Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kalp Yetersizliği Hastalarında Plazma ve Fekal Metabolitlere Bağlı Renal Arter Fonksiyonu ve Histopatolojisi

539 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68583

⸱

9 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, kardiyorenal sendromda kardiyak metabolite bağlı renal vasküler disfonksiyonu aydınlatmak için multimodal bir platform geliştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bağırsak mikrobiyotası ve bununla ilişkili konak-mikrop ko-metabolitleri, özellikle kardiyorenal sendrom bağlamında, sistemik metabolik dengenin ve kardiyorenal eksenin anahtar düzenleyicileri olarak giderek daha fazla kabul görmektedir. Klinik kanıtlar kardiyak disfonksiyonun renal patolojik değişiklikleri başlatabileceğini veya şiddetlendirebileceğini gösterse de, kardiyorenal eksene aracılık eden anahtar metabolik sinyal molekülleri ve bunların altında yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışma, kardiyometabolik imzaları renal vasküler fonksiyon analizi ile bütünleştiren yeni bir sistematik araştırma platformu oluşturmaktadır ve şunları içermektedir: (1) Kalp yetmezliği hastalarından plazma/dışkı metabolitlerinin izolasyonu ve ekstraksiyonu; (2) Ex vivo renal vasküler izolasyon ve birincil kültür teknikleri; (3) Vasküler fonksiyonel analizleri, renal vasküler hasar belirteçleri için moleküler biyokimyasal testleri ve histopatolojik analizleri içeren kardiyorenal metabolik etkileşimler için multimodal bir değerlendirme çerçevesi. Sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında, kalp yetmezliği hastalarından alınan metabolitler, renal vasküler fonksiyonu bozdu ve inflamatuar yanıtları indükledi, bu da kardiyorenal sendromda fonksiyonel biyobelirteçler olarak potansiyellerini vurguladı. Bu çalışma belirli bir metabolite odaklanmamaktadır; bu nedenle, LC-MS/MS ve NMR gibi analitik teknikler kullanılarak gelecekteki çalışmalarda patojenik etkiler gösteren spesifik metabolit türlerinin daha fazla tanımlanması ve doğrulanması gerekecektir. Bu platformun uygulanması, kalp hastalığı ile ilişkili metabolitlerin renal vasküler fonksiyonu ve homeostazı bozduğunu ortaya koymuştur. Bu bulgular, kardiyorenal etkileşimlerin metabolik itici güçleri hakkında mekanik bir bakış açısı sağlar ve yeni biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri belirlemek için translasyonel bir araç sunar.

Giriş

Kardiyorenal Sendrom (KRS), kalp ve böbrekler arasında çift yönlü hasar ile karakterize karmaşık bir patolojik durumdur. Bu iki organ arasındaki karmaşık karşılıklı bağımlılık ilk olarak 1836'da, ilerlemiş böbrek hastalığı1 ile ilişkili kalpteki önemli yapısal değişiklikleri sistematik olarak belgeleyen Robert Bright tarafından tanımlanmıştır. CRS prevalansı, kardiyovasküler hastalık (KVH) ve kronik böbrek hastalığının (KBH) bir arada bulunmasıyla güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Çalışmalar, kalp yetmezliği hastalarının yaklaşık %30'unun aynı zamanda KBH olduğunu, KBH hastalarındaki ölümlerin ise %44-51'inin doğrudan kardiyovasküler olaylara bağlandığını göstermektedir2.

CRS'nin yönetimi birçok önemli zorluğu beraberinde getirir. İlk olarak, klinik bakım, disiplinler arası koordinasyon ve erken uyarı mekanizmalarının eksikliği ile parçalanmış durumda kalır ve genellikle dekompansasyonfaz 3 sırasında müdahalelerin gecikmesine yol açar. İkincisi, mevcut tedavi stratejileri paradoksal bir ikilemle karşı karşıyadır. Diüretikler ve renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi (RAAS) inhibitörleri gibi geleneksel tedaviler kalp yetmezliği semptomlarını hafifletebilir4; bununla birlikte, uzun süreli veya yüksek doz kullanımları RAAS ve sempatik sinir sistemini (SNS) aktive ederek renal hipoksi ve fibrozu şiddetlendirebilir, sonuçta diüretik direncine ve böbrek fonksiyonunun kötüleşmesine katkıda bulunabilir5. Benzer şekilde, anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri (ACEI'ler) ve anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB'ler) kardiyorenal hasarı azaltabilirken, yüksek serum kreatinin veya hiperkalemi ile ilgili endişeler nedeniyle klinik kullanımları genellikle sınırlıdır ve hastaların sadece %30-40'ı uzun süreli tedaviyi tolere edebilir6.

