Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yerinde MTT Tabanlı Kriyoseksiyon Görüntüleme Kullanılarak Hepatosellüler Karsinom Dokusunda Metabolik Olarak Aktif Hücrelerin Tespiti

324 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

31 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, MTT tabanlı kriyoseksiyon görüntüleme kullanarak hepatosellüler karsinom dokusundaki metabolik olarak aktif hücreleri saptamak için basit bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, diğer doku veya organlardaki aktif hücreleri in situ olarak tespit etmek için de kullanılabilir.

Özet

Önceki çalışmalar da dahil olmak üzere ortaya çıkan kanıtlar, hepatoselüler karsinom (HCC) dokularında üstün metabolik aktivite ve stres direnci sergileyen bir hücre alt popülasyonunu vurgulamaktadır. Bu hücreler, tümör ilerlemesinin ve tedavi direncinin temel itici güçleridir. Bununla birlikte, yerinde canlı hücre tespiti için mevcut yöntemler genellikle doku bütünlüğünü tehlikeye atar, hücresel canlılığı değiştirir veya teknik olarak zorludur. Bu çalışma, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromürün (MTT) çözünmeyen formazan kristallerine mitokondriyal bağımlı indirgenmesi yoluyla HCC dokularındaki metabolik olarak aktif hücrelerin yerinde tespiti için yeni, basit, tahribatsız bir yaklaşım sunmaktadır. Doku fragman boyutunu (1 × 1 × 0.2cm3), kültür koşullarını (%20 FBS, 1 mg/mL MTT ve aralıklı girdaplı 3 saatlik inkübasyon) ve kriyoseksiyon parametrelerini (20 μm kalınlık, %4 PFA fiksasyonu ve DAPI karşı boyama) optimize ederek, canlı HCC hücrelerinin uzamsal haritalaması 5 saat içinde sağlandı. Bu uygun maliyetli protokol, özel bir ekipman gerektirmez ve doku mimarisini koruyarak yüzey bölgelerindeki yüksek canlılığa ve strese dayanıklı hücre kümelerinin mekansal olarak tanımlanmasına olanak tanır. Sınırlamalar arasında 6 saatin ötesinde ilerleyici canlılık kaybı ve kesit alma sırasında FBS takviyesi ve kontrollü dondurma yoluyla hafifletilebilen kristal yer değiştirmesi yer alır. Bu yöntem, tedaviye dirençli alt popülasyonların tek hücre izolasyonu için pratik bir platform sağlayarak HCC mikro çevre araştırmalarını ilerletir.

Giriş

Dünya çapında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni olan hepatoselüler karsinom (HCC), yüksek heterojenlik ve nüks oranları ile karakterizedir1. Bu uzamsal ve zamansal heterojenlik, tümör dokularındaki belirli hücre popülasyonlarını metabolizma, proliferasyon, ilerleme, stres toleransı ve ilaç direncinde diğerlerinden daha aktif hale getirir. HCC dokularındaki canlı hücrelerin yerinde tespiti, bu hücreler çoğalan alt klonları, tedaviye dirençli popülasyonları ve metastaz başlatan hücreleri kapsadığından derin klinik ve biyolojik öneme sahiptir. Bu tür canlı hücreler, tümör nüksü, bağışıklıktan kaçınma ve terapötik başarısızlığın kritik itici güçleri olarak hizmet edebilir2.

Bununla birlikte, mevcut uzamsal profilleme teknolojileri (örneğin, uzamsal transkriptomik) özel enstrümantasyon gerektirir ve yüksek maliyetlerle ilişkilendirilirken, geleneksel toplu analizler genellikle canlı hücrelerin uzamsal heterojenliğini ve stromal bileşenlerle dinamik etkileşimlerini gözden kaçırır3. Örneğin, rezeksiyon sonrası rezidüel canlı HCC hücreleri, ayrışmış hücre sistemlerinde aslına uygun olarak özetlenemeyen farklı metabolik profiller sergiler4. Bu nedenle, canlı tümör hücreleri ile mikro çevreleri arasındaki işlevsel karışmayı çözmek ve sonuçta hassas terapötik stratejilere bilgi sağlamak için mekansal olarak çözümlenmiş tespit teknolojilerinin geliştirilmesi zorunludur. Grubumuz tarafından HCC'deki canlı hücreleri tespit etmek için akış sitometrisi veya immünohistokimya (IHC) gibi geleneksel yöntemler kullanılmış olsa da, doku ayrışması veya fiksasyonu gerektirirler, böylece uzamsal bağlamı kaybederler ve hücre-hücre etkileşimlerinin analizini engellerler 5,6. Bu nedenle, canlı hücrelerin yerinde tespiti için tahribatsız, yüksek çözünürlüklü teknolojilerin geliştirilmesi, HCC direnç mekanizmalarının aydınlatılması ve hassas tedavilerin yönlendirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.

