Yöntem makalesi

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 Kasım 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsamlı deneysel kanıtlar, epigenetik mekanizmaların kanserin başlangıcı, ilerlemesi ve tekrarlanmasında rolünü desteklemektedir. Bunlar arasında, histon varyantları ve onların translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler), kromatin organizasyonunu ve dinamiklerini ve genom erişilebilirliğini düzenler; böylece transkripsiyon, replikasyon ve DNA hasarının onarımı gibi temel DNA tabanlı süreçleri etkileyerek histon kodu olarak adlandırılır. Düzensiz histon PTM desenleri kanserlerde sıkça gözlemlenir; bazı belirteçlerin tanısal ve prognostik biyobelirteç olarak hizmet ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, klinik örneklerde tarafsız ve kapsamlı histon PTM profillemesini mümkün kılan yeni metodolojiler, tümörlerin epigenetik manzaralarını karakterize etmek için son derece değerlidir. Burada, klinik örneklerden histonların verimli çıkarılması için bir protokol sunuyoruz; bunlar arasında ani dondurulmuş, optimal kesme sıcaklığı (OCT) dondurulmuş ve formalin sabitlenmiş parafinli gömülü (FFPE) biyopsiler yer alıyor. Bu yaklaşım, yüksek performanslı sıvı kromatografi ve tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile aşağıdan yukarıya analiz için yeterli miktar ve kalitede histon proteinleri elde eder. Bu iş akışı, birincil tümör örneklerinde özellikle lizin asetilasyonları ve metilasyonları gibi temel histon modifikasyonlarının sağlam bir şekilde tespit edilmesini ve nicelendirilmesini sağlar ve kanser karakterizasyonu için ek bir moleküler tabaka sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryot hücrelerin çekirdeğinde, histonlar DNA ile birleşerek kromatinin temel yapısal birimleri olan nükleozomları oluşturur. Her nükleozom, çekirdek histonlar H2A ve H2B'nin iki kopyasından oluşan bir oktamerin etrafına sarılmış yaklaşık 146 bp DNA'dan oluşur; ayrıca H3 ve H4 histonlarının iki dimeri bulunur. Ayrıca, bir linker histon H1 de mevcuttur ve hem nükleozom hem de linker DNA uzanımlarınınükleozom 1 arasında bağlayarak kromatinin üst dereceden organizasyonunu kolaylaştırır. Histonlar esas olarak N-terminal kuyruklarında bulunan çok çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) ile süslenir. Bu modifikasyonlar arasında metilasyon, çeşitli asilasyon türleri (asetilasyon, propionilasyon, butirilasyon vb.), fosforilasyon, SUMOylasyon, ubiquitilasyon, ADP-ribozilasyon ve krotonilasyon bulunur; bunlar arasında lizin ve arginin metilasyonu ile lizin asetilasyonu en çok karakterizeedilenlerdir. Histon modifikasyonlarının özel türleri, konumları ve kombinasyonları, histon kodu olarak bilinen şeyi oluşturur. Bu kod, histonların N-terminal kuyruklarında çeşitli post-translasyonel modifikasyonlardan (PTM) oluşur; bu modifikasyonlar belirli histon modifiye edici enzimler tarafından eklenip çıkarılır. Bu modifikasyonlar daha sonra efektör proteinler tarafından tanınır ve kromatin yapısında sıkışma veya dekondensasyon gibi değişikliklere yol açar; bu da nihayetinde DNA hasarının onarımı, çoğalması ve özellikle gentranskripsiyonu 3,4 gibi çeşitli biyolojik süreçleri etkiler.

DNA metilasyonu ve histon PTM'ler, kanserde en çok incelenen epigenetik özelliklerarasındadır. Son deneysel kanıtlar, çeşitli kanser tiplerinde çeşitli histon PTM seviyelerinde değişiklikler olduğunu göstermiştir. Özellikle, H4K20me3 ve H4K16ac kaybı kanserin belirgin özellikleri olarak bildirilmiştir; çünkü seviyeleri neredeyse tüm tümörlerde normal dokulara kıyasla daha düşükbulunmuştur. Grubumuz, H3K14ac kaybını, kütle spektrometrisi (MS) tabanlı yaklaşımlarla normal kanserlere kıyasla birkaç kanserde azalmasını niceleyerek potansiyel bir kanser işareti olaraktanımladı 5. Ayrıca, birçok çalışma histon PTM'lerin prognostik değerini vurgulamış ve hasta biyopsilerinde öncelikle immünohistokimya ile değerlendirilen küresel seviyelerindeki değişikliklerin kanser ilerlemesi, histolojik derecelendirme ve terapötik yanıt 6,7,8 ile korelasyon olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, kanser örneklerinde histon PTM analizi, yeni tanısal ve prognostik biyobelirteçlerin ve sözdeepi-ilaçların potansiyel hedeflerinin tanımlanması için önemlidir 8.