Bu zorluklar göz önüne alındığında, yeni terapötik hedeflerin keşfini kolaylaştırmak için etkili erken biyobelirteçlerin belirlenmesine ve CRS patogenezinin daha derinlemesine anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, kardiyorenal karışmanın eyleme geçirilebilir aracılarının belirlenmesindeki mevcut sınırlamalar - özellikle kardiyak disfonksiyonu renal vasküler hasarla doğrudan ilişkilendiren hastalığa özgü metabolitler - bu karşılanmamış klinik ihtiyaçların çözümünde ilerlemeyi engellemektedir. Ortaya çıkan kanıtlar, kardiyak hastalıkla ilişkili metabolitlerin, renal vasküler homeostazı yeniden programlayarak CRS'nin hem tanısal biyobelirteçleri hem de mekanik sürücüleri olarak hizmet edebileceğini göstermektedir, ancak böbrek hasarını başlatma veya büyütmedeki uzay-zamansal rolleri zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir 7,8,9. Son çalışmalar, seramidler gibi endojen metabolitlerin, özellikle kardiyorenal koşullar altında vasküler inflamasyonu ve yeniden şekillenmeyi aktif olarak şiddetlendirebileceğini göstermiş ve vasküler patolojide metabolit algılamanın daha geniş önemini vurgulamıştır10.

KRS'de etkilenen böbrek kompartmanları arasında damar sistemi, yaralanmanın birincil ve erken hedefi olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bozulmuş nitrik oksit biyoyararlanımı, oksidatif stres ve proinflamatuar ve pro-trombotik mediatörlerin yüksek ekspresyonu ile işaretlenen renal mikrosirkülasyondaki endotel disfonksiyonu, mikrovasküler seyrekleşmeye, artmış vasküler geçirgenliğe ve bölgesel hipoksiye katkıda bulunur11. Buna paralel olarak, arteriyel tonus ve kompliyansı düzenlemek için gerekli olan vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) de CRS'de metabolik düzensizliğe karşı savunmasızdır. Biriken kanıtlar, hastalıkla ilişkili metabolitlerin VSMC kontraktilitesini bozabileceğini, uyumsuz yeniden şekillenmeyi teşvik edebileceğini ve vasküler sertliğin artmasına ve böbrek perfüzyonunun bozulmasına katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Temel rollerine rağmen, düz kas kaynaklı vasküler disfonksiyon mekanizmaları, mevcut CRS modellerindeyeterince araştırılmamıştır 8,12. Bu patofizyolojik değişiklikler sadece böbrek hasarını şiddetlendirmekle kalmaz, aynı zamanda uyumsuz nörohormonal aktivasyonu ve sistemik hemodinamik bozuklukları teşvik ederek kardiyak fonksiyonu daha da bozar ve KRS ilerlemesini sürdürür13. Bu nedenle, renal vasküler hasarı hedeflemek, CRS'nin erken patogenezine mekanik olarak bilgilendirici bir pencere sunar ve kalp-böbrek metabolik etkileşimlerini araştırmak için rasyonel bir odak sağlar.

Bu boşlukları gidermek için çalışmamız, CRS ilerlemesinin merkezi düzenleyicileri olarak kalp yetmezliği ile ilişkili metabolitlerin sistematik olarak tanımlanmasına ve fonksiyonel olarak doğrulanmasına öncelik vermektedir. Bu çalışma, bu metabolitlerin renal vasküler disfonksiyonu nasıl indüklediğini, inflamatuar kaskadları nasıl aktive ettiğini ve doku onarım mekanizmalarını nasıl tehlikeye attığını tanımlayarak gözlemsel biyobelirteç keşfi ile mekanik patogenez araştırması arasındaki kritik kopukluğu kapatmaktadır. Hayvan modelleri, in vitro hücre kültürleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevli organoidler dahil olmak üzere CRS'yi incelemek için kullanılan geleneksel modellerin her birinin sınırlamaları vardır14. Hayvan modelleri, klinik alaka düzeyini sınırlayan türler arası farklılıklardan muzdariptir. İn vitro kültürler organ düzeyinde entegrasyondan yoksunken, iPSC'den türetilen organoidler - kardiyomiyosit-tübüler epitel hücre etkileşimlerini modelleyebilmelerine rağmen - işlevsel olarak olgunlaşmamış kalır ve erken gelişim aşamalarıile sınırlıdır 15. Ayrıca, mevcut vasküler organoid sistemler esas olarak endotelyal tek tabakalardan veya ilkel mikrodamarlardan oluşur, kasılma düz kas tabakasından ve metabolik hasara damar düzeyinde yanıtları değerlendirmek için gerekli fonksiyonel okumalardan yoksundur16.

