ayarlamak üzere BF düğmesine tıklayın.
    13. Önizleme panelinde görünen ROI kutusunu hareket ettirerek ROI'yi seçin. İstenen yatırım getirisi bulunduğunda, alttaki Nokta Ekle'yi tıklayın. Görüntüleme noktası listesi görünecektir.
    14. Görüntülemeye başlamak için Al'a tıklayın. Ham görüntü verileri elde edilecektir.
  3. Görüntü elde etme
    NOT: Bu işlem, ham görüntü verilerinden bir Tomocube Ortak Dosyası (TCF) oluşturur. Ham görüntü verileri, RI tomogramı ve maksimum yoğunluk projeksiyonu gibi birden çok görüntü türü içeren bir TCF dosyasına işlenmelidir. RI tomogramı, numunenin 3D RI dağılımını temsil eder ve maksimum yoğunluk projeksiyonu, XY düzlemindeki her yanal konum için en yüksek RI değerini gösterir.
    1. Ham görüntü dosyalarını HTX işleme sunucusuna sürükleyip bırakın. Ham görüntü dosyasından bir TCF dosyası oluşturmak için İşlem'e tıklayın.
    2. TCF dosyasında oluşturulan RI tomogramlarını görüntülemek için TomoAnalysis Viewer, MATLAB veya Python kullanın. MATLAB'de bir TCF dosyasını görüntülemek için h5info ve h5read gibi işlevleri kullanın. Aynı şekilde Python'da H5 dosyalarını okumak için h5py paketini kullanın.

3. Görüntü analizi

  1. Makine öğrenimi tabanlı görüntü segmentasyonu
    1. Verilerin ilastik ile uyumlu çok boyutlu bir formatta olduğundan emin olmak için TCF görüntü dosyasını HDF5 formatına (Ek Kodlama Dosyası 1) dışa aktarın.
    2. İlastik'i açın ve Yeni Proje > Dosya'ya gidin. Segmentasyon İş Akışları bölümünde Piksel Sınıflandırması'nı seçin. Proje dosyasını belirlenen bir dizine kaydedin.
    3. 1'e giderek HDF5 dosyasını yükleyin. Giriş Verileri sekmesi. Yeni Dosya Ekle'ye tıklayın, Uygun H5 Veri Kümesi'ni seçin ve doğru görüntü kanallarının atandığından emin olun.
    4. 2'ye gidin. Segmentasyonu optimize etmek için ilgili özellikleri (Renk / Yoğunluk, Kenar, Doku) seçmek için Özellik Seçimi sekmesi.
      NOT: Özellik seçimi, veri kümesine ve görüntü özelliklerine bağlı olarak değişebilir. Mevcut analiz için seçilen özellikler şunları içeriyordu: Renk/Yoğunluk (σ = 1,60), Kenar (σ = 3,50) ve Doku (σ = 1,60). Görüntü karmaşıklığına bağlı olarak sezgisel bir yaklaşıma dayalı optimizasyon gerekebilir. Alternatif olarak, lastik'teki Özellik Öner > Çalıştırma Özelliği Seçimi işlevi, en uygun parametre kümesini tanımlamak için kullanılabilir.
    5. 3 yılında. Eğitim sekmesi, farklı renklerde fırça darbeleri uygulayarak organoid ve organoid olmayan bölgeleri etiketleyin. Segmentasyon doğruluğunu artırmak için, sınırların etrafındaki bölgelere dikkatli bir şekilde açıklama ekleyin.
    6. Segmentasyon sonuçlarını önizlemek ve gereken iyileştirmeleri yapmak için Canlı Güncelleme'ye tıklayın.
    7. 4'e gidin. Tahmin Dışa Aktarma. Kaynak Seçimi'nde, etiketli tahminleri dışa aktarmak için Basit Segmentasyon'u seçin. Aşağı akış analiz gereksinimlerine bağlı olarak çıktı biçiminin .h5 veya .tiff olarak ayarlandığından emin olmak için Tümünü Dışa Aktar'a tıklayın.
  2. Kantitatif özellik analizi
    NOT: Bu protokol adımı, her prosedür Ek Kodlama Dosyası 2'de ayrıntılı olarak MATLAB'da yürütülür.
    1. RI tomogramını maske görüntüsüyle birleştirerek, yalnızca organoid bölgeyi içeren maskelenmiş bir RI görüntüsü oluşturun.
    2. Maskelenmiş RI görüntüsünü kullanarak organoid hacmi, protein yoğunluğu ve protein içeriği gibi nicel parametreleri hesaplayın.
      1. Hacim: Segmentli maskedeki piksel sayısını X, Y ve Z için piksel çözünürlüğüyle çarparak organoidin toplam hacmini hesaplayın. Yerleşik MATLAB işlevi Sum'u kullanarak organoid etiketli maske dizisindeki tüm voksel değerlerini sayarak piksel sayısını hesaplayın.
        NOT: Piksel çözünürlüğü görüntüleme sistemi tarafından belirlenir ve HDF5 yapısı içindeki Veri > 3D nitelikler grubu altında bulunabilir.
      2. Protein Yoğunluğu: Orta RI değerini ortalama organoid RI'den çıkararak ve bunu Protein Kırılma İndeksi Artışına bölerek protein yoğunluğunu hesaplayın.
        1. Orta RI: Analizden önce bir refraktometre kullanarak çevredeki ortamın RI'sini ölçün.
        2. Ortalama RI Değeri: Organoid maskesi içinde bulunan voksellerin RI değerlerinin ortalamasını alarak organoidin ortalama RI'sini belirleyin.
        3. Protein Kırılma İndeksi Artışı (α): Kırılma indisi artış çalışmalarından türetilen daha önce bildirilen bir ampirik sabiti kullanın.
      3. Protein İçeriği: Adım 3.2.2.1'de belirlenen hacim ile Adım 3.2.2.2'de elde edilen protein yoğunluğunu çarparak toplam protein içeriğini hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, 4D görüntüleme ve sIO'ların kantitatif analizi için şematik iş akışını göstermektedir. Bu protokol, dört aşamalı bir süreçle sürekli canlı görüntüleme ve sIO'ların kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar: Kültür, 4D Görüntüleme, Görüntü İşleme ve Kantitatif Analiz (Şekil 1D).