HCC dokularındaki canlı hücreleri yıkıcı tedavi olmaksızın in situ olarak hızlı bir şekilde tespit etmek ve görüntülemek için basit bir 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) bazlı doku kültürü yöntemi geliştirilmiştir. Kısaca, taze ince HCC dokuları (yaklaşık 1 × 1 × 0.2cm3) ilk olarak %20 fetal sığır serumu (FBS) ve MTT (1 mg/mL) içeren 3 saat boyunca DMEM ortamında kültürlendi. Daha sonra %4 paraformaldehit (PFA) fiksasyonu ve DAPI içeren montajdan sonra OKT'ye gömülü donmuş doku lamları (20 μm kalınlığında) parlak veya UV ışığı altında mikroskobik gözleme tabi tutuldu. Canlı hücreler mor, mor-kırmızı veya mor-siyah renk gösterecektir. Bu protokolü kullanarak, HCC dokularındaki canlı hücreleri 5 saat içinde başarıyla tespit ettik. Bu arada, bu yöntem 3D mikro mimariyi korur, aşağı akış çoklu omik analiziyle uyumludur ve basit, aynı zamanda zaman ve maliyet dostudur. Ancak bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Çok adımlı yıkama, kesit alma ve kültürleme işlemleri, dokularda, özellikle bu çalışmada HCC dokusu gibi yüksek metabolik örneklerde yapısal deformasyona ve apoptoza neden olabilir. Ek olarak, kriyoseksiyon dilimlerinin kalınlığının artması, mikroskobik gözlemlerin netliğini ve düzlüğünü tehlikeye atar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi ve Quanzhou Birinci Bağlı Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (No. FJMU IACUC2021257). HCC dokuları, hastalardan bilgilendirilmiş onam alınarak Fujian Tıp Üniversitesi'ne bağlı Quanzhou Birinci Hastanesi'nde cerrahi olarak çıkarıldı ve toplandı. Bu deney, laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık maske ve eldiven giymek de dahil olmak üzere standart koruyucu önlemler gerektirir.

1. Doku hazırlığı

  1. Buz üzerine steril 9 cm'lik bir Petri kabı yerleştirin. 30 mL buz gibi soğuk Fosfat Tampon Salin (PBS) ekleyin.
  2. Cerrahi olarak rezeke edilen insan HCC dokusunu derhal PBS'ye aktarın.
  3. Kan kirleticilerini gidermek için çanağı 5 saniye boyunca hafifçe döndürün. PBS'yi steril bir pipet kullanarak aspire edin.
    NOT: Üç kez tekrarlayın.
  4. Dokuyu Petri kabının kapağına aktarın.
    NOT: Mendiller, daha sonra daha iyi kullanım için ıslanmamış Petri kabı kapağına kolayca yapışır.
  5. Steril bir cerrahi bıçak kullanarak dokuyu yaklaşık 1 × 1 × 0,2cm3'lük parçalar halinde kesin (No. 11).
    NOT: Parçaların uzunluğu ve genişliği değiştirilebilir, ancak derinlik 0,2 cm'den az olmalıdır.
  6. Parçaları 30 mL buz gibi PBS ile doldurulmuş 9 cm'lik taze bir kaba geri koyun.
  7. Kan kirleticilerini gidermek için çanağı 5 saniye boyunca hafifçe döndürün. PBS'yi steril bir pipet kullanarak aspire edin.
    NOT: Adım 1.7'yi üç kez tekrarlayın. PBS'de (95 °C, 10 dakika) kaynatılan bir doku parçası negatif kontrol olarak ayarlandı. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin.

2. Doku kültürü

  1. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna glikoz (nihai konsantrasyon = 4.5 g/L) ve L-glutamin (nihai konsantrasyon = 2 mM) içeren 1.8 mL tam kültür ortamı DMEM (37 °C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin. Ardından, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,6 mL FBS (nihai konsantrasyon = %20 v/v) ve 0,6 mL MTT stoğu (nihai konsantrasyon = 1 mg/mL) ekleyin.
  2. Doku parçalarını steril forseps kullanarak kuyucuklara aktarın.
  3. 6 oyuklu plakayı inkübatöre yerleştirin. %5 CO2 ile 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
    NOT: Plakayı her 3 dakikada bir 30 saniye boyunca hafifçe döndürün. Doku parçalarının yüzeyi mor veya mor-siyaha döndüğünde inkübasyon sonlandırılabilir.

3. Sonlandırma ve sabitleme

  1. MTT ortamını aspire edin. Doku parçalarını buz gibi tuzlu su ile yıkayın.
    NOT: Beş kez tekrarlayın.
  2. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2 mL %4 nötr tamponlu formalin (NBF) ekleyin.
  3. Plakayı 4 °C'de 1 saat buzdolabına koyun.

