Yöntem makalesi

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

821 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68594

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

Bu makalede

Özet

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Özet

Lipozomların iç hacminde kapsüllenmiş ligandları içeren ligand ikame reaksiyonlarına dayalı olarak lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için yeni, uygun maliyetli ve oldukça hassas bir test geliştirdik ve bunu bir hidrolitik aktivite testi (koenzim A asilasyonu kullanarak) ve fosfatidilinositoldeki inositol halkasının fosfatlarının membranları anormal şekilde eksprese edilen enzimlerin zararlı etkilerinden koruyup korumadığını araştırmak için moleküler modelleme simülasyonu ile birleştirdik. FosfolipazA2'nin (PLA2) anormal ekspresyonu, multipl skleroz ve Alzheimer hastalığının gelişimini tetikleyen aksonların demiyelinizasyonuna yol açar. Anormal şekilde ifade edilen PLA₂'nin etkilerini taklit etmek için engerek zehiri PLA₂'nin temel alt birimi olan HDP-2P'yi kullandık. HDP-2P, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol-4-fosfat (PI-4-P) veya fosfatidilinositol-4,5-difosfat (PI-4,5-P2) ile zenginleştirilmiş fosfatidilkolin (PC) lipozomları üzerinde test edildi. HDP-2P, PC lipozomlarında minimum hidrolitik aktivite ve sadece biraz artmış geçirgenlik gösterirken, PC lipozomlarının PI ile zenginleştirilmesi hem hidrolizi hem de geçirgenliği arttırdı. Dikkat çekici bir şekilde, PI-4-P ve PI-4,5-P₂, HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesini önemli ölçüde inhibe etti ve geçirgenliği tamamen azalttı. Moleküler modelleme simülasyonları, fosfatidilinositol içindeki inositol halkasının fosfatlarının, HDP-2P'nin aktif bölgesine fosfolipid erişimini sterik olarak bloke ederek hidrolizi önlediğini ortaya çıkardı. Hem in vitro hem de in silico veriler, fosforile fosfatidilinositollerin azalmış PLA₂ aktivitesi ile ilişkili olduğunu ve muhtemelen hücre zarlarını dejenerasyondan korumanın bir yolu olarak aşırı PLA2 aktivitesini azaltmak için potansiyel bir mekanizmaya işaret ettiğini göstermektedir.

Giriş

Fosfatidilinositol (PI), bir fosfat grubu aracılığıyla bir heksahidroksi altı karbonlu halka olan inositol'e bağlı bir fosfatidik asit omurgasından oluşan anyonik bir fosfolipiddir. İnositol, 2, 3, 4, 5 ve 6 karbon pozisyonlarında1 fosforilasyon yoluyla geri dönüşümlü olarak fosfoinositidlere dönüştürülebilir. PI ve fosfoinositidler, hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar arasında çeşitli hücrelerin plazma zarlarında ve organellerinde bulunur. Mable ve Lowell Hokin 2,3,4 tarafından keşfedilmelerinden yetmiş yıl sonra, PI ve fosfoinositidler, moleküler mekanizmalarını ve insan sağlığı ile ilişkilerini anlamayı amaçlayan kapsamlı araştırmaların konusu olmaya devam etmektedir 5,6,7.

Beyin dokusunun yanı sıra, fosfoinositidler tipik olarak düşük konsantrasyonlarda bulunur ve plazma zarının iç broşüründeki toplam lipidlerin yaklaşık% 0.5 ila 1'ini oluşturur. Yayınlanan veriler, PI'nin fizyolojik koşullar altında önemli bir yapısal rol oynama olasılığının düşük olduğunu göstermektedir1. Bununla birlikte, hastalık durumları sırasında, PI ve fosfoinositidlerin seviyeleri artar ve plazma zarının dış broşürüne takla atarlar, bu da bu fosfolipidlerin hastalık direnci1 ile bağlantılı olabileceğini gösterir. Uzun zamandır PI'nin fosfoinositidlere kıyasla daha az önemli bir fizyolojik rol oynadığı düşünülse de, ortaya çıkan kanıtlar PI-4-P ve PI-4,5-P2'nin çeşitli fizyolojik süreçlerdeki önemini vurgulamaktadır1. Bu süreçler arasında hücre içi sinyalleşme, hücreler arası sinyal iletimi 8,9,10, membran kaçakçılığı 11,12,13, gen ekspresyonunun modülasyonu 1, ayrıca hücre proliferasyonu14 ve hayatta kalma1 yer alır. Buna rağmen, PI ve fosfoinositidlerin bu süreçleri yönlendirdiği moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.

PI ve fosfoinositidler, toplam fosfolipidlerin yaklaşık %10'unu oluşturdukları beyin dokusu hücrelerinde bol miktarda bulunur, ancak seviyeleri beyin hastalıklarının erken evrelerinde geçici olarak artabilir, bu da fosfoinositidlerin, anormal PLA2'ninaktivitesinin neden olduğu aksonal demiyelinizasyonun tetiklediği multipl skleroz ve Alzheimer hastalığı gibi nörolojik patolojilerin15 gelişimini engelleyebileceğini düşündürür. 16,17. Bu enzimler, grup IIA salgı fosfolipaz A2 (sPLA2 ) dahil olmak üzere çeşitli sınıflara ve gruplara aittir15. Bu enzim grubunun yüksek seviyeleri, multipl skleroz ve Alzheimer hastalarının beyin omurilik sıvısında bulunur ve burada miyelin zarlarının parçalanmasına katkıda bulunarak demiyelinizasyona yol açar15. Ayrıca yılan zehirlerinden gelen sPLA2'lerinnöromüsküler sinapslarda18,19 iletimi inhibe ettiği, merkezi sinir sistemi bozukluklarına neden olduğu ve periferik nöromüsküler sistemi20 olumsuz etkilediği bildirilmiştir.

Bu çalışmada, PI ve fosfoinositidlerin model fosfolipid membranları anormal eksprese edilen sPLA2 enzimlerinin etkilerinden koruyup koruyamayacağını araştırdık. Model zarlar, tüm memeli hücre zarlarında21 en bol bulunan fosfolipid olan fosfatidilkolinden (PC) yapılmıştır ve PI, PI-4-P veya PI-4,5-P2'nin %20 molar oranı ile zenginleştirilmiştir. Anormal şekilde eksprese edilen sPLA2 enzimlerinin model membranlar üzerindeki etkilerini taklit etmek için, hidrolitik aktivitesi daha önce model miyelin membranları23 üzerinde incelenmiş olan grup IIA salgı engerek zehiri nörotoksik PLA2 enzimi22'nin temel alt birimi HDP-2P'yi kullandık.

Bu çalışma için, HDP-2P'den etkilenen lipozomal membranların geçirgenliğindeki değişiklikleri araştırmak için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Yeni yöntem, lipozomların içinde hapsolmuş birNH3 ligandını içeren, lipozomların dışındaki CuSO4 çözeltisinde bir ligand ikame reaksiyonuna dayanmaktadır. HDP-2P ile indüklenen membran geçirgenliği, lipozomlardanNH3 sızıntısına izin verirse, salınan amonyak, reaksiyon yoluyla hidratlı bakır iyonlarında kantitatif olarak dört su molekülünü ikame edecektir: [Cu(H2O)6]2+ (sulu) + 4NH3 (sulu) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (sulu) + 4H2O (l). Bu ligand değişimi, çözelti optik yoğunluğunda spektrofotometri (λ = 600 nm) ile ölçülebilen karakteristik bir artış üretir ve membran geçirgenlik değişiklikleri için nicel okumamız olarak hizmet eder. Ligand ikamesine dayalı yaklaşımımız, 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 ve iyon taşıma testleri29 gibi geleneksel tekniklere kıyasla membran geçirgenliğini değerlendirmek için üstün hassasiyet gösterirken, pahalı enstrümantasyon gerektirmemesi gibi ek bir avantaj sunar. HDP-2P hidrolitik aktivite ölçümleri ve PI, PI-4-P ve PI-4,5-P2'nin HDP-2P'nin moleküler yüzeyine bağlanmasının in silico simülasyonu ile birlikte uygulanan bu basit ve uygun maliyetli yöntem, PI'deki inositol halkasının fosfatlarının, HDP-2P'nin PI-4-P veya PI-4 ile zenginleştirilmiş PC membranları üzerindeki yıkıcı etkilerini ortadan kaldırdığı sonucuna varmamızı sağladı. 5-P2. Bu bulgu daha ileri çalışmalarda doğrulanırsa, PI'deki inositol halka fosfatlarının anormal etki gösteren hücresel proteinlerin zararlı etkilerine karşı koruma sağlama ve anormal protein aktivitesini içeren hastalık koşullarında membran stabilitesine potansiyel olarak katkıda bulunma yeteneği, Alzheimer hastalığı ve multipl skleroz gibi nörolojik bozuklukların tedavisi için yeni farmasötiklerin geliştirilmesinin önünü açabilir.

