Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Travma Sonrası Osteoartritte PGE 2-EP4-Ca2+ Sinyal Ekseninin Potansiyel Rolü

673 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68602

⸱

22 Ağustos 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Regenerative Medicine in Sports Science, School of Physical Education and Sports Science, South China Normal University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Refractory Chronic Diseases, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine), 3Bone and Joint Research Team of Degeneration and Injury, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences

Bu makalede

Özet

Burada, akut mekanik yaralanmaya bağlı ve kronik metabolik / çevresel faktöre bağlı osteoartrit arasındaki farklı patogenez için bilimsel kanıtlar sağlayarak, karşılaştırma yoluyla osteoartrit sıçan modellerinin oluşturulması ve değerlendirilme yöntemlerini sistematik olarak özetlemek için bir protokol sunuyoruz. ACLT modeli, EP4-Ca2+-mitokondriyal disfonksiyon sinyal yolundaki değişiklikleri vurgulayan ana odak noktasıdır.

Özet

Travma sonrası osteoartrit (PTOA), travma veya yoğun mekanik stres ile tetiklenen, eklem kıkırdak dejenerasyonuna ve fonksiyonel bozulmaya yol açan dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Prostaglandin E2 (PGE2), kondrosit membranları üzerindeki reseptörü Prostaglandin E reseptörü 4'ü (EP4) aktive ederek mekanik yaralanmayı takiben kıkırdak bozulmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Eklem kıkırdağının homeostazı esas olarak, kondrositler tarafından ince bir şekilde düzenlenen bir süreç olan kıkırdak bozulması ve onarımı arasındaki dinamik dengeye dayanır. Ca2 + / Kalmodulin'e bağımlı Protein Kinaz II (CAMKII) sinyal yolunun, kondrosit fonksiyon restorasyonuna aracılık etmede kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu çalışmada, interlökin-1 beta (IL-1β) ile uyarılmış kondrositlerde EP4, İnositol 1,4,5-trisfosfat reseptörü (IP3R) ve fosforile CaMKII ekspresyonunun arttığını gözlemledik, bu da EP4 sinyali ile kalsiyum düzensizliği arasında olası bir bağlantı olduğunu düşündürdü. Bununla birlikte, EP4-Ca2+/CaMKII ekseninin PTOA'ya katılımını doğrulayan doğrudan kanıtlar hala eksiktir. Bu potansiyel mekanizmayı açıklığa kavuşturmak için genetik veya farmakolojik müdahaleler kullanan daha ileri araştırmalara ihtiyaç vardır. Bu bulgular, PTOA tedavisi için hedefler olarak kalsiyum homeostazı ve EP4 sinyalini araştırmak için bir ön temel sağlar.

Giriş

Fiziksel aktivite, sağlık yararları nedeniyle yaygın olarak teşvik edilmesine rağmen, çeşitli olumsuz sonuçlara yol açabilen alt ekstremite kas-iskelet sistemi yaralanmalarının önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir1. Bunlar arasında PTOA, genç yaşta eklem yaralanmaları yaşayan ergenler ve genç yetişkinler için giderek artan bir yük haline gelmiştir2. Endişe verici bir şekilde, sporla ilgili eklem yaralanmaları geçiren bireylerin yaklaşık% 48-52'si 11-17 yıl içinde PTOA geliştirir 3,4. Gençlik sporlarında ve rekreasyonel aktivitelerde en sık yaralanan eklemlerden biri olan diz eklemi, eklem yaralanmasından PTOA'ya ilerlemede özellikle savunmasızdır. Prospektif bir çalışma, diz yaralanması olan bireylerin, yaralanmadan 12-20 yıl sonra radyografik olarak doğrulanmış diz osteoartriti geliştirme riskinin, yaralanmamış bireylere kıyasla 10 kat daha yüksek olduğunu bildirmiştir5. Ayrıca, genç erişkinlerde, radyografik değerlendirmeler, ön çapraz bağ transeksiyonu (ÖÇBT) yaralanması olan kadın futbolcuların 12 yıl içinde PTOA gelişme riskinin %51 olduğunu, erkek oyuncuların ise 14 yıl içinde %41 riske sahip olduğunu göstermiştir5. Bu bulgular, sporla ilişkili eklem yaralanmalarının kas-iskelet sağlığı üzerindeki uzun vadeli olumsuz etkisini vurgulamaktadır. Bu nedenle, PTOA gelişiminin altında yatan geri dönüşümsüz patolojik mekanizmaların anlaşılması, hastalığın ilerlemesini azaltmayı amaçlayan uygun müdahale stratejilerinin belirlenmesi için çok önemlidir.

Ca2+ homeostazının erken düzensizliği, PTOAbaşlangıcı 6 için anahtar göstergelerden biridir. Ca2 + , CaMKII ile etkileşime girebilen, otoinhibitör konformasyonunu hafifleten ve kinaz aktivitesini düzenleyen bir Ca2 + / CaM kompleksi oluşturmak için kalmoduline (CaM)bağlanır 7. Hem insan hem de fare OA'sında, fosforile CaMKII'nin (CaMKII'nin aktive edilmiş formu) ekspresyonu artarken, CaMKII inhibitörlerinin kullanımı fosforilasyon seviyelerindeki bu yükselmeyi bloke ederek eklem kıkırdağı yıkımınayol açar 8, bu da Ca2+ / CaMKII'nin OA kıkırdak homeostazına aracılık etmede önemli düzenleyici rolünü gösterir. Normalde, bu değişiklikler PTOA gelişiminde inflamatuar mekanizmaların aktivasyonundan önemli ölçüde etkilenir. Önemli bir proinflamatuar ağrı mediatörü olarak yüksek PGE2 seviyeleri, EP4 reseptörünü aktive ederek OA'nın ilerlemesini etkiler. Spesifik olarak, eklem kıkırdağında EP4'ün koşullu nakavtlanması, kondrosit hipertrofisi ve katabolizmayı inhibe ederken kıkırdak oluşumunu ve anabolik metabolizmayı arttırır, böylece fibrokartilaj yerine stabil, olgun eklem kıkırdağının yenilenmesini teşvik eder ve eklem ağrısını hafifletir9. Ca2 + / CaMKII sinyal yolunun kondrosit fizyolojisindeki önemli rolü ve EP4 reseptörünün osteoartrit ilerlemesinde bilinen rolü göz önüne alındığında, bu çalışma EP4 aktivasyonunun PTOA gelişimi sırasında kalsiyum sinyalizasyonundaki değişiklikler ve mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçladı. EP4 ve Ca²⁺ düzensizliği arasındaki nedensel ilişki henüz belirlenmemiş olsa da, buradaki veriler daha fazla araştırmayı gerektiren olası bir mekanik bağlantı olduğunu göstermektedir.

Bu çalışma, PTOA gelişimi sırasında EP4 reseptör aktivasyonunu Ca²⁺ sinyalizasyonu ve mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkilendiren potansiyel mekanizmalara odaklanmaktadır. Yaklaşımımız, PTOA progresyonunu saptayan görüntüleme teknikleri gibi geleneksel tanı yöntemleri ve semptomların giderilmesi için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAİİ'ler) gibi güncel terapötik yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, PTOA patogenezinde erken hücre içi sinyal bozukluklarını ortaya çıkarmayı amaçlamaktadır. Bu mekanik içgörü, hastalığın başlangıcı ve ilerlemesinin daha kesin bir şekilde anlaşılmasını sağlayarak erken tanı ve hedefe yönelik müdahaleler için yeni yollar sunar. Bu nedenle, bu çalışma, akut veya kronik fiziksel aktivite sırasında motor kontrolü bozulmuş sporcularda yaygın olarak görülen mekanik yaralanmaları taklit etmek için ön çapraz bağ transeksiyonu (ACLT) ile indüklenen bir PTOA sıçan modeli oluşturmuştur. Bu model, travma sonrası mekanik eklem hasarının optimal bir temsili olarak hizmet eder ve hem histopatolojik değişiklikleri hem de altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için tekrarlanabilir bir platform sunar. Yüksek yağlı bir diyet artı nemli ortama maruz kalma (FD) grubu, kronik osteoartrit ile ilişkili metabolik ve çevresel risk faktörlerini simüle etmeyi amaçlayan pozitif bir kontrol görevi görür. İlki, mekanik travmanın neden olduğu akut yaralanmayı modellerken, ikincisi, metabolik bozukluk ve çevresel faktörlerin neden olduğu doğal olarak oluşan bir hastalık modelini temsil eder, ancak bu gruptaki nihai patogenez EP4-Ca²-mitokondriyal ekseni takip etmeyebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, Guangdong İl Çin Tıbbı Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (etik onay numarası: 2024014-2). Çalışma, Çin Halk Cumhuriyeti Devlet Konseyi tarafından şart koşulan laboratuvar hayvanlarının etik kullanımına ilişkin düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür.

1. Hayvanlar

  1. Kızgınlık döngüsü ile ilişkili potansiyel karıştırıcı etkileri azaltmak için Sprague-Dawley (SD) dışlanmış SPF sıçanlarını kullanın. Bu deney için yaşları 4 hafta olan ve ağırlıkları 90 g ile 100 g arasında olan toplam dokuz erkek SD sıçan seçin.
    NOT: Bu fareler, Çin'deki lisanslı bir laboratuvar hayvanı tedarikçisinden temin edilmiştir (sertifika numarası: 20240410Aazz0619000774).
  2. Tüm hayvanları belirli bir patojen içermeyen (SPF) ortamda tutun. Ortalama %24 ±nem ± %60 nem 12 °C sıcaklıkta 24 ila 1 °C sıcaklıkta kontrollü bir ortam sağlayın.
  3. Sıçanların asitlendirilmiş suya ve standart bir kemirgen yemeği diyetine serbestçe erişebildiğinden emin olun.

2. Hayvan modeli yapımı ve müdahalesi

  1. Sıçanları beslenme merkezinde 2 haftalık bir süre boyunca iklimlendirin. Sıçanları 6 haftalıkken rastgele üç gruba atayın: Kontrol grubu, PTOA grubu ve FD grubu, her grupta üç sıçan ile.
  2. Kontrol grubunu standart koşullar altında koruyun.
  3. PTOA grubunu izofluran ile uyuşturun (indüksiyon için %4 ve idame için %1-2).
  4. Medial parapatellar yaklaşım kullanarak uzunlamasına bir cilt insizyonu ile bilateral diz eklemlerini cerrahi olarak ortaya çıkarın.
  5. Bir neşter kullanarak ACLT yapın ve pozitif bir ön çekmece testi yaparak tam transeksiyonu onaylayın.
    NOT: Model tutarlılığını sağlamak ve bireysel değişkenliği azaltmak için bilateral ÖÇB transeksiyonu yapıldı. Analiz için hayvan başına bir değer elde etmek için her iki dizden elde edilen verilerin ortalaması alındı.
  6. FD gruplarındaki sıçanları periyodik olarak aynı tesiste bulunan iklim kontrollü bir odaya aktarın. Bu fareleri yüksek yağlı bir diyete tabi tutun.
    NOT: Yüksek yağlı diyet %20 sakaroz, %15 domuz yağı, %1.2 kolesterol, %0.2 sodyum kolat, %10 kazein, %0.6 kalsiyum hidrojen fosfat, %0.4 kireçtaşı tozu, %0.4 premiks ve %52.2 bazal yem içeriyordu. Kontrol yeminin besin profili şu şekildedir: %19 protein, %31 yağ ve %50 karbonhidrat, kalori oranı %17 protein, %37 yağ ve %46 karbonhidrattır.
  7. İklim odası içindeki çevre koşullarını 24 ± 2 °C sıcaklıkta, %90 ± %4 nem seviyesinde ve 12 saatlik günlük ışık döngüsünde koruyun.
    NOT: Bu kadar yüksek sıcaklık ve yüksek nemli bir ortamda bakteri üreme riskinin artması nedeniyle, kontaminasyonu en aza indirmek için içme suyunu ve yiyecekleri sterilize edin ve günlük olarak yenileyin. Deneysel müdahalenin toplam süresi 12 haftaydı.

