Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Alüminyum RNA ile transfekte edilmiş Primer Fare Retina Pigment Epiteli: Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu için Patolojik Olarak İlgili Bir İn Vitro Model

558 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokolde, birincil fare retina pigment epiteli (RPE) hücrelerinde yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için patolojiyle ilgili bir model oluşturma sürecinin tamamını açıklıyoruz.

Özet

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), özellikle eksüdatif olmayan AMD, insan patolojisini daha iyi kopyalayan deneysel modeller gerektirir. Mevcut in vivo modeller teknik olarak zorlu ve zaman alıcı olmaya devam ederken, geleneksel in vitro sistemler hastalığa özgü patolojik tetikleyicileri özetlemekte başarısız oluyor. Burada, coğrafi atrofi patolojisinde doğrudan rol oynayan bir retrotranspozon olan Alu RNA ile transfekte edilmiş birincil fare RPE hücrelerini kullanarak bir retina pigment epiteli (RPE) dejenerasyon modeli oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz.

Bu protokol, birincil fare RPE hücrelerinin enzimatik izolasyonunu ve ardından RPE dejenerasyonunu indüklemek için Alu RNA transfeksiyonunu detaylandırır. Doğrulama, morfolojik (altıgen mimari), fonksiyonel (polarite kaybı ve fare proteini ZO-1 bozulması) ve moleküler analizi (kantitatif PCR) entegre eder. Sonuç olarak, tetiklenen multifaktöriyel değişiklikler gözlemledik alüminyum RNA transfeksiyonu: inflamatuar sitokin sekresyonu (fare genleri Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0.05) ve hücresel yaşlanma (fare genleri p21 ve p53 yukarı regülasyonu; p < 0.05). Geleneksel akut stres modelleriyle karşılaştırıldığında bu sistem, AMD'nin kronik inflamatuar-dejeneratif basamaklarını standartlaştırılmış tekniklerle özetleyerek tekrarlanabilirliği sağlar. Basitleştirilmiş in vitro analizlerin ve karmaşık in vivo modellerin özelliklerini birleştiren bu yaklaşım, retrotranspozon güdümlü mekanizmaların araştırılması ve potansiyel terapötik adayların taranması için bir ön platform görevi görebilir.

Giriş

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), küresel görme bozukluğunun baskın nedenidir. Bununla birlikte, eksüdatif olmayan YBMD için etkili tedaviler sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, hastalık mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve terapötik hedefleri belirlemek için tekrarlanabilir ve verimli araştırma modellerine acil ihtiyaç vardır 1,2. Bu çabanın merkezinde, Bruch membranı (koroid) ve fotoreseptörler (retina) arasında yer alan ve fotoreseptör fonksiyonunu destekleyerek, kan-retina bariyerini düzenleyerek ve atık temizliğini kolaylaştırarak retina homeostazının sürdürülmesinde çok önemli bir rol oynayan tek bir tabaka olan retina pigment epiteli (RPE) bulunmaktadır 3,4.

RPE hücrelerinin disfonksiyonu veya kaybı, özellikle RPE disfonksiyonunun ilerlemesinde erken ve kritik bir adımı temsil ettiği YBMD'de birçok retinal dejeneratif hastalığın göze çarpan bir özelliğidir 2,4,5. Özellikle, AMD'nin ileri fazı olan coğrafi atrofi (GA) gösteren hastalarda, mikroRNA işleme enzimi Dicer 1 ribonükleaz III'ün (DICER1) azalmış seviyeleri, RPE dejenerasyonu ile doğrudan bağlantılı ve insan patolojisinde yer alan bir retrotranspozon transkripti olan Alu RNA'nın toksik birikimine neden olur6.