5 günlük bir inkübasyon süresinden sonra, olgun sIO'lar düşük koherens holotomografi (HT) kullanılarak görselleştirme için lamel tabanlı görüntü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Holotomografi, canlı organoidlerin etiketsiz, yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için güçlü bir yaklaşım sunar ve geleneksel görüntüleme teknikleriyle ilişkili birçok zorluğun üstesinden gelir. Bu protokolde, organoid morfolojisinin, büyüme dinamiklerinin ve ilaç tedavisine verilen yanıtların gerçek zamanlı, kantitatif görselleştirilmesini sağlayan, sIO araştırmalarına düşük tutarlılıklı HT uygulamak için kapsamlı bir metodoloji açıklıyoruz. Makine öğrenimi tabanlı segmentasyon ve nicel ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. ve Y.K.P., holotomografi ve kantitatif faz görüntüleme cihazlarını ticarileştiren bir şirket olan Tomocube Inc.'de finansal çıkarlara sahiptir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibesi (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), Uluslararası Kooperatif Ar-Ge programı (P0028463) aracılığıyla Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) ve Kore hükümeti (Bilim ve BİT Bakanlığı ve Sağlık ve Refah Bakanlığı) tarafından finanse edilen Kore Rejeneratif Tıp Fonu (KFRM) hibesi (21A0101L1-12) tarafından desteklenmiştir. Veri toplama, M.J.L. ve J.H.L. tarafından, J.H.L. veri işlemeden ve J.M.C. veri analizinden sorumlu olarak gerçekleştirilmiştir. Makalenin yazımına tüm yazarlar katkıda bulunmuştur. ChulMin Oh ve Chungha Lee'ye değerli teknik tartışmalar ve figür hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48-kuyucuklu plaka Corning3548Kültür yemeği
Hücre geri kazanım çözümü Corning354253Matrigel bozulması 
SisplatinSupelcoPHR1624YOK
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650 SerisiAraç
Eppendorf tüpüCorningMCT-175-CSYOK
HTX işleme sunucusuTomocube Inc., KoreYOKVeri işleme sunucusu
HT-X1Tomocube Inc., KoreYOKİşletim yazılımı
İlastikYOKYOKMakine öğrenimi tabanlı segmentasyon araç seti
Görüntüleme kabı kap tutucu Tomocube Inc., KoreYOKGörüntüleme çanak tutucusu
IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (Fare)STEMCELL Teknolojileri#06005Ticari olarak mevcut önceden hazırlanmış kültür ortamı 
MatlabMatematik İşleriMatlab 2024aGörüntü işleme yazılımı
MatrisCorning3562313D organoidler için ECM
Millipore  Steritop  Vakumlu Şişe Üstü FiltreMerckS2GPT05RE0.22 μ Orta sterilizasyon için M filtre ünitesi
Fare Bağırsak OrganoidleriSTEMCELL Teknolojileri#70931YOK
RefraktometreATAGOR-5000 SerisiKırılma indisi hesaplayıcısı
TomoDishTomocube Inc., Kore901002-02#1.5 Lamel-tabanlı görüntüleme çanağı
TomoStudio XTomocube Inc., KoreYOKGörüntüleme yazılımı
TrypLEGibco12604Tek hücre ayrışması

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles