Yöntem makalesi

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/68568

⸱

6 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektron mikroskobu (EM) ve özellikle üç boyutlu (3D) EM teknikleri, yapısal virolojide yerleşik yöntemler haline gelmiştir. Zika virüsü (ZIKV) kaynaklı replikasyon fabrikaları veya koronavirüs replikasyon organelleri gibi hücresel üst yapının virüs kaynaklı değişiminin araştırılması, 3D görüntüleme gerektirir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tomografisi, kalınlığı 200 nm'ye kadar olan numunelerle sınırlı olmasına rağmen yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (SEM)-tomografi, tipik olarak daha düşük çözünürlüğe rağmen, izotropik ile daha büyük hacimlerde 3D veriler üretebilir. Daha büyük hacimlerin görüntülenmesi için blok yüz taramalı elektron mikroskobu (BF-SEM), SEM array tomografi veya seri kesitlerin TEM görüntülemesi gibi alternatif teknikler kullanılır. Bununla birlikte, daha önce bahsedilen tekniklerle karşılaştırıldığında, bu teknikler, numunenin Z ekseni boyunca çok daha düşük çözünürlük pahasına gelir. Birkaç nanometre izotropik çözünürlükle 1 μm kalınlığa kadar numunelerin 3D bilgisini sağlayan bir teknik, taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tomografisidir.

Burada, yüksek basınçlı dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş ve reçine gömülü virolojik örneklerin hazırlanması ve bunların STEM tomografisi kullanılarak analizi için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, biyolojik üst yapıyı doğal duruma yakın bir durumda korurken oda sıcaklığında görüntülemenin avantajlarından yararlanır. STEM tomografisi kullanılarak cevaplanabilecek sorular için iki temsili örnek gösteriyoruz. İlk olarak, rekombinant veziküler stomatit virüsünün (VSV) virion morfogenezini incelemek için protokolü uyguluyoruz. STEM tomogramları, aksi takdirde 2D görüntüleme ile erişilemeyen rekombinant VSV tomurcuklanması hakkında bilgi sunar. İkinci olarak, Foerster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme ve EF-C peptit nanofibrillerinin STEM tomografisini (FRET-3D-CLEM) kullanarak korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunu (CLEM) gösteriyoruz. Yakın zamanda yayınlanan bu kombinasyon, özellikle STEM tomografisi ile erişilebilen büyük hacimden yararlanarak, enfeksiyonu artıran peptit nanofibrillerin alımı ve sökülmesi hakkında yeni bilgiler vermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
Şekil 1: Çözünürlük, enstrümantasyon, edinme süresi ve çaba dikkate alınarak farklı 3D mikroskopi tekniklerinin karşılaştırılması. Tekniklerin maksimum uygulanabilir hacmi, moleküler çözünürlük sunan teknik olarak zorlu kriyo-TEM tomografisi ile çözünürlüğün ışığın kırınım sınırı ile sınırlı olduğu ışık mikroskobu arasındadır. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; STEM = tarama TEM; SEM = taramalı elektron mikroskobu; FIB = odaklanmış iyon ışını. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Virüsle ilgili yapılar ve sistemler, sub-angstrom rejiminden (örneğin, viroterapi için küçük moleküller, izole viral proteinler) birkaç metreye (örneğin, tüm enfekte organizmalar) kadar bir ölçeği kapsar. Viral partiküller 20-1.000 nm aralığındadır ve esas olarak μm aralığında olan konakçı hücreler ve viral üretici hücre hatları gibi biyolojik bağlamlarında incelenir. Bu nedenle, virüsle ilgili belirli yapıların görselleştirilmesi, yeterli bir görüş alanı ve uygun çözünürlük sağlayan bir tekniğin seçilmesine bağlıdır. Virüs ile enfekte olmuş hücrelerin ve doku parçalarının incelenmesi mikroskopi tekniklerine dayanır (Şekil 1). Hücrelerin ve dokuların genel bakış görüntüleri klasik ışık mikroskobu kullanılarak elde edilebilirken, virüs replikasyonunda yer alan hücre içi yapılar genellikle elektron mikroskobu (EM) kullanılarak incelenir. Günümüzde daha çok temel virolojik araştırmalarda kullanılmasına rağmen, EM aynı zamanda tanı 1,2'de de kullanılmaktadır ve aynı zamanda biyofarmasötik uygulamalara da girmiştir3.

Genellikle, klasik transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gibi 2D EM yaklaşımları, belirli bir biyolojik soruya yeterince cevap veremez. Virolojide, bu özellikle virion bağlanması ve girişi, viral fabrikaların oluşumu veya virion morfogenezi 4,5,6,7,8,9 gibi virüs-konak-hücre etkileşimlerini incelerken geçerlidir. Bu nedenle, EM tomografi, biyolojik örneklerin 3D ultrayapısını analiz etmek için kullanılır. Prensip olarak, belirli bir numunenin tomogramını elde etmenin iki yolu vardır: 1) daha sonra bir 3D görüntü yığınında birleştirilen seri dilimlerin aşamalı olarak görüntülenmesi veya 2) numunenin farklı görüntüleme açılarından projeksiyonların elde edilmesi ve ardından bilgilerin sanal bir görüntü yığınına hesaplamalı olarak yeniden yapılandırılması.

Birinci tipteki teknikler arasında TEM veya SEM (SEM dizi tomografisi) ile seri kesitlerin görüntülenmesi, seri blok yüz SEM ve odaklanmış iyon demeti (FIB)-SEM tomografisi yer alır. Seri kesitlerin SEM ve TEM görüntülemesi, kesit kalınlığı ile sınırlı olan z'deki çözünürlükten yoksundur, ancak geniş bir görüş alanı sağlar ve çoğu EM laboratuvarında kolayca bulunabilen ekipmana dayanır4. FIB-SEM tomografi izotropik çözünürlük sağlayabilir, ancak cihaz ve bakım maliyetleri zor olabilir ve tüm hücrelerin izotropik çözünürlükte görüntülenmesi zaman alıcıdır 9,10.

İkinci tip tomografi, yalnızca elektron demetinin bir numuneden iletilmesine dayanır. Bu, iki farklı görüntüleme yöntemi kullanılarak yapılabilir: TEM veya taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM). TEM tomografi daha yaygın ve uygulaması daha kolay olmakla birlikte kesit kalınlığı ~200 nm ile sınırlıdır. Bu nedenle, mitokondri, veziküller veya viryonlar gibi kesit kalınlığından daha büyük yapılar tek bir tomogramda görüntülenemez. STEM tomografi, 1 μm kalınlığa kadar numuneleri görüntüleme imkanı sunar11,12. Bununla birlikte, yüksek ivme voltajına (≥200 kV) sahip bir STEM ve yüksek eğim açılarını destekleyen bir kurulumun yanı sıra küçük bir yarı yakınsama açısı13 gerektirir. STEM görüntüleme, malzeme biliminde yaygın bir teknik olmasına rağmen, biyolojik EM laboratuvarlarında nadir görülen bir teknik olmaya devam etmektedir.