Hücre hatlarında ve klinik örneklerde histon PTM'lerin analizi için çok yaygın yöntemler, immunoblottasyon, immünohistokimya ve enzimle bağlantılı immünosorbent test (ELISA) gibi antikor tabanlı tekniklere dayanır. Ancak, antikor tabanlı yöntemler, çapraz reaktivite veya tersine, epitop maskelenmesi gibi çeşitli sınırlamalara sahiptir10. Çapraz reaktivite, antikorların benzer epitoplara sahip istenmeyen hedeflere bağlanması ve potansiyel yanlış pozitiflere yol açmasıyla oluşur; epitop maskelemesi, komşu kalıntılarda başka modifikasyonların bulunması nedeniyle belirli bir epitopun (bu durumda bir histon PTM veya varyant) kaçırılması anlamına gelir. Ayrıca, antikorlarla histon modifikasyonu analizi için gereken doku miktarı genellikle yüksektir, çünkü aynı anda sınırlı sayıda PTM tespit edilebilir, bu nedenle çoklu analizler için birkaç doku diliminin işlenmesi gerekir11. Kütle spektrometrisi (MS), histon PTM'leri ve varyantlarının profillenmesinde tercih edilen yöntem olarak ortaya çıkmıştır ve antikor tabanlı yaklaşımların sınırlamalarınıaşmıştır 5,8. MS, teorik ve deneysel olarak ölçülen peptid ve protein kütleleri arasında bir kütle farkının (Δm, delta kütle) tespitine dayanır. Tarafsız, kapsamlı ve nicel bir yapıya sahiptir; çünkü PTM'lerin ve varyantların önceden tespit edilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar, ancak yerlerini önceden bilmeden tespit edilir. Bu durum, MS'i, kanser ve diğer patolojik durumlarda histon PTM değişikliklerinin hassas ve doğru analizi için özellikle değerlikılar 8.

Burada, klinik örneklerden histon ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü ve MS tabanlı histon PTM'lerin profillenmesini (daha sonra epi-proteomik iş akışı olarak adlandırılan) tanımlıyoruz. Hasta biyopsileri ağırlıklı olarak taze dondurulmuş (FF) örnekler, optimal kesme sıcaklığı (OCT) donmuş örnekler ve formalin sabitli parafin-gömülü (FFPE) örnekler olaraksaklanır 12. Taze biyopsiler, herhangi bir koruma ortamı eklemeden sıvı azot veya önceden soğutma izopentanındadondurulurken, OCT dondurulmuş biyopsiler, ağırlıklı olarak polivinil alkol ve polietilen glikolden oluşan suda çözünür kriyoprotektif bir yerleştirme ortamı içerir ve doku dilimlemesinikolaylaştırır 14. Öte yandan, formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülü FFPE örnekleri, klinik örnekler için en yaygın depolama yöntemidir; çünkü oda sıcaklığında birkaç yıl saklanabilirler ve düşük veya ultra düşük sıcaklıklarda maliyetli bakım önlenir15. Koruma katkılarından arındırıcı olan snap-dondurulmuş biyopsiler doğrudan histon ekstraksiyonu için işlenebilirken, OCT-dondurulmuş ve FFPE biyopsileri ise gömülü ortam/fiksatif çıkarımın ilk adımlarını gerektirir. FFPE örnekleri ayrıca kapsamlı protein decrosslinking ve antijen geri kazanımı gerektirir.

Bu protokol, taze dondurulmuş, OCT-gömülü ve FFPE klinik örneklerinden histon çıkarma için ayrıntılı yöntemleri özetlemekte, her örnek koruma türünün özel zorluklarını göz önünde bulundurarak aşağı akış MS analizi için yeterli miktar ve kaliteyi garanti eder (adım 1). Klinik örneklerden saflaştırılan histonlar, denatürleme koşullarında protein jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılır, ardından bir türevleme aşaması yapılır ve enzimatik olarak sindirilir, böylece aşağıdan yukarıya kütle spektrometrisianalizi 16 (adım 2) için uygun uzunlukta (4-15 amino asit) peptidler üretilir. Daha spesifik olarak, histonlar, genellikle modifiye edilmemiş lizinlerin (K) ve argininlerin (R) C-terminalinde kesen tripsin, daha önce propionik anhidrit (PRO) ile değiştirilmemiş ve monometillenmiş lizinlerin kimyasal asilasyonu nedeniyle ArgC'ye benzer bir stratejiyle sindirilir; bu stratejide genellikle C-terminalinde kesim yapılır. Sonra, Arg-C benzeri sindirilmiş histon peptitleri, fenil izosiyanat (PIC) eklenmesiyle N-terminal kuyruklarında asillenir. Bu daha fazla türevleşme, peptid hidrofobisitesini artırır ve ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) ile kısa histon peptitlerinin daha iyi ayrılmasını sağlar; böylece izobarikpeptidoformlar 17,18'in tanımlanması ve nicelendirilmesi iyileştirilir (adım 3). Burada açıklanan yöntemler, kanser epigenetiği çalışmalarında MS tabanlı histon profillemenin gücünü vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avrupa Onkoloji Enstitüsü'nde (Milano) ameliyat yapılan hastalardan bilgilendirilmiş onayla taze dondurulmuş ve OCT dondurulmuş doku biyopsileri, Milano Istituto Neurologico Carlo Besta'da ameliyat olan hastalardan FFPE biyopsileri alındı. Bu çalışma, Avrupa Onkoloji Enstitüsü Etik Komitesi (Çalışma UID 2550) ve Istituto Neurologico Carlo Besta (Çalışma CET 39/24) tarafından onaylandı.