Sodyum iyodat (NaIO3) modeli ve amiloid-β (Aβ) modeli gibi geleneksel in vivo modeller, sistemik hastalık karmaşıklığını korur ancak kritik sınırlamalarla karşı karşıyadır. NaIO3 modeli hızla retinal oksidatif stres ve RPE hasarını indükler, ancak akut toksisitesi hem RPE'yi hem de fotoreseptörleri bozar, YBMD'nin kronik patoloji ile ilişkili ilerlemesini taklit edemez ve ince RPE disfonksiyonunun terapötik değerlendirmesini engeller7. Benzer şekilde, Aβ modeli hastalığa özgü stres faktörlerini ortaya çıkarır, ancak in vitro yaklaşımlara kıyasla kapsamlı teknik uzmanlık ve uzun zaman çizelgeleri gerektirir 8,9. Öte yandan,H2O2ve hidrokinon maruziyet modelleri gibi geleneksel in vitro RPE modelleri, toksik protein agregatları veya inflamatuar tetikleyiciler gibi hastalığa özgü stres faktörlerini özetlemekte başarısız olarak patolojik ilgiden yoksundur1.

Burada, GA patogenezinde doğrudan rol oynayan retrotranspozon türevli kodlamayan bir RNA olan Alu RNA kullanarak birincil fare RPE hücrelerinde bir RPE dejenerasyon modeli oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz6. Alüminyum RNA, inflamatuar yolları aktive eder ve RPE bariyer bütünlüğünü10,11 tehlikeye atar, böylece eksüdatif olmayan AMD ile ilişkili patolojik özellikleri taklit eder. Bu yöntem, RPE hücrelerinin enzimatik izolasyonunu ve kültürünü ve ardından RPE dejenerasyonunun indüksiyonunu kullanır. Ek olarak, bu dejenerasyon modelini değerlendirmek için morfolojik (altıgen mimari), fonksiyonel (bariyer bütünlüğü ve polarite kaybı) ve moleküler (inflamatuar ve yaşlanma belirteçleri) okumaları birleştiren kapsamlı bir doğrulama sistemi sağlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Genel Hastanesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokol, Deney Hayvanlarıyla İlgili İşlerin İdaresine İlişkin Yönetmeliğe (Devlet Bilim ve Teknoloji Komisyonu tarafından yayınlanan) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından oluşturulan oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların etik kullanımına ilişkin yönergelere sıkı sıkıya bağlıdır. Bu protokolde kullanılan malzemelerle ilgili daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Birincil fare RPE hücrelerinin izolasyonu

