Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Renal Arteriyel Dallarının Çok Düzeyli Mikrodiseksiyonu ve Fonksiyonel-Yapısal Profillemesi

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

Bu makalede

Özet

Bu makale, insan renal arter dallarının izolasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için adım adım bir protokol sunmakta ve farmasötik geliştirme için klinik öncesi çalışmaları kolaylaştırmaktadır.

Özet

Renal vasküler disfonksiyon, akut böbrek hasarı, renal iskemi ve hipertansiyon dahil olmak üzere birçok klinik durumun patogenezinde kritik bir rol oynar ve klinik yönetimde önemli zorluklar sunar ve hasta sonuçlarını olumsuz etkiler. İntrarenal arterlerin izolasyonu ve fonksiyonel karakterizasyonu, özellikle böbrek hasarı ile ilişkili renal vasküler disfonksiyonun altında yatan mekanizmaların aydınlatılması ve hedefe yönelik terapötik gelişimin yönlendirilmesi için çok önemlidir. Klinik önemine rağmen, farklı dallanma seviyelerinde insan intrarenal arterlerini izole etmek ve fonksiyonel olarak değerlendirmek için standartlaştırılmış yaklaşımlar az gelişmemiştir. Bu protokol, intrarenal arter dallarının sistematik izolasyonu ve multimodal değerlendirmesi için hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında fonksiyonel ve yapısal değerlendirmeleri içeren kapsamlı bir çerçeve sağlar. Metodoloji üç temel bileşeni kapsar: (1) yapısal doğrulama için Hematoksilen-Eozin (H & E) boyaması ile birlikte donör böbreklerden intrarenal arterlerin hassas anatomik tanımlanması ve mikrodiseksiyonu; (2) ölçüm tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini artırmak için tel miyografisinde titiz normalizasyon prosedürleri; ve (3) hassas tel miyografi teknikleri kullanılarak vazomotor yanıtların kantitatif analizi. Normalizasyon, arteriyel segmentlerin artımlı gerilmesinin, aktin-miyozin örtüşmesini en üst düzeye çıkarmak için optimal bir dinlenme gerilimi oluşturduğu ve böylece pik kasılma tepkilerini ortaya çıkardığı kas uzunluğu-gerilim ilişkisine dayanır. Tel miyografide, izole edilmiş damar segmentleri iki paralel tel arasına asılarak damar gerginliğinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu teknik, titiz normalizasyon protokolleri uygulayarak, çeşitli patofizyolojik durumlar ve farmakolojik müdahaleler arasında vasküler reaktivitenin tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Giriş

Böbrek, metabolik atıkların temizlenmesi, elektrolit dengesi ve sıvı regülasyonu yoluyla insan homeostazını korumaktan sorumlu hayati bir organdır - son derece yüksek kan akışı gerektiren işlevler. Fizyolojik koşullar altında, böbrekler her dakika kalp tarafından pompalanan toplam kan hacminin yaklaşık% 25'ini alır (kalp debisi), sistemik kan akışındaki önemli rollerini ve genel fizyolojik dengenin korunmasında böbrek perfüzyonunun kritik önemini vurgular1. Renal arteriyel sistem, sistemik hemodinamik değişikliklere uyum sağlarken GFR'yi korumak için bu büyük kan dağıtımını hassas bir şekilde düzenler. Sonuç olarak, renal perfüzyon bozukluğu, akut böbrek hasarı ve renal iskemi gibi durumlarda glomerüler filtrasyon hızının (GFR) azalmasına katkıda bulunan kritik bir patolojik mekanizmayı temsil eder. Ek olarak, sıklıkla şok, kardiyak disfonksiyon ve sepsis dahil olmak üzere renal kan akışını bozan sistemik bozukluklara ikincil olarak ortaya çıkar 2,3,4,5. Renal arter, böbrek içinde sıralı dallanmaya uğrar ve önce medüller piramitler arasındaki renal sütunlardan geçen interlobar arterlere bölünür. Kortikomedüller bileşkeye ulaştıktan sonra, bu damarlar korteks ve medulla arasındaki sınır boyunca kemerli kavisli arterlere yol açar. Bu eğrisel damarlardan, kortikal parankima radyal olarak nüfuz eden interlobüler arterler ortaya çıkar ve sonuçta bireysel nefronları perfüze etmek için afferent arteriyoller yoluyla glomerüler kılcal damarlara kan iletir 1,6,7. İnterlobar, kavisli ve interlobüler arterler, böbrekteki anahtar direnç vaskülatürünü oluşturur ve intrarenal hemodinamiğin birincil düzenleyicileri ve basınç kontrolü olarak görev yapar 1,8. Bu damarların hassas izolasyonu ve karakterizasyonu, renal perfüzyon homeostazını yöneten temel mekanizmaların aydınlatılması için çok önemlidir9. Ayrıca, çeşitli patofizyolojik koşullar altında heterojen vasküler reaktiviteleri, böbrek koruyucu potansiyele sahip yeni vazodilatör ajanların geliştirilmesi için stratejik bir çerçeve sunmaktadır10,11.