Protokol

1. Moleküler modelleme yazılımı kullanılarak HDP-2P'nin PI ve fosfoinositidler ile etkileşiminin in silico simülasyonu

  1. Yazılım kurulumu ve hazırlanması
    1. Ek Dosya 1-Ek Şekil S1A'da gösterildiği gibi ligand molekülleri oluşturmak için başvurulan kimyasal çizim düzenleyicisini kurun.
    2. Ligandın reseptöre moleküler kenetlenmesi için moleküler modelleme yazılımını kurun.
    3. Ligand ve reseptör hazırlığı için Otomatik Yerleştirme Araçlarını kurun.
    4. Moleküler modelleme simülasyon yazılımı Python ortamına bağlı olduğundan Python'u yükleyin.
  2. Ligand hazırlama
    1. İlk olarak, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, kardiyolipin ve fosfatidilserin moleküler yapılarının atomik koordinatlarını oluşturmak için kimyasal çizim düzenleyicisini kullanın.
      NOT: Ligand hazırlamanın aşağıdaki adımlarındaki örnek protokol, yalnızca PI için adımları açıklar.
    2. Ek Dosya 1-Ek Şekil S1B'de gösterildiği gibi kimyasal çizim düzenleyicisini kullanarak PI'nin moleküler yapısını oluşturun ve dosyayı Ek Dosya 1-Ek Şekil S2'de gösterildiği gibi PDB formatında kaydedin.
    3. PDB dosyasını Ek Dosya 1-Ek Şekil S3A'da gösterildiği gibi otomatik yerleştirme aracı yazılımında açın.
    4. Ek Dosya 1-Ek Şekil S3B'de gösterildiği gibi hidrojen atomları ekleyin ve Ek Dosya 1-Ek Şekil S4A'da gösterildiği gibi polar veya tüm hidrojen atomlarını seçin.
      NOT: HDP-2P ile PI yerleştirme tamamlandıktan sonra, polar veya hidrojen bağlarının görselleştirilmesini basitleştirmek için yalnızca polar hidrojen atomlarını seçin.
    5. PI molekülünü, Ek Dosya 1-Ek Şekil S4B'de gösterildiği gibi otomatik yerleştirme aracı yazılımı için ligand olarak ayarlayın.
    6. Ligandı Ek Dosya 1-Ek Şekil S5A'da gösterildiği gibi bir PDBQT dosyası olarak kaydedin. Tüm bağları dönebilir hale getirdiğinizden emin olun.
  3. Reseptör hazırlama
    1. Biri asidik, enzimatik olarak aktif olmayan A ve diğeri bazik, enzimatik olarak aktif, E olmak üzere iki monomerden oluşan fosfolipaz A2 HDP-2'nin (PDB kodu 2I0U) PDB dosyasını indirin. Enzimatik olarak aktif olmayan monomer A'yı silmek için, 2I0U dosyasını moleküler modelleme yazılımına aktarın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S5B), monomer A'nın tüm atomlarını seçin (Ek Dosya 1-Ek Şekil S6A), ardından Düzenle'ye gidin ve monomer A'nın tüm atomlarını silin (Ek Dosya 1-Ek Şekil S6B). Artık reseptör olarak belirlenen enzimatik olarak aktif monomer E'yi tutun.
    2. HDP-2P reseptörü PDB dosyasını Ek Dosya 1-Ek Şekil S7'de gösterildiği gibi otomatik yerleştirme aracı yazılımında açın.
    3. Tüm su moleküllerini Ek Dosya 1-Ek Şekil S8A'da gösterildiği gibi çıkarın.
    4. Ek Dosya 1-Ek Şekil S8B'de gösterildiği gibi hidrojen atomları ekleyin. HDP-2P'nin PI ile kenetlenmesinin tamamlanmasından sonra, polar ve hidrojen bağlarının görselleştirilmesini basitleştirmek için yalnızca polar hidrojenlerin seçilmesi gerektiğini lütfen unutmayın.
    5. HDP-2P'yi Ek Dosya 1-Ek Şekil S9A'da gösterildiği gibi reseptör olarak ayarlayın ve bir PDBQT dosyası olarak kaydedin. Reseptörün dönebilen bağlar olmadan ayarlandığından emin olun.
  4. Yerleştirme parametresi ayarı
    1. Hem ligand hem de reseptör PDBQT dosyalarını açın.
    2. Ek Dosya 1-Ek Şekil S9B'de gösterildiği gibi ızgara kutusu kurulum arayüzüne girin ve Ek Dosya 1-Ek Şekil S10A'da gösterildiği gibi reseptör molekülünün tüm yüzeyini tamamen çevreleyen ızgara kutusu boyutunu (boyut x = 44.644; boyut y = 74.939; boyut z = 43.050) ve merkezi (merkez x = 25.626; merkez y = 9.582; merkez z = 41.825) koordinatlarını tanımlayın.
    3. Izgara kutusu kurulum arayüzünü Ek Dosya 1-Ek Şekil S10B'de gösterildiği gibi mevcut ayarlarla kapatın ve yerleştirme parametrelerini Ek Dosya 1-Ek Şekil S11A'da gösterildiği gibi bir config.txt dosyasına kaydedin.
  5. Moleküler yerleştirme yazılımının çalıştırılması
    1. Ek Dosya 1-Ek Şekil S11B'de gösterildiği gibi config.txt dosyasını kullanarak moleküler yerleştirme yazılımını başlatın.
    2. Yerleştirme hesaplamasını yürütün (~30-90 dk; Ek Dosya 1-Ek Şekil S12).
    3. Yerleştirme puanlarını (bağlama benzeşimi) gözden geçirmek için docking_log.txt dosyasını denetleyin.
    4. En düşük enerji konformasyonuna sahip kenetlenme sonucunu seçin.
  6. Yerleştirme verilerinin analizi
    1. Yerleştirme sonucu PDBQT dosyasını açmak için otomatik yerleştirme aracı yazılımını kullanın.
    2. İyonik, iyon-polar, polar ve hidrojen bağı etkileşimleri dahil olmak üzere reseptörün aktif merkezine ve moleküller arası etkileşimlere odaklanarak ligand-reseptör bağlanma bölgelerini analiz edin. Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterildiği gibi, kcal/mol cinsinden bağlanma bölgesi afinitelerini, PI/fosfoinositid polar kafasındaki yüklü ve polar kısımları ve moleküller arası bağlanmada yer alan HDP-2P kalıntılarını ve bağ türlerini tanımlamak için reseptörün aktif bölgesi ile etkileşime giren PI ve fosfoinositid için bir tablo yapın. Bağlanma bölgelerinde, bağlanma afinitelerinde, PI/fosfoinositid ve HDP-2P kalıntılarının yüklü ve polar kısımlarında ve bağ tiplerinde herhangi bir sapma olmadığından emin olmak için her reseptör-ligand çifti için yerleştirmeyi 3 kez tekrarlayın.

2. Serbest yağ asitleri ile asillenmiş koenzim A kullanılarak izlenen PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS veya CL ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi

NOT: Kloroform, metanol,NH3 ve CuSO4 tehlikelidir. Daima nitril eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Tüm protokolleri çeker ocak altında bu reaktiflerle işleyin. Kloroformu kehribar rengi bir cam şişede saklayın. Metanolü yanıcı dolaplarda oksitleyicilerden uzakta saklayın. Metanolü alevlerden ve kıvılcımlardan uzak tutun. Bu reaktifler için tüm atık kaplarını etiketleyin ve yerel tehlikeli atık imha yönetmeliklerine göre atın.

