Bu cerrahi protokol, hedefe yönelik tedavi sağlamak için bir kemirgenin spinal subdural boşluğuna intratekal kateter yerleştirmek için adım adım bir kılavuzdur.
Yöntem makalesi
Tedavi sunumu için kemirgen omuriliğinin subdural boşluğuna erişim
Bu makalede
Özet
Özet
Omurilik hastalıklarının veya yaralanmalarının tedavisi, kısmen, doğrudan kordona uygulanabilecek etkili tedavilerin geliştirilmesindeki zorluklar nedeniyle zordur. Örneğin, omurilik yaralanması (SCI) için mevcut tedaviler öncelikle epiduraldir. Bununla birlikte, epidural tedaviler omurilik ile doğrudan etkileşime izin vermez ve potansiyel tedavi etkisini azaltır. Burada, belirli bir tedavinin daha doğrudan bir etkisi için bir kemirgen modelinde subdural boşluğa erişmek için bir yöntem önerilmiştir. Açıklanan protokol kullanılarak, omurilik kaydı/stimülasyonu için bir biyoelektronik cihazın başarılı bir subdural implantasyonu ve ayrıca nörotrofin-3 yüklü bir hidrojelin güvenli bir şekilde yerleştirilmesi gerçekleştirildi. Her iki uygulamada da bu protokole maruz kalan hayvanlar, işlemi takiben arka bacak veya ön ayak fonksiyonunda herhangi bir değişiklik göstermedi ve işlem sonrası 12 haftaya kadar herhangi bir işlev bozukluğu gelişmedi. Burada sunulan örnekler oldukça spesifik olsa da, önerilen protokol, omuriliğin nörolojik bozukluklarının daha etkili lokalize tedavisine izin vermek için çeşitli uygulamalarda kullanılabilir.
Giriş
Omurilik hastalıkları ve yaralanmaları dünya çapında milyonlarca insan üzerinde yıkıcı etkilere neden olabilir ve bu da önemli sosyal, ekonomik ve sağlık yükü doğurabilir 1,2. Omurilik yaralanmaları ve nörodejeneratif hastalıklar, etkilenen bireyler için yaşam kalitesini ve bağımsızlığı azaltan kronik motor, duyusal ve otonomik işlev bozukluklarına yol açabilir. Cerrahi müdahale ve farmakoterapi gibi mevcut tedaviler, ilk travmayı hafifletmeye ve ikincil komplikasyonları yönetmeye odaklanmaktadır3. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar nadiren önemli nöral rejenerasyon veya fonksiyonel iyileşme sağlar ve altta yatan mekanizmaları hedef alan daha etkili müdahalelere acil bir ihtiyaç bırakır.
Mevcut tedavi stratejileri için birincil endişe, istenen bir tedavinin yeri ve uygulanmasıdır. Nöromodülasyon veya farmasötik müdahale gibi tedaviler, nöronal aktiviteyi etkileme, fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırma ve hasarlı omurga devresinde potansiyel olarak bağlantıları yeniden kurma yeteneğine sahiptir4. Omurilik stimülasyonu, motor kontrolde iyileşmelere ve ağrının azalmasına yol açabilir5. Bununla birlikte, bu stratejiler şu anda omuriliğindura mater bariyerini dikkate almadan, epidural boşluğa odaklanan yaralı dokuya dolaylı iletim ile sınırlıdır 6,7,8. Epidural tedaviler klinik faydalar göstermiş olsa da, hedef nöronal popülasyonlara dolaylı erişim nedeniyle sınırlıdır ve bu da terapötik ajanların etkilerinin potansiyel olarak azalmasına yol açar.
Grubumuz, epidural odaklı stratejilerle ilişkili bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve omurilik yaralanması (SKY) modellerinde doğrudan subdural tedavi uygulama potansiyelini araştırmak için çalışmıştır. Kateterlerin subdural boşluğa yerleştirilmesi, tedavinin doğrudan omuriliğe uygulanmasına olanak tanıyarak etkilenen nöral doku ile gelişmiş etkileşim sağlar 9,10. Subdural uygulama ayrıca dura materyalin bariyer etkilerini azaltır, elektriksel stimülasyonun ve hedefe yönelik ilaç verme sistemlerinin etkinliğini artırır11,12. Bu yöntem, tedavinin hassasiyetini ve etkinliğini artırabilir ve potansiyel olarak fonksiyonel iyileşmede daha iyi sonuçlara yol açabilir.
Bu makale, kemirgen omuriliğinin subdural boşluğuna güvenli erişim için adım adım bir protokolü açıklamaktadır. Bu prosedür omurganın torasik bölgesine (T10-T12) odaklanır, ancak gerektiğinde kordon üzerinde farklı yerlerde uygulanabilir. Bölge tanımlamasına izin veren anatomik işaretler belirtilmiştir ve laminektomi, durotomi ve dura mater penetrasyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar sunulmuştur. Bu protokolün, bir elektrik stimülasyon cihazının implantasyonu ve bir hidrojel ilaç dağıtım sisteminin verilmesi dahil olmak üzere iki uygulaması da sunulmaktadır (Şekil 1). Belirtilen adımlar, kemirgen cerrahisi deneyimi olan araştırmacılar tarafından kolayca tekrarlanabilir. Bu protokol, SCI'nin bir kontüzyon modeli bağlamında yazılmıştır; Bununla birlikte, spesifik yaralanma modeli, istenen deneysel sonuçlara bağlı olarak değiştirilebilir. Burada açıklanan teknik, sadece SCI tedavisini ilerletmek için umut vaat etmekle kalmaz, aynı zamanda kesin, lokalize müdahaleler yoluyla omurilik onarımı ve rejenerasyonu üzerine gelecekteki araştırmalar için bir platform sağlayabilir.