Burada, virolojik örnekler için STEM tomografisini kullanmak için uygulama odaklı bir yaklaşım sunuyoruz. EM tomografinin yüksek karmaşıklığı ve emek yoğun doğası nedeniyle, yüksek kaliteli numune hazırlama çok önemlidir. Kriyojenik TEM (tomografi) kuşkusuz moleküler düzeyde araştırmalar için altın standart olsa da, yüksek basınçlı dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş hücrelerin oda sıcaklığında görüntülenmesi, hücresel üst yapının sağlam bir şekilde korunmasını ve netliğini sağlar 7,14. Kısaca yapışık hücreler safir bir disk üzerinde büyütülür ve istenildiği gibi enfekte edilir veya başka bir şekilde tedavi edilir. Hücreler daha sonra çok yüksek soğutma hızlarında yüksek basınç altında dondurularak hareketsiz hale getirilir ve bu da içindeki suyun vitrifikasyonuna neden olur. Daha sonra, numuneler karşılaştırılırken ve yavaşça oda sıcaklığına geri getirilirken su bir çözücü ile değiştirilir. Numuneler daha sonra yavaş yavaş reçineye gömülür.

Yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame için makine, taşıyıcı sistem ve numunenin bileşimi bakımından farklılık gösteren birçok protokol vardır. Walther ve ark.15 tarafından hazırlanan bir video protokolü ve Steyer ve ark.16 tarafından mikrodalga destekli kontrast geliştirme kullanılarak FIB-SEM için doku hazırlığına odaklanan bir video protokolü de dahil olmak üzere yüksek basınçlı dondurma için ayrıntılı protokoller yayınlanmıştır. Virolojik araştırmalar için, Read ve ark.17 ve Romero-Brey18, virüs bulaşmış hücrelerin safir disklerle yüksek basınçlı dondurma ve ardından elektron tomografisi kullanılarak analiz edilerek hazırlanması için ayrıntılı protokoller yayınladı. Ultra ince kesit alma da daha önce tarif edilmiştir 15,17. Bu yaklaşımlarla ilgili daha fazla ayrıntı için alıntı yapılan literatüre bakın.

Burada, daha önce yayınlananprotokollerin uyarlanmış ve güncellenmiş bir versiyonu olan bir iş akışı sunuyoruz 15,17 ayrıntılı bir video kılavuzu ile ilk kez eşleştirildi. Protokol, yüksek basınçlı dondurma, dondurma ikamesi ve epoksi reçinesine gömme kullanarak numune hazırlama için bir iş akışı sağlar. 800 nm-1.000 nm kalınlığındaki kesitler bir ultramikrotom kullanılarak kesilir. EM yazılım araçları kullanılarak 200 kV'luk bir STEM ile bir eğim serisi elde edilir. Bu protokol, yapışık hücreler için optimize edilmiştir ve doku veya süspansiyon hücreleri gibi diğer numune türleri için modifikasyonlara izin verirken kapsamlı bir iş akışı sağlar. Kriyojenik koşullar altında STEM tomografisi için Michael Elbaum'un19,20 grubunun çalışmasına bakın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü

  1. Safir disklerin hazırlanması
    1. Safir diskleri 3 kez %100 etanolde 20 dakika yıkayarak temizleyin. Diskleri kuru bir filtre kağıdının üzerine çekerek kalan etanolü çıkarın. Diskleri en az 30 dakika veya tamamen kuruyana kadar 37 °C'lik bir kurutma odasında bırakın.
      NOT: Bu protokolde 3 mm çapında ve 0,16 mm kalınlığında safir diskler kullanılmaktadır. Doku veya süspansiyon hücreleri için optimize edilmiş bir iş akışı olan diğer sistemler için Walther et al.15'e bakın. Kültürlenmiş hücreler ve diğer sistemler için bazı "ipuçları ve püf noktaları" McDonald ve ark.21 tarafından sağlanmaktadır.
    2. Yaklaşık 50 safir diski temiz bir saat camına düz bir şekilde yerleştirerek ve bir karbon kaplama cihazı kullanarak 10-15 nm kalınlığında bir karbon tabakası ile kaplayarak safir diskleri karbonla kaplayın. Karbon tabakasını stabilize etmek için diskleri gece boyunca 120 °C'de pişirin.
      NOT: Bağıntılı EM yaklaşımları için bir koordinat sistemi tanıtın: karbon kaplamadan önce safir disklerin üzerine bir bulucu ızgara yerleştirin, böylece ızgara disk21'de negatif olarak görünür.
    3. Safir diskin karbon kaplı tarafını daha sonra tanımlayabilmek için, karbonda yalnızca bir taraftan doğru şekilde okunabilen bir işaret çizmek için keskin bir alet (örneğin bir cımbızın ucu) kullanın.
      NOT: "2" veya benzeri bir rakam öneririz (Şekil 2A,B). Kaplamalı koordinat sistemine sahip safir diskler için bu adımı atlayın.
    4. Safir diskleri daha fazla kullanılana kadar 37 °C'lik bir kurutma odasında saklayın.
      NOT: Safir disklerin yeniden kullanılması tavsiye edilmez, çünkü bu, yüksek basınçlı dondurma sırasında kırılma olasılığını artırır.
  2. Hücre kültürü
    1. Hücre kültürüne yerleştirmeden kısa bir süre önce, disklerin karbon kaplı tarafını hidrofilik hale getirmek için bir kızdırma boşaltma cihazı ile kızdırma deşarjı yapın (örneğin, 40 s boyunca 20 mA'lık bir akımla 0,26 mbar). Daha sonra diskleri 15 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin.
      NOT: UV ışığına 30 dakikadan fazla maruz kalmak karbon kaplamaya zarar verebilir.
    2. Diskleri ortam içeren bir kültür kabının altına yerleştirmek için steril cımbız kullanın ve disklerin yüzmediğinden emin olun. Hücreleri dikkatlice üstüne tohumlayın. Safir disklerin hücre kültürü ortamında yüzmesi durumunda, deneyi tekrarlarken daha uzun süre kızdırma deşarjı.
      NOT: "2"nin doğru yönlendirilmiş olması, yani karbon kaplı tarafın yukarı bakması çok önemlidir. Diskler üzerinde ~%80'lik bir son birleşime sahip bir hücre tek tabakası arzu edilir. Safir diskler üzerindeki hücre büyümesi, çevredeki kültür kabındakinden farklı olabilir. Protokole devam etmeden önce disklerdeki hücrelerin dağılımını ve kalitesini ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu ile kontrol edin. Hücrelerin dağılımı, hücreleri tohumlarken plakayı hafifçe sallayarak iyileştirilebilir.
      Süspansiyon hücreleri için, karbon kaplı safir diskleri poli-L-lizin ile örtün veya15'te açıklandığı gibi kılcal damarlar kullanın. Poli-L-lizin kaplı diskleri UV ışığına maruz bırakmayın, çünkü bu poli-L-lizin kaplamaya zarar verebilir.
    3. Safir diskleri yerinde tutarken hücrelerin istenen herhangi bir tedavisini (örn. enfeksiyon, ilaç tedavisi) gerçekleştirin. Hücrelerin ayrılmasını veya karbon kaplamanın çizilmesini önlemek için diskleri dikkatli bir şekilde tutun. Hücreleri buna göre inkübe edin. Numuneleri yüksek basınçlı dondurucuyataşımadan önce, yerel yönetmeliklere göre, örneğin %2,5 glutaraldehit, 0,1 M fosfat tamponunda (pH 7,3) %1 sakkaroz veya %4 paraformaldehit ile kimyasal ön fiksasyon gerçekleştirin 1,7,22.
      NOT: Enfekte numuneler biyogüvenlik seviyesindeki laboratuvarlardan ayrılmadan önce, model sistem için geçerli olan tüm yerel biyogüvenlik düzenlemelerine uyun.