  1. 5.55 mg CaCl2'yi 0.10 M Tris-HCl tamponunda (pH 7.4) çözerek HDP-2P katalizli fosfolipid hidrolizi için 100 mL tampon çözeltisi hazırlayın.
  2. 7.31 g EDTA'yı deiyonize damıtılmış suda (ddH20) çözerek 50 mL 1.0 M EDTA stok çözeltisi hazırlayın.
  3. 0,10 M Tris-HCl tamponunda (pH 7,4) 0,54 mM HDP-2P stok çözeltisi hazırlayın. HDP-2P'nin molar kütlesi 13.827 kDa'dır.
  4. Kloroform/metanol karışımında (hacimce 2 ila 1) 10.0 M konsantrasyonda aşağıdaki fosfolipid stok çözeltilerini hazırlayın: yumurta sarısı L-α-fosfatidilkolin (PC), sığır kalbi kardiyolipin (CL), sığır beyni L-α-fosfatidil-L-serin (PS), PI, PI-4-P ve PI-4,5-P2. PC, CL, PS, PI, PI-4-P ve PI-4,5-P2'nin molar kütleleri, aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi sırasıyla 768 Da, 1.466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da ve 1.057 Da'dır.
  5. Beş PC lipozom örneği hazırlayın. Bir PC lipozom numunesi hazırlamak için, bir cam test tüpüne 75 μL kloroform/metanol stok PC çözeltisi ekleyin ve lipitleri bir lipit filmi oluşana kadar 10 Pa vakum altında 25 °C'de 1 saat kurutun. Lipid filmini bir termostatta 25 ° C'de fosfolipid hidrolizi için 15 mL tampon çözeltisi ile 1 saat boyunca hidratlayın. Daha sonra, 100-150 W'lık bir ultrasonik dağıtıcının titanyum tabancasını bir buz banyosuna yerleştirilmiş cam test tüpündeki lipid süspansiyonuna yerleştirin ve süspansiyonu maksimum gücün% 50'sini aşmayacak şekilde 10 dakika boyunca 22 kHz frekansında sonikleştirin. Titanyum 'tozu' parçacıklarını gidermek için, lipozomları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 × g'da (10 cm'lik bir rotorla 1.270 rpm) santrifüjleyin.
  6. Kloroform/metanolfosfolipid stok çözeltilerini karıştırarak PC'de CL, PS, PI, PI-4-P veya PI-4,5-P2 ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarının örneklerini hazırlayın - 60 μL PC, 15 μL CL, PS, PI, PI-4-P veya PI-4,5-P2-bir cam tüp içinde. Daha sonra, lipitleri 10 Pa vakumda veya oda sıcaklığında 3 saat kurutun, lipit filmini fosfolipid hidrolizi için tampon çözelti içinde hidratlayın ve yukarıda tarif edildiği gibi ultrasonik dalgalarla sonikasyon yapın.
    NOT: Her lipozom türü için beş numune hazırlayın.
  7. Tüpleri ayırmak için yukarıda açıklanan her bir lipozom tipinden beş numuneden 1.0 mL yerleştirin ve her tüpe NEFA kitinden 10 μL renksiz koenzim-A çözeltisi ekleyin ve ardından lipozom örneklerinde 0.000'lik HDP-2P/fosfolipid molar oranlarını elde etmek için tüpleri ayırmak için 0.00, 0.93, 1.86, 2.79 veya 3.72 μL 0.54 mM HDP-2P stok çözeltisi ekleyin, sırasıyla 0.001, 0.002, 0.003 ve 0.004.
  8. Lipozomlara HDP-2P ekledikten hemen sonra, lipozom örneklerini bir termostatta 37 °C'de 15 dakika inkübe edin ve ardından 100 μL stok EDTA çözeltisi ekleyerek HDP-2P tarafından indüklenen fosfolipid hidrolizini durdurun. Bundan sonra, numuneleri 1 dakika vorteksleyin.
  9. Renksiz koenzim-A çözeltisinin serbest yağ asitleri ile asillendiğinde mora dönme derecesini ölçecek bir spektrofotometre kullanarak lipozomal numunelerin optik yoğunluğunu 550 nm'de ölçerek HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesini ölçün.
  10. Ortalama optik yoğunluk değerlerinin üç bağımsız denemeden elde edilmesi için yukarıdaki prosedürü iki kez daha tekrarlayın.
    NOT: Bu deneysel denemede elde edilen her veri noktası, optik yoğunluğun ortalama değeridir. İdeal olarak, deneysel veri noktalarının standart sapması ortalamanın %±5'i içinde olmalıdır.

3. HDP-2P'nin PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS veya CL ile zenginleştirilmiş PC lipozomal membranlarının geçirgenliği üzerindeki etkileri, lipozomların içinde hapsolmuş bir NH3 ligandı içeren CuSO4 çözeltisinde bir ligand ikame reaksiyonu ile ölçülür

NOT: Kloroform, metanol,NH3 ve CuSO4 tehlikelidir. Daima nitril eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Tüm protokolleri çeker ocak altında bu reaktiflerle işleyin. Kloroformu kehribar rengi bir cam şişede saklayın. Metanolü yanıcı dolaplarda oksitleyicilerden uzakta saklayın. Metanolü alevlerden veya kıvılcımlardan uzak tutun. Bu reaktifler için tüm atık kaplarını etiketleyin ve yerel tehlikeli atık imha yönetmeliklerine göre atın.

  1. Kloroform/metanol (2 ila 1 hacim) içinde altı fosfolipidin (PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2) her biri için 20 mL 0,03 M stok çözeltileri hazırlayın. PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2'nin moleküler kütleleri sırasıyla 768, 1466, 792, 867, 962 ve 1057 Da'dır.
  2. 0.05 M CuSO4 nihai konsantrasyonunda 100 mL 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) tamponu hazırlayın.
  3. 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) tamponunda 4 mL 1,5 × 10-3 M HDP-2P stoğu hazırlayın. HDP-2P'nin molar kütlesi 13.827 kDa'dır.
  4. 100 mL 0,5 MNH3 çözeltisi hazırlamak için% 25 NH3 çözeltisi kullanın (yoğunluk 905 g / L30, 13,30 M'ye eşit [905 g / L × 0,25 M ÷ 17,00 g / L = 13,30 M]). Bu nedenle, 100 mL 0.5 MNH3 hazırlamak için 3.76 mL %25NH3 çözeltisi kullanın: (0.5 M × 1.000 mL ÷ 13.30 M) ÷ 10 = 3.76 mL %25NH3 çözeltisi. 100 mL'lik hacimsel bir şişeye 3,76 mL% 25 NH3çözeltisi yerleştirin ve 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) tamponu ile hacmi 100 mL'ye getirin.
  5. Lipozomların iç hacminde NH3 içeren lipozomlar hazırlamak için, bir tüpe kloroform / metanol içinde 12.5 mL 0.03 M stok fosfolipid çözeltisi ve kuru fosfolipidleri 10 Pa vakumda veya oda sıcaklığında 3 saat boyunca yerleştirin. Fosfolipid filmi bir termostatta 25 °C'de 12.5 mL 0.5 MNH3, 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) ile 1 saat boyunca nemlendirin; daha sonra sonikasyonlu lipozomlar üretmek için adım 2.5'te açıklandığı gibi lipid süspansiyonunu 22 kHz frekansında sonikleştirin.
    NOT: Sonikasyonlu lipozomlu çözeltide, NH3 lipozomların içinde ve dışında bulunur.
  6. NH'yi ortadan kaldırmak için3 lipozomların dışında, manyetik bir karıştırıcı kullanarak 0.10 M Tris-HCl'ye (pH 7.4) karşı 5 şapka oda sıcaklığında bir diyaliz membranı (moleküler kesme 1.0 kDa) kullanarak lipozomları diyalize edin.
    NOT: 0.5 mL 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 tamponuna 0.5 mL diyaliz lipozomlarının eklenmesi, NH 3 olmadan hazırlanan ve aynı tamponla karıştırılan lipozomlarla 600 nm'de aynı optik yoğunluğu verdiğinden, 5 saatlik diyaliz NH3'ü tamamen çıkarmak için yeterliydi.
  7. Diyalizden sonra, lipozomları peletlemek için lipozomları adım 2.5'te tarif edildiği gibi 90 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve lipozomları 5.0 mL 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4) tamponu ile yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş lipozomları her biri 1.0 mL'lik beş numuneye bölün. Bu beş 1.0 mL numuneye ayrı ayrı 60, 40, 20 ve 0 μL 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4) tamponu ve ardından lipozom numunelerinde HDP-2P/fosfolipid molar oranlarını sırasıyla 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 ve 0.004 ayarlamak için 0, 20, 40, 60, 80 μL HDP-2P stok tamponu ekleyin.
  8. Lipozom örneklerini 37 °C'de bir termostatta 30 dakika inkübe edin; Ardından, bir spektrofotometre kullanarak lipozom örneklerinin optik yoğunluğunu 600 nm'de ölçün. Altı lipozom örneğinin tümü için bölüm 3'te açıklanan adımları izleyin ve her veri noktası için üç kopya optik yoğunluk okuması sağlamak için 3x tekrarlayın.
    NOT: Deneysel veri noktalarının standart sapması her zaman ortalamanın %±5'i içinde olmalıdır.