1. Hasta kaynaklı dokulardan histon ekstraksiyonu (Şekil 1A)

NOT: Temsil tümör hücre popülasyonlarından histonları analiz etmek ve örnek arası değişkenliği azaltmak için, en az %50 hücreliliğe sahip ve nekrotik alanlar ve/veya yaygın bağışıklık sızıntısı olmayan klinik biyopsilerin kullanılması tavsiye edilir.

  1. Taze donmuş dokulardan histon zenginleştirmesi (tahmini süre: 60 dakika)
    NOT: Tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
    1. Dokuyu buz üzerinde eritin ve genellikle yaklaşık 2 mm3 dokuya karşılık gelen yaklaşık 20-30 mg bir parça kesin.
    2. Numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu makasla küçük parçalara doğrayın (Materyal Tablosu).
    3. Malzemeler Tablosu'nda listelenen proteaz inhibitörleriyle taze takviye edilmiş 1 mL Çekirdek İzolasyon Tamponu (Tablo 1) ekleyin. Sonrasında iyice karıştır.
    4. Örneği bir Dounce homojenizatoruna (Materyal Tablosu) aktarın.
      NOT: Büyük doku parçaları varsa, numuneyi daha iyi toplamak için p1000 ucu kullanın (ucu makasla kesilince).
    5. Dokuyu önce LOOSE, sonra TIGHT tokvanı (Malzemeler Tablosu) kullanarak homojenleştirin; doku parçaları çıplak gözle görünmez hale gelene kadar.
    6. Homojenleştirilmiş örneği 100 μm hücre süzgeciyle (Materyal Tablosu) filtreleyerek doku kalıntılarını çıkarın.
    7. Plazma zarını çözerek p200 ile pipetle sertçe yukarı aşağı hareket ettirin ve örneği yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    8. Hücre çekirdeklerini 2.300 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 15 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj ile santrifüjle pelet edin (Materyal Tablosu).
    9. Süpernatantı atın ve nükleer peletleri 50-100 μL Çekirdek İzolasyon Tamponunda yeniden süzülür, %0,1 SDS ile takviye edilerek nükleer zarı çözebilir (Materyal Tablosu).
    10. Nüklein asitleri sindirmek için 250 U Benzonez nükleaz ekleyin, iyi karıştırın ve 37°C'de 2 dakika kuluçka yapın (Malzemeler Tablosu).
      NOT: Numune hâlâ viskoz ise, sonikasyon su banyosunda da yapılabilir (ayar: 10 dakika 30 saniye AÇIK/30 saniye KAPALı; güç: yüksek; sıcaklık: 4 °C). Bu adımdan sonra örnekler -20 °C'de saklanabilir.
  2. OCT örneklerinden histon zenginleştirme (tahmini süre: 90 dakika)
    NOT: Bu protokol, 20-60 mg dokuya karşılık gelen dört/beş 10 μm kalınlığında OCT kesitleri için optimize edilmiştir. Ancak, doku kesitlerinin sayısı klinik biyopsi türüne ve toplam doku alanına bağlıdır. Klinik örneklerin kıtlığı göz önüne alındığında, daha düşük miktarda başlangıç dokusundan ekstraksiyon yapılabilir, ancak bu histon modifikasyonlarının azalmasına yol açabilir.
    1. Yaklaşık 20-60 mg dokuya karşılık gelen dört/beş adet 10 μm kalınlığında doku kesitlerini 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    2. Bölümleri 1 mL buz gibi soğuk %70 EtOH (Tablo 1) ile dönen bir tekerlekte (Malzemeler Tablosu) 2 dakika boyunca 4 °C'de yıkayın.
    3. 16.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 2 dakika boyunca tezgah üstü santrifüjde santrifüj yapın.
    4. 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını toplamda 3 kez tekrarlayın.
    5. Örnekleri 1 mL çift damıtılmış suda (ddH2O) rotasyonla (Malzemeler Tablosu) 4 °C'de 2 dakika boyunca yeniden hidratlayın.
    6. 16.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 2 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde (Malzemeler Tablosu).
    7. 1.2.5 ve 1.2.6 adımlarını 1x PBS (Materyal Tablosu) ile iki kez tekrarlayın.
    8. Taze donmuş örneklerden zenginleştirme protokolünün 1.1.2 adımına geçin.
  3. FFPE örneklerinden histon çıkarımı (tahmini süre: 8 saat)