  1. Kaplamalı plakaların hazırlanması
    1. Matrigel'i 150 μL Matrigel'e 13 mL DMEM / F12 oranında seyreltin (nihai konsantrasyon yaklaşık% 1.14).
    2. Plakanın altını seyreltilmiş Matrigel ile eşit şekilde kaplayın (48 oyuklu bir plaka için yaklaşık 150 μL). Bir jel oluşturmak için gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. Çözelti hazırlama
    1. %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ile tamamlanan Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı/Besin Karışımı F-12'yi (DMEM/F12) kullanarak RPE kültür ortamının tamamını hazırlayın.
    2. Bir papain şişesine (100 Ünite/şişe) 4,5 mL Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) ekleyerek Papain Karışımını hazırlayın.
    3. Bir DNase I şişesine (1.000 Birim/şişe) 500 μL EBSS ekleyerek DNase I Karışımını hazırlayın.
    4. 4,5 mL Papain Karışımına 250 μL DNase I Karışımı ekleyerek papain sindirim solüsyonunu hazırlayın (22 IU/mL'lik nihai papain konsantrasyonunu elde etmek için tedarikçi tarafından sağlanan protokolü ayarlayın), nihai hacmi 4,75 mL yapın.
  3. Ötenazi ve doku toplama
    1. 2-3 haftalık farelere 150-200 mg / kg vücut ağırlığında% 5 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ötenazi yapın. Kalp atışının ve solunumun durduğunu doğrulayarak derin anesteziyi ve ölümü doğrulayın.
    2. Yüzey kirleticilerini ortadan kaldırmak için enükleasyondan önce oküler bölgeye% 70 etanol püskürtün 12,13,14. Küreyi dışarı çıkarmak için periorbital kenara hafifçe bastırın. Ardından, göz küresini çıkarmak için forseps kullanın ve daha kolay diseksiyon için optik siniri koruyun.
      NOT: Tüm aletler (örn. forseps, makas) otoklavlanır ve steriliteyi korumak için prosedürler laminer bir akış başlığı altında gerçekleştirilir.
    3. Gözbebeklerini hemen 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış steril tam RPE kültür ortamına daldırın.
  4. Enzimatik sindirim
    NOT: Enzimatik sindirim ve sonraki prosedürler dahil olmak üzere tüm adımlar, steriliteyi korumak için laminer bir akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Göz küresini bir tabağa aktarın ve stereomikroskop altında yapışan bağ dokusunu ve kalan ekstraoküler kasları ortadan kaldırmak için forseps kullanın.
    2. Gözleri önceden soğutulmuş Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS;Ca2+/Mg2+ yok; 4 °C'de) ile 2 kez nazikçe yıkayın.
      NOT: Artık tam RPE kültür ortamı papain enzimatik aktivitesini tehlikeye atabilir.
    3. Gözleri 1 mL papain sindirim solüsyonuna tamamen daldırın ve 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
  5. RPE hücrelerinin ayrılması
    1. Sindirimden sonra, enzimatik aktiviteyi tam RPE kültür ortamı ile nötralize edin.
    2. Göz küresini bir tabağa aktarın ve bir stereomikroskop altında kornea, iris ve lensi çıkarın ve arka vizör lastiğini koruyun.
      NOT: RPE hücreleri, tüm süreç boyunca (tek hücrelere ayrışmak yerine) bozulmamış tabakalar olarak izole edildi ve muhafaza edildi.
    3. Retina-RPE kompleksini koroidden ayırın, ardından RPE tabakasını tam RPE kültür ortamında sürekli tabakalar halinde retinadan uzaklaştırın. Ayrılmış RPE katmanlarını bir karışım olarak taze tam RPE kültür ortamına eşit şekilde toplayın ve ardından bunları Matrigel kaplı yüzeylerde kültürleyin.
  6. Hücre kültürü
    1. Karışımı Matrigel kaplı 24 oyuklu bir plakaya (immün boyama için lamel üzerinde kuyu başına 8-10 gözbebeği), Matrigel kaplı 48 oyuklu bir plakaya (qPCR için kuyu başına 6-8 gözküresi) veya Matrigel kaplı 96 oyuklu bir plakaya (kuyu başına 5-6 gözbebeği) tohumlayın.
    2. 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin. Tam RPE kültür ortamını kullanarak 48 saat sonra ilk ortam değişimini gerçekleştirin. İlk değişiklikten sonra ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
      NOT: RPE hücrelerinin polaritesini mümkün olduğunca korumak için, tekrarlanan alt kültürleme farklılaşma ve fonksiyonel bütünlük kaybına yol açabileceğinden, mümkün olduğunca onları geçirmekten kaçının.
  7. Hücre morfolojisi izleme
    1. Hücrelerin karakteristik altıgen morfolojiye sahip bir tek tabaka oluşturmasına izin verin. Ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskobu altında morfolojiyi izleyin.