figure-protocol-1
Şekil 2: Yüksek basınçlı dondurma. (A) "2" (solda) ile karbon kaplamayı veya bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için bir koordinat sistemini (sağda) gösteren safir diskler. (B) Yüksek basınçlı dondurma için hazırlanmış bir SD-altın ara parça-SD sandviçinin şematik tasviri. Diskler üzerinde büyüyen hücreler birbirine bakar ve böylece sıkı boşlukta korunur. (C) SD sandviç içeren yüksek basınçlı dondurma tutucusu. (D) HPF tutucuyu yüklemek için malzemeler ve cihazlar: (1) Isıtma plakası, (2) Stereo mikroskop, (3) Filtre kağıdı, (4) 1-heksadesen içeren reaksiyon tüpü, (5) Cımbız, (6) Kaplamasız SD'ler, (7) Altın ara parçalı Petri kabı, (8) HPF tutucu. (E) HPF sisteminin kurulumu: (1) Dondurulmuş numunelerin aktarılması için LN kutusu (ayrıca bkz. F), (2) Dondurulduktan sonra HPF tutucunun ısınmasını hızlandırmak için saç kurutma makinesi, (3) LN kutusunu yeniden doldurmak için nitrojen dewar. (F) HPF tutucunun açılabileceği ve SD'lerin güvenli bir şekilde işlenebileceği merkezi bir oluk (noktalı anahat) ile yüksek basınçlı dondurmadan sonra donmuş numuneleri tutmak için LN kutusu. Yüksek basınçlı dondurmadan hemen sonra ihtiyaç duyulan malzemeler: (1) Altı adede kadar numune kabı için tutucu, (2) Yalıtımlı cımbız, (3) Kapaklı numune kapları. Kaplar, sıvı nitrojene daldırılmaları için küçük delikler ve küçük ağırlıklar (örneğin bir vida) içerir. Kısaltmalar: SD = safir disk; HPF = yüksek basınçlı dondurucu; LN = sıvı azot. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Elektron mikroskobu için numune hazırlama