Protokol
Tüm prosedürler Auckland Üniversitesi'ndeki etik yönergelere uygun olarak yürütüldü ve kurumun Hayvan Etik Komitesi (AEC) ve üniversite Hayvan Refahı Görevlileri (AWO) tarafından onaylandı. 240-260 g ağırlığındaki dişi Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı ve grup halinde yerleştirildi (21 ° C; 12 sa : 12 saat, aydınlık: karanlık döngü) ve ameliyattan önce ve sonra standart kemirgen diyetine ad libitum erişim sağlandı. Amaç kemirgen omuriliğinin subdural boşluğuna güvenli erişim sağlamak olduğundan, bu protokolün öncelikle bir yaralanma modelinin yokluğunda denenmesi önerilir. Bu, protokolün yaralanmaya neden olmadan uygulanabileceğini göstermek için önemli bir ilk adımdır ve istenen bir yaralanma modelinin daha doğru bir şekilde incelenmesine olanak tanır. Protokol, araştırma grupları tarafından kullanılan birçok farklı yaralanma modeli ile birleştirilmeye uygundur. Bu nedenle, protokol, uygulamaya göre değişeceğinden, belirli yaralanma uygulama adımlarını açıklamaz. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Tüm aletleri (Ek Şekil 1) ve ilgili sarf malzemelerini sterilize edin.
- Ertesi gün ameliyat olacak fareleri tartın.
- Uygulanacak uygun ilaç dozlarını hesaplayın; bupivakain (analjezik) @ 2 mg / kg, doz - 0.08 mL / 100 g; meloksikam (analjezik) @ 2 mg / kg, doz - 0.04 mL / 100 g; buprenorfin (analjezik) @ 0.03 mg / kg, doz - 0.1 mL / 100 g; enrofloksasin (antibiyotik) @ 10 mg / kg, doz - 0.08 mL / 100 g12,13.
NOT: Bupivakain, ilk insizyondan önce cerrahi bölge boyunca 3-4 bölgeye deri altından uygulandı.
2. Cerrahi hazırlık
- Anestezi sisteminin doğru şekilde kurulduğundan emin olun (oksijen ve anestezi sistemi ile ilişkili tüm tüplerin doğru şekilde kurulup kurulmadığını kontrol edin).
- Sıçanların ağırlığına göre gerekli enjeksiyonları hazırlayın ve başlamadan önce uygulanacak 3 mL salin enjeksiyonunu yapın.
- Isı yastığının (bakım sıcaklığı 37 °C), lambanın, mikroskobun ve tıraş makinesinin kurulu ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
NOT: Büyütme, kullanıcı tercihine ve işlem sırasındaki görünürlüğe bağlı olarak değişeceğinden, diseksiyon mikroskobu için özel bir büyütme gerekli değildir.
DİKKAT: İşlem sırasında hayvanın sıcaklığının 35°C'nin altına düşmediğinden veya 40°C'yi geçmediğinden emin olun.
3. Hayvan hazırlama
- Anestezi sistemi ve oksijen tankı ile ilişkili tüm boruların bağlı olduğundan emin olun. Bu çalışmada kullanılan anestezi sistemi kullanılıyorsa (bkz . Malzeme Tablosu), izofluran indüksiyonunu %3'e ayarlayın ve idame anestezisi için oksijen akış hızını ayarlamak üzere hayvanın ağırlığını anestezi sistemine girin (Ek Şekil 1A).
NOT: Anesteziyi her bir hayvan için uygun bir bakım seviyesinde tutun. Bu oran hayvana bağlı olarak %1,3-%2 arasında değişebilir. - Sıçanı, kendini düzeltemeyecek duruma gelene kadar indüksiyon odasına yerleştirin, istenen izofluran bakım seviyesine geçin ve sıçanı burun konisine taşıyın.
- Tıraştan önce 3 mL salin ve gerekli ilaç enjeksiyonlarını deri altına uygulayın.
NOT: Tuzlu su enjeksiyonları ve tıraştan sonra, bupivakaini amaçlanan insizyon bölgesi boyunca birkaç noktaya enjekte edin - Hayvanın anestezi seviyesini izlerken, cerrahi alandaki tüm aletleri (mikroskop, aletler, steril örtüler) hazırlayın. İstenilen alana aletler için steril bir örtü yerleştirin ve steril alanı koruyarak aletleri örtü üzerinde düzenleyin.
- Kürkü hayvanın sırtı boyunca, boynun tabanından kalçaların üstüne kadar tıraş edin.
- Alanı klorhex ovma ile dezenfekte edin, ardından traş edilen alanın ortasından (3x) dairesel bir hareket kullanarak klorhex tentürü uygulayın ve kurumasını önlemek için gözlere kayganlaştırıcı uygulayın.
- Fareyi mikroskop altında ısıtma yastığına aktarın, traş edilmiş alanın üzerine bir pres ve mühür örtüsü yerleştirin ve cerrahi alanı ortaya çıkaracak kadar büyük, ancak tıraşsız kürkü açığa çıkaracak kadar büyük olmayan bir delik açın.
