Belirli Bir Bölgede Translasyon Sonrası Modifikasyon Seviyelerinin Hızlı İn vitro Aşağı Regülasyonu için İnhibe Edici Peptitin Tasarımı ve Uygulaması

Özet

Burada, translasyon sonrası modifikasyon inhibe edici bir peptit olan TAT-PIP'in tasarım özelliklerini, kalite kontrol standartlarını ve fonksiyonel doğrulama sistemini özetleyen bir protokol sunuyoruz.

Özet

Proteinler, yaşam aktivitelerinin birincil yürütücüleridir ve transkripsiyonel, translasyonel ve translasyon sonrası modifikasyon (PTM) seviyelerinde düzenlenir. Ayrıca, PTM, protein aktivitelerini düzenlemek için daha karmaşık bir mekanizmayı temsil eder, çünkü bir protein genellikle çeşitli PTM tiplerine ve belirli bir PTM için birden fazla bölgeye sahiptir. Plazmid transfeksiyonu veya lentivirüs ve adenovirüs, tanımlanan tüm bölgeler arasında işlevsel olarak önemli PTM bölgesinin ilk taramasında kullanılabilir; Bununla birlikte, bu yöntemler her zaman hücre ve doku girişinde düşük verimlilik, zaman alıcı ve yüksek maliyetler, potansiyel bağışıklık reaksiyonu vb. gibi zorluklarla karşı karşıyadır. Bunu ele almak için, yakın zamanda TAT ile konjuge PTM inhibitör peptit olan TAT-PIP adı verilen bir tür rekombine peptit geliştirdik ve başarıyla kullandık. TAT-PIP, hücre ve doku girişini kolaylaştıran bir TAT modülünden ve rekabetçi bağlama yoluyla hedeflenen bölgelerde PTM'yi özel olarak aşağı regüle eden bir PIP modülünden oluşur. Burada, TAT-PIP'in tasarım özelliklerini, kalite kontrol standartlarını ve işlevsel doğrulama sistemini özetleyen bir protokol sunuyoruz. Tasarım bölümünde, TAT-PIP'in tutarlılığını, isteğe bağlı uzunluğunu, özgüllüğünü ve korunumunu açıklıyoruz. Ardından, etkinliğini ve güvenliğini garanti eden TAT-PIP'in kalite test gerekliliklerini tanıtıyoruz. TAT-PIP bölümünün uygulanmasında, TAT-PIP'in konsantrasyon gradyan testini, test edilen hücrelerin inkübasyon sürecini ve müteakip fenotipik tespiti tanıttık. Özetle, belirli bir bölgeyi seçici olarak yıkarak ve işlevini anlamak için ortaya çıkan fenotipi gözlemleyerek PTM bölgelerini taramak için etkili bir yöntem açıklıyoruz. Düşük sentetik maliyeti ve yüksek verimliliği nedeniyle bu yöntem, plazmit transfeksiyonu gibi mevcut teknolojilerin sınırlamalarının üstesinden gelir.

Giriş

Proteinler, yaşam aktivitelerinin birincil yürütücüleridir ve biyolojik düzenleyici süreçleri, gen ekspresyonunun düzenlenmesinin iki temel yönünü içerir: gen transkripsiyonu ve mRNA translasyonu. Bununla birlikte, son on yıllarda, translasyon sonrası modifikasyon (PTM), hücresel fonksiyonları düzenlemek için başka bir vazgeçilmez mekanizma haline gelmiştir¹. Araştırmacılar tarafından en iyi bilinen PTM olan fosforilasyon, fizyolojik fonksiyonlarda özellikle önemli bir rol oynar. Örneğin, hücre dışı sinyal regüle kinaz (ERK), Thr202 ve Tyr204 bölgelerinde MEK kinaz tarafından fosforile edildikten sonra, konformasyonu değişir ve transkripsiyon faktörleri² gibi aşağı akış hedef proteinlerini aktive eden aktif bölgeyi açığa çıkarır. Buna karşılık, GSK-3β'nın N-terminal Ser9'u Akt / PKB kinaz tarafından fosforile edildiğinde, substrat bağlama cebi bloke edilir ve kinaz aktivitesi^{kaybına yol açar 3}. Ubikitinasyon, ubikitin moleküllerinin substrat proteinlerine kovalent bağlanması yoluyla çeşitli hücresel süreçleri düzenleyen bir başka önemli PTM'dir. Ubikitin, 7 lizin kalıntısı (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) ve bir N-terminal metiyonin (M1) içerir. Ubikitin zincirlerinin farklı bölgelerdeki bağlantısı, substrat proteinlerine farklı kaderler verir. K48'e bağlı ubikitinasyonun birincil işlevi, proteazom⁴ tarafından bozunma için substrat proteinlerini işaretlemektir. Tersine, K63'e bağlı ubikitinasyonun birincil işlevi, DNA hasarı onarımı, inflamatuar yanıtlar ve endositoz⁵ gibi bozunmayan sinyal iletimine girmektir. Son yıllarda, proteomik teknolojilerin hızla ilerlemesiyle birlikte, artan sayıda yeni PTM keşfedilmiştir. Klasik asetilasyonun ötesinde, propiyonilasyon, krotonilasyon ve glutarylasyon gibi yeni asilasyonlar tanımlanmıştır⁶. Histon modifikasyonları alanında, histon laktosilasyonu, RNA m⁶A modifikasyonuna ve immün mikroçevrenin⁷ homeostazına müdahale eder. Histon olmayan modifikasyonlar alanında, ATP5O krotonilasyonunun azalması, fosfolipid metabolizmasının⁸ aşağı regülasyonunda önemli bir zararlı faktördür.