Şu anda, klinik görüntüleme teknikleri (ör., ultrason) renal kan akışı değişikliklerini izlemek için rutin olarak kullanılmaktadır; Bununla birlikte, renal perfüzyonun önemli bir belirleyicisi olan renal vasküler gerginliği doğrudan değerlendirmek için temel araştırmalardaki deneysel metodolojiler sınırlı kalmaktadır 12,13,14,15. Tel miyografi sistemi, çapları 50 μm ile10 mm 16,19,20 arasında değişen, kan damarları, trakea 16,17,18 dahil olmak üzere in vitro küçük biyolojik dokulardaki gerilim değişikliklerini ölçen köklü bir deneysel platformdur. Tel miyografi hayvan çalışmalarında yaygın olarak uygulanmasına rağmen, vasküler yapı ve fonksiyondaki türler arası farklılıklar, kemirgen damarlarının insan vasküler fizyolojisini ne ölçüde temsil edebileceğini sınırlar21. Bu nedenle, insan intrarenal arterlerinin çeşitli anatomik seviyelerde (interlobar, arkuat ve interlobüler) hassas bir şekilde tanımlanması ve izolasyonu, fizyolojik özelliklerinin yanı sıra hastalıkla ilgili fonksiyonel değişiklikler ve patolojik yaralanma mekanizmaları hakkında kapsamlı in vitro araştırmalara olanak sağlamak için çok önemlidir. Çeşitli vazoaktif bileşikler kullanılarak yapılan farmakolojik müdahalelerle birleştirildiğinde, bu sistem izole arteriyel halkalardaki vazokonstriksiyon/vazodilatasyon yanıtlarının dinamik değerlendirmesine ve kantitatif kaydına izin vererek, kontrollü deneysel koşullar altında vasküler reaktiviteyi araştırmak için güçlü bir araç sağlar 19,22,23.

Bu protokol, insan intarenal arter dallarının (interlobar, arkuat ve interlobüler arterler) hassas anatomik lokalizasyonu ve mikrodiseksiyonu için kapsamlı bir metodolojiyi detaylandırır, ardından vazoaktif ilaçlara karşı diferansiyel reaktivitelerini değerlendirmek için in vitro vasküler gerginlik izleme sistemi kullanılarak fonksiyonel karakterizasyon, böylece bu vasküler segmentler arasında hem yapısal hem de fonksiyonel ayrımlar oluşturur. Anatomik lokalizasyonu farmakolojik reaktivite profillemesi ve histopatolojik analiz ile birleştirerek, vazoaktif ajanlara bölgeye özgü vasküler yanıtların kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan bir ex vivo platform oluşturuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan protokol ve örnekler, Pekin Üniversitesi Birinci Hastanesi Üroloji Bölümü tarafından gözden geçirilerek onaylanmıştır (onay No. 2023yan500-002) ve Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüştür. Tüm katılımcılar katılımdan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler.