    NOT: Tarif edilen protokol, yaklaşık 20-60 mg dokuya karşılık gelen dört adet 10 μm kalınlığında FFPE kesitleri için geliştirilmiştir. Çoğu MS histon modifikasyonu analizinde bu miktar fazladır ve malzeme sınırlayıcı olmadığında güvenli bir başlangıç noktasını temsil eder. Ancak, daha az başlangıç materyali de kullanılabilir; bu durum, klinik örnekler analiz edilirken genellikle az miktarda doku olması göz önüne alındığında oldukça önemlidir. Daha az başlangıç materyali kullanımı, uygulanabilir olsa da, genellikle düşük bolluklu histon modifikasyonları (örneğin, H3K27ac veya çoklu metilen H3K27/K36 peptitleri) için niceliklendirme dayanıklılığını azaltır ve bu etki doku tipine ve numuneden numuneye bağlı olarak değişebilir. Buna rağmen, laboratuvarımız daha önce MS tabanlı histon PTM profillemenin, meme kanseri FFPE örneklerinin lazerle mikrodiseksiyonlu doku alanlarından başarıyla yapılabileceğini göstermiştir; bu bölgeler 1.000 hücreye kadar en düşük seviyeye denk gelir18.
    1. Yaklaşık 20-60 mg dokuya karşılık gelen dört adet 10 μm kalınlığında FFPE kesitini 1,5 mL'lik bir tüpe içine yerleştirin.
    2. Parafin tamamen çözünene kadar numuneye ve girdaba (Malzemeler Tablosu) maksimum hızda 1 mL parafin eritici madde ekleyin.
      DIKKAT: Parafin çözen reaktifler mutajenik, kanserojen ve yanıcıdır, bu yüzden kimyasal bir kapüşon altında kullanılmalıdır.
      NOT: Parafin çözünürlüğü, parafin parçaları artık çıplak gözle görünmediğinde ve parafin çözünürücü maddenin beyaz, homojen bir renge sahip olması durumunda sağlanır.
    3. 16.000 x g boyunca tezgah üstü santrifüjde 3 dakika boyunca RT ile santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Süpernatant çıkarma sırasında istenmeyen örnek aspirasyonunu önlemek için, vakum pompası/pipetleri daha küçük bir uçla (örneğin, p200, p10 uçları) kaplanabilir.
    4. Tam parafin çıkarılması için 1.3.2 ve 1.3.3 adımlarını üç kez daha (toplamda 4 kez) tekrarlayın. Alternatif olarak, tamamen parafinizden arınmış örneği tartarak işlenen doku miktarının göstergesini elde edin.
    5. Tam doku resüspansiyonu için 1 mL %95 EtOH çözeltisi (Tablo 1) eklenin ve maksimum hızda 30 saniye girdaba basın.
    6. 16.000 x g boyunca tezgah üstü santrifüjde 3 dakika boyunca RT ile santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Alternatif olarak, işlenen kuru doku miktarının göstergesi için kuru numuneyi tartın.
    7. Örnek yeniden hidratlandırılmak için 1.3.5 ve 1.3.6 adımlarını %70, %50 ve %20 EtOH (Tablo 1) ile ddH2O ile tekrarlayın.
    8. 200 μL ekstraksiyon tamponu ekleyin (Tablo 1).
      NOT: Daha büyük doku parçaları varsa, makasla daha küçük parçalara kesin. Doku miktarına bağlı olarak, uygun örnek lizisini sağlamak için daha küçük/daha büyük hacimlerde ekstraksiyon tamponu eklenebilir. Özellikle küçük pelletler, 100 μL'den düşük bir Ekstraksiyon tamponu hacmine yeniden süspansiye alındığında, sonikasyon cihazı (Materyal Tablosu) kullanılarak yapılabilir (30 s AÇIK/30 s KAPALı güç: yüksek, 10 döngü).
    9. Ekstraksiyon tamponunda dokuyu sonikasyon ile sonikasyon ile 3 mm mikrouçlu (>15 döngü, 5 saniye AÇIK/2 dakika KAPALı, güç: %15-30) kullanarak homojenleştirin.
      NOT: Çözeltide görünür doku parçacıkları görünmediğinde ve ekstraksiyon tamponu tekerer, bulanık olmayan bir renk sergilediğinde, örnekler doğru şekilde homojenleştirilmiş sayılabilir. Sonikasyon döngüleri sırasında örnekleri RT'de tutun. Buz, Ekstraksiyon tamponunda SDS'nin çökelmesine neden olabilir ve bu da doku homojenleşmesini bozabilir. Tam doku analizi ve protein ekstraksiyonu için doğru sonikasyon çok önemlidir. Mikrouç tüpünü örnek tüpünde doğru bir yüksekliğe yerleştirin (tüpün altına dokunmamalı, plastik parçacıklar salgılamalı ve hava çıkarma tampon arayüzünde olmamalı, köpük ve kabarcıklar oluşturmamalıdır).
    10. Homojenizasyondan sonra, örnekleri termomikserde 95 °C'de 45 dakika kuluçka altına alın. Her 15 dakikada bir, formaldehitin buharlaşmasına izin vermek için tüplerin kapağını açın.
    11. Örnekleri termomikserde 65 °C'de 4 saat kuluçka altına alın. Formaldehitin buharlaşması için kapağı her 20-60 dakikada bir açın.
    12. 16.000 x g boyunca 1 dakika boyunca RT olarak bir tezgah üstü santrifüjde santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
      NOT: Örnekler bu noktada -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.