Sonuçlar

HDP-2P'nin moleküler modelleme simülasyonu PI ve fosfoinositidler ile etkileşim
Moleküler modelleme programı, bir ligand (daha küçük molekül) tarafından hedeflenen bir reseptörün (daha büyük molekül) moleküler yüzeyindeki en iyi dokuz bağlanma bölgesini hesaplar. Bu bölgeler, en iyi bağlanma afinitelerine sahip bölgeleri belirleyen en yüksek dokuz entalpinin salınmasıyla belirlenir. Bağlanma afiniteleri, moleküller arası bağlanmanın ekzotermik bir süreç olduğunu gösteren negatif değerler olarak ifade edilir. HDP-2P'nin PI ile etkileşime girmesi durumunda, simülasyon, aktif merkez içindeki HDP-2P'nin moleküler yüzeyinde PI için dört bağlanma bölgesi (#3, #6, #7 ve #8) öngördü (Tablo 1). Ek olarak, PI için beş bağlanma bölgesi, HDP-2P'nin aktif merkezinin dışında bulundu. PI'nin kutup başındaki yüklü ve kutupsal kısımların gösterimleri Şekil 1'de gösterilmektedir.

HDP-2P'nin aktif merkezi beş temel amino asit kalıntısından oluşur: Katalitik hidrolizi sağlamak için aktif merkezdeki fosfolipid substratın uygun şekilde hizalanmasını kolaylaştıran Gly30, Gly32, His48, Asp49 ve Lys69. Bazı temsili kenetlenmiş yapılar, PI'nin aktif merkezin bazı amino asit kalıntılarına bağlanmasını gösterirken, bağlanma bölgesi #6'da PI, iyonik, iyon-polar ve hidrojen bağları yoluyla aktif merkezin beş anahtar amino asit kalıntısının tümü ile etkileşime girer (Tablo 1). Şekil 2 , PI'nin bağlanma bölgesi #6 içindeki HDP-2P'nin aktif merkezindeki beş anahtar amino asit kalıntısının tümü ile nasıl etkileşime girdiğini göstermektedir.

İnositol halkasının 4. pozisyonunda bir fosfat grubu içeren HDP-2P ve PI-4-P arasındaki etkileşimin kenetlenme simülasyonu, PI-4-P'nin HDP-2P'nin aktif merkezine bağlandığı yer olarak yalnızca bağlanma bölgesi #1'i öngördü. Spesifik olarak, bu bölgede PI-4-P, iyonik, iyon-polar ve hidrojen bağları yoluyla aktif merkezin üç temel amino asit kalıntısı - Gly30, Gly32 ve Lys69 - ile etkileşime girer (Tablo 2). Şekil 3 , PI-4-P'nin HDP-2P'nin aktif merkezi ile etkileşimini göstermektedir. HDP-2P'nin moleküler yüzeyinde kalan sekiz bağlanma bölgesinde, PI-4-P aktif merkezin dışındaki yerlere bağlanır.

HDP-2P'nin PI-4,5-P₂ (inositol halkasının 4. ve 5. pozisyonlarında fosfat grupları içeren) ile etkileşimlerinin moleküler yerleştirme simülasyonları, tahmin edilen dokuz bağlanma bölgesinin tamamında enzimin aktif merkezine bağlanma olmadığını ortaya çıkardı. Bunun yerine, PI-4,5-P₂ sürekli olarak aktif merkeze bitişik oluk benzeri bir boşluğa bağlanır (Şekil 4), üç HDP-2P kalıntısı, Trp31, Gly33 ve Gln34 ile iyon-polar ve hidrojen bağları oluşturur.

PI-4,5-P₂'nin hücresel veya zehir PLA2'lerinaktif merkezine yakın oluk benzeri bir boşluğa bağlanması daha önce belgelenmemiş olsa da, yapısal olarak benzer özellikler pleckstrin homolojisi31 (PH) ve epsin N-terminal homolojisi32 (ENTH) alanlarında iyi bilinmektedir. Bu sinyal alanları, enzimatik olmayan yapılarına rağmen, spesifik PI-4,5-P2 tanıma31,32 için benzer hidrofobik-polar-katyonik oluk mimarilerini kullanır. HDP-2P'de karşılaştırılabilir bir yapısal motifin varlığı, HDP-2P tarafından membran alanı tanımayı kolaylaştırmak için evrimsel taklit veya yakınsak evrimin ilgi çekici olasılıklarını gündeme getirir. Diğer yöntemlerle daha fazla doğrulanırsa, bu çalışma, fosfoinositid tanıma için böyle bir mekanizma kullanan bir zehir PLA2'nin bildirilen ilk örneğini temsil edebilir.

İlginç bir şekilde, HDP-2P ile etkileşime giren CL ve PS'nin moleküler yerleştirme simülasyonları, dokuz bağlanma bölgesinden sekizinde her iki fosfolipidin HDP-2P'nin aktif merkezine bağlanmasını öngörürken, CL ve PS'nin aktif merkezin dışındaki tek bağlanma bölgesi oluk benzeri boşlukta yer almıyordu (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, PI gibi, PC'nin de dokuz bağlanma bölgesinden dördünde HDP-2P'nin aktif merkezine bağlandığını ve CL ve PS gibi hem PI hem de PC'nin oluk benzeri boşluğa bağlanmadığını belirtmekte fayda var (veriler gösterilmemiştir). Bu bulgular, PI'nin inositol halkasındaki fosfat gruplarının, aktif merkeze bitişik bulunan oluk benzeri boşluğa yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunu göstermektedir. Yapısal analizler, hem hücresel33 hem de zehir34 PLA2 enzimlerinde katalitik merkeze yakın hidrofobik-polar-katyonik yüzey yamaları ile benzer oluk benzeri boşluklar tanımlamıştır. Fosfoinositidlerin bu boşluklara bağlanması, fizyolojik olarak önemli konformasyonel değişikliklere neden olabilir ve potansiyel olarak enzimatik aktiviteyi inhibe edebilir. Özellikle, fosfoinositidler arasında, PI-4,5-P2 özellikle zayıf substrat özellikleri gösterir - insan PLA2 izoformları (sitozolik, kalsiyumdan bağımsız ve salgılanan tipler), PI-4,5-P235'e karşı minimum ila saptanamayan hidrolitik aktivite gösterir. Bu, fosfoinositidin bu korunmuş yapısal özelliklere bağlanmasının, PLA2 süper ailesi boyunca katalitik işlevlerden ziyade farklı bir fizyolojik işleve (örneğin, allosterik inhibisyon) hizmet edebileceğini ve bunun gelecekte deneysel doğrulama gerektirdiğini düşündürmektedir.

Serbest yağ asitleri ile asillenmiş koenzim A kullanılarak izlenen PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS veya CL ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi
HDP-2P'nin lipozomal numuneler üzerindeki hidrolitik aktivitesi, koenzim A çözeltisi kullanılarak değerlendirildi. Koenzim A çözeltisi renksizdir ancak HDP-2P tarafından katalize edilen fosfolipid hidrolizi sırasında salınan serbest yağ asitleri tarafından asilasyon üzerine mora döner. Koenzim A asilasyonunun derecesine karşılık gelen optik yoğunlukta ortaya çıkan artış, 550 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Bu nedenle, koenzim A ve HDP-2P ile muamele edilen lipozomal örneklerde optik yoğunluktaki artış, HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi ile doğru orantılıdır.