1. Çözelti hazırlama

  1. 119.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 25.0 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4 ve pH 7.4'te 11.0 mM D-glikoz içeren Krebs-Ringer çözeltisi (Krebs) hazırlayın.
  2. 64.0 mM NaCl, 60 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 25.0 mM NaHCO3, 1.2 mMKH2PO4 ve pH 7.4'te 11.0 mM D-glikoz içeren yüksek potasyum tuzu çözeltisi (60K +) hazırlayın.

2. Reaktif hazırlama

NOT: İlaçları teslim aldıktan hemen sonra Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) verilen ayrıntılara göre saklayın.

  1. 167.21 mg fenilefrini 10 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek fenilefrini (Phe, stokta 10-1 M) hazırlayın. Stok çözeltisini -80 ° C'de saklayın, kullanım gününde çalışma konsantrasyonu olarak 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M'ye seyreltin.
  2. 18.166 mg asetilkolini 10 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek asetilkolini (ACh, stokta 10-2 M) hazırlayın. Stok çözeltisini -80 ° C'de saklayın, kullanım gününde çalışma konsantrasyonu olarak 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M'ye seyreltin.

3. Böbrek dokusu toplanması ve intrarenal arter izolasyonu

  1. Renal hücreli karsinom tanısı konan yetişkin hastaları, histolojik olarak preoperatif çekirdek iğne biyopsisi veya intraoperatif frozen kesit ile doğrulandığı şekilde işe alın.
    NOT: Radikal nefrektomi planlanan hastalar, cerrahi spesimenleri tümör sınırlarının distalinde bulunan sağlam intrarenal arter segmentlerine erişim sağladığı için özel olarak seçilir. Bu segmentler hassas bir şekilde diseke edilebilir ve izole edilebilir, bu da malign dokudan müdahale olmadan insan renal vasküler fizyolojisinin ayrıntılı çalışmasına izin verir. Histolojik doğrulama, karsinomun doğru bir şekilde tanımlanmasını ve tümör sınırlarının net bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak deneysel araştırmalar için normal, tümörsüz arteriyel segmentlerin seçimini kolaylaştırır.
    1. Vasküler fonksiyon üzerinde kafa karıştırıcı etkilerden kaçınmak için önemli komorbiditeleri (hipertansiyon, diabetes mellitus veya diğer sistemik hastalıklar) olan hastaları hariç tutun, böylece fizyolojik değerlendirmelerin güvenilirliğini ve alaka düzeyini artırın.
      NOT: Bu deney için örnekler, Pekin Üniversitesi Birinci Hastanesi'nde radikal nefrektomi planlanan hastalardan toplanmıştır.
  2. Radikal nefrektomi sırasında, yeni eksize edilmiş insan böbrek örneklerini toplayın ve doku canlılığını korumak için hemen buz gibi soğuk Krebs solüsyonuna daldırın. Arteriyel diseksiyon için sadece tümör sınırlarının distalinde makroskopik olarak normal görünen bölgeler tutulur (Şekil 1A).
    NOT: Optimal intrarenal arter izolasyonu için, radikal nefrektomi sırasında bitişik sağlıklı doku, tam kalınlıkta bir kortikomedüller kama olarak toplanmalı, böylece kortikalden medüller vaskülatüre kadar tüm arter ağacı korunmalıdır.
    1. Eksize edilen dokuyu hemen 200 mL soğuk Krebs solüsyonunda saklayın. Kabı buzun üzerine yerleştirin ve yalıtımlı bir soğutucu torba içinde, toplandıktan sonra 2 saat içinde laboratuvara taşıyın. Sonraki diseksiyon ve fonksiyonel analiz için canlılığı ve yapısal bütünlüğü korumak için dokunun taşıma boyunca tamamen su altında kaldığından emin olun.