  1. Yüksek basınçlı dondurma
    NOT: Bu protokol, referans alınan yüksek basınçlı dondurucu (HPF, Malzeme Listesi). Açıklanan adımlar, aynı amaca hizmet ettikleri için diğer makineler için çok farklı olmamalıdır.
    1. Yüksek basınçlı dondurucuyu kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Yeterli sıvı nitrojen kaynağı olduğundan emin olun (Şekil 2E), makineyi açın ve bir test çalıştırması gerçekleştirin.
    2. Diskleri HPF tutucusuna yüklemek için bir çalışma alanı ayarlayın (Şekil 2D). Aşağıdaki öğeleri hazır bulundurun: bir ısıtma plakası (1), bir stereo mikroskop (2), filtre kağıdı parçaları (3), dolgu maddesi olarak hekzadesen içeren reaksiyon tüpü (4), cımbız (5), hücreli tek sayıda SD'yi dondurmak için boş/kaplamasız safir diskler (6), altın ara parçalar (7) ve HPF tutucu (8, Şekil 2C'de ayrıntı).
    3. Dondurulmuş numuneleri işlemek için bir çalışma alanı hazırlayın (Şekil 2E,F). Yüksek basınçlı dondurmaya başlamadan önce aşağıdaki ekipmanları hazırlayın:
      1. Donmuş safir diskleri HPF tutucusundan depolama kapsüllerine taşımak ve aktarmak için LN kutusunu hazırlayın ve sıvı nitrojenle doldurun (Şekil 2E,F).
      2. Küçük bir dewar (Şekil 2E'de 3) hazırlayın ve sıvı nitrojenle doldurun: dondurma işlemi sırasında LN kutusunu birkaç kez sıvı nitrojenle doldurmaya hazır olun.
      3. Yalıtımlı cımbızları (Şekil 2F'de 2) hazır bulundurun.
      4. Yüksek basınçlı dondurmadan sonra safir diskleri tutacak numune kaplarını hazırlayın (saklama kapsülleri, Şekil 3F'de 2). Sıvı nitrojenin dökülmesi için bir kapakları ve birkaç delikleri ve yüzmemelerini sağlamak için küçük ağırlıkları (örn. küçük vidalar veya benzeri) olduğundan emin olun. Kullanmadan önce kapları etiketleyin ve LN kutusunda önceden soğutun.
        NOT: Depolama kapsülü olarak BEEM kapsüllerini kullanıyoruz.
    4. Fizyolojik koşulları (37 ° C,% 5 CO2) mümkün olduğunca uzun süre korumak için, hücreler önceden sabitlenmemişse veya mümkün değilse, ısıtılmış bir plaka (Şekil 2D'de 1) üzerinde numuneleri yüksek basınçlı dondurucuya yakın bir inkübatörde saklayın.
    5. Yüksek basınçlı dondurmaya başlamadan önce safir disklerde yeterli sayıda hücre olduğundan ve hücre kalitesinin iyi olduğundan emin olun. Bunu yapmak için, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak diskleri inceleyin.
    6. Yüksek basınçlı dondurma gerçekleştirin.
      1. Cımbızla kültür kabından bir safir disk alın ve karbon kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde HPF tutucusuna (Şekil 2C) yerleştirin ("2" okunabilir). Bundan önce, diski filtre kağıdına hızlı bir şekilde batırarak fazla ortamı çıkarın, ancak hücrelerin kurumasına izin vermemeye dikkat edin.
      2. Altın bir ara parçayı hekzadecen içine batırın ve dikkatlice safir diskin üzerine yerleştirin. İkinci bir safir disk alın ve karbon kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde altın ara parçanın üzerine yerleştirin ve hücreler birbirine bakacak şekilde bir safir disk - altın ara parça - safir disk sandviçi oluşturun. Sandviç boşluğunda hava sıkışmadığından emin olun.
      3. HPF tutucusunu kapatın. Özellikle önceden sabitlenmemiş canlı hücreler için numune üzerindeki stresi en aza indirmek için bu adımı dikkatli ama hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
        NOT: Kimyasal fiksatifler gibi kanserojen, mutajenik veya reprotoksik (CMR) maddeler içeren numuneler için, maruziyeti en aza indirmek için HPF tutucuyu bir çeker ocak altına yükleyin.
      4. Dondurma işlemini başlatın. HPF tutucuyu hızlı bir şekilde yüksek basınçlı dondurucuya yerleştirin, üreticinin talimatlarına göre kilitleyin ve dondurma işlemini başlatın.
    7. Vitrifiye edilmiş numuneleri HPF tutucusundan çıkarın. Artık donmuş safir diskleri taşıyan HPF tutucunun ucunu hızlı bir şekilde önceden soğutulmuş LN kutusuna aktarın. Diskleri HPF tutucusundan LN kutusundaki merkezi oluğa dikkatlice çıkarın ( Şekil 2F'deki kesikli çizgi). Bundan sonra, HPF tutucusunu ısıtın ve bir sonraki sandviçi monte etmeye başlamadan önce kalan etanol veya hekzadekeni çıkarın.
      NOT: Şu andan itibaren, disklere temas eden her şeyin sıvı nitrojen içinde önceden soğutulduğundan emin olun. Transfer adımlarını nitrojen atmosferinde hızlı bir şekilde gerçekleştirin ve numunenin çözülmesini önlemek için diskleri sıvı nitrojen içinde saklayın. Sorunsuz ve hızlı bir geçiş sağlamak için tutucunun HPF'den LN kutusuna transferini önceden uygulayın. Tutucunun ısınma süreci, dondurulduktan sonra bir saç kurutma makinesi kullanılarak hızlandırılabilir (Şekil 2E'de 2).
    8. Safir diskleri tutucudan çıkardıktan sonra, dondurarak ikame cihazına aktarmak veya daha sonraki işlemlere kadar sıvı nitrojen depolamak için etiketli kaplara koyun. Safir diskler HPF'den sonra sıkıca istiflenirse, dondurma ikamesinden önce safir diskleri ayırmak için bir neşter kullanın.
      NOT: Diskleri kırmamaya ve kesme kuvvetlerinden kaçınmaya dikkat edin. Bu adım için yeterli zaman planlayın.
  2. Dondurma ikamesi
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek dondurma ikame cihazını kurun. Sıvı nitrojen dewar'ı doldurun ve numune haznesini -90 °C'ye kadar önceden soğutmak için programı başlatın. Tüm ikame prosesi için yeterli sıvı nitrojen olduğundan emin olun.
      NOT: İlgili kimyasallar tehlikelidir. Tüm adımları çeker ocak altında gerçekleştirin ve yerel çevre, sağlık ve güvenlik (EHS) yönergelerine uyun.
    2. Aseton içinde %0.1 (a/h) uranil asetat, %0.2 (a/h) osmiyum tetroksit (OsO4) ve %5 (h/h) su içeren dondurma ikame çözeltisini hazırlayın. 6 mL'lik bir hacim hazırlamak için (burada kullanılan ikame cihazının maksimum kapasitesine eşit olan 24 kriyoviyal doldurmaya yetecek kadar), şu adımları izleyin:
      1. 6 mg uranil asetatı sıkı bir kapaklı cam bir kaba tartın.
      2. Suya 300 μL %4 (a/h) osmiyum tetroksit ekleyin.
      3. Damarı kapatın ve uranil asetatı çözmek için 5 dakika boyunca sonikat yapın.
      4. 5.7 mL aseton ekleyin, karıştırın ve çözeltiyi dondurma-ikame cihazıyla uyumlu kriyoviyallere eşit şekilde bölün.
    3. Dondurarak ikame solüsyonu içeren kapalı kriyoviyalleri -90 °C'de önceden soğutulmuş dondurarak ikame cihazına yerleştirin ve solüsyon da -90 °C'ye kadar soğuyana kadar bekleyin (yaklaşık 20 dakika).
    4. LN kutusunu sıvı nitrojenle doldurun. Safir diskleri dondurma ikame cihazına aktarmak için, cımbız, bir neşter ve pense (veya büyük cımbız) sıvı nitrojen içinde önceden soğutun.
    5. Yüksek basınçlı donmuş numuneleri içeren saklama kapsüllerini depolama tankından LN kutusuna aktarmak için önceden soğutulmuş büyük cımbız kullanın.
      NOT: Numunelerin çözülmesini önlemek için hızlı çalışın. Numuneleri yüksek basınçlı dondurmadan hemen sonra işlerken bu adım atlanabilir.
    6. Yüksek basınçlı donmuş numuneleri dondurarak ikame cihazına aktarın. Safir diskleri sıvı nitrojen içinde tutarken tek tek ayırın. Diskin tamamen daldırıldığından emin olarak, her diski ayrı ayrı dondurarak ikame solüsyonu içeren bir kriyoviyal içine hızlı bir şekilde aktarın. Kriyoviali kapatın ve hemen dondurma ikame cihazına geri yerleştirin.
      NOT: Aktarım sırasında, ikame çözeltisinin ısınmasını önlemek için kriyoviyal sıvı nitrojen atmosferinde tutun, ancak donmasını önlemek için sıvı nitrojen içinde tutmayın. İkame çözeltisinin ısınmasını önlemek için şişeyi parmaklarınızla kapağa yakın tutun. Toksik maddeler içerdiğinden ikame çözeltisini dikkatli kullanın.
    7. Tüm diskler değiştirme cihazına aktarıldıktan sonra, dondurma değiştirme işlemini başlatın. Cihazı, 0 °C'de 1 saatlik bir inkübasyon adımıyla ve ardından 1 saat içinde 20 °C'ye kademeli olarak artırarak 16 saat boyunca sıcaklığı kademeli olarak -90 °C'den 0 °C'ye yükseltecek şekilde ayarlayın.
    8. Numuneler 20 °C'ye ulaşır ulaşmaz, numuneleri doğrudan %100 aseton ile 3 x 30 dakika yıkamaya devam edin.
      NOT: Disklerdeki hücrelerin kurumasına izin vermeyin. Sonraki tüm adımları bir çeker ocak altında gerçekleştirin. Tüm atıkları uygun bir kapta toplayın ve yerel EHS yönetmeliklerine göre atın.
  3. Katıştırma
    1. Epoksi reçineyi üreticinin talimatlarına göre taze olarak hazırlayın.
      NOT: Tüm adımları çeker ocak altında epoksi reçine ile gerçekleştirin. Daha düşük viskozite ve dolayısıyla daha iyi numune sızması nedeniyle her gömme prosedürü için taze reçine hazırlamanızı öneririz.
    2. Numuneleri önceden gömmek için, numuneleri 1/3 epoksi reçine ve 2/3 aseton içeren bir çözelti içinde 1 saat inkübe edin. Çözeltiyi 2/3 epoksi reçine ve 1/3 aseton ile değiştirin ve 3 saat inkübe edin. Çözeltiyi %100 epoksi reçine ile değiştirin ve kalan asetonun buharlaşmasına izin vermek için flakon kapağı açıkken gece boyunca inkübe edilmesine izin verin.
    3. Ertesi gün, safir diskleri taze hazırlanmış epoksi reçine ile doldurulmuş yeni, etiketli reaksiyon tüplerine aktarın. Diskleri, reaksiyon tüpünün duvarı tarafından desteklenecek şekilde yatay olarak yerleştirin ve hücrelerin bulunduğu tarafın reaksiyon tüpünde yukarı baktığından emin olun ("2" stereo mikroskop altında okunabilir). Reaksiyon tüplerini kapağı açık olarak 60 °C'de bir fırına yerleştirin ve epoksi reçinenin en az 48 saat polimerize olmasına izin verin.
      NOT: Bir safir disk parçasının gömülmesi gerekiyorsa, önceki bir deneyin reçine bloğunun polimerize bir ucunun yardımıyla gömün: Ucu reaksiyon tüpüne yerleştirin, tüpü taze reçine ile doldurun ve kırık diski polimerize ucun üzerine koyun.
      Epoksi reçine ile kontamine olmuş herhangi bir tek kullanımlık sarf malzemesi, reçinenin atılmadan önce tamamen polimerize olmasını sağlamak için 60 °C'de bir fırına yerleştirilmelidir. Cımbız ve diğer eşyalar önceden etanol ile silinebilir.
    4. Kapalı bir reaksiyon tüpünün ucunu yaklaşık 10 saniye boyunca sıvı nitrojene batırın. Daha sonra, reaksiyon tüpünü masaya vurarak reçine bloğunu reaksiyon tüpünden çıkarın. Safir disk, gömülü hücrelerin üzerinde kalan karbon kaplamadan kolayca ayrılır.
      NOT: Gömme ortamınızın sıvı nitrojen işleminin neden olduğu sıcaklık değişikliklerini tolere ettiğinden emin olun.
  4. STEM tomografi bölümlerinin hazırlanması
    1. TEM görüntüleme için ultra ince kesitlerden çok daha kalın, genellikle 800 nm ile 1 μm arasında kesitler hazırlayın.
      NOT: STEM tomografi için kesitlerin hazırlanması konvansiyonel ultramikrotomiden biraz farklıdır. STEM tomografi kesitlerinin hazırlanmasını açıklayan ayrıntılı bir protokol için Walther ve ark.15 ve Villinger et ark.10'a bakınız.
      STEM tomografi bölümlerinin hazırlanmasına devam etmeden önce hücrelerin kalitesinin iyi olduğundan emin olunuz. Bunun için ultra ince kesit alma (~70 nm) ve TEM analizi yapın (Şekil 3D,E).
    2. Numuneyi yüksek açılara eğerken hiçbir ızgara çubuğu elektron ışınını engellememesi için bölümleri paralel çubuklu bakır ızgaralar üzerinde toplayın. Daha iyi kesit bağlantısı için, ızgaralara %0,01 poli-L-lizin uygulayın:% 0,1'lik bir stok çözeltisinden% 0,01 poli-L-lizin'den küçük bir alikot hazırlayın, ızgaraları alikotun içine batırın, ızgaranın kenarını bir filtre kağıdı üzerine sürükleyerek dikkatlice kurulayın. Izgaraları kızdırma-boşaltma ve bölümleri toplamak için kullanın.
    3. Kolloidal altın içeren bölümleri, eğim serisi hizalaması için referans belirteçleri olarak değerlendirin (bkz. bölüm 3).
    4. Bölümleri stabilize etmek ve daha iletken hale getirmek için bölümlere bir karbon kaplama uygulayın.