Buna karşılık, platformumuz insan kaynaklı kardiyak metabolitleri ve ex vivo insan böbrek damar sistemini kullanarak fizyolojik olarak ilgili ve yapısal olarak sağlam ex vivo insan renal arterlerine izin vererek, vasküler arayüzdeki kardiyorenal metabolik etkileşimlerin fizyolojik olarak ilgili ve mekanik olarak bilgilendirici analizini mümkün kılar. Bu, kardiyorenal sendrom ilerlemesinin altında yatan organlar arası metabolik iletişimin modellenmesinde benzersiz bir avantaj sağlar. Öncü entegre kardiyorenal araştırma platformumuz üç temel yeniliği sinerji haline getiriyor: kalp yetmezliğinden türetilen plazma/dışkı metabolitlerinin metabolomik profili, ex vivo renovasküler izolasyon/kültür sistemleri ve multimodal fonksiyonel-moleküler-histopatolojik değerlendirme. Bu platformun her bir bileşeni, numune başına 200 μL plazma veya 0.1 g dışkı materyali kullanımı, 2 mm insan renal arter segmentlerinin 37 °C'de %5 CO ile inkübasyonu dahil olmak üzere tekrarlanabilirlik ve translasyonel uygunluk için optimizeedildi.2 24 saate kadar ve vasküler yaralanma belirteçlerinin kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tabanlı tespiti. Bu sistem yalnızca metabolit imzalarının tanısal potansiyelini çözmekle kalmaz, aynı zamanda bunların nedensel katkılarını doğrudan CRS patolojisine bağlayarak organlar arası metabolik düzensizliğin moleküler düzeyde haritalanması yoluyla terapötik hedefin tanımlanmasını sağlar. Mekanik keşif ile klinik çeviri arasında köprü kuran bu çift odaklı paradigma, CRS yönetimini reaktif semptom kontrolünden proaktif biyobelirteç odaklı müdahalelere kaydırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan deneysel protokoller ve vaka metodolojileri, Pekin Üniversitesi Birinci Hastanesi Üroloji Bölümü (Etik İnceleme Kodu: 2023yan500-002) ve Pekin Birliği Tıp Fakültesi Hastanesi (onay No. I-23PJ585) tarafından Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere sıkı sıkıya bağlı kalınarak etik olarak onaylanmıştır. Bu çalışma için, Temmuz 2019'dan itibaren Pekin Birliği Tıp Fakültesi Hastanesi'nde (PUMCH) yatan ve en az iki deneyimli kardiyolog tarafından kalp yetmezliği (KY) teşhisi konan erkek veya kadın hastaları dahil ettik. Plazma ve fekal metabolit ekstraksiyonu için toplam dört KY hastası (HF1-HF4) dahil edildi. Araştırmaya dahil edilmeden önce tüm deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Deney aparatı ve reaktifler Malzeme Tablosunda gösterilmektedir.