      NOT: Doku canlılığını ve fizyolojik fonksiyonunu korumak için, tüm izolasyon ve ardından 4 ° C'de Krebs çözeltisinde depolama işlemi 6 saat içinde tamamlanmalıdır24,25,26,27. Solüsyon, kan bileşenlerinin vasküler lümenden temizlenmesini kolaylaştırırken, oksijenasyonu ve doku canlılığını korumak için prosedürler sırasında düzenli olarak değiştirilmelidir.
  3. Renal hilusu bularak ve kesimi hem renal pelvis hem de lateral dışbükey sınırdan geçecek şekilde hizalayarak koronal düzlemi görsel olarak tanımlayın. Steril bir neşter kullanarak, iki simetrik yarım oluşturmak için böbreği koronal düzlem boyunca ikiye bölün. Bu yaklaşım, renal piramitler ve sütunlar dahil olmak üzere iç mimariyi ortaya çıkararak, intrarenal arterlerin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve ardından diseksiyonunu kolaylaştırır (Şekil 1A).
    NOT: Renal arterlerin ayrılmasını kolaylaştırmak için, daha fazla kan damarını açığa çıkarmak için önce renal pelvisin bir kısmı, renal piramitler ve kesit yüzeyindeki yağ çıkarılmalıdır (Şekil 1B). Kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.
  4. Stereomikroskop altında, 10 cm'lik siyah tabanlı bir kültür kabında mikro diseksiyon makası ve forseps kullanarak interlobar, kavisli ve interlobüler arterleri titizlikle ayırın (Şekil 1C).
    NOT: İnsan böbreğinde, interlobüler arter, ortalama çapı yaklaşık 1-2 mm olan üç arteriyel dal 1,8 arasında en kalın damar duvarına sahip böbrek piramitleri boyunca uzanır. Kortikomedüller bileşkede, interlobar arter kavisli artere geçer ve kortikomedüller sınır boyunca ortalama çapı yaklaşık 500 μm olan yarı dairesel bir yay oluşturur. Kan damarları ayrıca, interlobüler arter olan renal kortekse dallanır ve üçü arasında en ince vasküler duvar ve en küçük çap, yaklaşık 200 μm (Şekil 1C). Ayrıca, üç vasküler dalı ayırt ederken, anatomik lokalizasyon, mutlak vasküler çap ölçümlerinden daha kritik bilgi sağlar 1,8.
    1. Arterlerdeki tüm dokuları ve yağları nazikçe çıkarın, bunları 10 cm'lik siyah tabanlı bir kültür kabında iyice temizlediğinizden emin olun (Şekil 1B).
  5. Aşağıdaki deneyler için izole edilmiş renal arterleri (interlobüler, kavisli ve interlobar arterler) kullanın:
    1. İzole edilmiş dokuları, parafin gömme ve histolojik kesitleme için uygun olan yaklaşık 3 mm'lik standart bir uzunluğa dikkatlice budayarak histolojik işleme için arteriyel segmentler hazırlayın. Doku morfolojisini korumak için her numuneyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 mL %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. Fiksasyondan sonra, yerleşik histolojik protokollere göre sonraki hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için standart dehidrasyon, temizleme ve parafin gömme protokolleri ile işlem yapın (Şekil 2).
      NOT: Potansiyel histolojik değerlendirmeler için, numuneler, yerleşik histolojik protokolleregöre kollajen birikimini değerlendirmek için Masson'un trikrom boyamasına veya elastik lif görselleştirmesi için Verhoeff-Van Gieson (EVG) boyamasına tabi tutulabilir 28,29.
    2. Vasküler fonksiyon çalışmaları için, intrarenal halkaları test edilene kadar buz gibi soğuk Krebs solüsyonunda saklayın. Arteriyel halkalar tamamen suya batırılmalıdır.
      NOT: Western blot/qPCR gibi sonraki moleküler tahliller için, diseksiyondan hemen sonra taze numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun, ardından RNA bütünlüğünü korumak ve protein bozulmasını önlemek için daha önce yayınlanmış prosedürleri izleyerek -80 °C'de saklayın30,31.