Tablo 1: Tampon Bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. SDS-PAGE ve jel içi sindirim yoluyla histon çözünürlük

  1. SDS-SAYFA (Şekil 1B; tahmini süre: 2 saat)
    1. Histon saflığını değerlendirmek ve miktarını tahmin etmek için, histon ekstraktlarının 1/10'unu %17 poliakrilamid jele (SDS-PAGE; Tablo 1) Şekil 1B'de gösterildiği gibi bilinen miktarda rekombinant histonların yanı sıra.
      NOT: Histon ekstraktlarının 1/10'u yüklenmek yerine, yüksek deterjan konsantrasyonlarına tolere eden testlerle, örneğin bicinchoninic acid (BCA) proteintesti 19 gibi testlerle ölçüldüğünde, 15-50 μg protein yüklenebilir. Ancak, toplam proteinler üzerindeki histon zenginleşmesinin taze dondurulmuş, OCT dondurulmuş ve FFPE örneklerinde önemli ölçüde değişebileceğini ve histon miktarının nicelendirilmesinin yalnızca SDS-PAGE ile yapılabileceğini unutmayın. 1, 0.5 ve 0.25 μg rekombinant histon H3.1 (Materyal Tablosu), histon miktarını daha hassas şekilde ölçmek için referans olarak yüklenebilir.
    2. Örnekleri lityum dodesil sülfat (LDS) yükleme tamponuyla veya SDS-PAGE için eşdeğer yükleme tamponlarıyla (örneğin, Laemmli tamponu) ditiothreitol (DTT; Malzeme Tablosu) nihai konsantrasyon 10 mM'dir.
    3. Örnekleri termomikserde 95°C'de 5 dakika boyunca denatüre edin.
    4. SDS-SAYFA üzerinde protein ayrıldıktan sonra, jeli Coomassie boyama ile boyandırın (Materyal Tablosu).
    5. Klinik örneklerdeki histon bantlarının görsel veya yazılımdestekli 20 nicel ölçüsiyle bilinen miktarlarda yüklenmiş rekombinant histon H3'e kıyasla histon verimini tahmin edin.
  2. Histone in-jel sindirimi (Şekil 2; Tahmini süre: 2 gün)
    NOT: ArgC benzeri sindirim, histon PTM'lerin MS-analizinde kullanılır çünkü standart tripsin sindirimi, lizin ve arginin amino asitlerinin dizisinde yüksek sıklığı nedeniyle aşırı kısa peptitler üretir ve bu da LC-MS peptidlerinin tespit edilmesini ve PTM tanımlamasını engeller. Lizin kimyasal olarak modifiye edilerek, bu bölgelerdeki triptik bölünme önlenir; bu da argininlerin yalnızca C-terminalinde bölünme ile bölünmeye yol açar ve dizide modifiye lisinler içeren daha uzun peptitler (4-15 amino asit) üretilir; Genel olarak, bu protokol modifiye histon peptitlerinin MS algısını ve ölçümü kolaylaştırır ve birçok yayında ayrıntılı şekilde tanımlanmıştır8,17,21.
    İÇERİ OPSIYONELI: İç bir standart (örneğin, ağır etiketli spike-in, sentetik olarak etiketlenmiş peptitler)22), MS'de daha doğru peptit nicelendirmesi sağlamak için histon örnekleriyle 1:1 oranında karıştırılabilir (Şekil 2B).
    1. Proje 2.1.5'te (Şekil 2B) yapılan tahmini histon miktarına dayanarak, %17 poliakrilamid jel üzerine 3-5 μg histon örneği yüklenin.
    2. SDS-PAGE'den sonra, jeli Coomassie boyama ile boyanarak proteinleri görselleştirin.
      NOT: LC-MS/MS analizini engelleyebilecek kontaminasyonu önlemek için, keratin güçlü bir MS kirleticisi olduğundan, özel bir kapot gibi keratin içermeyen bir ortamda aşağıdaki adımların yapılması tavsiye edilir.
    3. Çekirdek histon proteinlerinin moleküler ağırlığına karşılık gelen eksiz jel bantları (10 ile 18 kDa arasında jel bandı, her çekirdek histon için aşağıdaki moleküler ağırlık dikkate alınarak: H3 yaklaşık 17 kDa, H2A-H2B yaklaşık 14 kDa, H4 yaklaşık 11 kDa) bir bistik kullanılarak (Materyal Tablosu) ve bantlar yaklaşık 1 mm3 boyutunda parçalar halinde kesilir.
    4. Skarpel yardımıyla jel parçalarını 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: Jel parçalarını tamamen kaplamak için, aşağıda belirtilen hacimler artırılabilir ve reaktif stoichiometry korunur.
    5. Jel parçalarını ddH2O içinde %50 asetonitril (ACN) çözeltisi ekleyerek dedeten edin (Tablo 1). 1.400 rpm'de ayarlanmış termomiksere 10 dakika RT boyunca yerleştirin ve ardından süpernatantı atın.
    6. Jel parçaları tamamen lekelenmeden çıkana kadar 2.2.5. adımı tekrarlayın.
    7. Jel parçalarını %100 ACN (Malzemeler Tablosu) ekleyerek kurutun. 1.400 rpm'de karıştırarak 10 dakika RT boyunca kuluçka yapın ve ardından süpernatantı atın.
    8. 2.2.7 adımını jel parçaları beyaz ve sert hale gelene kadar tekrarlayın, böylece tamamen susuz kalsın.
    9. Jel parçalarını RT'de vakumlu santrifüjde 5 dakika kurutun (Malzemeler Tablosu).
      NOT: Histonlar sisteinlerde zayıftır (histon H3'te 96 ve 110 pozisyonlarında sadece iki sistein bulunur (UniprotKB ID P68431), histon H2B'de ise 154 pozisyonunda sadece bir sistein bulunur (UniprotKB ID B4DR52)). Ayrıca, bu sisteinler, aşağıdan yukarıya MS'de ArgC benzeri sindirimde tespit edilemeyen peptitlerde bulunur; bu nedenle tiolgrupları 23'ün kimyasal adduktları MS histon analizinde bir artefakt değildir ve belirtilen protokolde sistein indirgemesi ve alkilasyon adımları yapılmaz.