Şekil 5, çeşitli lipozomal örneklerde HDP-2P/fosfolipid molar oranının bir fonksiyonu olarak hidrolitik aktivite eğrilerini göstermektedir. HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi, 550 nm'de ölçülen optik yoğunluğun (OD) keyfi birimleri (au) cinsinden ifade edilir. Deneysel denemelerimiz, organik çözücülerdeki yağ asitlerinin, koenzim A ve asil-koenzim A sentetaz içeren sulu çözeltilere eklendiğinde, 550 nm'de saptanabilir OD değişikliği üretmediğini gösterdiğinden, a.u. değerlerini serbest yağ asitlerinin molar konsantrasyonlarıyla ilişkilendirmek için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmadık. Bu, bu tür yağ asitlerinin koenzim A'ya bağlanmak yerine miseller oluşturduğunu gösterir. Buna karşılık, yalnızca zar tarafından üretilen yağ asitleri (PLA2 aktivitesi tarafından üretilir) zarla ilişkili koenzim A'ya bağlanır ve bu da ölçülebilir bir OD değişikliği ile sonuçlanır. Moleküler yüzeyinde hem hidrofobik hem de hidrofilik bölgelere sahip olan koenzim A'nın amfipatik doğası, onu tercihen PLA2 aktivitesi tarafından üretilen yağ asitlerinin koenzim A'ya bağlanmasını kolaylaştıran zar-su arayüzünde lokalize eder. Bununla birlikte, bu tahlil koşulları altında, yağ asitlerinin molar konsantrasyonunu belirlemek mümkün değildir. Bu nedenle, koenzim A tahlilini kullanan araştırmacılar, PLA2'nin hidrolitik aktivitesini 550nm20'de ölçülen keyfi OD birimlerinde ifade ederler.

HDP-2P'nin en büyük hidrolitik aktivitesine karşılık gelen optik yoğunluktaki en yüksek artış, CL veya PS ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında gözlendi. Bu bulgu, HDP-2P'nin aktif merkezinde CL ve PS için en yüksek sayıda bağlanma bölgesi ile uyumludur. PI ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi, CL veya PS ile zenginleştirilmiş lipozomlardan sırasıyla 3.0 ve 2.5 kat daha düşük, ancak saf PC lipozomlarından daha yüksekti. Bu, her iki lipidin de aktif merkezde aynı sayıda bağlanma bölgesine sahip olmasına rağmen, PI'nin HDP-2P'sinin aktif merkezine bağlanma afinitesinin PC'ninkinden daha yüksek olduğunu göstermektedir.

Bu belirgin tutarsızlık, PI ve PC'nin kutup başı gruplarındaki yapısal farklılıklarla açıklanabilir. PC nötr bir molekül iken, katyonik trimetilamonyum grubu çözeltinin içine doğru uzanırken, anyonik fosfat grubu zarın hidrofobik alanına daha yakın konumlandırılmıştır. PC ana grubundaki bu yük dağılımı, temel HDP-2P'ye karşı elektrostatik bir itme oluşturarak bağlanma afinitesini azaltabilir. Buna karşılık, PI'nin asidik yapısı, onu temel HDP-2P ile etkileşim için daha çekici bir lipit türü haline getirir, bu da saf PC lipozomlarına kıyasla daha yüksek hidrolitik aktivitesini açıklayabilir.

Şekil 5'te gösterildiği gibi, PI-4-P ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi, fosfolipidlerin minimal katalitik hidrolizini düşündürür. Dikkat çekici bir şekilde, PI-4,5-P ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarından elde edilen optik yoğunluk eğrisi, bu lipozom örneğinde HDP-2P tarafından hidrolitik aktivitenin tamamen ortadan kaldırıldığını gösterir. Bu bulgular, HDP-2P'nin aktif merkezinde PI-4-P için bir bağlanma bölgesi öngören yerleştirme simülasyonlarıyla iyi uyum sağlarken, PI-4,5-P2 aktif merkeze hiçbir bağlanma afinitesi göstermez. Bu, inositol halkasına bağlı fosfat gruplarının, fosfolipidin HDP-2P'nin aktif merkezine bağlanmasını engellediğini göstermektedir. İnositol halkasındaki fosfat gruplarının çözeltiye doğru uzandığını ve iyonik ve iyon-polar moleküller arası etkileşimler yoluyla HDP-2P'ye bağlanarak HDP-2P'yi membran yüzeyinden uzakta tuttuklarını ve böylece membranı HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesinden koruduklarını öneriyoruz. Bu, insan sitozolik, kalsiyumdan bağımsız ve salgılanan PLA2 enzimlerinin PI-4-P ve PI-4,5-P2 substratlarına35 karşı zar zor saptanabilir veya hiç hidrolitik aktivite göstermediğini ortaya koyan son bulgularla tutarlıdır.

PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS veya CL ile zenginleştirilmiş PC lipozomal membranlarında HDP-2P kaynaklı geçirgenlik değişiklikleri: Kapsüllenmiş NH₃ ile CuSO4 çözeltisinde ligand ikame reaksiyonu yoluyla değerlendirme

HDP-2P hidrolitik aktivitesinin PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS veya CL ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarının membran geçirgenliği üzerindeki etkisi, ikame edici ligandın lipozomların iç hacmi içinde kapsüllendiği karmaşık bir iyon sisteminde bir ligand ikame reaksiyonu kullanılarak araştırıldı. Bu basit ve güvenilir yöntem, kompleks iyonunda [Cu(H2O)6]2+ NH 3 tarafından ligand görevi gören dört su molekülünün yer değiştirmesine dayanır

[Cu(H2O)6]2+ (sulu) + 4NH3 (sulu) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (sulu) + 4H2O (l)

NH işlemi sırasında3 kompleks iyonunda [Cu(H2O)6]2+ su moleküllerini ikame ederek, [Cu(H2O)6]2+'nın soluk mavi rengi [Cu(H2O)2(NH3)4]2+'nın koyu mavi rengine geçer. NH3'ün lipozomların iç hacmi içinde kapsüllendiği ve [Cu(H2O)6]2+ 'nın harici çözeltide mevcut olduğu bir sistemde, bu renk değişikliği - spektrofotometrik olarak izlenir - lipozomal membran geçirgenliğinde bir artış olduğunugösterir 3 .

Böyle bir sistem kurmak için, NH içeren Tris-HCl tamponunda bir fosfolipid dispersiyonunu sonikleştirdik3, lipozomların içinde ve dışında NH₃ ile sonikasyonlu lipozomlar oluşturduk. Dış NH3 diyaliz ile uzaklaştırıldı, ardından iç hacminde NH3 içeren lipozom örneğine CuSO4 çözeltisi ilave edildi. Daha sonra lipozomları HDP-2P ile tedavi ettik ve optik yoğunluktaki değişiklikleri spektrofotometrik olarak izledik.

Optik yoğunluk değişikliklerini ölçmek için en uygun dalga boyunu belirlemek için, 500 nm ila 900 nm aralığında görünür ışık kullanarak 0,025 M CuSO4, 0,100 MNH3 çözeltisinde [Cu(H2 O)2(NH3)4]2+ absorbans spektrumlarını 0,025 M CuSO4 çözeltisinde kaydettik. Şekil 6'da gösterildiği gibi, 600 nm'de ışınlama, [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ için maksimum absorbans ve [Cu(H2O)6]2+ için minimum absorbans verdi ve membran geçirgenlik deneylerimiz için en uygun dalga boyu olarak 600 nm'yi seçmemize yol açtı.

Şekil 7, NH₃'ye membran geçirgenliğinin anyonik CL ve PS ile zenginleştirilmiş PC lipozomlarında en yüksek olduğunu göstermektedir. Bu gözlem, bir grup IIA PLA2 olan HDP-2P'nin anyonik fosfolipid palmitoiloiloil-gliserofosfogliserol ile verimli bir şekilde etkileşime girdiğini ve substrat hidrolizine yol açtığını gösteren daha önce bildirilen verilerimizle tutarlıdır - nötr fosfolipid palmitoiloilgliserofosfokolin36 ile gözlenmeyen bir etki. Genel olarak, çoğu grup IIA PLA2 enzimi, anyonik fosfolipidlere 33,37,38 karşı önemli ölçüde daha yüksek hidrolitik aktivite sergiler. PC+PI lipozomlarının geçirgenliği, PC+CL ve PC+PS lipozomlarından daha düşüktür, ancak saf PC lipozomlarından daha yüksek kalır. Bu bulgular, yerleştirme simülasyonlarının ve HDP-2P hidrolitik aktivite analizlerinin sonuçlarıyla iyi bir uyum içindedir. Başka bir deyişle, düşük geçirgenlik gösteren lipozomal numunelerin, moleküler yerleştirme verilerinin öngördüğü gibi, HDP-2P'nin fosfolipidleri hidrolize edememesi ve HDP-2'nin PI ve fosfoinositidlere bağlanma afinitesinin daha düşük olması nedeniyle yapısal olarak stabil olması beklenmektedir (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Bu nedenle, Şekil 7'de gösterildiği gibi, HDP-2P (Şekil 5) ile enzim hidrolitik aktivitesi ve membran geçirgenliği pozitif korelasyona sahip olmalıdır.