3. Yürüyüş analizi (Ayak İzleri)

  1. Model sıçanlarda tedavinin başlamasından 12 hafta sonra, daha önce belirtilen bir yöntemi kullanarak ayak izi analizi yapın10.
  2. Sıçanların arka pençelerinin ventral yüzeylerini kırmızı mürekkeple kaplayın ve beyaz kağıtla kaplı 100 cm uzunluğunda ve 8 cm genişliğinde bir yol boyunca yürümelerine izin verildi.
  3. Fareleri hareket etmeye teşvik etmek için, ileri hareketi teşvik etmek için yolun sonuna karanlık bir oda yerleştirin.
  4. Düzensizliği değerlendirmek için kullanılan adım uzunluğu ve adım uzunluğu dahil olmak üzere her parametre için ortalama değerler elde etmek için üç ardışık ölçüm yapın.
  5. Aynı arka pençenin birbirini izleyen iki adım arasında kat ettiği mesafeyi ölçerek adım uzunluğunu (cm) belirleyin.
  6. Adım uzunluğunu (cm) sol ve sağ arka pençeler arasındaki yatay mesafe olarak tanımlayın.
  7. Pençe açısını (°) yatay bir çizgiye göre ikinci ayak parmağı ile kalkaneus arasındaki açı olarak ölçün11.
  8. Image-Pro Plus yazılımını (sürüm 6.0) kullanarak, yerleşik mesafe ve açı ölçüm araçlarını kullanarak adım uzunluğunu, adım uzunluğunu ve pençe açısını doğrudan taranan ayak izi görüntüleri üzerinde ölçün.
    NOT: Bu yürüyüş parametreleri, osteoartritin erken evrelerinde ince fonksiyonel bozuklukları tanımlamak için çok önemlidir. Hastalar ağrılı eklemleri korumak için azalmış adım ve adım uzunluğu sergileyebilirken, artmış ayak ucu açısı ve yürüyüş asimetrisi genellikle ağrının neden olduğu eklem instabilitesine telafi edici yanıtlar olarak ortaya çıkar.

4. Eklem çapı ölçümü

  1. Her grupta modelleme yaptıktan sonra kalibre edilmiş bir spiral mikrometre (mm) kullanarak bağlantı çapını ölçün.
    NOT: Osteoartrit ilerledikçe, hastalar tipik olarak eklem şişmesi ve ağrısı gösterir. Daha yüksek derecede şişlik, hastalığın daha şiddetli bir aşamasını gösterebilir.

5. Kavrama gücü ölçümü

  1. Bir çekiş ızgarası ile donatılmış bir dijital kavrama gücü ölçer, bir çekiş ızgarası (90 mm × 90 mm) ile donatılmış bir güç ölçer kullanarak arka bacak kavrama gücünü ölçün.
    1. Fareyi kuyruğundan ve boynunun arkasındaki cildi nazikçe tutun.
    2. Hayvanı, arka ayakları ızgarayı sıkıca kavrayana kadar indirin, ardından hayvanı, tutuşunu serbest bırakana kadar kuvvet sensörünün ekseni boyunca yatay olarak sabit bir şekilde çekin.
    3. Testi hayvan başına üç kez tekrarlayın. En yüksek değeri maksimum kavrama gücü olarak kaydedin.
      NOT: Arka bacak kavrama gücü testi sırasında, ön ayakların çekiş ızgarası ile kazara birbirine girmesini önlemek için ön ayakları bir karton yüzeye bantlayarak hareketsiz hale getirin. Azalmış kavrama kuvveti, azalmış kas fonksiyonunun ve osteoartritik ilerlemeyle ilişkili potansiyel ağrıya bağlı motor eksikliklerin göstergesidir.

6. Primer kondrosit izolasyonu ve kültürü

  1. 6 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanlarından primer kondrositleri izole edin.
  2. Yaklaşık 100-150 mg kıkırdak dokusu toplamak için femur başlarını ve tibial platoları inceleyin.
  3. Dokuyu iki kez% 1 penisilin-streptomisin içeren PBS ile yıkayın.
  4. Kıkırdağı 5 mL% 0.25 tripsin-EDTA'da 3 ° C'de 30 dakika boyunca sindirin.
  5. Kıkırdağı 1-2 mm,3 parçaya kesin ve daha sonra 10 mL% 0.2 kollajenaz II'de 37 ° C'de 4 saat boyunca sabit sıcaklıkta bir çalkalayıcıda sindirin.
  6. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün, 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  7. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin.
  8. Hücreleri 3 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.