    10. Her tüpe 15 μL 7,7 M propionik anhidrit (PRO) çözeltisi (Malzeme Tablosu) ve 26 μL 1 M amonyum bikarbonat (AmBic) (Malzemeler Tablosu) eklenir ve örnekleri 350 rpm'de ayarlanmış bir termomikserde 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Reaktif bir tamponda çözünen anhidridler buharlaşma eğiliminde, PRO ve AmBic'in ana karışımını hazırlamayın; her numuneye ayrı ayrı ekleyin; böylece her tüpte uygun PRO konsantrasyonu sabit kalın.
    11. Jel parçalarını tamamen kaplayın, 1 M AmBic (önerilen hacim: 80 μL) ekleyerek ve örnekleri 1.400 rpm'de 4 saat boyunca 37°C'de termomikserde karıştırarak inkübe yapın. Sonrasında tüm sıvıyı çıkarın.
      NOT: Temel pH'ı korumak için 1 M AmBic eklenir; bu da PRO ile modifiye edilmemiş ve monometile edilmiş lizinlerin propionilasyonunu katalize etmek için idealdir.
    12. DdH2O ile üç kez yıkayıp arada RT hızında 10 dakika boyunca inkübe yapın ve 1.400 rpm'de termomikserde karıştırın. Her yıkamadan sonra sıvıyı atın.
    13. %50 ACN ekleyin ve 1.400 rpm'de termomikserde RT'de 15 dakika kuluçka yapın. Sıvıyı sonrasında atın.
    14. Jel parçalarını %100 ACN ekleyerek tamamen kurutun ve 1.400 rpm'de RT'de 15 dakika boyunca termomikserde inkübe yapın. Sonra sıvıyı atın.
    15. Jel parçaları beyaz ve kuru görünene kadar 2.2.14. adımı tekrarlayın.
    16. Kuru jel parçaları vakumlu santrifüjde RT'de 5 dakika bekletin.
    17. Her numuneye 4 μL tripsin çözeltisi (Tablo 1) ve 20 μL Sindirim tamponu (Tablo 1) ekleyin ve tripsinin jel parçalarına emilmesini sağlamak için 10 dakika buzda kuluçka yapın.
      NOT: Bu kuluçka, konsantre tripsin çözeltisi ve Sindirim tamponu (ddH2O içinde 50 mM AmBic, tripsin bölünmesi için ideal temel pH oluşturur) ile gerçekleştirilir - enzimin 37 °C'de aktivasyondan önce jel parçaları tarafından emilenmesini sağlar.
    18. Konsantre tripsin tamamen emildiğinde, jel parçalarını ek Sindirim tamponu (gösterge hacmi: 80 μL) ile iyice kaplayın ve 37 °C'de gece boyunca termomikserde kuluçka yapın.
    19. Jel parçalarından sindirilmiş peptitleri çıkarmak için 100 μL %100 ACN ekleyin ve 1.400 rpm'de RT hızında 20 dakika termomikserde kuluçka yapın.
    20. Süpernatantı topla ve yeni bir 1.5 mL tüpe aktar.
    21. Jel parçalarına 80 μL %100 ACN ekleyin ve termomikserde 1.400 rpm'de 10 dakika RT boyunca inkübe yapın.
    22. Süpernatantı toplayın ve 2.2.20. Adımda toplananlarla birleştirin, ardından peptitleri vakumlu santrifüjde 1 ile 5 μL arasında bir hacmde konsantre edin.
      NOT: Vakum santrifüjünün kullanımı, organik çözücünün (ACN) buharlaştırılmasına olanak tanır. Ancak, bu aşamada numunenin tamamen kurutulmaması önerilir; çünkü bu sonraki türev adımını olumsuz etkileyebilir. Numune kuruyursa, ddH2O suya tekrar soluk kalın, ardından 5 dakika boyunca su banyosunda soniklendirin.
    23. Her numuneyeddH 2O ekleyin, son hacmi 15 μL'ye, ardından 2 μL 1 M trietilamoniyum bikarbonat (Malzemeler Tablosu) ve 3 μL fenil izosiyanat (PIC) çözeltisi (Tablo 1) eklenin ve termomikserde 350 rpm'de 90 dakika boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
      DIKKAT: PIC mutajenik ve kanserojendir, bu yüzden kimyasal bir kapüşon altında ele alınması önerilir. PIC yüksek reaktif ve uçucu olduğundan, trietilemoniyum bikarbonat ve PIC ana karışımı hazırlamaktan kaçınmak önerilir, ancak tam PIC konsantrasyonunun bulunmasını sağlamak için her reaktifi ayrı ayrı eklemek önerilir.
    24. Her tüpe 8 μL %1 trifluroasetik asit (TFA; Malzeme Tablosu) PIC ile türevleşmeyi durdurmak için.
    25. Her örneği 100 μL Buffer A ile seyreldin (Tablo 1) ve bunları C18 aşama uçlarına yükleyin (24'te tanımlandığı gibi hazırlanmış veya farklı sağlayıcılardan satın alınmış).
    26. Örnekleri 2.100 x g hassasiyetinde, 4 °C'de 10 dakika boyunca salıncak rotor santrifüjde döndürerek histon peptitlerinin C18 reçinesine bağlanmasını sağlar.
      NOT: Örnekler, birkaç ay boyunca 4 °C sıcaklıkta aşama uçlarında saklanabilir.
    27. C18 Aşama Uçlarına 30 μL elusyon tamponu (Tablo 1) ekleyin ve uçları yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Örnekleri 1.000 x g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4 °C sıcaklıkta bir tezgah üstü santrifüjde çevirerek histon peptitlerini üüliye çıkarın.
    28. Örnekleri vakum santrifüjle 1 ila 3 μL arasında bir hacme konsantre edin, ardından %1 TFA ekleyerek nihai hacmi 6 μL elde edin.
    29. MS analizi için 96 kuyruklu bir mikroplakaya 5 μL peptid çözeltisi yüklenin (Malzemeler Tablosu) ve bir sızdırmazlık matı ile mühürleyin (Materyal Tablosu).

