Yöntem makalesi

İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

DOI:

10.3791/68636

⸱

7 Kasım 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak görüntülenen influenza virüslerinin veri işlemesi ve ardından hemaglutinin glikoproteininin subtomogram ortalaması için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, görüntü ön işlemeden son model iyileştirmeye kadar adım adım veri işlemeyi kapsar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi, heterojen örnekleri görselleştirmek için güçlü bir araçtır ve önemli bir uygulama pleomorfik virüslerin yapısal karakterizasyonudur. Son yıllarda, viral glikoproteinlerin subtomogram ortalaması, bu önemli proteinleri bozulmamış viryonların yüzeyinde doğrudan görselleştirmek için bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Önemli bir hedef, viral zarfı yoğun bir şekilde kaplayan ve influenza reseptörünün bağlanmasından ve membran füzyonundan sorumlu olan influenza virüsünün hemaglutinin (HA) glikoproteinidir. İnfluenza HA'nın subtomogram ortalamaları bildirilmiş olsa da, kriyoET'nin doğasında bulunan düşük sinyal-gürültü oranı ve heterojen influenza viryonlarını analiz etmek için gereken manuel çaba nedeniyle çözünürlükleri sınırlı kalmıştır. Burada, influenza viryonlarının tomografik verilerini verimli ve sağlam bir şekilde analiz etmek için çeşitli yazılım paketlerini entegre eden bir kriyoET analiz hattı sunulmaktadır. Bu protokol, ilk hareket düzeltmesinden son model oluşturmaya kadar olan adımlarla influenza viryonlarından HA'nın yapısal olarak belirlenmesini açıklar. Bu boru hattını takiben, A/Porto Riko/8/34 (PR8) influenza suşundan toplanan iki kriyoET veri setinden 6.0 şçözünürlükte bir HA rekonstrüksiyonu elde edildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi (kriyoET), protein komplekslerinin, virüslerin, hücrelerin ve organizmaların anlık görüntülerini yakalamak için son yıllarda uygulanmıştır. Kriyo-elektron mikroskobunun (kriyoEM) bir yöntemi olan kriyoET, biyolojik bir numunenin flaşla dondurulduğu ve daha sonra 1,2,3'ü eğerek çeşitli yönlerde görüntülendiği yapısal bir biyoloji yöntemidir. Her yönde çekilen görüntüler daha sonra hesaplamalı olarak ortak eğim eksenlerine hizalanır ve üç boyutlu bir görünüm sağlamak için bir tomogramda yeniden yapılandırılır

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol için kullanılan örnek veri kümelerine, bu protokol için kullanılan iki eğim serisi kümesini içeren EMPIAR-12864'ten erişilebilir. Eğim serileri, her bir eğim serisinin birkaç viryon içermesi için yeterince geniş bir görüş alanı sağlamak ve ayrıca mümkün olan en yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonları sağlamak için 2.09 Å/piksel fiziksel piksel boyutunda manuel olarak daldırılmış saflaştırılmış influenza A virüsü ızgaralarından toplanır. Kullanıcıların kendi veri kümeleri için iş akışını ham eğimli filmlerle başlatmaları önerilir. Bu veri kümeleri, yüksek performanslı iş istasyonları kullanılarak işlendi ve görselleşti....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu işleme protokolünün kullanımını göstermek için (Şekil 1), daha önce özetlenen iş akışı, bir H1N1 influenza A virüs suşundan (A/Porto Riko/8/1934) elde edilen, birleştirilmiş 25 tomogramdan oluşan iki veri kümesine uygulandı. Veri toplama parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Şekil 2 , temsili bir tomogramı ve pleomorfik influenza viryonlarının yakınlaştırılmış görünümlerini göstermektedir. Bu tomogramda çeş.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritik viral proteinlerin daha iyi yapısal olarak anlaşılması, bu virüslere karşı yeni tedavilerin keşfini hızlandırabilir. Son on yılda, çözünürlük devrimi, tek parçacıklı kriyoEM kullanılarak yüksek çözünürlüklü viral yapıların belirlenmesini hızlandırdı, ancak bu yöntem ya saflaştırılmış proteinlerle ya da ikosahedral simetriye sahip zarfsız virüslerle sınırlıdır. Buna karşılık, kriyoET, morfolojik olarak çeşitli membranöz viryonları 3D olarak görselleştirebilir, ancak sınırlı çözünür.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Schiffer Laboratuvarı ile yapılan yararlı tartışmaları kabul etmek isterler. Ayrıca UMass Chan cryoEM Core tesisine veri toplama konusundaki yardımları ve bize destek ve tavsiye sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından MS'ye R01GM143773 ve CAS'ye R35GM151996 desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4UC San Franciscohttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52Baylor Tıp Fakültesihttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27Colorado Üniversitesi Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
Grip analiz scriptleriUMass Chan Tıp Fakültesihttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3UCLAhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0Genentechhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D Intel Labshttps://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarıphenix-online.org
RELION 4.0MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarıhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
Ubuntu 20.04Ubuntuhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1UC San Franciscohttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
Warp 2.0.0Genentechhttp://warpem.github.io/warp/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

İlgili makaleler