PTM ile ilgili araştırma yapmak, PTM proteom^9'un analizinin sistematik olarak ilerletilmesini gerektirir. Bu alan iki ana araştırma yönünü kapsar: tüm proteom seviyesinde PTM profillerinin analizi ve belirli bir proteinin PTM bölgelerinin kapsamlı bir şekilde tanımlanması. Modern kütle spektrometresi, çeşitli PTM türlerini ve belirli bölgeleri etkili bir şekilde tanımlayabilse de, temel fonksiyonel bölgelerin taranması ve doğrulanması, araştırma ilerlemesini kısıtlayan temel bir bilimsel zorluk olmaya devam etmektedir. Verimli saha tarama stratejileri oluşturmak, kilit düzenleyici sitelerin işlevini çözmeye yönelik ilk adımdır. Geleneksel yöntemler, belirli bölgeler için mutant plazmitlerin oluşturulmasını (mutasyonların inaktive edilmesi, mutasyonların aktive edilmesi), bunların in vitro transfeksiyon teknikleri yoluyla hedef hücrelere sokulmasını ve hücre proliferasyonu, apoptoz ve oksidatif stres gibi fenotipik göstergelerdeki değişikliklerin sistematik olarak değerlendirilmesini içerir. Bununla birlikte, bu strateji, oositler ve primer doku kültürü sistemleri gibi transkripsiyonel olarak sessiz hücre modellerinde önemli teknik engellerle karşı karşıyadır. Lentiviral veya adenovirüs transdüksiyon sistemi, transfeksiyon verimliliği sorununun kısmen üstesinden gelebilse de, uygulaması ikili zorluklarla karşı karşıyadır: yüksek ekonomik maliyetler ve viral partiküllerin in vitro doku modellerinin düşük penetrasyon verimliliği. Mutant knock-in fareler inşa etme stratejisi son derece uzun ömürlü ve maliyetlidir. Genel olarak, işlevsel olarak önemli PTM sahalarının ilk taraması için ekonomik ve verimli stratejilerin geliştirilmesi acildir.

Son yıllarda, ekibimiz, polipeptit rekabetçi inhibisyonuna dayanan, TAT konjuge PTM inhibitör peptit olan TAT-PIP, TAT-PIP adı verilen hızlı bir PTM aşağı regülasyon tekniğini başarıyla geliştirdi ve kullandı. Temel avantajı, önemli PTM bölgelerinin moleküler mekanizmalarının derinlemesine analizleri için çok önemli bir temel sağlayan, işlevsel olarak önemli PTM bölgelerinin ön taramasını yürütmek için evrenselliği ve yüksek verimliliğidir. Bu çalışma, TAT-PIP'in temel çerçevesini ve uygulama sürecini sistematik olarak açıklamakta ve temsili deneysel veriler aracılığıyla belirli bir alanda PTM seviyesini düzenlemedeki etkinliğini göstermektedir.