7. Hücre tedavisi

  1. Bir hemositometre kullanarak izole edilmiş kondrositleri sayın.
  2. Kondrositleri, 0.1 mL tam kültür ortamında (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM / F12) kuyu başına 2 ×ila 105 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın.
  3. Yapışmayı sağlamak için hücreleri 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  4. Bir in vitro inflamatuar PTOA modeli oluşturmak için, hücre birleşmesi yaklaşık% 80'e ulaştığında, yapışık kondrositleri 48 saat boyunca IL-1β (10 ng / mL) ile tedavi edin.
  5. FD pozitif kontrolü için, palmitik asidi (PA, CAS No. 57-11-4) kloroformda 1:1000 seyreltmede çözün ve 500 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın.
    1. Hücre birleşmesi yaklaşık% 80'e ulaştığında, 500 nM'lik bir nihai PA konsantrasyonuna ulaşmak için 1 mL kültür ortamı başına 1 μL PA stok çözeltisi ekleyin. Kondrositleri bu çözelti ile 48 saat tedavi edin.
  6. PA içermeyen hücreleri kontrol etmek için 1 mL kültür ortamı başına 1 μL kloroform (araç kontrolü) ekleyin.

8. Numune toplama, dekalsifikasyon ve gömme hazırlama

  1. Müdahaleden 12 hafta sonra, en az 5 dakika boyunca kapalı bir odada aşırı dozda izofluran (% ≥5) soluyarak hayvanları ötenazi yapın ve solunum ve kalp atışının tamamen durduğunu onaylayın.
    NOT: Bu yöntem, Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının insancıl ötenazisi için ulusal yönergelere uygundur.
  2. Histolojik değerlendirme için her iki diz eklemini grup başına üç sıçandan (n = 3, toplam = 6 diz) toplayın.
  3. Numuneleri %4 paraformaldehit (PFA) içinde 1:20'den daha yüksek bir doku-fiksatif hacim oranında 48 saatten fazla bir süre boyunca °C'de bir çalkalayıcı üzerinde sabitleyin.
  4. Kalan fiksatifi çıkarmak için dokuları akan musluk suyu altında 1-2 saat durulayın.
  5. 3 ° C'de 21 gün boyunca 1: 20 doku-çözelti oranında 0.5 M EDTA çözeltisinde (pH 7.4, ~% 15) dokuları kireçten arındırın ve her 3 günde bir taze çözelti ile değiştirin.
  6. Yumuşatma için kemiği bir iğne ile inceleyerek dekalsifikasyonun tamamlanmasını değerlendirin.
  7. Kireçten arındırılmış mendilleri 2 saat akan musluk suyu altında yıkayın ve gömme kasetlerine yerleştirin.
  8. Numuneleri kademeli bir etanol serisi ile dehidrat: 2 saat (veya gece boyunca) %75 etanol, 2 saat boyunca %80 etanol, 0,5 saat boyunca %95 etanol ve 60 dakika boyunca iki kez mutlak etanol. Daha sonra 20 dakika boyunca 1: 1 ksilen: etanol içine daldırın.
  9. Ksilen içindeki dokuları iki kez temizleyin (10 dakika ve 60 dakika).
  10. Dokuları parafin ile aşağıdaki sırayla sızın: ksilen: parafin (1: 1) 15 dakika, yumuşak parafin 52-5 ° C'de 1 saat (iki kez), daha sonra 56-5 ° C'de 30 dakika sert parafin.
  11. Bir parafin gömme sistemi (örneğin, Leica, 6 ° C'ye ayarlanmış) kullanarak dokuları gömün ve blokları 2 saat boyunca -2 ° C'lik bir soğuk plakaya aktarın.
  12. Kesit parafin, bir mikrotom kullanarak μm kalınlığında sagittal olarak bloke olur.
  13. Kurdeleleri 4 °C'lik bir su banyosunda yüzdürün ve temiz cam slaytlara monte edin.
  14. Monte edilmiş bölümleri havayla kurutun ve kalan parafini çıkarmak için 60 ° C'lik bir fırında 2 saat pişirin.
  15. Ksilen (10 dakika), taze ksilen (10 dakika), mutlak etanol (5 dakika), taze mutlak etanol (5 dakika), %90 etanol (5 dakika) ve %75 etanol (5 dakika) içine sırayla daldırarak bölümleri deparafinize edin, ardından boyamadan önce musluk suyu ile durulayın.

9. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama

  1. Deparafinize edilmiş ve rehidre edilmiş doku kesitleri, oda sıcaklığında (RT; ~ 2 ° C) 3-5 dakika boyunca% 0.5 hematoksilen boyama çözeltisine daldırıldı, ardından akan musluk suyu altında iyice durulandı.
  2. Bölümleri hematoksilen farklılaşma solüsyonu ile 2-5 saniye kısaca tedavi edin ve akan musluk suyu altında durulayın.
  3. Bölümleri 2-5 saniye hematoksilen mavileştirme çözeltisine batırarak ve ardından durulamayı gerçekleştirin.
  4. Bölümleri %85 ve %95 etanolde 5 dakika kurutun, ardından 5 dakika boyunca %0.05 eozin Y (alkollü) içinde boyayın.
  5. Mutlak etanolde iki kez dehidre edin (her biri 5 dakika), daha sonra ksilen (5 dakika), ardından taze ksilen (5 dakika) ile temizleyin.
  6. Bölümleri nötr balsam ile monte edin ve bir lamel ile örtün.
    NOT: İyi korunmuş kıkırdakta, hematoksilen çekirdekleri maviye ve eozin matris pembesine boyar. Hasarlı kıkırdak, kondrosit kaybı, fibrilasyon ve dezorganize matriks gösterir.