- Hayvanın sıcaklığını izlemek için bir rektal sıcaklık probu yerleştirin ve ısıtma yastığı ile ~ 37 ° C'yi koruyun. Her 5-10 dakikada bir hayvan refahı kontrollerini uygulayın.
- Anestezinin cerrahi düzlemini doğrulamak için pedal refleksini uygulayın ve işleme başlayın.
4. Omurganın doku diseksiyonu
- Bir neşter bıçağı kullanarak, boynun tabanının altından başlayıp torasik kamburluğun üzerine uzanarak T9-T13 omurlarını açığa çıkaracak şekilde, rostral ila kaudal yönde doğrusal bir kesi (~ 6-8 cm) yapın (Şekil 2A).
- Omurga üzerindeki kas dokusunu doğrudan ortaya çıkarmak için kesi bölgesinin altındaki geri bağ dokusunu Graefe forseps veya mikro yaylı makasla nazikçe eşleştirin.
- İnsizyonun kaudal yarısına yakın iki beyaz V şeklindeki tendonu yerleştirerek T13 sürecini tanımlayın. Hayvanın kuyruk tarafındaki V'ye doğrudan rostral olan dikenli süreç T13'tür (Şekil 2B).
- T13'ten başlayarak ve T9'a kadar ilerleyerek, prosedür ilerledikçe konumun korunmasına yardımcı olmak için kasları temizlemeden önce ayırmak için her işlem arasındaki bağ dokularında küçük kesiler yapın (Şekil 2C). Daha sonra, mikroskripler kullanarak dikenli süreçlerin her iki tarafına paralel uzanan kas kanallarını kesin. Her bir omurga segmentinin laminasını ortaya çıkarmak için bunu omurganın her iki tarafında yapın (Şekil 2D).
- Omurgaya açık bir görüş alanı sağlamak için kas duvarlarının her iki tarafına serrefine kelepçeler takın. Bir çifti T13'ün yanlarına, diğerini T11/T12 kenarına ve diğerini T11/T10'a takın (Şekil 2E).
- Açık kanallar oluşturulduktan sonra, her işlem arasındaki bağ dokusunu mikromakas veya rongeur kullanarak kesin (Şekil 2F).
- Laminektomi prosedürü için T10-12 segmentlerini açığa çıkararak, T13'ün rostral kısmından T9'un kaudal kısmına kadar her laminadan bağ dokusu ve kas temiz bir şekilde diseke edilene kadar kanalları temizleyin. Başarılı bir şekilde tamamlanması, işlemlerin her iki tarafında açıkça görülebilen lamina ile gösterilir.
NOT: Adım 4 için mikroskop gerekli değildir, ancak şiddetle tavsiye edilir.
5. Laminektomi (laminektomi)
- T12 laminasının T13'ün rostral kısmıyla örtüşen kaudal kısmını bulun, rongeurların ucunu altına yerleştirin ve standart JoVE protokolleri 14,15'te önerildiği gibi lamina parçalarını nazikçe çıkarmaya başlayın (Şekil 2G).
NOT: Stabiliteyi korumak ve rongeurlarla her kesim sırasında plakaları nazikçe "kaldırmak" için her laminanın dikenli sürecini kavramak için forseps kullanın (Şekil 2G). Rongeurların ucunu laminanın altına kaydırırken, olası hasarı en aza indirmek için omurilikten dışa doğru basıncı koruyun.
DİKKAT: Dura mater ve/veya omuriliğin kendisine zarar verebileceğinden, kesim yaparken rongeurları çok fazla altına itmemeye dikkat edin. - Bir taraftan diğer tarafa hareket ederek, yaklaşık 5 mm çapında bir delik ile omuriliği açığa çıkararak, kesimi işlemin orta hattına uzatmak için yeterli alan olana kadar T12 laminadan kemik parçalarını kesmeye devam edin (Şekil 2H).
NOT: Omurgadan kemiğin çıkarılması, işlem sırasında görünürlüğü azaltabilecek kanamaya neden olabilir. Laminektomi yaparken bunu yönetmek için pamuklu çubuklar veya rulo tüy bırakmayan mendiller kullanın (Ek Şekil 1B). - Rongeurları her iki taraftaki laminanın altında çalıştırın ve ardından T12'nin kraniyal kısmına eşit bir kanal açın (Şekil 2I).
NOT: Her omurga segmenti için laminer plakanın parçaları çıkarıldıkça omurilik görünür hale gelecektir. - Hem T11 hem de T10'u çıkarmak için 5.1 ila 5.3 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Laminektomiye devam edin, her iki tarafta eşit kesikler sağlayın, rostral olarak T9'a kadar hareket edin (Şekil 2J).
NOT: Kontüzyon SCI prosedürleri için (Temsili Sonuçlar bölümüne bakınız), istenen omurilik segmentinin/segmentlerinin üzerindeki lamina, bir kontüzyon yaralanma cihazının kullanımına izin verecek kadar geniş bir şekilde açılmalıdır ( Şekil 2K'nın ortasındaki genişletilmiş alana bakın). İlaç dağıtımı için, laminektomi, istenen bileşiğin uygulanmasını görselleştirmek için yeterince geniş olabilir. - Tekal keseyi salinle nazikçe yıkayın ve laminektomi tamamlandıktan ve yeterli bir T10-T12 alanı çıkarıldıktan sonra durotomi için istenen alanı hazırlayın (Şekil 2K).