Ancak PC+PI-4-P ve PC+PI-4,5-P2 lipozomlarında HDP-2P ile tedavide geçirgenlik artmadı. Geçirgenlik sonuçları PC+PI-4,5-P2 lipozomları, aynı lipozomlar için yerleştirme simülasyonları ve HDP-2P hidrolitik aktivite verileri ile iyi bir korelasyon gösterirken, PC+PI-4-P lipozomlarında artan geçirgenliğin olmaması, bu lipozomlarda küçük bir derecede hidrolitik aktivite kaydedildiğinden, hidrolitik aktivite sonuçlarıyla tam olarak uyumlu değildir. Bu bulgular, PC+PI-4-P lipozomlarında hidrolitik aktivitede hafif bir lokalize artışın, fosfolipidlerin çift katmanlı paketlenmesini, membran geçirgenliğini NH3'e değiştirecek bir dereceye kadar bozmadığını göstermektedir.

figure-results-2
Şekil 1: Fosfatidilinositolün kutup başının yüklü ve polar kısımlarının gösterimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: PI'nin, moleküler yerleştirme yazılımı tarafından bağlanma bölgesi #6 için tahmin edilen HDP-2P'nin aktif merkezi ile etkileşimi. PI çubuk gösteriminde ve HDP-2P çizgi (soldaki diyagram) ve moleküler yüzey (sağdaki diyagram) gösterimlerinde verilmiştir. Çubuk temsilleri için zümrüt karbonu, turuncu fosforu, kırmızı oksijeni ve beyaz hidrojeni temsil eder. Moleküler yüzey ve çizgiler için yeşil karbonu, mavi nitrojeni, kırmızı oksijeni, beyaz hidrojeni ve sarı kükürdü temsil eder. Sarı kırık çizgiler moleküller arası bağları tanımlar. Oklar, aktif merkezdeki amino asit kalıntılarını gösterir. Kısaltmalar: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = engerek zehiri fosfolipazın temel alt birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 3: PI-4-P'nin, moleküler yerleştirme yazılımı tarafından bağlanma bölgesi #1 için tahmin edilen HDP-2P'nin aktif merkezi ile etkileşimi. PI-4-P çubuk gösteriminde, HDP-2P ise çizgi (soldaki diyagram) ve moleküler yüzey (sağdaki diyagram) gösterimlerinde verilmiştir. Çubuklar için zümrüt karbonu, turuncu fosforu, kırmızı oksijeni ve beyaz hidrojeni temsil eder. Moleküler yüzey ve çizgiler için yeşil karbonu, mavi nitrojeni, kırmızı oksijeni, beyaz hidrojeni ve sarı kükürdü temsil eder. Sarı kırık çizgiler moleküller arası bağları tanımlar. Oklar, aktif merkezdeki amino asit kalıntılarını gösterir. Kısaltmalar: PI-4-P = fosfatidilinositol-4-fosfat; HDP-2P = engerek zehiri fosfolipazın temel alt birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 4: PI-4,5-P2'nin moleküler yerleştirme yazılımı tarafından bağlanma bölgesi #6 için tahmin edilen HDP-2P'nin moleküler yüzeyi ile etkileşimi. PI-4,5-P2 , HDP-2P'nin aktif merkezinin altında bulunan oluk benzeri bir mağaraya bağlanır. Aktif merkezdeki beş anahtar amino asit kalıntısı üç harfli gösterimde verilmiştir. PI-4,5-P2 çubuk gösteriminde ve HDP-2P satır (soldaki diyagram) ve moleküler yüzey (sağdaki diyagram) gösterimlerinde verilmiştir. Çubuklar için zümrüt karbonu, turuncu fosforu, kırmızı oksijeni ve beyaz hidrojeni temsil eder. Moleküler yüzey ve çizgiler için yeşil karbonu, mavi nitrojeni, kırmızı oksijeni, beyaz hidrojeni ve sarı kükürdü temsil eder. Kısaltmalar: PI-4,5-P2 = fosfatidilinositol-4,5-difosfat; HDP-2P = engerek zehiri fosfolipazın temel alt birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 5: Çeşitli HDP-2P/fosfolipid molar oranlarında lipozom örneklerinden hidrolitik aktivite eğrileri. PC+CL (koyu yeşil), PC+PS (turuncu), PC+PI (koyu mavi), PC+PI-4-P (mavi), PC+PI-4,5-P2 (yeşil) ve PC'den (mor) oluşan lipozomlar. Rastgele birimlerdeki optik yoğunluk değerleri, 550 nm'de üçlü okumaların ortalamalarını temsil eder. Hata çubukları, üçlü okumaların SD'sini gösterir. Lipozom numuneleri arasındaki optik yoğunluk değerlerindeki farklılıkların istatistiksel anlamlılığı ANOVA kullanılarak değerlendirildi ve tüm p değerlerinin 0.05'in oldukça altında olduğu bulundu. Kısaltmalar: PC = fosfatidilkolin; CL = sığır kalbi kardiyolipin; PS = fosfatidilserin; PI = Fosfatidilinositol; PI-4-P = fosfatidilinositol-4-fosfat; PI-4,5-P2 = fosfatidilinositol-4,5-difosfat; a.u. = keyfi birimler; HDP-2P = engerek zehiri fosfolipazın temel alt birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 6: Bakır komplekslerinin sulu çözeltilerinin absorbans spektrumları. Bakır kompleksleri [Cu(H2O)6]2+ (turuncu çizgi) ve [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (mavi çizgi), 500 nm ila 900 nm aralığında görünür ışıkla ışınlanır. Bakır kompleksi [Cu(H2O)6]2+ , 0.025 M CuSO4 çözeltisinde yapıldı ve bakır kompleksi [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ , 0.100 M NH3 içeren 0.025 M CuSO4 çözeltisinde yapıldı. Her veri noktası için bu şekildeki absorbans değerleri, üç kopya halinde yapılan absorbans okumalarının ortalamasıdır. Hata çubukları, üçlü okumalardan SD'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 7: Lipozom örneklerinden membran geçirgenlik eğrileri. Çeşitli HDP-2P/fosfolipid molar oranlarında PC+CL (mor), PC+PS (mavi), PC+PI (koyu mavi), PC+PI-4-P (koyu yeşil), PC+PI-4,5-P2 (turuncu) ve PC'den (yeşil) oluşan lipozomlar. Membran geçirgenlik değerleri, 600 nm'de ölçülen isteğe bağlı birimlerde (au) optik yoğunluk değerleri olarak ifade edilir. Her veri noktası, üçlü okumaların ortalamasını temsil eder. Hata çubukları, üçlü okumaların SD'sini gösterir. Lipozom numuneleri arasındaki optik yoğunluk değerlerindeki farklılıkların istatistiksel anlamlılığı ANOVA kullanılarak değerlendirildi ve tüm p değerlerinin 0.05'in oldukça altında olduğu bulundu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: PI ile HDP-2P'nin aday moleküler kompleksleri için tahmin edilen afinite bağlanma enerjileri. Moleküler modelleme simülasyonları, hem fosfatidilinositol ana grubunun hem de moleküller arası etkileşimlerine katılan HDP2P amino asit kalıntılarının yüklü ve polar kısımlarının yanı sıra bağ türlerini ve bağlanma bölgesi afinitelerini tahmin etmek için kullanıldı. Fosfatidilinositolün yüklü ve polar grupları Şekil 1'de vurgulanmıştır. NH pb δ+'dakiPb'nin bir peptit bağını ifade ettiğine dikkat edin. Kısaltmalar: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = engerek zehiri fosfolipazın temel alt birimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: HDP-2P'nin PI-4-P ile aday moleküler kompleksleri için tahmin edilen afinite bağlanma enerjileri. Moleküler modelleme simülasyonları, hem fosfatidil-inositol-4-fosfat (PI-4-P) ana grubunun hem de moleküller arası etkileşimlerine katılan HDP2P amino asit kalıntılarının yüklü ve polar kısımlarının yanı sıra bağ türlerini ve bağlanma bölgesi afinitelerini tahmin etmek için kullanıldı. NH pb δ+'dakiPb'nin bir peptit bağını ifade ettiğine dikkat edin. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Moleküler yerleştirme iş akışı. Ligand yapımı, reseptör hazırlığı, ızgara kutusu kurulumu ve PI-HDP-2P etkileşimlerini tahmin etmek için yerleştirme simülasyonlarının yürütülmesi dahil olmak üzere AutoDock kullanan moleküler yerleştirme prosedürüne genel bakış. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, fosfatidilinositolde (PI) inositol halkasına kovalent olarak bağlanan fosfat gruplarının, fosfolipaz A2 (PLA2 ) enzimi tarafından fosfolipid membranların bozulmasını önleyip önleyemeyeceğini araştırdık. PLA2'nin hidrolitik aktivitesinin neden olduğu fosfolipid membran bozulmasının ilerlemesini değerlendirmek için, yapısal bozulma ilerledikçe artması gereken membran geçirgenliğindeki değişiklikleri ölçmek için basit ama oldukça hassas ve doğru bir yöntem tasarladık.