3. HPLC-MS/MS ve veri analizi (Şekil 3)

NOT: Burada açıklanan parametreler, EASY Spray kolonu üzerinden Q Exactive Plus Orbitrap kütle spektrometresine bağlı ESAY-nLC 1200 sıvı kromatografi sistemi için uygundur (Materyal Tablosu), ancak benzer/eşdeğer aletler de geçici parametrelerle kullanılabilir.

  1. HPLC-MS/MS (tahmini süre: örnek başına 90 dakika)
    1. 2.2.29. adımdaki 5 μL histon peptitinden 3 μL'ni (SDS-PAGE tarafından histon nicelenmesine göre yaklaşık 0.25-0.8 μg den) bir C18 nanosütuna (Materyal Tablosu) Buffer A'da 500 nl/dakika sabit akışla enjekte edin.
    2. Ayrı peptidlere 250 nL/dakika akış hızında %10-%45 Tampon B oranında 55 dakikalık doğrusal gradyan uygulayın.
    3. MS/MS verilerini, özel yazılım paketleri (Materyaller Tablosu) kullanarak MS1 ve MS2 arasında otomatik geçiş yapmak için veriye bağımlı modda (DDA) edinin.
      NOT: Satın alma ve genel ayarlar için Tablo 2'ye bakınız.
  2. RAW MS veri analizi
    NOT: Bu protokolde, histon PTM'lerin nicelendirilmesi, H3 ve H4 lizin metilasyonları ve asetilasyonları için tanımlanan standart analizler için uygun olan açık bir script (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family) olan EpiProfile kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, EpiProfile, daha az standart modifikasyonların analizlerini ve daha deneyimli kullanıcılar tarafından farklı örnek hazırlama protokollerini gerçekleştirecek şekilde özelleştirilebilir. Lütfen EpiProfile'ın25 çalıştırılması için MATLAB lisansı gerektirdiğini unutmayın.
    1. Edinilen RAW verileri EpiProfile 2.0 yazılımı (PRO-PIC sürüm)25 (Materyal Tablosu) ile analiz edin ve analiz etiketsiz yapıldığında histone_normal ve SUPER-SILAC spike-in kullanıldığında histone_SILAC seçenekleri seçerek histon peptitlerini nicelikle ölçün. Ndebug = 0 ayarla.
    2. Her histon peptidi (örneğin H3_3-8) için, her değiştirilmiş peptidoformun (örneğin, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) göreceli bolluğunu (%RA) EpiProfile tarafından hesaplanan çıkarılmış iyon kromatogramını (XIC) o peptid için hesaplanan tüm XIC'lerin toplamına bölerek hesaplayın.
      NOT: Opsiyon olarak, EpiProfile ile hesaplanan XIC'ler, MS spektrumlarının incelenmesi ve 18,26'da tanımlandığı gibi özel bir spektrum düzeni kullanılarak histon peptitlerinin manuel nicelenmesi ile doğrulanabilir.
    3. Her peptidoform için, her doğ, hafif peptidin %RA'sını, SUPER-SILAC karışımından elde edilen ilgili ağır peptidin %RA ile %RA ile bölünerek hafif-ağır (L/H) oranını hesaplayın; bu oran her numuneye siktirilmiştir.
    4. L/H oranlarını logaritmik bir ölçeke dönüştürün. Örnekler arasında peptidoform bolluğundaki önemli farkları vurgulamak için istatistiksel analiz yapılabilir ve tüm örneklerdeki L/H oranları, Şekil 4'te olduğu gibi ısı haritaları ve saçılım grafikleri olarak görsel olarak temsil edilebilir.