1. Plazma ve dışkı numunesi işleme-polar metabolit ekstraksiyonu

  1. Örnek toplama
    1. Tüm plazma ve dışkı örneklerini steril, önceden soğutulmuş toplama tüplerinde toplayın ve toplama işleminden sonra hemen sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Numuneleri işlenene kadar -80 °C'de saklayın.
    2. Metabolit stabilitesini sağlamak için, tüm numuneleri tek bir donma-çözülme döngüsü içinde işleyin ve numune toplama ile ekstraksiyon arasındaki zaman aralığının 2 haftayı aşmasına izin vermeyin.
      NOT: Bu önlemler, metabolit bozulmasını en aza indirmek ve aşağı akış metabolomik analizlerde tekrarlanabilirliği sağlamak için alınmıştır.
    3. Sırasıyla protokol adımları 1.3 veya 1.4'ü izleyerek dışkı ve plazma örneklerinden metabolitleri çıkarın.
  2. Çalışma popülasyonu
    1. Temel kan basıncı ölçümlerini yapın ve tüm katılımcıların ilaç geçmişlerini kaydedin.
    2. Metabolomik analizde kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için majör metabolik komorbiditeleri (örn. diyabet, primer hipertansiyon) olan bireyler hariç olmak üzere, herhangi bir akut klinik bozulmadan önce hasta örnekleri toplayın (Ek Tablo S1).
    3. Standart prosedürleri kullanarak her denek için klinik bilgi edinin.
  3. Plazma ekstraksiyonu
    1. Ham serumu 14.000 × g'da 10 dakika (4-8 °C) santrifüjleyin. Süpernatanı yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
    2. %80 (h/h) metanol konsantrasyonu elde etmek için soğutulmuş (-80 °C) HPLC sınıfı metanol ekleyin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın ve -80 °C'de 6-8 saat inkübe edin.
    3. 14.000 × g'da 10 dakika (4-8 °C) santrifüjleyin. Metabolomik profilleme için metanolik süpernatanı taze tüplere aktarın.
      NOT: Plazma örneklerini toplandıktan sonra 2 saat içinde -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin ve metabolit stabilitesini sağlamak için donma-çözülme döngülerini en aza indirin.
  4. Dışkı ekstraksiyonu
    1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde taze veya dondurulmuş dışkı örneklerine 500 μL HPLC sınıfı metanol (-80 °C'ye önceden soğutulmuş) ekleyin. Kuru buz üzerinde 1-2 dakika boyunca bir mikro havaneli/doku homojenizatörü kullanarak homojenize edin, ardından vorteksleme (4-8 ° C'de 1 dakika) ve -80 ° C'de 4 saat inkübasyon yapın.
    2. Soğutmalı bir santrifüj kullanarak 10 dakika (4-8 °C) boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın; Adım 1.4.4'e kadar -80 °C'de saklayın.
    3. Peleti 400 μL önceden soğutulmuş (-80 °C) HPLC sınıfı metanol ile yeniden süspanse edin. İyice vorteksleyin (4-8 °C'de 1 dakika) ve -80 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    4. Santrifüjlemeyi tekrarlayın (14.000 × g, 10 dakika, 4-8 °C). Her iki ekstraksiyon aşamasındaki süpernatanları birleştirin.
    5. Son bir arıtma santrifüjü gerçekleştirin (14.000 × g, 10 dakika, 4-8 °C). Saflaştırılmış süpernatanı aşağı akış analizi için steril 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
      NOT: Dışkı örneklerini toplandıktan sonra 2 saat içinde -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin ve metabolit stabilitesini sağlamak için donma-çözülme döngülerini en aza indirin.

2. Renal arter izolasyonu

  1. Katılımcı seçimi ve doku toplama
    1. Renal hücreli karsinom için radikal nefrektomi geçiren hastaları tarayın. Yalnızca metabolik komorbiditeleri olmayan 18 yaş ≥ olanları dahil edin (ör., birincil hipertansiyon, diabetes mellitus). Ameliyat sırasında, tümör kenarlarından en az 3 cm uzakta bulunan histolojik olarak normal böbrek parankimini toplayın.
    2. Hasat edilen numuneleri hemen oksijenli Krebs-Henseleit tamponuna daldırın (4 °C, pH 7.4; mM cinsinden bileşim: 119.0 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2 , 1.0 MgCl2 , 25.0 NaHCO3 , 1.2 KH2PO4 , 11.0 glikoz). İzolasyon prosedürlerini ameliyattan sonraki 6 saat içinde tamamlayın.
  2. Böbrek dokusu hazırlığı
    1. Bozulmamış hiler yapılar içeren heminefrik örnekler elde etmek için 4 °C Krebs tamponunda koronal kesit alın. Renal kavisli arter dallarını ortaya çıkarmak ve kavisli arterleri tanımlamak için stereomikroskopik bir sistem (40x büyütme) kullanarak mikrodiseksiyon gerçekleştirin.
  3. Mikrovasküler diseksiyon
    1. Mikro kornea makası kullanarak perivasküler adventisyal dokunun sıralı olarak çıkarılması yoluyla arteriyel segmentlerin hassas izolasyonunu sağlayın.
    2. Yaklaşık 500 μm çapında arteriyel segmentleri koruyun.
    3. Mikro forseps ile gerilimsiz manipülasyon yoluyla endotelyal kayma gerilimini en aza indirin. Fizyolojik pH'ı ve iyonik homeostazı korumak için her 15 dakikada bir yenilenen Krebs tamponu ile diseksiyonu hipotermik koşullar altında (4 ° C) gerçekleştirin.
      NOT: Arteriyel boyutların ve tampon bileşiminin açık bir şekilde ölçülmesi, tedarikten (4 °C) işlemeye (4 °C) kadar termal olarak düzenlenmiş bir iş akışı ve numune toplamadan 6 saat sonra tam mikrovasküler diseksiyon, optimum doku canlılığı ve fonksiyonel bütünlük sağlar.