4. Arteriyel halka montajı

  1. İnterlobar, kavisli ve interlobüler arteri farklı anatomik pozisyonlarına (Şekil 1C) ve çap aralıklarına (Şekil 2) göre tanımlayın, ardından vasküler fonksiyon çalışmaları için mikrodiseksiyon makası kullanarak bunları dikkatlice yaklaşık 2 mm uzunluğunda halkalara ayırın (Şekil 3A).
    NOT: Fonksiyonel teste kadar her izole edilmiş arteriyel halkayı hemen 5 mL buz gibi soğuk Krebs solüsyonunda ayrı ayrı saklayın. Fonksiyonel test için, temiz dikey kesimlerle 1.5-2.0 mm uzunluğunda dallanmamış vasküler halkaları seçin. Montaj zorluklarını önlemek için 2.0 mm'yi aşan halkaları veya dengesiz gerilim kayıtlarını önlemek için 1.5 mm'nin altındaki halkaları hariç tutun.
  2. Adım 4.1'de belirtildiği gibi tüm arteriyel halkaları (interlobar, kavisli ve interlobüler arterlerden ayrı ayrı) hazırlayın ve hem Krebs hem de 60K + çözeltilerini oda sıcaklığına getirin. Ardından bağlı bilgisayarı ve ardından tel miyograf sistemini açın ve deneylere devam etmeden önce tüm bileşenlerin doğru şekilde başlatıldığından emin olun.
  3. Arteriyel halkaları tel miyograf odalarına monte etmeden önce, temizliği sağlamak ve artık maddeleri ortadan kaldırmak için her odayı 5 mL Krebs solüsyonu ile iki kez durulayın, ardından her hazneye 5 mL Krebs solüsyonu ekleyin.
    1. Miyografın yerleşik sıcaklık kontrol sistemini kullanarak çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın. Eşzamanlı olarak, deney sırasında uygun oksijenasyonu ve pH dengesini korumak için çözeltiyi bağlı bir gaz hattı üzerinden gazla (%95O2 ve %5 CO2 karışımı) sürekli olarak havalandırın.
  4. Her bir arteriyel halka için 40 μm çapında 3 cm uzunluğunda iki kılavuz tel hazırlayın ve izole edilmiş arteriyel halkaları dikkatlice Krebs solüsyonu içeren 10 cm'lik başka bir siyah tabanlı kültür kabına aktarın.
    NOT: Farklı çaplardaki kan damarları için farklı çaplarda kılavuz teller seçilmelidir. Çapı yaklaşık 100 μm veya daha az olan arteriyel halka için 15 μm'lik bir kılavuz tel gereklidir; çap 100 μm ile 200 μm arasındaysa, 25 μm'lik bir kılavuz tel kullanılır; Çap 200 μm'den büyükse, 40 μm'lik bir kılavuz tel kullanılabilir. Deneyin tutarlılığı için, tek bir deney içinde aynı tipteki tüm kaplar için aynı çapın kullanılması önerilir. 19.
  5. İlk kılavuz teli tabağın içindeki arteriyel halkaya dikkatlice yerleştirin, kılavuz telin bir tarafını 90° bükün ve ardından cl'ye sabitlemek için hazneye aktarın.amp tipi s'yi kullanarakamp tipi s'yi kullanınamp saat yönünde vida sıkma için alet tarafından sağlanan özel vidaları kullanın amp tutucu (Şekil 3B).
    NOT: Kılavuz tel, numune tutucuya monte edilirken arteriyel halkanın transferi sırasında yapısal destek sağlamak için yerleştirilir ve kullanım kaynaklı hasarı veya bozulmayı en aza indirir.
  6. Arteriyel halkayı tutucuya sabitlemeden önce, damar uzunluğunu ve genişliğini kaydedin. Arteriyel halkayı iki tutucu arasına yerleştirin (Şekil 3C) ve 1 ölçeğin 10 μm'yi temsil ettiği mikrometre ölçeğini okuyun. Arteriyel halkanın uzunluğunu ve genişliğini belirlemek için tutucular birbirine zar zor dokunduğunda ölçülen ölçek değerini çıkarın (Şekil 3D).
  7. Kan damarından başka bir kılavuz tel geçirin ve son olarak diğer tarafa sabitleyin. Kılavuz teli her iki taraftaki sabitleme vidalarının etrafına saat yönünde sarın ve numune tutucu yüzeyine sıkıca takıldığından emin olun.
    NOT: Tüm fiksasyon işlemi sırasında, vasküler endotelyuma zarar vermemek için kan damarını çekmekten veya kan damarının iç duvarını kılavuz tel ile çizmekten kaçınmak gerekir. Kılavuz tel, sabitleme vidasının etrafına üst üste binmeden tek bir tabaka halinde sarılmalıdır. İki kılavuz tel aynı yatay düzlemde olmalı, birbirine paralel olmalı ve birbiriyle kesişmemelidir. Ek olarak, kılavuz teli sabitledikten sonra, her iki taraftaki numune tutucuyu daha yakın ayarlayın; bununla birlikte, Şekil 3E ve Şekil 3F'de gösterildiği gibi, kuvvetten kaçınmak için fiilen temas etmeden birbirlerine yakın olmalıdırlar.
  8. Hazneyi tel miyograf sistemine geri takın. Ardından kapağı kapatın ve gazı havalandırın. Sensörü bağlayın ve vasküler gerginlik testi için veri toplama yazılımını açın.