10. Safranin O - hızlı yeşil (SOFG) boyama

  1. RT'de 1-5 dakika boyunca% 2 Hızlı Yeşil çözelti ile bölümleri boyayın. Kıkırdak renksiz hale gelene kadar akan musluk suyu altında yıkayın.
  2. % 1 hidroklorik asit içindeki bölümleri 10-15 saniye boyunca kısaca ayırt edin, ardından akan su ile iyice durulayın.
  3. Bölümleri 5-10 saniye boyunca% 0.2 Safranin O çözeltisi ile boyayın, daha sonra dört mutlak etanol değişikliği (her biri 3-5 saniye) ile hızla dehidre edin.
  4. Ksilen (5 dakika) içindeki bölümleri temizleyin, ardından taze ksilen (5 dakika) gelir.
  5. Slaytları nötr balsam ile monte edin ve bir lamel ile örtün.
    NOT: Safranin O, kıkırdak proteoglikanları kırmızıya boyarken, Fast Green kemik/fibröz dokuları yeşile boyar. Kırmızı kaybı, proteoglikan tükenmesini ve dejenerasyonunu gösterir.
  6. Uluslararası Osteoartrit Araştırma Derneği (OARSI) puanlama sistemini kullanarak histolojik değişiklikleri değerlendirin. Yapısal dejenerasyonu değerlendirmek için eklem boşluğu genişliğini ve kıkırdak kalınlığını ölçün. Görüntüleri ışık mikroskobu altında (ör. ECLIPSE Ti2-E) 4× (ölçek çubuğu = 50 μm) ve 20x'te (ölçek çubuğu = 10 μm) yakalayın.
    NOT: Görüntü yakalama için sistemin görüntüleme yazılımını ve analiz için ImageJ'yi (v1.48v) kullanın. Analiz Et > Mikrometre ile Ölçek Ayarla ile görüntüleri kalibre edin. Her eklem için, üç bağımsız gözlemci tarafından kör analiz kullanarak üç sagital bölümden beş rastgele alanı ölçün.

11. Mikro-μ BT

  1. Müdahaleden 12 hafta sonra sıçan diz eklemlerini inceleyin ve doku morfolojisini korumak için 24 saat boyunca RT'de% 4 paraformaldehit içinde hemen sabitleyin.
  2. Sabit numuneleri PBS ile durulayın ve taramaya kadar% 70 etanol içinde saklayın.
  3. Taramadan önce her diz eklemi örneğini özel bir örnek tutucuya monte edin. Hareket artefaktlarını en aza indirmek için eklemi uzun ekseni boyunca hizalayın.
  4. Aşağıdaki tarama parametrelerine sahip bir mikro-μCT sistemi kullanarak mikro-μCT taraması gerçekleştirin: X-ışını voltajı 70 kV, akım 100 μA ve güç 7 W.
  5. Projeksiyon başına dört kare elde edin ve bunları 0,72°'lik dönme adım boyutuyla görüntü kalitesini artırmak için üst üste koyarak tam 360° döndürmeyi tamamlayın.
  6. Elde edilen voksel boyutunu (dilim kalınlığı) 15 μm'ye ayarlayarak trabeküler kemik analizine uygun yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlayın.
  7. Hem femur hem de tibianın subkondral kemiğine odaklanarak proksimal tibial büyüme plakası ile tibial plato arasındaki ilgi bölgesini (ROI) tanımlayın.
  8. Yeniden yapılandırma yazılımını kullanarak ham tarama verilerini kesitsel görüntüler halinde yeniden oluşturun.
  9. Yeniden yapılandırılmış görüntü yığınlarını kantitatif morfometrik analiz için uygun bir yazılıma aktarın.
  10. Kemik hacmi fraksiyonu (BV / TV, %), kemik mineral yoğunluğu (BMD, g / cm³) ve trabeküler ayrılma (Tb.Sp, mm) gibi temel parametreleri değerlendirin.
  11. Kalitatif ve üç boyutlu görselleştirme için, kemik mikro mimarisinin hacimsel işlemelerini oluşturmak üzere bir 3B görselleştirme yazılımı kullanın.
  12. Nicel verilerde gözlemlenen yapısal bütünlüğü ve morfolojik değişiklikleri doğrulamak için görsel bir değerlendirme yapın.
    NOT: Tüm görüntü işleme ve analizleri, tarafsız sonuçlar elde etmek için kör operatörler tarafından gerçekleştirilmiştir.

12. Elisa

  1. Müdahaleden 12 hafta sonra sıçanları uyuşturun. Kan örneklerini toplamak için abdominal aortu dikkatlice açığa çıkarın ve inceleyin.
  2. Toplanan kanın RT'de 30 dakika pıhtılaşmasına izin verin ve ardından 755 × g'da (7,5 cm rotor yarıçapına sahip bir santrifüj kullanarak 3000 rpm'ye eşdeğer) 15 dakika boyunca ° C'de santrifüjleyin.
  3. Piyasada bulunan bir ELISA kitini kullanarak PGE₂ seviyelerinin daha sonra ölçülmesi için serumu ayırın ve saklayın.
  4. Paralel olarak, birincil kondrositleri tohumlayın ve 24 saat boyunca kültürleyin, ardından belirlenen hücre tedavi protokolüne göre 48 saat boyunca IL-1β ve PA ile muamele edin. Müdahaleden sonra, aynı ELISA kitini kullanarak PGE₂ konsantrasyonu için kültür süpernatantlarını toplayın ve analiz edin.