Yöntem, fosfolipid lipozomların dışında sulu ortamda süspanse edilirken, amonyak (NH3) lipozomların içinde kapsüllenirken, hekzaaquabakır(II) kompleksi, [Cu(H2O)6]2+'yı içeren bir ligand ikame reaksiyonuna dayanır. Amonyak, Cu2+ için su moleküllerinden daha yüksek bir afiniteye sahiptir, ancak NH3 , [Cu(H2O)6]2+ içinde H2O moleküllerini ikame ettiği dış sulu faza erişmek için lipozomal membrandan geçmelidir . PLA2 katalizli fosfolipid hidrolizi nedeniyle lipozomal membranın yapısal bütünlüğü tehlikeye girerse, NH3'e artan membran geçirgenliği ligand ikamesini kolaylaştıracak ve [Cu(H2O)6]2+'nın soluk mavisinden [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ koyu mavisine renk değişimine yol açacaktır. 600 nm'de optik yoğunluktaki değişimi kaydetmek için spektrofotometri kullanarak bu dönüşümü niceliksel olarak izledik.

HDP-2P24 ve kobra zehiri kardiyotoksinleri 24,25,26,27,28,39'dan etkilenen membran geçirgenliğindeki değişiklikleri incelemek için daha önce paramanyetik iyon ferrosiyanür, [Fe(CN)6]3- ile 1 H-NMR kullanmıştık. Kobra zehiri kardiyotoksinlerinin lipozomal membranlarıngeçirgenliği üzerindeki etkilerini incelemek için bir dizi floresan ve fosforesan prob da kullandık 20,23,40. Bununla birlikte, ferrosiyanür ve floresan/fosforesan problar, membran bütünlüğü önemli ölçüde hasar gördüğünde lipid membranlara nüfuz eden büyük, fizyolojik olmayan moleküler varlıklardır. Buna karşılık, yeni ligand ikame testimiz, ince lipid paketleme bozulmalarında lipid zarlarına nüfuz edebilen küçük, doğal bir hücresel metabolit olan NH₃'yi kullanır. Yeni membran geçirgenlik yöntemimizin bu gelişmiş hassasiyeti, ¹H-NMR/ferrosiyanür tespiti23 için gereken 0,004'e kıyasla, 0,001'lik bir HDP-2P/lipid molar oranında membran geçirgenliğindeki değişiklikleri tespit etme yeteneği ile kanıtlanmıştır.

Aynı çalışmada, HDP-2P'nin zarlar arası lipid değişimi üzerindeki etkilerini incelemek için ferrosen ile eritrosin fosforesans söndürme kullandık, test numunelerindeki eritrosin ömrünün oranındaki değişiklikle değerlendirildi (τn) kontrol numunesindekine (τ0)23. 0.004'lük bir HDP-2P/lipid molar oranında, τn/τ0 değeri 0.423'e düştü, bu da iki değerlikli katyonlara24 geçirgen bir membran akışkanlığı durumunu gösterir. Bu nedenle, NH₃ bazlı ligand ikame testimiz, 0,001'lik bir HDP-2P/lipid molar oranında membran geçirgenliğini tespit ederken, geleneksel testler (1H-NMR/ferrosiyanür ve fosforesans probu söndürme) membran geçirgenliğini yalnızca 0,004'lük bir molar oranda tespit eder. Bu, NH3 bazlı testimizin geleneksel testlerden dört kat daha hassas olduğunu göstermektedir.

NH3 bazlı tahlilimizin olağanüstü hassasiyeti, hidrolitik aktivite ölçümleriyle yakından ilişkili olan geçirgenlik verileri verdi ve yalnızca bir belirgin tutarsızlık oldu: PC+PI-4-P lipozomları, geçirgenlik değişiklikleri olmadan önemsiz hidroliz gösterdi, bu da minimal lokal lizofosfolipid/yağ asidi üretiminin, membran yapısal bütünlüğünü ve geçirgenliğini etkilemeyen küresel lipid paketlemesini etkilemediğini düşündürdü. Bu nedenle, bu çalışma, lipozomların iç hacmi içinde kapsüllenmiş bir ligand içeren karmaşık bir iyon sistemindeki ligand ikame reaksiyonunun, HDP-2P'nin hidrolitik aktivite verileriyle mükemmel bir şekilde uyumlu sonuçlar ürettiğini göstermiştir. Bu bulgular, sırayla, PI ve fosfoinositidlerin HDP-2P'nin moleküler yüzeyine bağlanması üzerine in-silico çalışmalarla güçlü bir uyum içindeydi.

Genel olarak, bu çalışmadaki AutoDock simülasyonu, PI'nin tanımlanan dokuz bağlanma bölgesinden dördünde aktif merkeze bağlandığını, PI-4-P'nin ise tahmin edilen dokuz bölgeden yalnızca birinde aktif merkeze bağlandığını ortaya koymuştur. PC+PI-4-P lipozomlarında HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesi, PC+PI lipozomlarından yaklaşık 5 kat daha düşüktü. Ayrıca, in silico çalışmalar, PI-4,5-P2'nin HDP-2P'nin aktif merkezine bağlanmadığını öngördü. Tutarlı bir şekilde, PLA2 aktivite deneyleri ve ligand ikame reaksiyonu deneyleri, PI-4,5-P2'nin hem fosfolipid hidrolizini hem de membran geçirgenliğindeki artışı tamamen inhibe ettiğini, PI-4-P'nin ise daha az, önemli olmayan hidrolitik aktivite gösterdiğini ve membran geçirgenlik değişikliklerini tamamen önlediğini gösterdi. Bu gözlemler, insan sitozolik, kalsiyumdan bağımsız ve PI, PI-4-P ve PI-4,5-P235'e yönelik salgılanan PLA2 enzimlerinin in vitro aktivite çalışmaları ile iyi bir uyum içindedir. Bu çalışmalar, yalnızca Grup IVA sitozolik PLA2'nin PI ve PI-4-P'ye karşı nispeten yüksek katalitik aktivite sergilediğini, PI-4,5-P2'ye karşı aktivitesinin ise zar zor saptanabildiğini gösterdi. Test edilen diğer tüm PLA2 enzimleri, PI-4,5-P235'e karşı hiçbir aktivite göstermedi. Bu aktivite eksikliği, membran yüzeyi ile PLA2 enzimleri35 arasındaki üretken etkileşimlere müdahale eden inositol halkası üzerindeki yüksek hidrofilik fosfat gruplarına atfedilmiştir. İnositol halkası üzerindeki fosfat gruplarının çözeltiye dışa doğru genişlemesinin ve bunların HDP-2P'nin oluk benzeri boşluğunun kalıntıları ile iyon-polar ve hidrojen bağları oluşturma yeteneklerinin, HDP-2P'nin hidrolitik aktivitesini uygulamak için zar yüzeyine yeterince yaklaşmasını engellediğini, böylece zarı stabilize ettiğini ve hücre ölüm yollarını aktive ederek hücrelere zarar verebilecek HDP-2P tarafından fosfolipid zarların bozulmasını azalttığını öneriyoruz. Bu mekanizma, anormal enzim aktivitesini içeren hastalık durumlarında fosfoinositidlerin potansiyel koruyucu rolü ile uyumlu görünmektedir.