3. Kardiyak hasar metabolitleri ile renal arter inkübasyonu

  1. Vasküler doku hazırlığı: Renal arterleri steril koşullar altında mikrocerrahi olarak inceleyin ve ince oftalmik forseps kullanarak yapışık perivasküler bağ dokusunu titizlikle çıkarın. İzole renal arterleri, sonraki organotipik kültür için steril mikromakas kullanarak 2 mm'lik segmentlere ayırın.
  2. Antibiyotik dekontaminasyonu: Mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek ve metabolite maruz kalmadan önce steriliteyi sağlamak için vasküler segmentleri üçlü antibiyotik / antimikotik kokteyli ile desteklenmiş fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  3. Deneysel gruplama: Vasküler segmentleri dört deney kohortuna rastgele atayın ve kuyu başına 500 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını içeren 24 oyuklu kültür plakalarına aktarın.
  4. Metabolit müdahalesi
    1. Aşağıdaki gruplardan metabolitler ekleyin: 1) Sağlıklı kontrol plazmasından türetilen metabolitler (HC-P); 2) Kalp yetersizliği hastalarının plazma kaynaklı metabolitleri (HF-P); 3) Sağlıklı kontrol dışkı kaynaklı metabolitler (HC-F); 4) Kalp yetmezliği hastalarının dışkı kaynaklı metabolitleri (HF-F).
    2. Metabolit ekstraktlarını metanol (HPLC sınıfı) içinde sulandırın ve her ekstraktın 10 μL'sini, 500 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve renal arter segmentlerini içeren 24 oyuklu kültür plakasının karşılık gelen kuyucuğuna uygulayın (nihai çözücü konsantrasyonu% 2 (v / v)). Kontrol kuyularına eşdeğer hacimlerde araç (metanol/PBS karışımı) ekleyin.
  5. Kültür koşulları: Plaka düzeneklerini standart hücre kültürü koşulları altında (37 °C, %5CO2, %95 nem) nemlendirilmiş bir inkübatör kullanarak 24 saat inkübe edin.

4. Renal arter halkası testi

  1. Renal arter halkası süspansiyonu ve fiksasyonu
    1. Tel hazırlama: İki paralel 2 cm paslanmaz çelik teli (Krebs, %95 O2/%5 CO2 cinsinden önceden dengelenmiş) optik mikroskopi altında arteriyel lümenden geçirin ve her iki uçta eşit tel çıkıntısı sağlayın.
    2. Miyograf montajı: Fizyolojik sıcaklığı ve oksijenlenmeyi korumak için ısıtma sistemini ve gazı açın. Kabloları sıcaklık kontrollü bir tel miyograf banyosunda yatay olarak sabitleyin (Krebs, %95 O2/%5 CO2). Doğal damar gevşemesini korumak için vida düğmelerini ayarlayın.
  2. Gemiye özgü normalizasyon ile optimal başlangıç geriliminin belirlenmesi
    NOT: Dinlenme gerilimi, temel koşulları standartlaştırmak, damar tepkisini optimize etmek ve tekrarlanabilirliği sağlamak için bir normalleştirme prosedürü kullanılarak ayarlandı. Normalleştirmeye devam etmeden önce 30 dakika dengeleyin.
    1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak DMT menüsünden Normalleştirme ayarları'nı seçin: mercek kalibrasyonu: 1 mm/böl; hedef basınç: 13,3 kPa; IC1/IC100 oranı: 0,9 C; çevrimiçi ortalama: 3 sn; Gecikme süresi: 60 sn.
      NOT: Ek arka plan ve sistem yapılandırma ayrıntıları, başvurulan kağıt17'de verilmiştir.
    2. Bir gemiyi normalleştirmek için ilgilenilen kanalı seçin ve normalleştirme ekranını verilerle doldurun. Mikrometre okumasına ve 40 μm tel çapına göre doku uç noktalarını ayarlayın.
    3. Pasif esneme uygulayın ve 3 dakika bekleyin. Potasyum aracılı bir kasılmayı indüklemek için 60K+ uygulayın ve kasılma bir platoya ulaşana kadar bekleyin. 60K+'yı yıkamak için müstahzarı Krebs solüsyonu ile 3 x 5 dakika durulayın. İz üzerinde kaydedilen potasyum kaynaklı kuvvetten her gerilme seviyesindeki pasif kuvveti çıkararak aktif kuvveti hesaplayın.
    4. Maksimum aktif kuvvete ulaşılana kadar 4.2.3 adımını tekrarlayın. Optimal dinlenme gerilimini, her arterde maksimum aktif gerilim veren seviye olarak tanımlayın ve referans kasılmalar olarak kullanılan yüksek K+' ya en yüksek tepkiler.
    5. Daha fazla deneyden önce arter halkasını 10 dakika dengeleyin.
      NOT: Damar dereceleri, kalınlıkları ve kökenlerindeki önemli bireyler arası değişkenlik nedeniyle, tekrarlanabilirliği sağlamak için her kan damarını ayrı ayrı normalleştirin. Her bir damarın pasif çapına ve mekanik özelliklerine göre uygun temel gerilimi belirlemek için tel miyograf sisteminin normalizasyon modülünü kullanın. İşlevsel testten önce prosedürü tüm numunelere tutarlı bir şekilde uygulayın.
  3. Renal arter halkalarının reaktivite tespiti
    1. Farklı metabolitlerin vasküler kontraktilite üzerindeki etkilerini araştırmak için, sağlıklı gönüllülerden ve KY hastalarından 12 saat boyunca ekstrakte edilen plazma ve dışkı metabolitleri ile inkübe edilen renal arterleri kullanarak vasküler kontraksiyon fonksiyon testleri yapın. Belirli ayrıntılar için bölüm 3'e bakın.
    2. Potasyum aracılı bir kasılma ortaya çıkarmak için 60K+ kullanın. Her haznenin 5 mL Krebs çözeltisine sahip olduğundan emin olun.
    3. Arter halkalarında fenilefrin (Phe) ile indüklenen, konsantrasyona bağlı kasılmaları belirlemek için, 10-9 ila 10-4 M arasında yarım log artışlarla Phe ekleyin. En düşük Phe konsantrasyonuyla başlayın, odaya sokun ve sabit bir kasılma bekleyin.
    4. Sabit bir kasılmaya ulaşılan noktayı işaretleyin (yani, platodaki gerilim değerini kaydedin), ardından bir sonraki konsantrasyona geçin. Son konsantrasyon başarıyla eklenene kadar tekrarlayın.
    5. Deneyi bitirdikten sonra veri dosyasını kaydedin ve arter halkalarını çıkarın. Hazneyi %8'lik bir asetik asit çözeltisiyle iyice temizleyin, ardından 3 dakika inkübe edin.
    6. Gazı kapatmadan önce tüm sıvının çıkarıldığından emin olarak ısıtma sistemini ve gazı kapatın.