2. RPE dejenerasyon modelinin indüksiyonu

  1. Alüminyum RNA sentezi ve doğrulaması
    1. Sentez alüminyum Bir in vitro transkripsiyon sistemi kullanarak RNA.
      NOT: Çalışmamızda kullanılan alüminyum RNA sentezi, Ambati Lab6 tarafından açıklanan protokole dayanmaktadır.
    2. RNA'yı saflaştırın ve bir mikrospektrofotometre kullanarak kalitesini doğrulayın.
  2. Alüminyum RNA transfeksiyonu
    NOT: Birincil RPE hücre tohumlama gününü 0. gün olarak belirledik. 5. günde, yapışık birincil RPE hücreleri tek tip bir morfoloji sergiledi ve %50'den fazla hücresel birleşmeye ulaştı, bu noktada alüminyum RNA transfeksiyonu, üreticinin yönergelerine göre katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi.
    Sonuçları doğrulamak için iki kontrol grubu dahil edildi: i) ne Alu RNA ne de transfeksiyon reaktifinin eklenmediği ve ikame olarak düşük serum ortamının kullanıldığı bir negatif kontrol (NC); ii) lipozom kontrolü (LC), burada alüminyum RNA ihmal edildi, ancak aynı miktarda transfeksiyon reaktifi düşük serumlu ortam ile karıştırıldı ve lipofeksiyonla ilişkili etkileri kontrol etmek için hücrelere uygulandı. Aşağıdaki adımlar özetlemektedir alüminyum RNA transfeksiyon prosedürü.
    1. Transfeksiyon prosedürlerinden önce mevcut ortamı kuyu başına 300 μL tam RPE kültür ortamı (48 oyuklu plaka) ile değiştirin.
    2. Düşük serumlu ortamda alüminyum RNA ve katyonik lipid bazlı reaktif ile transfeksiyon kompleksleri hazırlayın.
      1. Karışım 1'i 1.2 μL katyonik lipid bazlı reaktif ve 18.8 μL düşük serum ortamı ile hazırlayın. Yavaşça karıştırın (girdap yapmayın) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      2. Karışım 2'yi 6 μL Alu RNA (100 μg/mL) ve 14 μL düşük serum ortamı ile hazırlayın.
      3. 20 μL Karışım 2'ye damla damla 20 μL Karışım 1 ekleyerek transfeksiyon kompleksleri hazırlayın.
        NOT: Alu RNA, kuyu başına 1.2 μL katyonik lipid bazlı reaktif (1.2 μL reaktif: 0.6 μg RNA oranı) kullanılarak kuyu başına 0.6 μg'lık bir nihai konsantrasyonda transfekte edildi.
      4. Karıştırmak için hafifçe hafifçe vurun. Daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
    3. 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL/kuyu transfeksiyon kompleksi ekleyin. Plakayı 48 saat boyunca 37 °C/%5CO2 inkübatörüne yerleştirin.
    4. Transfeksiyondan 48 saat sonra qPCR, immün boyama ve diğer deneysel prosedürleri gerçekleştirin.

3. Dejenerasyon modelinin doğrulanması

NOT: 7. günde kapsamlı model doğrulama deneyleri yapılmıştır.