13. Kantitatif RT-PCR

  1. Ticari RNA ekstraksiyon reaktifi (TRIzol) kullanarak hücre örneklerinden toplam RNA'yı çıkarın.
  2. Bir Ters Transkripsiyon Kiti (gDNA Sökücü ile) kullanarak cDNA'yı sentezleyin ve elde edilen cDNA'yı sonraki analiz için -8 °C'de saklayın.
  3. SYBR Green kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin ve 2−ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl ifade seviyelerini hesaplayın.
    NOT: Kullanılan primer dizileri aşağıdaki gibidir: β-aktin ileri: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-aktin ters: CTGACCCATACCCACCATCAC; EP4 ileri: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 ileri: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 ileri: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 ters: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Batı lekeleme analizi

  1. Hücreleri RIPA tamponu ile buz üzerinde 30 dakika boyunca parçalayın.
  2. Protein örneklerini 90 dakika boyunca SDS-PAGE ile ayırın, ardından 2 saat boyunca nitroselüloz membranlara aktarın.
  3. Membranları %5 BSA ile bloke edin ve fosfat tamponlu solüsyonla yıkayın.
  4. Spesifik antikorlar kullanarak immünoblotlama yapın.
    NOT: Antikorlar ve ilgili seyreltmeleri aşağıdaki gibidir: anti-MMP9 (1:1000), anti-kollajen II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) ve anti-β-aktin (1:2000).
  5. Primer antikorlarla gece boyunca inkübe edildikten sonra, membranları TBST ile yıkayın ve ikincil antikorlarla 1 saat inkübe edin: karanlıkta fare-HRP (1:2000) veya tavşan-HRP (1:2000).
  6. TBST ile başka bir yıkamanın ardından, gelişmiş bir kemilüminesans kiti kullanarak protein tespiti yapın.
  7. Verileri ImageJ yazılımıyla (sürüm 1.48v) analiz edin.

15. İmmünofloresan boyama

  1. % 80 birleşmeye ulaşana kadar 12 oyuklu plakalardaki lameller üzerindeki kondrositleri kültürleyin.
  2. 48 saat boyunca IL-1β ve PA ile muameleden sonra veya kontrol olarak tedavi edilmedikten sonra, hücreleri RT'de 15 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  3. % 0.2 Triton X-100 içeren PBS ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgen hale getirin.
  4. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her biri 5 dakika), daha sonra gece boyunca ° C'de antikor seyreltme tamponunda birincil antikor (anti-IP3R, 1:200 seyreltme) ile inkübe edin.
  5. Hücreleri 1 saat boyunca 1:500 oranında floresein izotiyosiyanat etiketli keçi tavşan önleyici IgG ikincil antikoruna maruz bırakın.
  6. Hücreleri 10 dakika boyunca 5 μg / mL DAPI çözeltisi ile boyayın.
    NOT: Floresan görüntüler, 40x objektif lens kullanılarak elde edilmiştir (ölçek çubuğu = 2 μm). Tüm görüntüler ZEN yazılımı ile işlendi ve tutarlı kalibrasyon prosedürleri izlenerek ImageJ (sürüm 1.48v) ile ölçüldü.

16. İstatistiksel analiz

  1. GraphPad Prism (sürüm 8.0.2) kullanarak istatistiksel analizler yapın.
  2. Parametrik testleri uygulamadan önce, Shapiro-Wilk testini kullanarak verileri normal dağılım için ve Brown-Forsythe ve Bartlett testlerini kullanarak varyans homojenliği için değerlendirin.
  3. Birden fazla grup arasında karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in post hoc testini kullanın ve iki grup karşılaştırmaları için iki kuyruklu eşleşmemiş Öğrenci t-testi uygulayın.
  4. 0,05'ten küçük P değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.
  5. Tüm verileri en az üç bağımsız deneyden elde edilen Ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ACLT ile indüklenen PTOA, FD ile indüklenen kronik KOA'ya göre erken kıkırdak yıkımı ve davranışsal eksiklikler sergiler (Şekil 2 ve Şekil 3)
Eklem boşluğu daralması ve kıkırdak dejenerasyonu OA'nın birincil sonuçlarıdır. Önceki çalışmalar, aşırı kilo ve çevresel faktörleri (örneğin, nemli iklim) OA başlangıcına potansiyel katkıda bulunanlar olarak tanımlamıştır12,13