5. Optimum başlangıç gerilimi tayini için gemiye özel normalizasyon

NOT: Maksimum kasılma tepkisi için optimum dinlenme gerilimi olarak tanımlanan kararlı temel koşulların oluşturulması, tekrarlanabilir fonksiyonel ölçümler için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, bireyler arası doğal fizyolojik farklılıklar nedeniyle, insan kan damarları, hayvan kan damarlarına kıyasla temel mekanik özelliklerde daha fazla değişkenlik gösterir 32,33,34,35,36. Bu faktörler, içsel vasküler heterojenite ile birleştiğinde (ör., çap, duvar kalınlığı ve kasılma özelliklerindeki yapısal ve fonksiyonel eşitsizlikler), toplu olarak temel gerilimde önemli değişikliklere yol açar. Bu nedenle, deneysel tekrarlanabilirliği sağlamak için, her kan damarının ayrı ayrı normalleştirilmesi önerilir. Tel miyograf sistemi, her bir kap için temel gerilimin hassas bir şekilde belirlenmesini sağlayan özel bir normalizasyon modülü içerir.

  1. Arteriyel halkaları 4.1 ila 4.8 adımlarında açıklandığı gibi odaya monte edin. Grafik kaydına başlayın, kanalı sıfırlayın (Şekil 4A), en az 30 dakika stabilizasyona izin verin, ardından normalleştirmeye devam etmeden önce kanalı tekrar sıfırlayın.
  2. DMT menüsünden Normalleştirme Ayarları'nı seçin (Şekil 4B) ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın (Şekil 4C):
    1. Göz merceği kalibrasyonu (mm/div): 1; Hedef basınç (kPa): 13.3; IC1/IC100: 0.9; Çevrimiçi ortalama alma süresi (saniye): 3; Gecikme süresi (saniye): 60.
      NOT: IC1, maksimum aktif kuvvet üretiminde iç damar çevresini belirtirken, IC100, 100 mmHg transmural basınca karşılık gelen çevreyi temsil eder. İnsan renal arterleri, IC1/IC100 oranlarının deneysel olarak belirlenmesi ve yeniden kullanılması için tutarlı vasküler özelliklere sahip hayvan modellerinin aksine, standardizasyon gerektiren önemli örnekler arası değişkenlik sergiler. Bireysel insan örnekleri arasındaki kap çapı, duvar kalınlığı ve mekanik özelliklerdeki önemli farklılıklar nedeniyle, her bir kap, benzersiz temel özelliklerini belirlemek için bağımsız normalizasyondan geçmelidir. Bu nedenle 0,9 oranı, burada protokol başlatma için bir yer tutucu olarak oluşturulmuştur ve bu protokolde pratikte kullanılmamıştır.
  3. Hedef artere karşılık gelen kanalı seçin ve DMT menüsünden normalizasyon ekranını açın (Şekil 4C), uygun verilerle doldurun:
    1. Doku uç noktaları: a1 0 olmalı, a2 damarın uzunluğu olmalıdır (mm cinsinden); tel çapı: 40 μm (kullanılan telin çapını girin); mikrometre okuma: mikrometre ölçeğindeki değer, noktayı kaydetmek için Nokta ekle'ye tıklayın.
  4. Hazır olduğunuzda, ilk noktayı kaydetmek ve normalleştirme prosedürünü başlatmak için Nokta ekle'ye tıklayın.
  5. Pasif germe uygulayın, 3 dakika bekleyin, bir sonraki nokta olarak mikrometre okumasını girin, ardından potasyum aracılı bir damar kasılmasını ortaya çıkarmak için 5 mL 60K+ ekleyin (Şekil 5).
  6. Kasılma bir platoya ulaşana kadar bekleyin. Ardından, 60K + çözeltisini 5 mL Krebs çözeltisi ile 3 kez yıkayın ve potasyumla aktive edilen kuvvetten her gerilmedeki pasif kuvveti çıkararak izden aktif kuvvet verilerini hesaplayın (Şekil 5).
  7. Aktif kuvvet maksimuma ulaşana kadar 5.5 ila 5.6 arasındaki adımları ("Germe-60K+ stimülasyon-Yıkama" adımları) tekrarlayın, ardından kabın aktif kuvvet üretiminin maksimum olduğu optimum temel gerilimi belirleyin (Şekil 5).
  8. Deneyin sonraki adımlarına geçmeden önce odadaki arteriyel halkayı 10 dakika boyunca dengeleyin.