  1. Polarite ve bariyer bütünlüğü değerlendirmesi için immünofloresan boyama
    1. Kültürlenmiş RPE hücrelerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 metanol içermeyen formaldehit ile sabitleyin. 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
    2. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 5 sığır serum albümini (BSA) ile 1 saat boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
    3. Birincil antikorlar anti-ZO1 (%3 BSA'da 1:1.000 seyreltme) ve Phalloidin 488 (%3 BSA'da 1:1.000 seyreltme) ile gece boyunca 4 °C'de ışıktan kaçınarak inkübe edin.
    4. Hücreleri PBS ile 3 x 10 dakika nazikçe yıkayın.
    5. İkincil antikorlarla (%3 BSA'da 1:1.000 seyreltme) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    6. Numuneleri 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
    7. 10 dakika boyunca DAPI (PBS'de 1:1.000 seyreltme) ile karşı boyama yapın.
    8. Numuneleri 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
    9. Lameli 24 oyuklu plakadan dikkatlice çıkarın ve bir damla montaj ortamı ile önceden yüklenmiş bir cam slayt üzerine yerleştirin. 40x/0,95 objektif kullanarak konfokal görüntüler yakalayın.
  2. Yaşlanma ve inflamatuar belirteçler için kantitatif PCR (qPCR)
    NOT: Gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (fare geni Gapdh), eşik döngüsü (Ct) değerlerinin normalleştirilmesi için dahili referans geni olarak kullanıldı. Tüm kantitatif PCR (qPCR) reaksiyonları, deney grubu başına üç biyolojik kopya içeriyordu. Primer dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir.
    1. RNA ekstraksiyonu
      1. Kültür plakasına (10 cm² yüzey alanı başına 1 mL) lizis tamponu (Toplam RNA Kiti) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      2. 4 °C'de 5 dakika boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir RNaz içermeyen tüpe aktarın.
        NOT: Numunelerde kalıntı yoksa (örneğin, berrak hücre lizatı) bu adımı atlayın.
      3. Süpernatanta 200 μL kloroform ekleyin, 15 saniye vorteks yapın ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
      4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin. Üst sulu fazı (~500 μL) yeni bir tüpe aktarın.
      5. Sulu faza 0,5 hacim etanol ekleyin. Pipetleyerek hafifçe karıştırın.
      6. Karışımı bir silika membran kolonuna yükleyin (Total RNA Kitine dahildir). 30 saniye boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
      7. Kolona 500 μL protein giderme tamponu (Toplam RNA Kiti) ekleyin. 30 saniye boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
      8. Kolona 500 μL yıkama tamponu (Toplam RNA Kiti) ekleyin. 30 saniye boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
      9. Önceki adım 3.2'yi tekrarlayın.
      10. Membranı kurutmak için boş kolonu 13.400 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
      11. Membrana 30-100 μL RNaz içermeyen su ekleyerek RNA'yı ayrıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. 13.400 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    2. Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi
      1. 260 nm ve 280 nm'de bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
        NOT: 1.8 ile 2.0 arasındaki bir A260/A280 oranının kabul edilebilir RNA saflığı ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.
      2. Reaksiyon karışımını RNaz içermeyen bir tüpte hazırlayın: RNA şablonu (500-1.000 ng): X μL (konsantrasyonuna bağlı), 5x ters transkripsiyon tamponu: 4 μL, RNaz içermeyen su: 20 μL'ye kadar.
      3. Reaksiyon karışımını aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngüleyicide inkübe edin: 37 °C'de 15 dakika, 85 °C'de 5 saniye ve 4 °C'de süresiz bekletme.
    3. qPCR
      1. Her reaksiyon için qPCR ana karışımı hazırlayın (toplam 10 μL): TB Green (Premix Taq'a dahildir): 5 μL, ROX boyası (Premix Taq'a dahildir): 0,2 μL, İleri primer (1 μM): 0,2 μL, Ters primer (1 μM): 0,2 μL, RNaz içermeyen su: 3,4 μL, cDNA şablonu: 1 μL.
      2. 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL ana karışım ekleyin.
      3. Plakayı yapışkan bir optik kapakla kapatın. 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
      4. Aşağıdaki programı gerçek zamanlı bir PCR sisteminde çalıştırın: Aşama 1: 30 saniye boyunca 95 °C; Aşama 2: 40 döngü: 95 °C'de 5 sn, 60 °C'de 30 sn; Aşama 3: Erime eğrisi analizi.
      5. 2−ΔΔCt yöntemi15'i kullanarak hedef mRNA'ların nispi ekspresyon seviyelerini hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Alu RNA transfeksiyonundan önce birincil fare RPE hücreleri