5. Renal arterin histopatolojik incelemesi: hematoksilen-eozin boyama

NOT: Tehlikeli reaktifleri ve biyolojik atıkları kurumsal biyogüvenlik ve kimyasal hijyen protokollerine uygun olarak atın. Spesifik olarak, ksilen ve paraformaldehit, etiketli, sızdırmaz kimyasal atık kaplarında toplanmalı ve sertifikalı tehlikeli atık işleyicileri tarafından bertaraf edilmeden önce belirlenmiş bir çeker ocak alanında saklanmalıdır. Miyograf odası temizliğinde kullanılan asetik asit, standart asit atık bertaraf prosedürleri izlenerek nötralize edilmeli ve bertaraf edilmelidir. Bu reaktiflerin hiçbirini laboratuvar lavabolarına boşaltmayın.

  1. Arterleri soğuk PBS'de yıkayın ve gece boyunca %4 paraformaldehit (pH 7.4) ile sabitleyin. Seri kesitleri 4 μm'de kesin ve histoloji için işlem yapın.
  2. Cam slaytlara monte edilmiş doku bölümlerini 60 °C'de 1 saat boyunca bir slayt kurutucuda inkübe edin, ardından hemen ksilene aktarın. Bölümleri ksilene batırın (3 x 5 dakika).
  3. Bölümleri kademeli etanol hidrasyonuna tabi tutun: %100 etanol (2 x 5 dakika), %95 etanol (1 x 5 dakika), %90 etanol (1 x 5 dakika), %80 etanol (1 x 5 dakika), %70 etanol (1 x 5 dakika), ultra saf suyla durulayın (1 x 5 dakika).
  4. 5 dakika boyunca hematoksilen (%0,5 a/h) ile boyayın; Ardından akan su altında durulayın.
  5. %1 asit alkol (HCl-etanol) ile 5-10 saniye boyunca farklılaştırın ve akan su altında durulayın.
  6. Bölümleri %0,6 amonyaklı suda mavileştirin ve akan su altında durulayın.
  7. Bölümleri 2 dakika boyunca eozin çözeltisine (%1 a/h) daldırın.
  8. Bölümleri %95 etanol (2 x 5 dakika), %100 etanol (2 x 5 dakika) ve ksilen (2 x 5 dakika) içinde kurutun ve temizleyin.
  9. Optik şeffaflık elde edilene kadar kısa bir süre havayla kurutun, montaj ortamına monte edin, lamellerle örtün ve lamelleri nötr bir montaj ortamıyla kapatın.
  10. Parlak alan görüntüleme ve histomorfometrik değerlendirme gerçekleştirin.