Protokol

1. TAT-PIP dizisinin tasarlanması

NOT: TAT-PIP iki kısım peptitten oluşur (Şekil 1): N-terminal kısmı, her TAT-PIP için değişmeden kalan ve in vitro kültürlenmiş hücrelere veya in vivo dokulara verimli bir şekilde girmeye yardımcı olabilen TAT, CYGRKKRRQRRR'dir; C-terminal kısmı, bir nesne proteininin spesifik PTM bölgesi (Şekil 1, genellikle "K" sembolünde lizin, kırmızı vurgulanmıştır) etrafındaki bir polipeptit dizisidir. PIP'in uzunluğu yaklaşık 10-15 AA kalıntısıdır (daha uzunsa maliyet artar; daha kısaysa özgüllük önemli ölçüde azalır).

1. Patlama analizi ile PIP dizisini optimize edin (Şekil 2).
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ için oturum açın, protein dizileri için blastp aramasına tıklayın.
   2. Hedef protein dizisini sorgu dizisini girin penceresine kopyalayın.
   3. Arama seç bölümünde Standart veritabanları seçeneğini belirleyin. Program seçiminde blastp (protein-protein BLAST) seçeneğini seçiniz. Son olarak, BLAST düğmesine tıklayın (Şekil 2B).
   4. Aday PIP'ler olarak en yüksek özgüllüğe sahip peptit segmentlerini seçin.
2. Son PIP için insanlar ve fareler arasında bir homoloji karşılaştırması yapın.
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ için oturum açın, protein dizileri için blastp aramasına tıklayın.
   2. Hem insan hem de fare türlerinden protein dizilerini kopyalayın ve bunları giriş dizisi kutusuna yapıştırın.
   3. Sonuçları almak için gönder düğmesine tıklayın.
   4. İnsan ve fare arasında %100 homolojiye sahip bir PIP seçin (Şekil 2C).
3. N-terminal TAT ve C-terminal PIP'den oluşan TAT-PIP'in bileşimini belirleyin.

2. TAT-PIP'in sentezi ve kalite doğrulaması

1. Kütle spektrometresi ile en az %98 peptit saflığı sağlamak için kapsamlı proje deneyimine sahip bir şirket seçin ve sonraki deneyleri etkileyebilecek safsızlıklardan kaçının.
   NOT: Polipeptidin endotoksin seviyesi ≤10 olmalı ve patojen içermemelidir.

3. TAT-PIP uygulaması

1. 10 mg/mL'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için TAT-PIP'i çözmek için patojen içermeyen ultra saf su kullanın. Kısmi denatürasyona neden olacak tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için stoğu küçük tüplere dağıtın.
   NOT: %1 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenmesi TAT-PIP yapısının korunmasına yardımcı olacaktır.
2. Hücreleri TAT-PIP ile tedavi edin.
   1. Standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO₂) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda kültür insan embriyonik böbrek 293T hücreleri.
      NOT: Tohumlamadan sonra, hücreler yaklaşık 12 saat boyunca kültürlendi ve birleşme yaklaşık% 70'e ulaştığında TAT-PIP tedavisi yapıldı.
   2. Çözünmüş TAT'ı PBS kullanarak 1 mg / mL'ye seyreltin, daha sonra uygun dozajda doğrudan hücre kültürü ortamına ekleyin (kültür ortamının önerilen nihai konsantrasyonu: 0.05 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.4 mg / mL) 24 saat boyunca.
   3. Hücreleri orijinal kültür ortamı ile 3 kez yıkayın.
   4. PTM'nin aşağı regülasyonunun kapsamını doğrulamak için western blot analizi yapın.
      NOT: Deneyimlere ve sonraki deneysel sonuçlara dayanarak, TAT-PIP'in optimum nihai konsantrasyonu 0.1 mg / mL'dir.