0. Günde (Şekil 1), birincil fare RPE hücreleri izole edildi ve sağlıklı RPE hücrelerine özgü karakteristik altıgen morfolojiyi sergiledi. Bu hücreler iyi organize edilmiş bir tek tabakayı korudu. Hücreler, altıgen şekil ve iyi tanımlanmış sınırlarla kanıtlandığı gibi, ilk yapısal organizasyona ve sıkı bağlantıların oluşumuna izin verecek şekilde kültürlendi. Bu morfoloji, RPE dejenerasyonunun müteakip indüksiyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Amacımız, minimum kaynak kısıtlaması ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve mekanik analiz sağlayan tekrarlanabilir ve erişilebilir bir RPE yaralanma modeli oluşturmaktı. Bu yaklaşım, net bir şekilde görselleştirilmesini sağladı alüminyum Konfokal Z-yığını görüntüleme (0.5 μm adım boyutu) yoluyla apikal sıkı bağlantı parçalanması ve bazal hücre iskeleti düzensizliği dahil olmak üzere kontrol grubuyla karşılaştırıldığında RNA kaynaklı yapısal bozulma. İki kritik adım sistemin güvenilirliğ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Eylem Planı Tıbbi İnovasyon Araştırma Özel Projesi (23Y11901300), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171076) ve Şanghay Belediye Eğitim Komisyonu (2023ZKZD18) tarafından desteklenmiştir. Profesör LZ'ye nazik hediyesi için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1300 Serisi Sınıf II, Tip A2 Biyolojik Güvenlik KabiniTermo Bilimsel
37 &derece; C/%5 CO2 inkübatörTermo Bilimsel
%4 Paraformaldehit (PFA)Hizmet biyografisiG1101-500ML
insan alüminyum RNALZ tarafından hediye edildi
Anti-tavşan ikincil antikor, Alexa Fluor 568 (keçi)Invitrogen Thermo ScientificA11011 Serisi
Applied Biosystems MicroAmp yapışkanlı optik kapakThermo Fisher Bilimsel
Applied Biosystems MicroAmp Optik 96 Kuyulu Reaksiyon PlakalarıThermo Fisher Bilimsel
Applied Biosystems ViiA 7 Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fisher BilimselKantitatif gen ekspresyonu analizi için gerçek zamanlı PCR sistemi
Sığır Serum Albümini (BSA, Fraksiyon V)BeyotineST023-50G
Carl Zeiss Primovert ters hücre kültürü mikroskobuZeissHücre morfolojisi izleme için
Santrifüj 5424 REppendorf Hakkında
KloroformSigmaRNA ekstraksiyonunda faz ayrımı.
Konfokal lazer tarama mikroskobu (LSM900+Hücre keşfi 7)Zeissİmmünofloresan belirteçlerinin (örneğin, ZO-1 ve F-aktin) yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi.
Costar 24/48/96 kuyucuklu plakaCorning
kapak kaymasıThermo Fisher Bilimselİmmünofloresan görüntüleme için 24 oyuklu plakada kullanılır.
DAPITermo62248
Dijital kuru banyoMulab
DMEM/F12GibcoRPE hücrelerini büyütmek için medya 
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu (D-PBS)PaylaşBiyografiSB-CR017 Serisi
Earle' Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS)GibcoRPE izolasyonu sırasında papain ve DNase I dilüsyonu için kullanılan dengeli tuz çözeltisi.
Etanol (Mutlak)SigmaRNA çökeltme ve kolon yıkama.
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaEksiksiz RPE hücre kültürü ortamı için
ForsepsDiseksiyon için
Lipofectamine 3000 (Katyonik Lipid Bazlı Transfeksiyon Reaktifi)Termo BalıkçıL300015Transfekte etmek için alüminyum RNA RPE hücrelerine
MatrigelCorning356234RPE yapışmasını ve polarizasyonunu desteklemek için kaplama plakaları için matris (%1,14 seyreltme).
Metanol İçermeyen FormaldehitTermo Bilimselİmmünofloresanda epitopları korumak için alternatif fiksatif (%4)
MikropipetEppendorf Hakkında
Nanodrop 2000 spektrofotometreTermo BilimselRNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçer
Nikon ECLIPSE Ti-S floresan Ters mikroskopNikonBoyanmış numunelerin floresan görüntülemesi
Olympus SZX16 stereomikroskopOlympusFare gözbebeklerinin diseksiyonu ve RPE izolasyonu için
Opti-MEMGibcoTransfeksiyon kompleksi hazırlama için düşük serumlu ortam
Papain ayrışma sistemiWorthingtonLK003150Çalışan enzim için
Penicillin-Streptomycin GibcoEksiksiz RPE hücre kültürü ortamı için
Pentobarbital sodyum tuzuSigmaÖtenazi ajanı
Phalloidin 488 Abcam176753Polarite değerlendirmesi için
PrimeScript RT reaktif KitiTakaraRR037AcDNA sentezi için ters transkripsiyon kiti (qPCR şablon hazırlama)
RNAsimple Toplam RNA KitiTIANGENDP419 SerisiRNA'yı çıkarmak için
TB Yeşil  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420A SerisiqPCR için
ZO-1 Tavşan Poliklonal AntikoruProtein teknolojisi21773Morfolojik değerlendirme için

Kaynaklar

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Alu RNA TransfeksiyonuPrimer Fare RPERPE DejenerasyonuEnzimatik İzolasyonİnflamatuar Sitokin SalınımıHücresel SenesansKantitatif PCRKronik İnflamasyon

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.