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çevresel ve diyet faktörlerinin neden olduğu kronik OA ile karşılaştırıldığında, ACLT'nin neden olduğu eklem travması hastalığın daha hızlı ilerlemesine yol açar. Eklem şişmesi, arka bacak kavrama gücü ve yürüyüş analizi gibi davranışsal değerlendirmelere dayanan sonuçlarımız, kontrol grubu, PTOA grubu ve pozitif kontrol grubu arasında çevresel ve diyet faktörlerinin neden olduğu önemli farklılıklar ortaya koydu. 12 haftalık müdahaleden sonra, PTOA grubunda arka bacak kavrama kuvvetinde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 82205147; Hayır. 62472046); Guangdong Spor Bürosu Bilimsel Araştırma Projesi (GDSS2024N038); ve Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi (GZYFT2024G08) Üniversite-Hastane Ortak Fon Projesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,2 Kollajenaz IISigma-Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriCAS Numarası: 9001-12-1Primer kondrosit izolasyonu ve kültürü
%0,2 Triton X-100Beyotime, ÇinST795 Serisiİmmünofloresan
%0,25 tripsin-EDTAWuhan Boster Biyolojik Teknoloji Co, LtdAR1071 SerisiKireç çözme
%0,25 Tripsin-EDTAGibco, Amerika Birleşik Devletleri25200072Primer kondrosit izolasyonu ve kültürü
%4 Paraformaldehit Fiksatif SolüsyonBiyuntian, ÇinP0099-3LDoku fiksasyonu
Anti-CaMKII AntikoruHuabio, ÇinET1608-47Batı lekesi (1:1000)
Anti-Kollajen II AntikoruAbcam, Birleşik KrallıkAB34712Batı lekesi (1:1000)
Anti-COX2 AntikoruAbcam, Birleşik KrallıkAB179800Batı lekesi (1:1000)
Anti-Cyt-C AntikoruSelleck, ÇinF2534 SerisiBatı lekesi (1:1000)
Anti-IP3R Antikoru (B-2)Santa Cruz, Amerika Birleşik DevletleriSC-377518Batı lekesi (1:1000)
Anti-MMP9 AntikoruAbcam, Birleşik KrallıkAB76003Batı lekesi (1:1000)
Anti-p-CaMKII AntikoruSelleck, ÇinF0342Batı lekesi (1:1000)
Anti-β-aktin AntikoruHücre Sinyal Teknolojisi (CST), ABD8H10D10Batı lekesi (1:2000)
BSA Engelleme ÇözümüSigma Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriYOKWestern blot blokajı için %5 BSA
Santrifüj (5424 R)Eppendorf, AlmanyaYOK755 &kez; g santrifüj hızı
KloroformSigma Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriYOKPA için çözücü
İklim kontrollü hazne (RXZ-158A)Yerli üretici, ÇinYOKNemli ortam modeli
Renkli Ters Transkripsiyon KitiInvitrogen, Suzhou, ÇinYOKcDNA sentezi
CTAn yazılımı BrukerSürüm 1.9 ve 4.1Kantitatif morfometrik analiz için
CTVol yazılımı BrukerSürüm 2.0Kalitatif ve üç boyutlu görselleştirme için
DAPI Boyama SolüsyonuBeyotime, ÇinYOKNükleer boyama (5 µ g/mL)
Dijital Kavrama Gücü ÖlçerPuxin EnstrümanıYOKArka bacak kavrama gücünün ölçülmesi
DMEM/F12 OrtaCorning, Amerika Birleşik DevletleriYOKHücre kültürü ortamı
EDTA (Etilendiamintetraasetik asit)AladdinYOKKemik dokularının dekalsifikasyonu
PGE2 için ELISA KitiElabscience, Wuhan, ÇinPGE2E-EL-0034ELISA algılama
Geliştirilmiş Kemilüminesans KitiMillipore, Amerika Birleşik DevletleriWBKLS0500Western blot tespiti
EtanolGuangdong Guangshi Reaktif Teknolojisi Co., Ltd.CAS: 64-17-5Doku dehidrasyonu
Fetal Sığır Serumu (FBS)Corning, Amerika Birleşik DevletleriYOKKültür için %10 konsantrasyon
FITC etiketli Keçi Anti-Tavşan IgGBeyotime, ÇinP0179 takımıİmmünofloresan (1:500)
GraphPad PrizmasıGraphPad Yazılımı, ABDSürüm 8.0.2Veri analizi
Hematoksilen ve Eozin (H& E) Boyama KitiServicebio, VuhanG1005 SerisiHistoloji
IL-1βPeproTech, Amerika Birleşik Devletleri400-01BPTOA hücre modeli için 10 ng/mL
ResimJNIH, Amerika Birleşik DevletleriSürüm 1.48vGörüntü analizi
Image-Pro Plus yazılımıMedya SibernetikSürüm 6.0Taranan ayak izlerinden kantitatif yürüyüş analizi
İzofluranŞanghay Yaji BiyolojikYS1412CHayvan cerrahisi için anestezi
Leica Gömme MerkeziLeica MikrosistemleriEG1160 SerisiParafin gömme
Leica MikrotomLeica MikrosistemleriRM2235 SerisiParafine gömülü dokuların kesilmesi
Leica Su BanyosuLeica MikrosistemleriHI1210 SerisiYüzer parafin bölümleri
Işık mikroskobu (ECLIPSE Ti2-E)Nikon, JaponyaYOKHistolojik gözlem
Mikro-CT Tarayıcı (ZKKS-MCT-Sharp)Yerli üretici, ÇinYOKKemik görüntüleme
Fare-HRP İkincil AntikoruHücre Sinyal Teknolojisi (CST), ABD70761:2000 seyreltme
NIS-Elements Görüntüleme YazılımıNikonYOKMikroskop görüntülerinin yakalanması ve analiz edilmesi
NRecon yazılımıBruker, AlmanyaSürüm 1.6BT rekonstrüksiyonu
Palmitik Asit (PA)Sigma Aldrich, Amerika Birleşik DevletleriP0500 Serisi500 &mikro; FD hücre modeli için M stoğu
Kesitleme için Parafin Mum, Patoloji Derecesi, Erime Noktası 52-54 ° CGuangdong Guangshi Reaktif Teknolojisi Co., Ltd.Y258797-500gDoku işleme sırasında parafin gömmek için kullanılır
Kesitleme için Parafin Mum, Patoloji Derecesi, Erime Noktası 56-58 &derece; CGuangdong Guangshi Reaktif Teknolojisi Co., Ltd.Y258799-500gDoku kesitinde son sert mum gömme için kullanılır
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Gibco / Termo BalıkçıC10010500BTHücre yıkama ve doku durulama
Penisilin-StreptomisinCorning, Amerika Birleşik DevletleriYOKHücre kültürü için %1
PVDF Membran (0.45 µ m)Millipore, Amerika Birleşik DevletleriIPVH00010Western blot membranı
Tavşan-HRP İkincil AntikoruHücre Sinyal Teknolojisi (CST), ABD70741:2000 seyreltme
Kırmızı MürekkepKAHRAMANKAHRAMAN 204Yürüyüş analizinde ayak izi takibi
RIPA Lizis TamponuKeygen, ÇinYOKProtein ekstraksiyonu
Safranin O– Hızlı Yeşil Boyama KitiServicebio, VuhanG1053 SerisiHistolojik boyama
Spiral Mikrometre (Verniyeli Kumpas)Huangshan, ÇinYOKDerz genişliği ölçümü
Subkondral Kemik Analiz Yazılımı (CTAn)Bruker, AlmanyaSürüm 1.9 ve 4.1Morfometrik analiz
SYBR Yeşil PCR Ana KarışımıAG Scientific, ÇinYOKqPCR analizi
Western blot reaktifleri (RIPA tamponu, SDS-PAGE jel bileşenleri, yükleme tamponu, TBST, vb.)Beyotime Biyoteknoloji (Çin)Yok (grup girişi olarak kullanılır)Western blot prosedürleri için kullanılan tüm rutin reaktifler
KsilenGuangdong Guangshi Reaktif Teknolojisi Co., Ltd.CAS: 1330-20-7Doku temizleme