4. Kriyoseksiyon

  1. Parçaları temiz emici kağıt üzerine nazikçe kurulayın.
  2. Dokuyu OCT bileşiği ile doldurulmuş bir kriyokalıba yerleştirin.
    NOT: Dokunun OCT bileşiği ile tamamen kaplandığından emin olun.
  3. Mendili düşük sıcaklıktaki bir buzdolabında -80 °C'de 20 dakika dondurun.
  4. Donmuş bloğu -20 °C'de bir kriyostat aynasına monte edin.
  5. Doku yüzeyi açığa çıkana kadar -20 °C'de 100 μm'lik kesitler kesin.
    NOT: Doku yüzeyi mor benzeri bir renklenme gösterir.
  6. Yapışkan kaplı slaytlar kullanarak 20 μm'lik dilimler toplayın.
    NOT: Doku dilimleri mor, mor-kırmızı veya mor-siyah tonlarında bulunmalıdır.
  7. Dilimleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde 2 dakika sabitleyin.
  8. Slaytları PBS ile 1 dakika boyunca nazikçe durulayın.
    NOT: Üç kez tekrarlayın.

5. Montaj

  1. DAPI içeren (son konsantrasyon: 1 μg/mL) montaj ortamını 1 damla uygulayın..
  2. Bir lamel ile örtün.
  3. Kenarları oje ile kapatın.
    NOT: Kenarları kapalı olan slaytlar, mikroskopi hemen yapılmazsa karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.

6. Mikroskopi

  1. Parlak alan mikroskobu kullanarak parlak alan altında ×20 büyütmede mor, mor-kırmızı veya mor-koyu formazan birikintilerini (canlı hücreler) görselleştirin.
  2. Floresan mikroskobu kullanarak UV aydınlatması altında mavi DAPI'yi (çekirdekleri) tespit edin.
  3. Uzamsal korelasyon için parlak alan ve floresan kanallarını birleştirin.
    NOT: Burada kullanılan yazılım NIS Element F'dir (sürüm 4.00.06).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma, doku mimarisini bozmadan HCC dokusundaki metabolik olarak aktif hücreleri başarıyla tespit etti. İlk olarak, parlak alan görüntüleri (Şekil 1A), doku yüzeyinin yoğun hücresel kapsama alanı ve slayt boyunca çok katmanlı hücre istiflenmesi sergilediğini gösterdi ve bu da kültür ve işleme boyunca HCC dokusunun korunmuş mimari bütünlüğünü doğruladı. Özellikle, yüzeysel bölgelerdeki hücre kümeleri, canlı hücre popülasyonlarında mitokondriyal aktivitenin göstergesi olan farklı mor-kırm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yerinde canlı hücre tespiti için mevcut metodolojiler hala çok yönlü sınırlamalarla karşı karşıyadır. Proliferasyon belirteçlerini veya apoptozla ilişkili proteinleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılan IHC ve immünofloresan (IF), formaldehit fiksasyonunun neden olduğu membran bütünlüğünün bozulmasındanmuzdariptir 7. Ayrıca, kalın doku kesitlerinde antikor penetrasyonu optimalin altındadır8. Calcein-gibi floresan canlılık prob...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Fujian Tıp Üniversitesi'nin Bilimsel Araştırma Başlangıç Fonu (2021QH1240) olan Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 3502Z20227197) tarafından finanse edilmiştir. Teknik yardımları için Xianying Zhang, Jingjing Zhou ve Shaocong Weng'e (Huaqiao Üniversitesi) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
-80 ve derece; C dondurucu (dik)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Temiz tezgah (dikey laminar akış)AIRTECHSW-CJ-1FD
CO2 kuluçka makinesi (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (örneğin, 51030400 / 51033559)
Coverslip (24 kez; 50 mm, #1.5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Kültür Petri kabı (90 mm)YUVA752001 (örnek)
DAPI içeren montaj ortamıBeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (yüksek glikoz, piruvat ile)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (Nitelikli, ABD kökenli)Invitrogen (Gibco)A3160501
Floresan mikroskopNikonECLIPSE Ti2 serisi
Dondurma mikrotomu (kriyostat)LeicaCM1950
Mikroskop slaytları (sade, 25 kez; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
MTT reaktifi (toz)BeyotimeST316
Tırnak ojesi (şeffaf)Beyotime—
NBF (Nötr Tamponlu Formalin)Beyotime—
OCT bileşiğiSAKURA (Sakura Finetek)4583
Optik mikroskop (dik)NikonECLIPSE Ci serisi (örneğin, Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, PBS'de %4 (fiksative)BeyotimeP0099
Pipet ucu (1 mL, düşük bağlı)KIRGENKG1313-L
Pipet ucu (200 & mikro; L)Axygen (Corning)T-200-Y (toplu) / T-200-Y-R-S (raflı, steril)
Pipettor (tek kanallı)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (menzile özgü kedi#)
NeşterHİSTIKModel değişkenlik gösterir (örneğin, tedarikçi referansı 100022208326)
CımbızHİSTIKModel değişkenlik gösterir

Kaynaklar

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

MTT G r nt lemeCanl H cre HaritalamaT m r Mikro evresiTerapi DirenciFormazan KristalleriTek H cre zolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.