figure-protocol-2
Şekil 3: Gömme, kırpma ve ultra ince kesitleme sonrasında hücrelerin TEM ile farklı görünümleri ile kalite kontrolü. (A) SD çıkarıldıktan sonra epoksi reçineye gömülü hücreler. Çizilmiş '2' ile karbon tabakası reçine gömülü hücreler üzerinde kalır ve açıkça görülebilir. Neredeyse saydam hücreler, blok yüzü boyunca eşit olarak dağıtılır. (B) Mikrotomiden önce kesilmiş blok yüzü. Çizilen 2'nin bir kısmı reçine bloğunun yüzeyinde hala görülebilir. (C) 70 nm inceliğinde kesitlerbir TEM ızgarası üzerine monte edilmiştir. (D) Bir ultra ince bölümün tamamına TEM'e genel bakış. Eksik reçine sızmasından kaynaklanan ve yaygın bir artefakt olan bölümdeki deliklere (beyaz ok uçları) dikkat edin. (E) (D) içinde beyaz bir dikdörtgenle işaretlenmiş seçili bir hücrenin büyütülmüş görünümü. (D)'ye benzer şekilde, plazma zarında (beyaz ok uçları) eksik gömme görülebilir; Bununla birlikte, hücrenin geri kalanı iyi koruma ve gömme gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm (D), 10 μm (E). Kısaltmalar: SD = safir disk; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Görüntüleme

  1. STEM tilt serisi satın alma
    1. Mikroskobu üreticinin yönergelerine göre ayarlayın. Uygun ışın hizalamasını sağlayın.
    2. Sıvı nitrojen dewarını mikroskopta dikkatlice doldurun.
    3. Mikroskop çalıştırma yazılımında doğru tomografi tutucusunu seçin.
    4. Izgarayı tutucuya yerleştirin. Çubukların yüksek eğim açılarında elektron ışınını engellemesini önlemek için ızgara çubuklarının eğim eksenine dik olarak yönlendirilmesine dikkat edin.
    5. Tutucuyu mikroskobun içine yerleştirin.
    6. Aşağıdaki adımları uygulayarak kirişi hizalayın:
      1. Üretici tarafından sağlanan hizalama dosyasını yükleyin. Kiriş vanasını açın ve şimdilik TEM modunda çalışın. Yaklaşık 20.000x'lik bir büyütme ayarlayın ve STD Focus'a basarak standart odağı ayarlayın.
      2. Örnekte bir delik arayın. Bu, düşük büyütme modunda daha kolaydır ( LowMag'e basın).
      3. Diyafram açıklığı takılmadığından emin olun. Spot boyutunu 1 ve Alfa'yı 3 olarak ayarlayın. Parlaklık düğmesini saat yönünün tersine çevirerek görüntüleme ekranındaki ışını en aza indirin ve ışın kaydırma düğmeleriyle ortalayın.
      4. Doğru tabanca hizalaması: Mikroskop çalıştırma yazılımının hizalama panelinde, Tabanca ve anot sallayıcıyı seçin. DEF/STIG düğmeleriyle ışının simetrisini ayarlayın. Işının floresan ekran üzerindeki hareketinin homojen olduğunu onaylayın. SHIFT düğmeleriyle en parlak noktayı ekranın ortasına taşıyın; İşiniz bittiğinde tümünün seçimini kaldırın.
      5. Doğru kondenser uyarıcıları: Aynı hizalama panelinde, CLA ve HT sallantısını seçin. Homojen bir hareket elde etmek için DEF/STIG düğmeleri ile ayarlayın.
      6. Kondansatör lens açıklığını ayarlayın: Parlaklık düğmesini saat yönünde çevirerek floresan ekrandaki ışını en üst düzeye çıkarın. En küçük kondansatör lens diyaframını takın ve parlaklığı değiştirerek ışında doğru şekilde hizalandığından emin olun. Işın görüntüleme ekranında asimetrik olarak hareket ediyorsa, manuel diyafram sürücülerini kullanarak diyaframı manuel olarak ayarlayın. Floresan ekranda diyafram bozuk görünüyorsa, kondenser damgalayıcıları CLA'yı DEF/STIG ile tekrar düzeltin (önceki adım 3.1.6.5).
      7. STEM moduna geçin (ASID'yi seçin).
        NOT: Lens gevşetme diyaloğunu 5-10 saniye sonra kesebilirsiniz.
      8. Sahne alanını örneğin ince, kontrast açısından zengin bir bölgesine taşıyın. STD Focus'a basın ve tüm açıklıkları çıkarın. 1,5 nm spot boyutuyla 25.000 büyütmeye geçin, kamera uzunluğunu 80 ile 120 cm arasında ayarlayın ve spot modunu seçin.
      9. Görüntüleme ekranında ronkigram görünene kadar açıölçerin z değerini değiştirin. Ronkigram soluksa kamera uzunluğunu değiştirin. Yuvarlak değilse, ayarlamak için COND Stig düğmesini kullanın.
      10. En küçük kondansatör lens diyaframını yerleştirin. Diyaframı ronkigramın etrafında ortalamak için manuel diyafram sürücülerini kullanın.
    7. Uygun dedektörü takın. Araştırma sorusuna dayanarak, parlak alan dedektörünü ve/veya karanlık alan dedektörünü kullanın. Tarama modunu etkinleştirin ve numunenin ilk test görüntüsünü alın.
    8. Tomogram için istenenden daha büyük bir büyütme seçin ( 800.000x'ten yüksek). Doğru odaklama ve astigmatizma: Kritik numune alanlarına ışın hasarını önlemek için bunu doğrudan ilgilenilen bölgeye (ROI) yakın bir yerde yapın.
      NOT: Altın referans işaretleri bu adımı kolaylaştırabilir.
    9. ROI'nin tüm eğim aralığı boyunca (yani -72 ° ila 72 °) ortalanmış kalmasını sağlamak için ötesantrik yüksekliği ayarlayın. ROI'ye yakın bir özellik seçin, merkeze getirin, odaklanın, astigmatizmayı düzeltin ve sahneyi adım adım - 72 ° 'ye eğin. Özelliği merkezde tutmak için tutucunun z konumunu ayarlayın ve gerekirse kontrast ve parlaklığı ayarlayın. Gerekirse, bunu kademeli olarak +72 ° 'ye eğerek tekrarlayın.
    10. ROI'ye geri dönerek görüş alanını seçin, odaklanın ve bir genel bakış görüntüsü elde edin (Şekil 4). Eğim serisi alımı için istenen büyütmeyi ayarlayın.
    11. -72° ile +72° arasında ve her 1,5°'de bir görüntü için otomatik eğim serisi çekimini ayarlayın.
    12. Sahne alanı eğiminin yönünü değiştirirken ortaya çıkan mekanik etkilere karşı koymak için, eğim serisine görüntülemeye başlamak için kullanılandan daha büyük bir açıyla başlayın. -72° ile 72° arasında görüntüleme yapıyorsanız, sahneyi 0° ile -74° arasında eğerek başlayın ve ardından +72°'ye giderken görüntü almaya başlayın ve ilk görüntüyü -72°'de elde edin.
    13. Otomatik eğim serisi alımını başlatın. Alım yazılımında dinamik odağı etkinleştirdiğinizden emin olun.
      NOT: Eğim serisi alımı zamanından önce sonlandırılırsa, ösantrik yüksekliği düzeltin. Özellikle daha yüksek büyütme oranlarında bu, yatırım getirisinin görüş alanının dışına taşınması nedeniyle otomatik eğim serisi alımında sorunlara neden olabilir.
      STEM ve TEM tomografisi için yaygın olarak kullanılan bir yazılım SerialEM'dir. Kirchweger ve ark.20 , oda sıcaklığında STEM tomografisine kolayca uyarlanabilen SerialEM kullanarak Cryo-STEM tomografisi için bir video protokolü yayınladılar.