6. Renal arter halkası reaktivitesinin tespiti

  1. Deney başlamadan önce her odadaki Krebs hacminin 5 mL olduğundan emin olun.
  2. Fenilefrin kaynaklı konsantrasyona bağlı kasılmayı değerlendirmek için, yarım günlük artışlarla (10-9 ila 10-4 M) kümülatif Phe uygulayın37.
  3. En düşük fenilalanin konsantrasyonu (10-9 M) ile başlayın. 5 mL Krebs tamponu içeren hazneye 5 μL Phe stoğu (10-6 M) ekleyin, kasılma stabilize olana kadar (2-3 dakika değişmemiş gerginlik) sürekli izleyin ve bekleyin, noktayı işaretleyin, ardından bir sonraki konsantrasyonu yarım günlük bir artışla ekleyin. Son konsantrasyona (10-4 M) ulaşana kadar tekrarlayın ve baştan sona tutarlı izlemeyi sürdürün (Şekil 6).
  4. Ek ilaç testi için, gerginlik taban çizgisine dönene ve en az 10 dakika boyunca stabil kalana kadar hazneyi en az 5 mL ılık 5 mL Krebs solüsyonu ile yıkayın.
  5. Asetilkolinin neden olduğu konsantrasyona bağlı vazodilatasyonu değerlendirmek için, kümülatif ACh'yi yarım günlük artışlarla (10-8 ila 10-5.5 M) uygulayın.
    NOT: Normal vaskülatürde, asetilkoline (ACh) yanıt, endotel bütünlüğünün37,38 fonksiyonel bir göstergesi olarak işlev görür. ACh'ye vazodilatör yanıt, sağlıklı damarlarda NO aracılı gevşeme yoluyla endotel fonksiyonunu yansıtır. Bununla birlikte, patolojik koşullar altında, bozulmuş nitrik oksit (NO) biyoyararlanımı ve / veya değişmiş reseptör sinyal yolları nedeniyle bu yanıt zayıflatılabilir veya ortadan kaldırılabilir.
  6. 10-4 M Phe ile ön sözleşme yapın, 5 mL Krebs tamponu içeren hazneye 5 μL Phe stoğu (10-1 M) ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. En düşük ACh konsantrasyonundan başlayarak, 5 mL Krebs tamponu içeren odaya 5 μL Ach stoğu (10-5 M) ekleyin, vazodilatasyon yanıtını sürekli olarak izleyin ve bekleyin (sürekli iz tespiti ile onaylanır), noktayı işaretleyin, ardından bir sonraki konsantrasyona geçin. Hepsi test edilene kadar tekrarlayın (Şekil 7).
  7. Dosyayı kaydederek ve arteriyel halkaları çıkararak deneyi tamamlayın. 10 mL %8 asetik asit solüsyonu ile 3 dakika inkübe ederek hazneyi iyice temizleyin, ardından 3 kez 10 mL su ile durulayın. Daha sonra, 10 mL% 95 etanol içinde 3 dakika inkübe edin ve 3 kez 10 mL su ile tekrar durulayın. Son olarak, hem ısıtıcıyı hem de gazı kapatın ve gazı kapatmadan önce tüm sıvının çıkarıldığından emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsan böbreğinde, interlobar arter, karşılık gelen damarı ile birlikte böbrek piramitleri arasında uzanır. Nispeten kalın bir vasküler duvar ve önemli yağ dokusu kaplaması ile karakterize edilen bu arter, özellikle dikkatli bir diseksiyon gerektirir. İzolasyon işlemi sırasında aşırı kuvvet uygulamamak için çevredeki yağ dokusu titizlikle çıkarılmalıdır (Şekil 1C).