Kaynaklar

  1. Whittaker, J. L., Roos, E. M. A pragmatic approach to prevent post-traumatic osteoarthritis after sport or exercise-related joint injury. Best PractRes Clin Rheumatol. 33 (1), 158-171 (2019).
  2. Maia, C. R., et al. Post-traumatic osteoarthritis: The worst associated injuries and differences in patients' profile when compared with primary osteoarthritis. BMC Musculoskel Dis. 24 (1), 568(2023).
  3. Luc, B., Gribble, P. A., Pietrosimone, B. G. Osteoarthritis prevalence following anterior cruciate ligament reconstruction: A systematic review and numbers-needed-to-treat analysis. J Athl Train. 49 (6), 806-819 (2014).
  4. Chen, T., et al. Radiographic osteoarthritis prevalence over ten years after anterior cruciate ligament reconstruction. Int J Sports Med. 40 (11), 683-695 (2019).
  5. Roos, E. M. Joint injury causes knee osteoarthritis in young adults. Curr Opin Rheumatol. 17 (2), 195-200 (2005).
  6. Chery, D. R., et al. Early changes in cartilage pericellular matrix micromechanobiology portend the onset of post-traumatic osteoarthritis. Acta Biomater. 111, 267-278 (2020).
  7. Nguyen, B. V., et al. A domain-swapped camkii conformation facilitates linker-mediated allosteric regulation. bioRxiv. , (2024).
  8. Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Sci Rep. 11 (1), 5682(2021).
  9. Jiang, W., et al. PGE2 activates EP4 in subchondral bone osteoclasts to regulate osteoarthritis. Bone Res. 10 (1), 27(2022).
  10. Nasiri, N., Hosseini, S., Reihani-Sabet, F., Baghaban Eslaminejad, M. Targeted mesenchymal stem cell therapy equipped with a cell-tissue nanomatchmaker attenuates osteoarthritis progression. Sci Rep. 12 (1), 4015(2022).
  11. Esmaeili, A., et al. Co-aggregation of MSC/chondrocyte in a dynamic 3D culture elevates the therapeutic effect of secreted extracellular vesicles on osteoarthritis in a rat model. Sci Rep. 12 (1), 19827(2022).
  12. Wang, L., Xu, Q., Chen, Y., Zhu, Z., Cao, Y. Associations between weather conditions and osteoarthritis pain: A systematic review and meta-analysis. Ann Med. 55 (1), 2196439(2023).
  13. Datta, P., et al. High-fat diet-induced acceleration of osteoarthritis is associated with a distinct and sustained plasma metabolite signature. Sci Rep. 7 (1), 8205(2017).
  14. Sun, Q., et al. Inhibition of PGE2 in subchondral bone attenuates osteoarthritis. Cells. 11 (17), 2760(2022).
  15. Wang, G., et al. Opposing effects of IL-1Β/COX-2/PGE2 pathway loop on islets in type 2 diabetes mellitus. Endocr J. 66 (8), 691-699 (2019).
  16. Curtis, E., et al. Safety of cyclooxygenase-2 inhibitors in osteoarthritis: Outcomes of a systematic review and meta-analysis. Drugs Aging. 36 (Suppl 1), 25-44 (2019).
  17. Jin, Y., et al. A novel prostaglandin E receptor 4 (EP4) small molecule antagonist induces articular cartilage regeneration. Cell Discov. 8 (1), 24(2022).
  18. Dupont, G., Goldbeter, A. Cam kinase ii as frequency decoder of Ca2+ oscillations. Bioessays. 20 (8), 607-610 (1998).
  19. Pritchard, S., Guilak, F. Effects of interleukin-1 on calcium signaling and the increase of filamentous actin in isolated and in situ articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 54 (7), 2164-2174 (2006).
  20. Bartok, A., et al. IP3 receptor isoforms differently regulate ER-mitochondrial contacts and local calcium transfer. Nat Commun. 10 (1), 3726(2019).
  21. Katona, M., et al. Capture at the ER-mitochondrial contacts licenses IP3 receptors to stimulate local Ca2+ transfer and oxidative metabolism. Nat Commun. 13 (1), 6779(2022).
  22. Lin, F., et al. Positioning regulation of organelle network via Chinese microneedle. Sci Adv. 10 (16), eadl3063(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PGE2 EP4 Sinyal iletimiKıkırdak DejenerasyonuKondrosit FonksiyonuKalsiyum Sinyal iletimiCaMKII YolağıEP4 ReseptörüKıkırdak HomeostazıIP3R Ekspresyonuİnterlökin-1 Beta

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.