4. Batı lekesi

1. Hücre protein örneklerini hazırlayın.
   1. Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın, hücre peletine 200 μL güçlü radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu (fenilmetilsülfonil florür [PMSF]-proteaz inhibitörü eklenmiş) ekleyin ve ön liziz için 5 dakika inkübe edin, bir hücre kazıyıcı ile kazıyın.
   2. Karışımı 5 saniye boyunca% 12 enerji yoğunluğunda ultrasonik bir kırıcı kullanarak sonikleştirin.
   3. Hücre lizatını 30 dakika buz üzerinde soğutun ve 13400 g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatan içeren proteinleri önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatanıma 1/4 hacim 5x numune tamponu ekleyin (son konsantrasyon 1x).
   5. Karışımı girdaplayın, kuru bir termostatta 95 °C'de 5 dakika ısıtın ve buz üzerinde 2 dakika soğutun.
   6. Bir Nanodrop üzerinde bir Bradford testi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçün.
2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) gerçekleştirin.
   1. SDS-PAGE için %12 çözücü jel ve %4 istifleme jeli kullanın.
   2. Protein örneklerini belirtilen hacme göre kuyucuklara pipetleyin.
   3. Elektroforez aparatını açın ve istifleme ve çözme jelleri arasındaki arayüzdeki bantları hizalamak için önce 80 V, 300 mA'da 30 dakika boyunca çalıştırın. Ardından, proteinleri çözmek için 45 dakika boyunca 120 V, 300 mA'da çalıştırın.
   4. Hızlı bir transfer aparatı kullanarak proteinleri jelden poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
3. Blokaj, antikor inkübasyonu ve görselleştirme gerçekleştirin.
   1. %0,1 Tween 20 (TBST) içeren Tris tamponlu tuzlu suda %5 yağsız sütte PVDF membranını bloke edin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
   2. Membranı, bir döndürücü üzerinde gece boyunca 4 ° C'de% 5 yağsız süt / PBST içinde 1:1000 oranında seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
   3. Membranı TBST ile üç kez yıkayın (her biri 10 dakika).
   4. Membranı, RT'de %5 yağsız süt / TBST içinde 1:1000 oranında seyreltilmiş ikincil antikor ile 1 saat inkübe edin.
   5. Membranı TBST ile üç kez yıkayın (her biri 10 dakika).
   6. Elektrojenere kemilüminesans (ECL) cihazı altında en uygun görüntüyü elde etmek için zarı bir zaman serisinde (5 sn, 10 sn, 20 sn, 30 sn, 60 sn, 120 sn) ortaya çıkarın.

5. İn vitro kültürlenmiş hücrelerde TAT-PIP'in fonksiyonel validasyonu

1. Hücresel reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerini tespit edin.
   1. 24 oyuklu bir kültür plakasında 1 x 10⁵ hücre / kuyu optimal yoğunluğunda plaka 293T hücreleri.
   2. Hücreleri TAT konjuge Histon3 lizin 116 Krotonilasyon inhibitör peptit (THCIP) (0.1 mg / mL) ile 24 saat boyunca tedavi edin, ardından hücreleri PBS ile yıkayın.
   3. Hücreleri 10 μM dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) ile serumsuz DMEM'de karanlıkta 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   4. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın ve ImageJ'deki Ölçüm işlevini kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.
      NOT: FITC filtre seti, 465-495 nm'lik bir emisyon filtresi, bir dikroik ayna 505A ve 512-550 nm'lik ikinci bir emisyon filtresi ile kullanılmıştır.
2. Hücre proliferasyon testi
   1. 24 oyuklu bir kültür plakasında oyuk başına 1 x 10⁵ hücrelik optimal yoğunlukta 293T hücreleri tohumlayın.
   2. Her oyuğa 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin.
   3. Hücreleri 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
   4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nm'de kaydedin ve arka plan sinyalini boş kuyulardan (orta + CCK-8) çıkarın.
   5. Hücre canlılığını hesaplamak için verileri normalleştirin.
3. Hücresel ATP seviyelerinin tespiti
   1. Hücreleri bir lizis tamponu ile parçalayın. Lizatı 12.000 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Sonraki analiz için süpernatanı toplayın.
   2. 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM ve 5 μM'lik bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için ATP standart çözeltisini lizis tamponu ile seyreltin.
   3. Hücre süpernatanı veya ATP standardını içeren her kuyucuğa 20 μL ATP algılama çözeltisi ekleyin.
   4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak ışıldayan sinyali hemen ölçün.
      1. Plaka Düzeni'ne tıklayın, numuneleri (standartlar ve numuneler) ayarlamak için Plaka Şablonunu Değiştir'de ilgili plaka şablonunu seçin.
      2. Ardından soldaki Protokol'e tıklayın, Kemilüminesans düğmesini seçin ve ardından algılamayı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
   5. ATP standartlarının ışıldayan sinyallerinden standart bir eğri oluşturun ve bunu hücre süpernatanındaki ATP konsantrasyonunu ölçmek için kullanın.