6. Böbrek hasarıyla ilişkili moleküler biyobelirteçlerin tespiti

  1. Renal arter mRNA ekstraksiyonu
    1. Dondurularak saklanmış vasküler dokuyu sıvı nitrojen içinde 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifine ekleyin ve tam homojenizasyon için önceden soğutulmuş bir doku homojenizatörüne aktarın.
    2. Ekstraksiyon reaktifinin 100 μL'si başına 250 μL kloroform ekleyin, 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve 25 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. 12.000 × g'da (10 dakika, 4 °C) santrifüjleyin ve sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
    4. Sulu faza 500 μL izopropanol ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 25 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    5. 12.000 × g'da (10 dakika, 4 °C) santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    6. Peleti 1 mL %75 etanol (2 x 5 dakika) ile yıkayın, RNA peletini havayla kurutun ve DEPC-H2O (%0.1 h/h) içinde yeniden süspanse edin.
      NOT: RNA saflığını doğrulayın (OD260/OD280 = 1.9-2.0) ve sağlam 28S/18S rRNA bantlarını onaylayın.
  2. cDNA sentezi
    1. 2 μg mRNA + 1 μL oligo(dT) primeri karıştırın, DEPC-H2 O (%0.1 v/v) ile 8 μL'ye ayarlayın, 70 °C'de 5 dakika ısıtın ve buz üzerinde 5 dakika soğutun.
    2. Ters transkripsiyon ana karışımını 10 μL 2x TS Reaksiyon Karışımı, 1 μL RT/RI Enzim Karışımı ve 1 μL gDNA Remover içinde hazırlayın. Toplam 20 μL'lik bir reaksiyon hacmi elde etmek için Adım 6.2.1'deki 8 μL RNA/primer karışımına 12 μL ana karışımı ekleyin.
    3. Karışımı adım 6.2.2'den itibaren ısıtın. 42 °C'de 60 dakika ve 85 °C'de 5 dakika ısıtarak işlemi sonlandırın.
    4. 20 μL ters transkripsiyon reaksiyonunu 80 μL nükleaz içermeyenH2Oekleyerek seyreltin, bu da 100 μL'lik bir nihai hacim (4x seyreltme) ile sonuçlanır. Kantitatif PCR için şablon olarak seyreltilmiş cDNA'yı kullanın.
  3. Kantitatif PCR analizi
    1. 2.0 μL cDNA şablonu, 0.5 μL ileri primer (10 μM), 0.5 μL ters primer (10 μM), 10 μL SYBR Green ana karışımı (2x) ve 7 μL ddH2O karıştırarak reaksiyonu ayarlayın.
    2. PCR'yi aşağıdaki ayarları kullanarak gerçekleştirin: ilk denatürasyon: 95 °C/3 dak; 40 döngü: 95 °C/30 sn; Tm-5 °C/30 sn; 72 °C/30 sn; erime eğrisi: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
    3. Gen ekspresyonunu 2-ΔΔct yöntemiyle analiz edin. Primer dizileri Ek Tablo S2'de gösterilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kohort, yaşları 46 ile 73 arasında değişen (ortalama yaş: 64.0 yıl) iki kadın ve iki erkekten oluşuyordu. Başlangıç kan basıncı ölçümleri, sistolik kan basıncının 109 ila 168 mmHg arasında değiştiğini ve diyastolik basıncın 68 ila 115 mmHg arasında olduğunu gösterdi. Tüm KY hastaları, beta-blokerler, statinler ve antiplatelet ilaçlar gibi yaygın kardiyoprotektif ajanlar da dahil olmak üzere, renin-anjiyotensin sistem inhibitörleri ve diüretiklerde bireysel varyasyonlarla birlikte ilaç öyküleri kaydetmişti. Kontroller içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CRS'deki son araştırmalar, metabolik yeniden programlamayı renal vasküler homeostazı düzenleyen metabolitlerle birlikte önemli bir patolojik mekanizma olarak tanımlamıştır 7,8,9. VSMC'ler KRS'de vasküler tonus ve kompliyansın düzenlenmesinde kritik bir rol oynarken, çalışmamız kardiyak hasarla ilişkili metabolitlerin vasküler düz kas kontraktilitesini ve yapısal bütünlüğü bozduğuna dair doğrudan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFF0501401, 2018YFA0800501'den Y. Z.'ye, 2021YFF0501404'ten Y. L.'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82325004 ve 92168114'den Y. Z.'ye, 82300286 J. Z.'ye, 92168113 E. D.'ye, 82170422 Y. L.'ye), Haihe Hücre Ekosistemi İnovasyon Fonu Laboratuvarı (No. HH22KYZX0047'dan E.D.'ye), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (BX20220023, 2022M720288'den J.Z.'ye), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7252157'dan J.Z.'ye). Pekin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (7232096'den Y.L.'ye), Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi'nin Devlet Anahtar Vasküler Homeostaz ve Yeniden Şekillenme Laboratuvarı'ndaki Araştırma Projesi (Pekin Üniversitesi; 2024-VHR-SY-07'den YZ'ye). Şekil 1, onaylanmış lisanslara sahip Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM Yüksek GlikozGibcoKedi# 06-1055-57-1-ACS
PBSGüneş EnerjisiKedi# P1010
Penisilin-Streptomisin-amfoterisin BThermo Fisher BilimselKedi# 15240062
FenilefrinMCEKedi#HY-B0769
Ters transkripsiyon sistemiPromegaKedi# A5001
Steremikroskobik sistemLeicaM80 Serisi
SYBR Yeşil ana karışımThermo Fisher BilimselKedi# 4309155
Damar gerilimi ölçüm sistemiDMT620 DK.