Membran geçirgenlik analizleri, hidrolitik aktivite ölçümleri ve in silico moleküler yerleştirme çalışmalarından elde edilen sonuçlar arasındaki güçlü korelasyon, ligand ikame reaksiyonu yönteminin güvenilirliğini vurgulamaktadır. Lipozomlar içinde kapsüllenmiş bir ligand kullanan bu yaklaşımın, fosfolipidlerin stabil çift katmanlı organizasyonundaki yapısal bozulmaların neden olduğu membran geçirgenliği değişikliklerini değerlendirmek için doğru ve etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yazıda sunulan AutoDock kullanan moleküler yerleştirme çalışmalarının, fosfolipidlerin HDP-2P ile dinamik ve uzunlamasına bir şekilde nasıl etkileşime girebileceğinin tam olarak anlaşılmasını sağlamadığını kabul etsek de, HDP-2'nin çeşitli fosfolipidlerden oluşan fosfolipid çift katmanlarını nasıl geçirebileceğine dair ek moleküler mekanizmaları belirlemek için gelecekte moleküler dinamik çalışmalarının yapılması gerekmektedir. Moleküler dinamik çalışmaları yapmanın, sınırlı kaynaklara ve araştırma fonuna sahip birçok akademik kurumda bulunmayan yüksek performanslı bilgisayarlar ve kümeler gibi yüksek hesaplama kaynakları gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Son olarak, mevcut teknik makalesinde sert bir reseptörün (HDP-2P) kullanıldığını ve bir çözücü/membran ortamının olmadığını kabul ediyoruz. Bununla birlikte, sert bir reseptör kullanarak HDP-2P'nin çeşitli fosfolipidlerle moleküler kenetlenmelerinin gerçekleştirilmesinin, substratlara bağlanan katalitik taraftaki kritik amino asit kalıntıları, esnek hale getirilebilecek moleküler bölgelere odaklanmak üzere tanımlandıktan sonra, gelecekte esnek bir reseptör ile takip edilebilecek kenetlenmiş aday yapıların ilk geçişini belirlemek için ilk yerleştirme çalışmaları yapmak için geleneksel yaklaşım olduğunu vurgulamak istiyoruz. moleküler yerleştirme çalışmalarını ve çözülmüş bir ortamda takip edin. Bu nedenle, daha fazla kaynağa sahip diğer kurumlarla işbirliklerinden yararlanmak, AutoDock tarafından sağlanan bazı ilk bulguları doğrulamaya ve substrat-enzim etkileşimlerinin ek moleküler mekanizmalarını tanımlamaya yardımcı olmanın bir yolu olabilir.

Sonuç olarak, bu çalışmanın bulguları, lipozomlar içinde kapsüllenmiş bir ligand kullanan ligand ikame reaksiyonu yönteminin, çeşitli membran aracılı işlemlerde membran geçirgenliği çalışmalarına etkili bir şekilde uygulanabileceğini göstermektedir. Bunlar, diğerleri arasında ligand-reseptör etkileşimlerini, lipid-protein etkileşimlerini, zarlar arası değişimi, zar füzyonu ve fisyonunu ve nöromüsküler kasılmaları içerir. Ayrıca bu yaklaşım, membranotropik farmasötiklerin araştırılması için önemli bir potansiyele sahiptir. Aynı zamanda, model membranlardaki yeni yöntemlerin, membran etkileşimlerinin spesifik mekanizmalarını incelemek için paha biçilmez olmasına rağmen, bunların doğal basitleştirmelerinin, biyolojik membranların yapısal, bileşimsel ve işlevsel karmaşıklığını in vivo olarak tam olarak kopyalama yeteneklerini sınırladığının farkındayız. Bu nedenle, model sistemlerden gelen verileri dikkatle yorumlamak ve mümkün olan her yerde hücresel veya organizma modellerini kullanarak bulguları doğrulamak önemlidir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu makaledeki çalışmalar, Pekin Chaoyang KaiWen Akademisi'nin (E.S.G.) başlangıç hibesi ve SEPA Ödülü, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.) ile desteklenmiştir. HDP-2'nin hazırlanmasına ilişkin çalışmalar, Rusya Bilim Vakfı'nın 24-15-00280 (Y.N.U.) tarafından sağlanan hibe ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu araştırma makalesinin yayınlanmasının ardından hazırlanan moleküler yerleştirme simülasyonunun uygulanmasına ilişkin senaryoyu yazan ve videoyu geliştiren Dr. Maryam Barancheshmeh'e teşekkür etmek isterler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
V. nikolskii engerek zehrinin temel alt birimi HDP-2P PLA2, HDP-2, %98,5 saflık Biyoorganik Kimya Enstitüsü, MoskovaHDP-2, PMID:18083205'de potocol'a göre izole edildi. HDP-2P, DEAE Sephadex A-50  tarafından HDP-2'den arındırılmıştır;  
Kardiolipin (Kalp, Sığır) (sodyum tuzu),%>99%MacklinC916138
Koenzim A, FUJIFILM Wako' s NEFA kit Lexington, MA, ABD
Diyaliz borusu selüloz zarı moleküler ağırlık kesimi 1.0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Şanghay, Çin 
Dijital olarak kontrol edilen su tankı termostatı YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pekin, Çin 
Elektronik yüksek hassasiyetli analitik denge FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., Çin
JingHua 752 UV-Görünür Aralık Spektrofotometresi Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Şanghay, Çin
L-α-fosfatidilkolin (Yumurta, Tavuk),≥ 95%MacklinL799415
L-α-fosfatidilinositol (karaciğer, sığır) (sodyum tuzu),≥ 99%MacklinL780292
L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisphosphate (Beyin, Porcine) (amonyum tuzu),≥ 99%MacklinL996223
L-α-fosfatidilinositol-4-fosfat (Beyin, Porcine) (amonyum tuzu), %99MacklinL970250
L-α-fosfatidilserin (Beyin, Porcine) (sodyum tuzu),%>99%MacklinL864755
Manyetik Karıştırıcı JB-3 Shanghai Leici JB-3
pH Ölçer PHS-3C Şanghay INESA Bilimsel Aletler A., Ltd., Çin
TGL-16B mikrosantrifüj Shanghai 3 Anting Co., Şanghay, Çin
Ultrasonik Dağıtıcı Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd., Çin
Vakum Pompası TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, Çin

Kaynaklar

  1. De Matteis, A., De Camilli, P. Phosphoinositides. Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).
  2. Hokin, M. R., Hokin, L. E. Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices. J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).
  3. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices. Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).
  4. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices. J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).
  5. Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease. J Biol Chem. 300, 105757(2024).
  6. Powis, G., et al. Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease. Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).
  7. Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).
  8. Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights. FEBS J. 287, 222-238 (2020).
  9. Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling. Life Sci. 301, 120596(2022).
  10. Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. Cracking the context-specific PI3K signaling code. Sci Signal. 13, eaay2940(2020).
  11. Wills, R. C., Hammond, G. R. V. PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane. Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).
  12. Epand, R. M. Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction. J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).
  13. De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways. Int J Mol Sci. 18, E634(2017).
  14. Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).
  15. Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. Phospholipases in Physiology and Pathology. 2, Academic Press. 139-158 (2023).
  16. André, S., et al. Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).
  17. Trotter, A., et al. The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).
  18. Schaloske, R. E., Dennis, E. A. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).
  19. Petrovic, U., et al. Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell. Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).
  20. Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance. J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).
  21. Harris, J. B., Scott-Davey, T. Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry. Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).
  22. Ramazanova, A. S., et al. Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).
  23. Chaudary, A. S., et al. Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance. J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).
  24. Li, M., Gasanoff, S. E. Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study. J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).
  25. Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure. Toxins. 16, 287(2024).
  26. Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane. Toxins. 12 (7), 425(2020).
  27. Zhang, B., et al. Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function. Toxins. 11, 152(2019).
  28. Gasanov, S. E., et al. Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins. PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).
  29. Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes. Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).
  30. Weast, R. C. CRC Handbook of Chemistry and Physics. , 62nd ed, CRC Press. (1982).
  31. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).
  32. Ford, M. G., et al. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).
  33. Khan, S. A., Ilies, M. A. The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles. Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).
  34. De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation. Toxins. 16 (2), 71(2024).
  35. Hayashi, D., Dennis, E. A. Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).
  36. Alekseeva, A. S., et al. Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon. 133, 169-179 (2017).
  37. Burke, J. E., Dennis, E. A. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).
  38. Dennis, E. A., et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  39. Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).
  40. Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipozom Ge irgenli iFosfatidilinositol FosfatlarFosfolipaz AktivitesiMolek ler ModellemeLipozom HidroliziFosfatidilkolin Lipozomlarnositol Fosfat GruplarMembran Korumas
Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.