Sonuçlar

Bu çalışma, rekabetçi inhibisyona dayalı olarak belirli bir bölgede bir hedef proteinin PTM seviyesini aşağı regüle etmek için TAT-PIP kullanan bir stratejiyi açıklamaktadır. Tipik bir örnekte, buradaki TAT-PIP, özellikle THCIP olarak yeniden adlandırılmıştır. İki fonksiyonel modülden oluşur: (1), THCIP'nin hücrelere nüfuz etmesine izin veren N-terminal hücreye nüfuz eden peptit TAT (CYGRKKRRQRRR); (2) H3'ün K116'sı etrafındaki C-terminal dizisi, AIHAKRVTIMPKD, özellikle K116'da krotonillenmek üzere endojen H3 ile rekabe...

Tartışma

Bu protokolde aşağıdaki adımlar kritiktir. İlk olarak, TAT-PIP tasarımı peptitin özgüllüğünü ele alır. İkinci olarak, uygulamayı ve nihai konsantrasyonu optimize edin; Optimize edilmiş konsantrasyon, verimli ve hızlı bir nakavt elde etmek için dikkatli bir şekilde test edilmelidir. Üçüncüsü, TAT-PIP'in etkisini doğrulamak için, ek etkilerini doğrulamak için tek bir deneye güvenmek yerine birden fazla deney önerilir.

Mevcut yöntemler karşılaştırıldığında, bu yö...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otomatik çok fonksiyonlu görüntüleme sistemi	Tanon	4600	Pozlama ölçer, geliştirme işleminden sonra membran üzerindeki floresan veya kemilüminesans sinyallerini algılayarak hedef protein bantlarını tanımlar ve görselleştirir.
Hücre sayma kiti-8	GLPBIO	GK10001	Hücre metabolik canlılığı ile hücre sayısı arasındaki korelasyona dayanan bu yöntem, hücrelerin CCK-8 reaktiflerine indirgeme yeteneğini ölçerek hücrelerin proliferatif kapasitesini değerlendirir
Dulbecco' s Modifiye Kartal' Gibco		11995065	Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM), çok çeşitli memeli hücrelerinin büyümesini desteklemek için yaygın olarak kullanılan bir bazal besiyeridir.
ECL kemilüminesan substrat	Biosharp	BL520B	ECL substratları, spesifik proteinlerin veya nükleik asitlerin tespit edilmesini sağlayan kemilüminesans reaksiyonları yoluyla ışık sinyalleri üretir.
Elektroforez aparatı	Tanon	EPS600	Elektroforez aparatının ana rolü biyolojik makromolekülleri ayırmak ve analiz etmektir ‌
Gelişmiş ATP test kiti	Beyotime	S0027	Kit, numunelerin ATP seviyesini etkili bir şekilde tespit edebilir
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco	16000-044	Fetal sığır serumu (FBS), hücre bakımı ve büyümesi için gerekli besinleri ve büyüme faktörlerini sağlar.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Cihaz oldukça verimlidir ve 15 dakika içinde poliakrilamid jelden PVDF membranına hızlı bir şekilde protein transferini sağlayabilir
Ters floresan mikroskobu	Olympus Corporation	IX73	Floresan mikroskobu, incelenen nesneyi floresan yaymak için ışınlamak için bir ışık kaynağı olarak ultraviyole ışık kullanır ve ardından nesnenin şeklini ve konumunu gözlemleyin. mikroskop.
NanoDrop2000 mikro hacimli UV-Vis spektrofotometresi	Thermo Scientific	2000	NanoDrop, DNA veya RNA PVDF membranının konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı
	BioRAD	1620177	Bu tip PVDF membranı, mükemmel kimyasal dirence ve yüksek protein bağlama kabiliyetine sahiptir
ROS tahlil kiti	Beyotime	S0033S	Kit, hücrelerdeki
reaktif oksijen türlerinin seviyesini doğru bir şekilde tespit edebilirTAT-konjugater H3K16 Krotonilasyon inhibitör peptit	Nanjing Taopu Biotechnology Co., LTD	CN218107533U	K16 'de krotonillenecek endojen H3 ile spesifik olarak rekabet edebilir;
TBST	Biosharp	BL602A	TBST, zardaki alakasız maddeleri temizleyebilir, deneysel hataları azaltabilir ve deneysel sonuçların doğruluğunu sağlayabilir ‌
Ultrasonik kırıcı	LICHEN	LC-AUD-150P	Cihazın ana işlevleri arasında hücre parçalanması, partikül dağılımı ve emülsifikasyon bulunur
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Mikroplaka okuyucular, mikroplakalardaki numunelerin optik sinyallerini (absorbans, floresan veya lüminesans gibi) tespit ederek biyolojik numunelerin yüksek verimli kantitatif analizini elde edebilir