figure-protocol-3
Şekil 4: Eğim serisi alımı. (A) 200 kV STEM. (B) Epoksi reçineye gömülü yüksek basınçlı dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş bir hücrenin STEM'e genel bakışı. (C-E)'de gösterilen eğim serisi, beyaz dikdörtgen ile işaretlenmiş konumda elde edilmiştir. (C-E) -72° ile +72° arasında elde edilen bir eğim serisinin seçilmiş görüntüleri. Kesitin her iki yanında bulunan altın referanslar, hesaplamalı tomogram rekonstrüksiyonu için kullanılmıştır. Beyaz elipslerle işaretlenenler gibi kümelenmiş referanslar, tomogramın yeniden yapılandırılması için kullanılamaz, ancak yüksek eğim açılarında iyi tanınabilir. İlgilenilen bölgenin dışındaki bu veya benzer yapılar, ösentrik yüksekliğin ayarlanması için kullanışlıdır. Ölçek çubuğu = 1 μm (B). Kısaltma: STEM = taramalı transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Tomogram rekonstrüksiyonu ve segmentasyonu

  1. Tomogram rekonstrüksiyonu gerçekleştirin (örneğin, IMOD yazılım paketi23'ün Etomo yazılımı ile).
    1. Eğim serisinin ilk hizalamasını gerçekleştirin ve ağırlıklı geri projeksiyon kullanarak tomogramı yeniden oluşturun.
      NOT: Ayrıntılı bir protokol IMOD web sitesinde bulunabilir: IMOD Tomografi Kılavuzu (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Karanlık alan dedektörü ile elde edilen görüntülerin işlenmesi için daha önce yayınlanmış çalışmayabakın 11,13.
  2. Hücresel yapıları segmentlere ayırın (örneğin, IMOD paketinden 3DMOD gibi yazılımlar veya yapay zeka tabanlı çözümlerle).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM tomografi, nanometre aralığındaki izotropik çözünürlüğü ile TEM tomografiden daha kalın kesitleri görüntüleme imkanı sunar ve FIB-SEM tomografi ile karşılaştırıldığında, nispeten zaman açısından verimli bir görüntüleme iş akışı sağlar. Virolojide bu, 3D olarak istatistiksel analiz için veya nadir olayları ararken çok sayıda ultrastrüktürel özelliğin görüntülenmesine izin verdiği için özellikle yararlıdır. Burada, STEM tomografisinin bu iki açıdan nasıl kullanılabileceğini gösteren iki temsili sonuç gösteriyoruz.

Tomurcuklanan rekombinant VSV viryonlarının görselleştirilmesi

Farklı şekil ve boyutlarda parçacıklar oluşturan çok çeşitli virüsler vardır. Bir virüs süspansiyonundaki viryonların şeklini analiz etmek için genellikle negatif leke TEM gibi basit bir yöntem yeterlidir. Hücresel bağlamda viryonların morfolojisini karakterize etmek daha zordur. Bu, özellikle rabdoviridae gibi anizotropik morfolojiye sahip parçacıklar oluşturan virüsler için geçerlidir. VSV, ~180 nm uzunluğunda mermi şeklinde viryonlar oluşturan bir rabdovirüstür. Süspansiyon hücrelerinde, viryonlar rastgele yönlendirilir, bu da 2D görüntülerde mermi şeklini her zaman ayırt etmeyi zorlaştırır (Şekil 5A-C). Bir numunedeki tüm rekombinant VSV virionlarının mermi şeklini doğru bir şekilde tanımlamak için, yeterince geniş bir numune alanı üzerinde hacimsel bilgi sağlayabilen izotropik çözünürlüğe sahip bir 3D yöntem gereklidir. Bir STEM tomogramı, tek bir veri setinde birçok tam virion içerebilir (Şekil 5D, E). Böylece, hücre başına sadece bir tomogram elde edilse bile, istatistiksel analiz için çok sayıda viryon görüntülemek mümkündür. Buna karşılık, 200 nm kalınlığındaki bir bölümün bir TEM tomogramı sadece birkaç tam rekombinant VSV virionunu yakalayacaktır (Şekil 5E'de işaretlendiği gibi).

figure-results-1
Şekil 5: Rekombinant VSV tomurcuklanma bölgelerinin STEM tomografisi. (A-C) 800 nm kalınlığındaki bir kesitten elde edilen bir STEM tomogramının sanal bir kesitinden alınan ayrıntılar, viryonların (A,B) farklı yönelimleri nedeniyle mermi şeklinin her zaman görünür olmadığını göstermektedir. (C) Yalnızca görüş düzlemine paralel olarak yönlendirilmiş virionlar, iyi tanımlanmış mermiler olarak bulunur. (D) Rekombinant VSV'nin tomurcuklanan bölgeleri, tercih edilen bir yönelimi olmayan büyük virion kümelerine benzer. (E) Tomogramın yandan görünümü, STEM tomografisi kullanılarak tek bir bölümde birçok tam rekombinant VSV viryonunu yakalama yeteneğini göstermektedir. Sanal görüntü yığını bu konumda yaklaşık 600 nm kalınlığa sahiptir. Kesikli çizgiler, TEM tomografisi (200 nm) için bir bölümün yaklaşık kalınlığını temsil eder, burada sadece birkaç tam mermi şeklindeki virion dahil edilir. Ölçek çubuğu = 500 nm (D). Kısaltmalar: STEM = taramalı transmisyon elektron mikroskobu; VSV = veziküler stomatit virüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