NOT: Bu prosedür, omurga segmentlerine (T10-T12) erişim için spesifiktir, ancak bu yöntemler omurga boyunca çeşitli segmentlerde laminektomi yapmak için kullanılabilir.
6. Tedavi uygulaması için Durotomi
- Omuriliğin subdural boşluğuna erişmek için diseksiyon kapsamını kullanarak durotomi (dura mater insizyonu) yapın (Şekil 3A).
NOT: Dürbünün büyütmesini, cerrahın dura materyalin görünürlüğü tercihine göre ayarlayın. - 27 G'lik bir iğneyi, eğim yukarı bakacak şekilde 90 derecelik bir açıyla bükün (Şekil 3B).
NOT: Bükme sırasında iğneyi kavramak için bir çift iğne sürücüsü veya hemostat kullanın. - Dura mater'i omurilik üzerinde istenen giriş noktasında iğnenin ucuyla nazikçe delin (Şekil 3B).
DİKKAT: Altta yatan omuriliğe veya medyan kan damarına zarar vermemeye dikkat edin. - Dura mater delindikten sonra, orta hat kan damarının her iki tarafında dura materde 2 mm'den fazla olmayan dairesel bir delik açmak için iğneyi dorsal olarak hafifçe kaldırın. Başarılı bir durotomi, her iki delikten az miktarda beyin omurilik sıvısı (BOS) sızıntısı ile gösterilir.
NOT: Subdural boşluğa daha kolay erişim sağlamak için laminektominin ucundan en az birkaç mm mesafe bırakın. Gerekirse, boyutunu artırmak için iğne ucunu ilk deliğe dikkatlice yeniden sokun. - Durotomi insizyonu için seçilen pozisyonun ve hemen önündeki pozisyonun orta hat kan damarından dallanan kan damarlarından arınmış olduğundan emin olun.
DİKKAT: Orta hat kan damarına zarar VERMEYİN, çünkü bu aşırı kanamaya neden olarak prosedürün tamamlanmasını engeller. - Durada açılan delikleri kullanarak, istenen tedaviyi sağlayın veya subdural boşluğa bir cihaz implante edin. Bu protokol için, intratekal kateterler, stimülasyon cihazını yerine yönlendirmek veya hidrojeli enjekte etmek için tedavi uygulaması için kullanılır (Şekil 3C).
NOT: Durotomileri takiben herhangi bir kan ve/veya BOS'u sürekli olarak temizleyerek net bir görüş alanı sağlayın. - Omuriliğe ilerlemeden önce kateterlerin uçlarının duranın altında göründüğünden emin olun. Başarılı bir uygulama, dural membranın altındayken küçük spinal kan damarları boyunca düzgün bir şekilde hareket eden kateterler ile gösterilir.
- İstenen tedavi uygulandıktan sonra (Şekil 3D,E), hemostaz, yara iyileşmesi ve omurga yapısının korunmasına yardımcı olmak için laminektomi tarafından oluşturulan boşluğa bir parça steril cerrahi jel köpük yerleştirin.
- Jel köpük yerleştirildikten sonra omurganın üzerindeki kas ve cilt tabakasını kapatmak için 4-0 polidioksanon emilebilir sütür kullanın.
7. Ameliyat sonrası bakım
- Hayvanları günlük olarak kontrol edin ve gerekli ameliyat sonrası ilaçları verin (2 gün boyunca buprenorfin; 5 güne kadar enrofloksasin ve meloksikam). Gerektiği kadar deri altına 1-3 mL salin uygulayın (ameliyat sonrası dönemde 24 saat boyunca vücut ağırlığının %<10'u kadar su tüketilirse).
- Prosedüre bağlı olarak, mesane fonksiyonunu, motor fonksiyonunu, yüz buruşturma ölçeğini ve diğer hayvan refahı belirtilerini izleyin.
- Ameliyattan yaklaşık 10-14 gün sonra cilt dikişlerini çıkarın.
Sonuçlar
Önerilen protokol iki farklı deney ortamında uygulanmıştır. Gösterilen veriler, yaralanmamış grupları temsil etmektedir, çünkü amaç, prosedürde açıklanan subdural manipülasyonların (bir yaralanma modelinin yokluğunda) işlevi bozmadığını göstermekti. 6-8 haftalık Sprague-Dawley sıçanlarına bir biyoelektronik cihaz implante edildi (Şekil 1A) veya bir hidrojel verildi (Şekil 1B). Bu hayvanların motor fonksiyonu, BBB motor fonksiyon ölçeği kullanılarak subdural prosedür olmadan sahte cerrahi uygulanan kontrol hayvanlarınınkiyle karşılaştırıldı. Burada, her bir prosedürün uygulanabilirliğini ve güvenliğini gösteren birkaç hayvan grubu temsil edilmektedir. Her prosedürden sonra, tüm hayvanlar, işlemden 7 gün sonra gruplar arasında BBB skorunda bir fark olmaksızın normal motor fonksiyonunu sürdürdü ve bu da açıklanan protokolün güvenli bir şekilde uygulandığını gösterdi. Ek olarak, bozulmuş arka bacak motor fonksiyonunu gösteren bir grup hayvan (Şekil 4C), deney gruplarında herhangi bir yan etki kaydedilmediğini göstermek için subdural prosedür gruplarıyla karşılaştırma için temsil edilmiştir. Bu gruba, önceki literatürde 12,13 tarif edildiği gibi 175 kdyn darbe cihazı kuvveti ile bir kontüzyon SCI prosedürü uygulandı.