Kavisli arter anatomik olarak kortikomedüller bileşkede konumlandırılmıştır ve böbrek piramitlerinin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Renal perfüzyon stabilitesi hem kritik bir terapötik hedef hem de hemodinamik patofizyolojiye açılan bir pencere olarak hizmet eder39,40. Taze nefrektomi örneklerinden insan renal arterlerinin hiyerarşik izolasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için mevcut metodolojilerdeki önemli boşlukları ele alan bir protokol sunuyoruz. Kadavra örnekleri veya hayvan modelleriyle sınırlı mevcut yaklaşımların aksine, tekniğimiz hem morfolojik ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmaya katıldıkları için gönüllülere teşekkür eder ve ayrıca Pekin Üniversitesi Birinci Hastanesi Üroloji Bölümü'ndeki cerrahi personele böbrek dokusu sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma Pekin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (F251013'dan Y. Z.'ye, 7232096'dan Y. L.'ye); Çin Ulusal Bilim Vakfı (82325004, 92168114 Y. Z.'ye, 82170422 Y. L.'ye); Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 - NZ, 2021YFF0501404 - YL, 2023YFC2415500 - LY); Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Devlet Vasküler Homeostaz ve Yeniden Modelleme Anahtar Laboratuvarı Araştırma Projesi (Pekin Üniversitesi; 2024-VHR-SY-07 - YZ); 2023 Pekin Belediye Sağlık Komisyonu Başkent Tıp Bilimi ve Teknolojisi İnovasyon Başarı Dönüşümü Mükemmel Tanıtım Programı Projesi (YC202301QX0162 L.Y.); Ulusal Üst Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu (Pekin Üniversitesi Birinci Hastanesi Bilimsel ve Teknolojik Başarılar Dönüşüm Kuluçka Rehberlik Fonu Projesi, 2024CX24 - LY).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetilkolin klorürSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlmanyaA6625 Serisi
Siyah tabanlı kültür tabağıDanimarka Myo Technology, Aarhus, Danimarka300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA501330
D-glikozSangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA610219
Dumont forsepsDanimarka Myo Technology, Aarhus, Danimarka300413
Geuder diseksiyon makasıDanimarka Myo Technology, Aarhus, Danimarka400431
Kılavuz telDanimarka Myo Technology, Aarhus, Danimarka400447Çap 40 &mikro; m
KartalSangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA100781
LabChart Professional sürüm 8.3 ADInstruments, Avustralya-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA100288
Çoklu miyograf sistemi Danimarka Myo Technology, Aarhus, Danimarka620 DK.
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA100865
FenilefrinSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlmanyaP6126

Kaynaklar

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikrodisseksiyon TekniğiTel MiyografisiVasküler Disfonksiyonİntrarenal Arter İzolasyonuVazomotor YanıtlarKas Uzunluk-Gerilim İlişkisiHematoksilin Eozin BoyamaFenilefrin KontraksiyonuArteriyel Normalizasyon
İnsan Renal Arteriyel Dallarının Çok Düzeyli Mikrodiseksiyonu ve Fonksiyonel-Yapısal Profillemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.