EF-C peptit nanofibrillerinin bozunması

Gen terapisi bağlamında, iletimi arttırıcı peptit nanofibriller bir ilgi konusu haline gelmiştir. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada24, EF-C peptit nanofibrillerinin alımını ve sökülmesini araştırmak için Foerster Rezonans Enerji Transferi (FRET) görüntüleme ve STEM tomografisi (FRET-3D-CLEM) kullanılarak korelasyon görüntüleme kullanıldı. Birbirine yakın FRET çiftlerine karşılık gelen yüksek FRET verimlilikleri, birleştirilmiş fibrillere karşılık gelen kırmızı floresan yayar. Birbirinden uzak FRET çiftlerine karşılık gelen düşük FRET verimlilikleri, demonte fibrilleri temsil eden yeşil floresan yayar. Her iki sinyal de hücrelerde EF-C peptit nanofibrillerini alma ve parçalama sürecinde olduklarında ortaya çıkar. Yüksek ve düşük FRET verimliliklerinin bulunduğu alanlar sarı renkte görünür (Şekil 6A).

figure-results-2
Şekil 6: EF-C peptit nanofibril bozunmasının korelasyonlu FRET görüntüleme ve STEM tomografi (FRET-3D-CLEM) ile görüntülenmesi. (A) Bir FRET çifti ile etiketlenmiş EF-C nanofibrilleri ile inkübe edilmiş bir hücrenin konfokal mikroskobu. Yeşil sinyaller, varsayılan olarak demonte edilmiş fibrillere karşılık gelir. Kırmızı, varsayılan olarak sağlam fibrillere karşılık gelir. Sarı, kırmızı ve yeşil sinyalin bir karışımının algılandığı alanlara karşılık gelir. Çekirdek çekirdeği. (B) Aynı hücreden 800 nm kalınlığındaki bir bölümün STEM'e genel bakışı. (C) Tomogramın konumu belirtilir. Görüntü, farklı bölümlerde elde edilen iki görüntünün bir bileşimidir, çünkü hücre, bölümlerden birindeki çubuk ızgara tarafından kısmen engellenmiştir. Çekirdek, A, B ve C'de Nu ile etiketlenir. (C) Tomogramdan sanal bölüm. Kırmızı ok uçları, kırmızı floresan sinyalleriyle çakışan bölgeleri işaretler. STEM tomografisi sağlam fibrillerin varlığını doğrular. Yeşil ok ucu, demonte fibrillerin olduğu bir bölgeye işaret eder. (D) Tomogramın segmentasyonu. Endositozlu bir filopodyum vezikül zarını sıkıştırıyor (beyaz ok). Bir STEM tomogramı ile incelenebilecek büyük hacim (burada yaklaşık olarak: 7 μm x 7 μm x 550 nm), böylesine nadir bir olayı gözlemlemeyi kolaylaştırır. (E) Tomogramın 19, 24 ve 29 numaralı sanal bölümleri. 6,8 nm piksel boyutunda, bölümlerin her biri 27,2 nm aralıklıdır. Şekil, Rauch-Wirth ve ark.24 tarafından yayınlanan verilerden alınmıştır. Ölçek çubukları = 5 μm (A), 1 μm (C). Kısaltmalar: STEM = taramalı transmisyon elektron mikroskobu; FRET = Foerster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Görselleştirme, EF-C fibrillerinin hücre tarafından alındığını ve daha sonra parçalandığını doğrulamak için bu korelasyonlu yaklaşımla gerçekleştirildi. Işık mikroskobu, farklı floresan sinyalleriyle ilişkili ultrastrüktürel görünümü karşılaştırmak için elektron mikroskobu için kırmızı ve yeşil sinyaller sağlayan hücreleri seçmemizi sağlar. Aynı hücreden alınan STEM tomogramları, kırmızı sinyalin ya hala hücre dışında olan fibrillerden kaynaklanabileceğini ya da makropinositoz ile görünüşte taze içselleştirilmiş olabileceğini göstermektedir (Şekil 6C). Ayrıca, CLEM, yeşil sinyalin gerçekten de bozulmuş fibrillerden kaynaklandığını doğruladı (lizozomlarda bulunabilen Şekil 6B, C (Şekil 6C, en büyük vezikül). STEM tomografi ile erişilebilen büyük hacim ve yapıların 3 boyutlu görselleştirilmesi nedeniyle, ışık mikroskobundan gelen sinyali ultrastrüktürel özelliklerle ilişkilendirmek ve yorumlamak daha kolaydır. Ayrıca, lizozom içindeki filopodia'nın sıkışması gibi nadir olaylar (Şekil 6D, E, beyaz ok) bu yaklaşımla tespit edilebilir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM tomografisi, 1 μm kalınlığa kadar hacimleri inceleme yeteneği ile birlikte TEM tomografisi ile karşılaştırılabilir bir çözünürlük sunar. Bu nedenle, zarın yeniden şekillenmesi 4,6,25, virionlarıntomurcuklanması 7 veya endositoz 5 gibi hücre içi yapıların virüs kaynaklı değişikliklerini görüntülemek için ideal olduğunu düşünüyoruz. Araştırma sorusuna bağlı olarak, diğer VolumeEM teknikleri düşünülebilir. Karşılaştırılabilir bir çözünürlükle daha geniş bir görüş alanı sağlayan bir teknik için FIB-SEM tomografisini öneriyoruz. FIB-SEM tomografisi, çözünürlük arttıkça görüntüleme süresi de arttığından, benzer çözünürlükte karşılaştırılabilir bir hacmi görüntülerken STEM tomografiye göre daha yavaş olacaktır. Çoğu zaman, bu daha sonra daha küçük görüş alanlarının görüntülenmesiyle dengelenir. Ayrıca, 6.8 nm'lik bir z-çözünürlüğü (Şekil 6), iyon ışını frezeleme ile teknik olarak zor olacaktır. Bu nedenle, FIB-SEM, genellikle birkaç on nanometrelik (izotropik) piksel boyutlarında olmasına rağmen, tüm hücreler ve doku 9,10,26,27 gibi daha büyük yapıları görüntülemek için idealdir. Ayrıca, FIB-SEM tomografileri, bir eğim serisinden yeniden oluşturulan tomogramlar için tipik olan "eksik kama" etkisi göstermez. Ayrıca, plazma FIB makinelerinin geliştirilmesiyle birlikte, daha hızlı ve hala hassas frezeleme sağlayan alternatifler şu anda sahaya sunulmaktadır.