Biyoelektronik implant
Cihaz implantasyonu için protokol, kılavuz kateterlerin dura altında hareketini ve cihazın kontrollü yerleşimini kolaylaştırmak için biri kateter girişi ve diğeri çıkış için olmak üzere iki durotomi bölgesi oluşturmayı içerir. Biyoelektronik cihaz, biyouyumlu bir mahfaza ile kapsüllenmiş bir PCB arayüzüne bağlı iki çatallı koldan oluşuyordu. İmplantın yerleştirilmesine yardımcı olmak için kollar geçici olarak 7-0 ipek sütür ile küçük intratekal kateterlere bağlanır. Kateterler rostral durotomi deliklerinden yavaşça çekilir, duranın altına kaydırılır ve kaudal çıkış durotomi deliklerinden tedavi yerine kaudal olarak yerleştirilir. Takılan implant kolları daha sonra çekildi ve omuriliğin her bir hemi bölümüne yerleştirildi. İmplantın kuyruk ucu, T13 işlemine bağlı kasa dikilir. Yuva, laminektomi için trapezius/latissimus kas rostralına dikilir. Cilt daha sonra harici erişim sağlamak için muhafaza ünitesinin tabanının etrafına kapatılır.
Hidrojel tedavisi
Hidrojel dağıtımı için sadece bir giriş noktası gereklidir. Hidrojel, stimülasyon cihazı ile aynı yere yerleştirilmiş benzer intratekal kateterler yoluyla verildi. Kateterlere 10 μL poloksamer hidrojel12 yüklendi ve cihaz implantasyon adımlarıyla aynı şekilde subdural boşluğa yerleştirildi. Yerleştirildikten sonra, kateterler yavaşça geri çekilirken, hidrojel sürekli olarak duranın altından (Şekil1B) her bir hemi-kordon üzerine salındı. Her prosedürün ardından, yeterli iyileşmeyi sağlamak için hayvanlar 7 gün boyunca izlendi.
Motor fonksiyon değerlendirmesi için 21 puanlık Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) ölçeği kullanıldı16. Her iki gruptaki hayvanlar işlemden önce (başlangıç) ve ameliyattan 1 gün, 3 gün ve 7 gün sonra değerlendirildi. Açık alan davranışı doğrudan ve kör video kayıtları aracılığıyla değerlendirildi. Ameliyatın herhangi bir yan etkisinin derecesini belirlemek için her grup için hem sol hem de sağ arka ayaklar için motor fonksiyon skorları, ameliyat edilmemiş kontrol hayvanları ve ayrı bir SCI grubu ile karşılaştırıldı. İmplant veya hidrojel grubundaki hayvanlar, ameliyat edilmemiş kontroller veya yaralı SCI hayvanlarla karşılaştırıldığında, her iki prosedürü de takiben motor fonksiyonda herhangi bir eksiklik göstermedi. Not etmek gerekirse, omurilik hasarının olmadığını doğrulayan histolojik analiz önceki çalışmalarımızda zaten yayınlanmıştır. Bu çalışma, bir cihazı implante etmek için bu yöntemin kullanılmasının, işlemden 7 gün sonrasına kadar ek omurilik travması üretmediğini göstermiştir11. Bir cihazın implantasyonu sonrasında kontrol hayvanlarına kıyasla hem astrosit (GFAP) hem de mikroglia/makrofaj (Iba1) aktivitesinde minimal değişiklikler görülmüştür. İmplantın hemen altındaki koronal omurilik bölümlerinin yüzey alanı ve yuvarlaklığı da incelendi ve morfolojide herhangi bir değişiklik gösterilmedi.