Kaynaklar

  1. Cases and observations illustrative of renal disease, accompanied with the secretion of albuminous urine. Med Chir Rev. 25 (49), 23-35 (1836).
  2. Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
  3. KDIGO 2020 clinical practice guideline for diabetes management in chronic kidney disease. Kidney Int. 98 (4S), S1-S115 (2020).
  4. Amatruda, J. G., et al. Reninangiotensinaldosterone system activation and diuretic response in ambulatory patients with heart failure. Kidney Med. 4 (6), 100465(2022).
  5. Valente, M. A., et al. Diuretic response in acute heart failure: clinical characteristics and prognostic significance. Eur Heart J. 35 (19), 1284-1293 (2014).
  6. Damman, K., et al. Renal effects and associated outcomes during angiotensinneprilysin inhibition in heart failure. JACC Heart Fail. 6 (6), 489-498 (2018).
  7. Curaj, A., et al. Cardiovascular consequences of uremic metabolites: an overview of the involved signaling pathways. Circ Res. 134 (5), 592-613 (2024).
  8. Wang, J., et al. New insights into the pathophysiological mechanisms underlying cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 12 (12), 12422-12431 (2020).
  9. Zou, D., Li, Y., Sun, G. Attenuation of circulating trimethylamine Noxide prevents the progression of cardiac and renal dysfunction in a rat model of chronic cardiorenal syndrome. Front Pharmacol. 12, 751380(2021).
  10. Zhang, S., et al. Sensing ceramides by CYSLTR2 and P2RY6 to aggravate atherosclerosis. Nature. 641 (8062), 476-485 (2025).
  11. Zhang, J., Bottiglieri, T., McCullough, P. A. The central role of endothelial dysfunction in cardiorenal syndrome. Cardiorenal Med. 7 (2), 104-117 (2017).
  12. Guo, J., et al. Vasculopathy in the setting of cardiorenal syndrome: roles of proteinbound uremic toxins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 313 (1), H1-H13 (2017).
  13. Khandait, H., Sodhi, S. S., Khandekar, N., Bhattad, V. B. Cardiorenal syndrome in heart failure with preserved ejection fraction: insights into pathophysiology and recent advances. Cardiorenal Med. 15 (1), 41-60 (2025).
  14. Gabbin, B., et al. Toward human models of cardiorenal syndrome in vitro. Front Cardiovasc Med. 9, 889553(2022).
  15. Gabbin, B., et al. Heart and kidney organoids maintain organspecific function in a microfluidic system. Materials Today Bio. 23, 100818(2023).
  16. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  17. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and realtime recording of dynamic tension changes along vessel diameter. J Vis Exp. (184), e64121(2022).
  18. Lai, Y., et al. Gut microbiotaderived metabolites: potential targets for cardiorenal syndrome. Pharmacol Res. 214, 107672(2025).
  19. Brunt, V. E., et al. TrimethylamineNoxide promotes agerelated vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in mice and healthy humans. Hypertension. 76 (1), 101-112 (2020).
  20. Wang, B., Qiu, J., Lian, J., Yang, X., Zhou, J. Gut metabolite trimethylamineNoxide in atherosclerosis: from mechanism to therapy. Front Cardiovasc Med. 8, 723886(2021).
  21. Seldin, M. M., et al. Trimethylamine Noxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogenactivated protein kinase and nuclear factorκB. J Am Heart Assoc. 5 (2), 002767(2016).
  22. Watanabe, H., et al. pCresyl sulfate, a uremic toxin, causes vascular endothelial and smooth muscle cell damages by inducing oxidative stress. Pharmacol Res Perspect. 3 (1), e00092(2015).
  23. Muteliefu, G., et al. Indoxyl sulfate promotes vascular smooth muscle cell senescence with upregulation of p53, p21, and prelamin A through oxidative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (2), C126-C134 (2012).
  24. Kotlyarov, S., et al. Immunology of atherosclerosis: problems and prospects of immunotherapy. Vessel Plus. , (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kardiyorenal SendromPlazma MetabolitleriBa rsak MikrobiyotasVask ler Fonksiyonel AnalizlerRenal Vask ler HasarHistopatolojik AnalizMetabolik Biyobelirte ler
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.