Z'de yüksek çözünürlük çok önemli değilse, seri kesitlerin TEM veya SEM görüntülemesi, çok geniş bir görüş alanının kısa sürede28,29 araştırılmasına izin veren bir alternatif olabilir, ancak genellikle anizotropik çözünürlükle. TEM tomografide seri kalınlıktaki kesitlerden farklı tomogramlar kombine edilebilmektedir30,31. Aynı şey STEM tomografisinde de mümkündür; Bununla birlikte, araştırılabilecek bölümlerin kalınlığı göz önüne alındığında, bir dizi tomogramı birleştirmeye daha az ihtiyaç vardır. Virolojide, TEM tomografisi genellikle virüsün neden olduğu zar yeniden şekillenmesini karakterize etmek için kullanılır 32,33,34,35. TEM tomografisinin kendisi virüslerin replikasyon döngüsünde değerli bilgiler sağlarken, çoğu kullanım durumu STEM tomografisinin daha kalın hacimleri görüntüleme yeteneğinden faydalanacaktır. Bu özellikle, TEM tomografisinin bir tomogramda35 yalnızca birkaç tam viryonu yakalayabildiği rhabdoviridae gibi anizotropik morfolojiye sahip virionlar veya insan sitomegalovirüsünün (HCMV) sitoplazmik viral montaj kompleksi (cVAC) boyutuna sahip bir replikasyon bölmesinde birkaç zarflayan viryonun görüntülenmesi için geçerlidir4.

Kriyojenik koşullar altında STEM tomografisi daha fazla fonksiyonel bilgi sunar19 ve bir video protokolümevcuttur 20. Protokolümüz, numuneyi yerel durumda korumak yerine, yerel ultrastrüktürel koruma sağlayan numune hazırlama iş akışında farklılık gösterir. Yüksek basınçlı dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş numunelerin STEM tomografisi, kriyojenik EM'de görülen ultrastrüktürel koruma ve atomik çözünürlüğü elde edemese de, daha basit ekipman, daha kararlı numuneler ve daha yüksek verim avantajlarından yararlanır.

Yöntemin başarısı için aşağıdaki adımlar kritik öneme sahiptir:

İlk olarak, görüntüleme deneyinin net bir hedefi. Tekniğin emek yoğun doğası nedeniyle, görüntüleme için net bir hedefi olan iyi planlanmış bir deneye ihtiyaç vardır. Model sistemin ayrıntılı bilgisi - hücre hattı ve virüs - gerçekleştirilmesi daha az zor olan diğer yöntemler kullanılarak önceden oluşturulmalıdır. Bu nedenle, ışık mikroskobu tabanlı ön deneylerde bulaşıcılık oranlarının optimize edilmesini ve deney koşullarının biyolojik sisteme uyacak şekilde ayarlanmasını teşvik ediyoruz. Optimizasyon parametreleri, hücre sayısını, enfeksiyon çokluğunu (MOI) ve virüse ve görüntülenecek olaya dayalı zaman noktalarını içerir. Bu, numunede yüksek oranda değerlendirilebilir hücre olmasını sağlayacaktır.

İkincisi, yüksek kaliteli numune hazırlama. Kaliteli numune hazırlamanın önemini vurguluyoruz. Şu anda, hücreler gibi kalın numuneler için altın standart olarak yüksek basınçlı dondurma ile vitrifikasyonu düşünüyoruz. Dondurarak ikame, gömme ve ardından oda sıcaklığında görüntüleme, STEM tomografisi ile birleştirildiğinde yüksek kaliteli sonuçlar elde etmenin sağlam bir yoludur. Bu nedenle, numune hazırlama için istikrarlı bir rutin oluşturmak çok önemlidir. Bunun için yüksek basınçlı dondurma14,21 ile ilgili literatürü vurgulamak istiyoruz. Daha az toksik bir donma-ikame çözeltisi kullanılacaksa, Schauflinger ve ark.36 tarafından tarif edildiği gibi osmiyum tetroksit yerine potasyum permanganat kullanılmasını öneririz.

Son olarak, iyi hizalanmış bir mikroskop da dahil olmak üzere eğim serisi alımı için sorunsuz çalışan bir iş akışı, STEM'in kullanıcı talimatlarına uygun olarak oluşturulmalıdır ve mikroskoptan mikroskoba farklılık gösterecektir. Sorunsuz bir iş akışı oluşturmak aynı zamanda tarama oluşturucuya ve görüntü elde etme yazılımına da bağlıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR ve MD, virüs bazlı ürünler geliştirmek ve üretmekle ilgilenen bir ilaç şirketi olan Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG'nin çalışanlarıdır. Bunun kağıdın tasarımı üzerinde hiçbir etkisi olmadı; bu nedenle, herhangi bir çıkar çatışması rapor etmiyoruz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayın, Küresel Kalkınma Teknoloji Stratejisinin bir parçasıdır ve Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals'taki Küresel Teknoloji Yönetimi tarafından desteklenmiştir. Renate Kunz ve Jana Apolloni'ye mükemmel teknik yardım ve numune hazırlama ile ilgili yardımcı tartışmalar için teşekkür ederiz. Teknik sorunlar ve cihaz bakımı ile ilgili mükemmel yardımı için Reinhard Weih'e teşekkür ederiz. Torsten Friedrich'e yararlı tartışma ve mikroskobun kurulumuna yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Clarissa Read, Julia LaRoche ve Jan Münch'in çalışmaları, Alman Araştırma Vakfı'nın (SFB1279) Ortak Araştırma Merkezi Hibesi tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-HeksadekenMerck KGaA8220640500
200 bakır ızgara paralel çubuklarlaPlano GmbHG2014C
37 ve derece; C kurutma odasıBinder GmbH9010-0323
AsetonVWR international GmbH20066330
DDSAElektron Mikroskopi Bilimleri13710
Elmas bıçakDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Elektron Mikroskopi Bilimleri13600
Embed-812 ReçineElektron Mikroskopi Bilimleri14900
EM araçlarıTVIPS GmbHTVIPS Yazılımı: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Etanol %100Merck KGaA1.00983.2511
Filtre kağıdıVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarElektron Mikroskopi Bilimleri15830-25
Dondurma yerine geçme ünitesi Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmAURION Immuno Altın Reaktifleri & Aksesuarlar425.011
Altın çam deliği ve oslash; 2000 & Mu; mScience Services GmbHGA2000-AU
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Isıtma plakasıMEDAX GmbH & Şirket KG12501
Yüksek vakum buharlaştırma sistemi BAF 300BAL-TEC AG
Yüksek basınçlı dondurucu Wohlwend HPF Compact 01Mühendislik Ofisi M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Sıvı azot tankıH.Erben GmbH94500
Azot (sıvı)VWR international GmbH-
NMAElektron Mikroskopi Bilimleri19000
Osmiyum tetrooksitChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Fırın 120 derece ve derece; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poli-L-Lizin %0,1 b/v aq. ÇözümTed Pella, Inc.18026
Güvenli Kilitli Tüpler 0.5 mLEppendorf SE0030 121.023
Örnek kapları (Beem kapsülleri)Plano GmbHG360-1
Safir disk diametri 3 x 0.16 mmMühendislik Ofisi M. Wohlwend GmbH500
Ultramikrotom Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Uranyl asetatRiedel de Haë n AG31697
UV ışık odasıDiniesELG100S

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

STEM TomografisiY ksek Bas n l DondurmaDonma Substit syonu3B G r nt lemeVir s Enfekte H crelerRe ine G mmeVezik ler Stomatitis Vir sKorelatif I k Elektron MikroskobuVirion Morfogenezi

İlgili makaleler