Şekil 1: Subdural tedavi stratejileri. (A) İmplant cihazı örneği ve (B) hidrojeli enjekte etmek için kullanılan kateter/şırınga. (C) Bir sıçanın omuriliğine hem implant hem de hidrojel yerleştirilmesinin temsili modelleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cerrahi alanı temsil eden laminektomi görüntüleri. (A) Şekil 2 ve Şekil 3'teki cerrahi görüntüler için hayvanın oryantasyonu. (B) Kas diseksiyonunun başlamasına rehberlik etmek için T13 işleminin yeri için kas tendonu yer işaretleri. (C) Laminektomi ile çıkarılacak her işlemi tanımlamak için dikey kesiler. (D) Kas kanalları, çıkarılmak üzere kemik plakalarına erişime izin vermek için omurga süreçlerine paralel olarak kesilir. (E) Yeterli cerrahi alan sağlamak için omurganın her iki tarafındaki kas/cildi geride tutmak için kullanılan bulldog serrefine klipsleri. (F) Laminektomiye başlamadan önce her işlemi birbirine bağlayan beyaz tendonların çıkarılması. (G) Laminektominin başlangıcında, rongeurlar kemiği kesmeye başlamak için T12 plakasının altına kaydırılırken cerrahi alan. (H) T12 işleminin ilk yarısı, omuriliği açığa çıkarmak ve cerrahın rostral olarak hareket etmesi ve kalan işlemleri çıkarmaya başlaması için yeterli alan sağlamak için çıkarıldı (T11 / T10). (I) T12'nin kraniyal kısmının çıkarılması ve segmentin tamamen çıkarılması. (J) Örnek bir kontüzyon SCI'nin uygulanması için daha geniş kesiler kullanılarak T11'de yarıya kadar tamamlanan laminektomi. (K) T10-T12 segmentlerinin çıkarılmasını takiben, omuriliğin dorsal yüzeyini tamamen açığa çıkaran tam laminektomi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Durotomi gerçekleştirme ve hedefe yönelik tedavi uygulama adımları. (A) Omuriliğin dura materindeki deliklerin yerinin şeması. (B) Durotomi oluşturmak için duraya nüfuz eden 27 G'lik bir iğneyi gösteren cerrahi alan; bu, (A)'da görüldüğü gibi merkezi kan damarının her iki tarafında yapılır. (C) Tedavi uygulaması için kullanılan bir kateterin ilk yerleştirilmesi. (D) Omurilik üzerinde yerinde elektriksel stimülasyon cihazı. (E) Omurilik yüzeyine enjeksiyon için hidrojel yüklü kateterler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ameliyat sonrası durum ve motor fonksiyon. (A) Cihaz implantasyonu ve hidrojel dağıtımını takiben hayvanların temsili görüntüleri. (B) Subdural prosedür (İmplant veya Hidrojel) uygulanan hayvanlara veya manipülasyonu olmayan kontrol hayvanlarına kıyasla spinal kontüzyon yaralanması olan hayvanların temsili BBB skorları. Kontrol (ameliyatsız), SCI ve İmplant grubu örneklem büyüklükleri n = 5 ve Hidrojel grubu örneklem büyüklükleri n = 3 idi. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Cerrahi aletler. Kullanılan ameliyat aletlerinin fotoğrafı. (1) #10 bıçak neşter. (2) Vannas mikro makas. (3) Graefe forseps. (4) Serrefine bulldog klipleri. (5) Rongeurs. (6) Durotomi için 27 G iğne. (7) İnce forseps. (8) İhtiyaç duyulduğunda tuzlu su uygulaması için 1 mL şırınga. (9) Diseksiyon makası. (10) Dikiş için hemostatlar. (11) Sivri uçlu pamuklu çubuklar. (12) Sterilize pamuk topları. (13) Rulo tüy bırakmayan mendiller. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Subdural ve epidural boşluk. Omurga ve omuriliğin şematik gösterimi, epidural vs. subdural boşluk. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Burada sunulan metodoloji, spinal subdural boşluğa erişim için adım adım talimatlar sağlar ve omuriliğin torasik bölgesine iki tedavi uygulaması örneği aracılığıyla güvenliğini ve fizibilitesini gösterir11,12. Çok sayıda araştırma grubu, omurilik yaralanmasını (SCI) elektriksel veya kimyasal müdahaleler yoluyla tedavi etmek amacıyla yaklaşımlar geliştirmiştir. Optogenetik17 veya elektriksel stimülasyon18 için implante edilebilir cihazların yanı sıra hidrojelleri19,20 kullanan farmasötik tedaviler de dahil olmak üzere mevcut stratejiler, iyileşme ve rehabilitasyonu kolaylaştırmada değişen derecelerde başarı göstermiştir. Bununla birlikte, mevcut tedavilerin çoğu subdural boşluğun dışında verildiğinden, hassas hedefleme kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada tarif edilen teknik, SCI ve nörodejeneratif durumlar için terapötik ajanların sürekli ve hedefli dağıtımını destekleyen, subdural boşluğa uzun süreli erişim yolu (Ek Şekil 2) dahil olmak üzere, müdahalelerin doğrudan omuriliğe verilmesi için umut verici bir yaklaşım sunmaktadır. Bunun, omurilik bozuklukları için etkili tedaviler geliştirmede büyük bir zorluk olan kan-omurilik bariyerini atlamak için önemli etkileri vardır.
Laminektomi (Laminektomi)
Kemirgenlerde laminektomi prosedürleri yaygın olarak kullanılırken 17,21,22, protokolün dikkat edilmesi gereken birkaç kritik yönü vardır. Yukarıdaki protokolde kullanılan anatomik işaretler (adım 4.3; Şekil 2A) omuriliğin alt torasik bölgesine erişim sağlar ve grubumuzun çalışmalarına özgüdür. İşlem farklı bir omurga bölgesine uygulanacaksa, yeri belirlemek için başlangıç omurlarına rostral veya kaudal segmentler sayılabilir. Bir diğer önemli husus ise laminanın çıkarılma derecesidir. İşlem sırasında omurilikte istenmeyen yaralanma riskini en aza indirmek için, en az iki bitişik seviye çıkarılmalıdır. Bunu yapmak durotomi için yeterli alan sağlar ve uygun görselleştirmeyi sağlar. Bu önlem, kateter yerleştirilmesi sırasında küçük kan damarlarının yaralanma riskini azaltır. Ameliyat sonrası gereksiz kanamayı veya omurganın instabilitesini önlemek için omurganın yan duvarından aşırı kemik çıkarılmasından da kaçınılmalıdır. Prosedür, yeterli erişim ve minimum kesinti arasında bir denge koruyarak, daha güvenli ve daha kesin tedavi sunumu sağlar.