Tablo 2: Bu protokolde kullanılan sistemle LC-MS/MS için kullanılan Edinim ayarlarının ve Genel ayarının listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda belirtilen protokole uygun olarak taze dondurulmuş ve OCT dondurulmuş meme kanseri örneklerinden ve FFPE meningioma örneklerinden histon çıkarımı gerçekleştirdik. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, donmuş örnekler için OCT (OCT) çıkarıldı ve hafif bir deterjan içeren (%0,1 Triton adım 1.1) içeren çekirdek izolasyon tamponu içinde örnekleri homojenleştirdik, böylece çekirdek izolasyonu sağlandı. Sonra, %0,1 SDS eklenerek histon çıkardık; bunun yerine, FF...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yöntem, taze dondurulmuş, OCT dondurulmuş ve FFPE biyopsileri olarak depolanan klinik örneklerden histonları verimli bir şekilde izole etmek için basit ve sağlam bir iş akışı sağlar; bu süreçte MS analiziyle modifikasyon peyzajlarının profillenmesi sağlanır. SDS-PAGE ayırma ve tripsin ile PRO-PIC in-jel sindirimi yoluyla sonraki örnek hazırlama protokolü, deterjanlar, tuzlar ve diğer MSkirleticilerinin etkili şekilde çıkarılmasını sağlar ve histon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avrupa Onkoloji Enstitüsü ve Istituto Neurologico Carlo Besta'dan cerrah ve klinisyenleri FF, OCT dondurulmuş ve FFPE doku biyopsileri sağladıkları için teşekkür ediyoruz. El yazması hazırlığı sırasında yapılan bilimsel ve metodolojik tartışma ve finansmanlarımız için Roberta Noberini'ye teşekkür ederiz: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (hibe numarası IG-2023-28767) ve Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
kimyasallar
Histoloji için Histolemon RSCarlo Erba4549122.5 L
Asetonitril (ACN)Carlo Erba4123411L
Amonyum bikarbonat (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Amonyum persülfatı (APS)WDR1.012.010.500500 g
Aprotinin proteaz inhibitörüSigma Aldrich A11535 mg
Benzonaz nükleazıMerkE101425 KU
Bisakrilamid %30 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
A %0,1 formik asit ddH2O içinde tamponlaThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Tampon B %0,1 formik asit /%80 asetonitrile ddH2O içindeThermo Fisher Scientific15431423500 mL
C18 reçineMerck66883-U47 mm çapı
Coomassie Instant BlueAbcamAB1192111 L
Ditiotreitol (DTT) WDR441496P25 g
EtanolCarlo Erba4146082.5 L
Leupeptin  Proteaz inhibitörüSigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′,N′-Tetrametil etilen etilendiamin (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
NuPAGE LDS örnek tamponuInvitrogenNP00074x
PBS - Fosfat tamponlu tuzlu sindir;MicroGemTL1006500 mL
Phenil izosiyanat (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF) proteaz inhibitörüSigma Aldrich P76261 g
Propionik anhidrit (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Rekombinant Histon H3.1 İnsanNew England BiolabsM25031 µ g/µ L
Dizileme derecesi tripsinPromegaV5113100 ug
Sodyum bütirat (NaBut) histon deasetliaz inhibitörüMerckB58875 g
Sodyum dodesilsülfat (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Trietilemoniyum bikarbonatSigma AldrichT7408100 mL
Trifluoroasetik asit (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HÇLSigma AldrichT3253100 g
Triton X-100 deterjanSigma-Aldrich X100RS5 g
Kitler/ Ekipman/Yazılım
96-kuyu mikroplakasıCorningPCR-96-FS-CPirojenik olmayan, Rnase/Dnase içermeyen
DengeKaya19024
Tezgah üstü santrifüjHareus Biyofüj LaboratuvarıPico, 23396
Bioruptor Sonication CihazıDiyagen düğümü
Branson Dijital Sonifer 250Emerson
Hücre süzcü 100 & mikro; mDoğan352360
Konsantrasyon artıEppendorf5305000509
Dounce Homogenizer (örneğin & nbsp; Dounce, Wheaton...)Dounce, Wheaton1 mL doku öğütücüsü
EASY-nLC 1200 Sıvı KromatografiThermo Fisher Scientific
EASY-Spray HPLC C18 KolonThermo Fisher ScientificES9022 µ e, 100  Å, 75 µ m x 25 cm
EpiProfile2.0 betiğihttps://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Fiji yazılımıhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
MaxQuant arama motoruhttps://maxquant.net/maxquant/
Pestel A (gevşek)Dounce, Wheaton
Pestel B (sıkı)Dounce, Wheaton
Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS sistemiThermo Fisher Scientific
Döner tekerlekThermo Fisher Scientific11496548
NeşterKiato13010
MakasThermo Fisher Scientific15207266
Sızdırmazlık MatıCorning-96-PCR-RDOtomasyon uyumlu
Salınabilir rotor santrifüjBeckman CoulterAllegra X-15R
Termomikser kompaktEppendorf5350
GirdapPBIVibromix
Xcalibur yazılımıThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Histon EkstraksiyonuHiston ModifikasyonlarTranslasyon Sonras ModifikasyonlarKromatin OrganizasyonuBiyobelirte Ke fiS v KromatografisiFFPE Doku

İlgili makaleler