Durotomi ve kateter takılması
Durotominin yapılması, omuriliğe nüfuz etmekten kaçınmak için hassasiyet gerektirir. Yanlış yerleştirme, omurilik veya subdural kan damarlarında morarma veya yırtılmalara neden olabilir. Durada oluşturulan açıklıklar, zarın bütünlüğünden ödün vermeden, istenen tedavi stratejisini, bu durumda intratekal kateterlerin çapını barındıracak kadar büyük olmalıdır. Durotomi yapılırken, dura mater delindiğinde beyin omurilik sıvısı sızabilir; Ancak, miktar minimumdur. Duradaki büyük yırtıklar komplikasyonlara neden olabilirken, önceki literatür, tarif edilen protokolde (adım 6.4) kullanılanlar gibi küçük deliklerin kollajen birikimi / vaskülarizasyon23 yoluyla kendi kendini iyileştirebildiğini ve prosedürü takiben ölçülebilir bir yan etki ile sonuçlanmadığını göstermektedir. Kateterleri yerleştirirken, doğrudan kuvvetten kaynaklanan yaralanma riskini en aza indirmek için omuriliğe mümkün olduğunca paralel yerleştirilmelidir. Bükülmeyi veya kıvrılmayı önlemek, düzgün yerleştirme ve uygun konumlandırma sağlamak için dikkatli kullanım gereklidir.
Ameliyat sonrası bakım
Prosedürü takiben ameliyat sonrası bakım, kemirgenlerin tipik olarak standart koşullarda grup halinde barındırıldığı göz önüne alındığında önemli bir husustur. Bu prosedürden sonraki agresif davranışlar veya sosyal etkileşimler, uygulanan tedavinin türüne bağlı olarak deneysel sonuçları etkileyebilir. Bu protokol, hayvanın sırtı boyunca 6-8 cm'lik bir deri dikiş çizgisi ile sonuçlanır. Yara iyileşmesine izin vermek ve dikişlerin bir kafes arkadaşı tarafından olası olarak çıkarılmasını önlemek için tek ev hayvanlarının ameliyattan sonra 7-10 gün boyunca tutulması önerilir. Bir ilaç verme uygulaması söz konusu olduğunda, insizyon iyileştikten sonra, prosedürle ilgili açıkça agresif bir davranış veya komplikasyon olmaksızın önceki gruplara yeniden yerleştirilebilirler. İmplante edilebilir cihazlar söz konusu olduğunda, hayvanlar sadece 2 kişilik gruplar halinde barındırılmalıdır. Hayvanları 3 veya daha fazla kişilik gruplar halinde barındırmanın, tedavi sonuçlarında saldırganlıkla ilgili komplikasyonlara yol açabileceğini bulduk.
Tedavi uygulamaları
Burada tarif edilen prosedür torasik omuriliğe ve iki spesifik tedavi stratejisine odaklanmasına rağmen, omurganın diğer bölgeleri ve ek terapötik uygulamalar için uyarlanabilir. Benzer laminektomi prosedürleri kemirgen modellerinde çeşitli omurga seviyelerinde başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, kemirgenlerdeki küçük subdural boşluk, tedavi uygulaması sırasında hataya minimum yer bırakarak bir zorluk teşkil eder. Laminektomi ve durotomi aşamaları kemirgen ameliyatlarında deneyimli kişiler tarafından kolaylıkla yapılabilirken, bir cihazın veya ilacın yaralanmaya neden olmadan dura altına hassas bir şekilde yerleştirilmesi ek eğitim süresi gerektirebilir. Cerrahi eğitime ek olarak, tedavi uygulamasında yardımcı olabilecek çeşitli faktörler vardır. Tedavi uygulanırken net bir görüş alanı sağlamak çok önemlidir. Bu çalışmada anlatıldığı gibi intratekal kateterleri kullanırken, kateterleri dura altına yerleştirmeden önce üzerinde pürüzlü veya pürüzlü noktalar olmadığından emin olun. Yukarıda da belirttiğimiz gibi durotomi yeri son derece önemlidir. Kateter giriş noktası kalan rostral laminadan ne kadar uzaktaysa, kateterlerin yerleştirilmesi sırasında sıralanması ve omuriliğe paralel kalması o kadar kolay olur. Bir yaralanma ile ilgili tedavi stratejilerinin zamanlaması da dikkate alınmalıdır. Gelecekteki çalışmalar, daha sonra kronik yaralanmaları ele almayı amaçlayan tedavilerin değerlendirilmesine izin vermek için yaralanma sonrası çeşitli zaman noktalarında hayvanlarda bu prosedürlerin oluşturulmasını içerecektir. Bu protokol, omuriliğin nörolojik hastalıkları için tedavi uygulamasında önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve tedavilerin doğrudan omurilik dokusuna iletilmesi için çok yönlü ve kesin bir yaklaşım sağlar.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma CatWalk Omurilik Yaralanması Vakfı ve bir HRC Sir Charles Hercus Araştırma Bursu (BH) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda, Savunma Bakanlığı tarafından onaylanan Sağlık İşlerinden Sorumlu Savunma Bakan Yardımcısı tarafından da 534.258 ABD Doları tutarında, Ödül No'lu Omurilik Yaralanması Araştırma Programı aracılığıyla desteklenmiştir. HT9425-23-1-0492. Şekil 2A ve Şekil 3A'daki şemalar Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL ve 3 mL şırıngalar | Amtech | ||
| 1ml Tüberkülin şırıngaları | BD | 302100 | |
| 2 x Graefe pensepsi | FST | 11051-10 | |
| İlaç yönetimi için 25G iğneler | Nipro | SH811 | |
| Dural kesi için 27G iğneler | Nipro | SH816 | |
| 6 x Tissue bulldog kelepçeleri | FST | 18051-28 | |
| %70 Etanol | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Biogel Surgeons Lateks eldivenleri | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaine 2 mg/kg | Aspen Yeni Zelanda | 2023-02 | |
| Buprenorfin 0,05 mg/kg | Ceva (Vetergesik) | 9000320 | |
| Klorheks ve ehtanol tentürü | Perrigo | K076A | |
| Klorhex scrub | Schulke | LBL11258 | |
| Kavisli rongeurlar | FST | 16021-14 | |
| Dumont #4 forseps | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, steril emilebilir jelatin sünger | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Hamilton şırıngası | Hamilton | 80314 | |
| Isıtma pedi (37 oC) | Kent bilimsel | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Infinite Horizon darbe makinesi ve yazılımı | Hassas sistemler ve enstrümantasyon (PSI) | IH-0400 | |
| İzofluran | Medsource | bilinmeyen | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Emilmez dikişler (Ethilon 4-0, P-3) | Etikon | 1603G | |
| O2 tankı | |||
| Omax Cerrahi Mikroskobu | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Örtü için Pres ve Seal plastik sargısı | Memnun oldum | Yok | |
| Smalı sapı | Güzel Bilimler Araçları (FST) | 10004-13 | |
| 10 numaralı bistüri bıçakları | Amtech Medical | SH070 | |
| Somnoflow İndüksiyon Süiti | Kent Scientific | SF-01 | Düşük akışlı anestezi sistemi |
| Steril emici pedler ve pamuk yünü | İsviçreliler | Yok | |
| Steril pamuk çubukları (standart + sivri) | help@hand | Yok | |
| Steril salin %0,9 | Laboratuvarda üretilip otoklavlanmıştır | Yok | |
| Rulo edilmiş Kim Wipe steril bölümleri | Kimtech Bilimi | 34155 | |
| Sıcaklık Probu | Kent bilimsel | SF-01 | |
| Vannas Bahar Makasları | FST | 15903-08 | |
| Su bazlı kayganlaştırıcı | |||
| Tartı | Herhangi bir | Yok |
Kaynaklar
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 3, 17018(2017).
- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
- Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 282(2019).
- Chari, A., Hentall, I. D., Papadopoulos, M. C., Pereira, E. A. Surgical neurostimulation for spinal cord injury. Brain Sci. 7 (2), 18(2017).
- Krucoff, M. O., et al. Spinal cord stimulation and rehabilitation in an individual with chronic complete L1 paraplegia due to a conus medullaris injury: Motor and functional outcomes at 18 months. Spinal Cord Ser Cases. 6 (1), 96(2020).
- Chalif, J. I., et al. Epidural spinal cord stimulation for spinal cord injury in humans: A systematic review. J Clin Med. 13 (4), 1090(2024).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nat Med. 29 (3), 689-699 (2023).
- Calvert, J. S., Grahn, P. J., Zhao, K. D., Lee, K. H. Emergence of epidural electrical stimulation to facilitate sensorimotor network functionality after spinal cord injury. Neuromodulation. 22 (3), 244-252 (2019).
- Capogrosso, M., et al. Advantages of soft subdural implants for the delivery of electrochemical neuromodulation therapies to the spinal cord. J Neural Eng. 15 (2), 026024(2018).
- Kwiecien, J. M., et al. Neuroprotective effect of subdural infusion of serp-1 in spinal cord trauma. Biomedicines. 8 (10), 372(2020).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), e2105913(2022).
- Meissner, S., et al. Safe subdural administration and retention of a neurotrophin-3-delivering hydrogel in a rat model of spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), 25424(2024).
- Harland, B., et al. Daily electric field treatment improves functional outcomes after thoracic contusion spinal cord injury in rats. bioRxiv. , (2024).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. 78, e50111(2013).
- Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. (205), e66463(2024).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Shalileh, S., Moallemi, A., Tsuyuki, B., Simard, A. A. P., Shahriari, D. Implantation of optoelectronic devices in the rodent spinal cord. J Vis Exp. (209), e66992(2024).
- Hachmann, J. T., et al. Epidural spinal cord stimulation as an intervention for motor recovery after motor complete spinal cord injury. J Neurophysiol. 126 (6), 1843-1859 (2021).
- Ye, J., et al. Rationally designed, self-assembling, multifunctional hydrogel depot repairs severe spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100242(2021).
- Wu, W., et al. Supramolecular hydrogel microspheres of platelet-derived growth factor mimetic peptide promote recovery from spinal cord injury. ACS Nano. 17 (4), 3818-3837 (2023).
- Pietruczyk, E. A., Stephen, T. K. L., Alford, S., Lutz, S. E. Laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse. J Vis Exp. (152), e58330(2019).
- Zhou, X. H., et al. Design and evaluation of a novel laminectomy auxiliary device based on rats. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 28 (3), 621-628 (2020).
- Ahmadi, S. A., et al. The effect of L-arginine on dural healing after experimentally induced dural defect in a rat model. World Neurosurg. 97, 98-103 (2017).
Yeniden basım ve izinler
