İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

Kriyo-elektron tomografisi (kriyoET), protein komplekslerinin, virüslerin, hücrelerin ve organizmaların anlık görüntülerini yakalamak için son yıllarda uygulanmıştır. Kriyo-elektron mikroskobunun (kriyoEM) bir yöntemi olan kriyoET, biyolojik bir numunenin flaşla dondurulduğu ve daha sonra 1,2,3'ü eğerek çeşitli yönlerde görüntülendiği yapısal bir biyoloji yöntemidir. Her yönde çekilen görüntüler daha sonra hesaplamalı olarak ortak eğim eksenlerine hizalanır ve üç boyutlu bir görünüm sağlamak için bir tomogramda yeniden yapılandırılır⁴.

X-ışını kristalografisi ve tek parçacıklı kriyoEM saflaştırılmış, yapısal olarak homojen moleküller gerektirirken, kriyoET bir molekülü doğrudan kendi doğal bağlamı içinde görüntüleyebilir⁴. Bu nedenle, kriyoET'in ana avantajlarından biri, influenza ^5,6,7 dahil olmak üzere membranöz virüsler gibi pleomorfik örnekleri görselleştirme yeteneğidir. CryoET'in bir başka vaadi de ölçekler arasında görüntüleme yeteneğidir. Tomogramlar tipik olarak 5-10 nm^8'den sonra çözülmezken, aynı parçacığın kopyalarının tanımlandığı, hizalandığı ve ortalamasının alındığı alt tomogram ortalamasının entegrasyonu, ribozomlar ^9,10 gibi bazı biyolojik moleküllerde atomik çözünürlüğe yakın olabilir. Bununla birlikte, yalnızca sınırlı molekül türleri bu çözünürlüğe ulaşabilir; subtomogram ortalamaları tipik olarak 10-15 şçözünürlüğü geçmez. Buna karşılık, tek parçacıklı kriyoEM, çözünürlük devrimi^11'den sonra rutin olarak 3-4 şçözünürlüklere ulaşır. Hem daha yüksek verimli kriyoET veri toplama hem de analiz yazılımındaki son gelişmeler, ek biyolojik moleküllerin kendi doğal bağlamları içinde^nanometre altı çözünürlük yapısının belirlenmesine izin vermiştir 12,13,14,15,16,17,18.

KriyoET'in yaygın kullanımlarından biri virüs morfolojisini, organizasyonunu ve yapısını görselleştirmektir. Tek parçacıklı kriyoEM veya X-ışını kristalografisine kıyasla bu tekniğin sağladığı daha düşük çözünürlüğe rağmen, subtomogram ortalaması ile birleştirilmiş kriyoET, viral proteinlerin doğal ortamlarında nasıl davrandıkları hakkında bilgi sağlayabilir ve virion bağlamında organizasyonları hakkında önemli ayrıntılar sağlayabilir. Virüslerin kriyoET'si için ortak bir hedef, genellikle ana antijenler ve terapötikler veya aşılar için hedefler olduklarından, konakçı hücre bağlanması ve füzyonu için yaygın olarak kullanılan yüzey glikoproteinleridir. KriyoET işleme paketlerindeki son gelişmelerle birlikte, bu glikoproteinlerin ^19,20,21,22 nanometre altı çözünürlük ortalamalarını elde etmek giderek daha mümkün hale gelmiştir. Böyle bir örnek, influenza viryonlarının yüzeyindeki ana protein olan hemaglutinindir (HA). Bu protein sadece hem reseptör bağlanmasını hem de membran füzyonunu gerçekleştirmekle kalmaz, aynı zamanda virionu, tek bir virion⁵ üzerinde yüzlerce ila binlerce HA ile inanılmaz derecede yoğun bir şekilde kaplar. Burada sunulan protokol (Şekil 1), influenza HA'nın bir alt tomogram ortalaması için ön işlemeden model iyileştirmeye kadar aşamaları tanımlamak için yaygın olarak kullanılan birkaç paketi şirket içi komut dosyalarıyla birleştirir.

NOT: Bu protokol için kullanılan örnek veri kümelerine, bu protokol için kullanılan iki eğim serisi kümesini içeren EMPIAR-12864'ten erişilebilir. Eğim serileri, her bir eğim serisinin birkaç viryon içermesi için yeterince geniş bir görüş alanı sağlamak ve ayrıca mümkün olan en yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonları sağlamak için 2.09 Å/piksel fiziksel piksel boyutunda manuel olarak daldırılmış saflaştırılmış influenza A virüsü ızgaralarından toplanır. Kullanıcıların kendi veri kümeleri için iş akışını ham eğimli filmlerle başlatmaları önerilir. Bu veri kümeleri, yüksek performanslı iş istasyonları kullanılarak işlendi ve görselleştirildi. Malzeme Tablosu, bu protokol için kullanılan donanım ve yazılımı listeler. Bu protokolde kullanılan tüm yazılım paketleri açık kaynak kodludur ve indirilebilir; kurulum bağlantıları ve talimatları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. CryoET veri kümelerini işlemek için önerilen iş istasyonu en az 8 çekirdekli bir işlemci, 6 GB VRAM'li özel bir GPU kartı, 64 GB RAM ve 2 TB yerel depolama alanıyla donatılmalıdır.

1. Warp ²³ ve IMOD ^24'te tilt filmlerinin veri ön işlemesi ve kriyo-elektron tomogramlarının yeniden yapılandırılması

1. Terminalde, aşağıdaki komutu kullanarak Warp'ın yüklü olduğu bir conda ortamını etkinleştirin:
   conda activate warp_environment
2. Kare serilerini işlemek için bir kare serisi ayarları dosyası oluşturun. Bu, mikroskop, işlenecek verilerin konumu ve çıktı dosyalarının nerede saklanacağı hakkında meta verileri içeren bir yapılandırma dosyasıdır.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   NOT: Bu veriler süper çözünürlük modunda toplanmıştır.
3. Kontrast transfer fonksiyonu (CTF) tahmini ve hareket düzeltmesi gerçekleştirin.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   NOT: m_grid parametre, eğimli bir film içindeki alt karelerin sayısına karşılık gelmelidir - veri kümelerimiz, eğimli film başına 5 alt kareden oluşuyordu.
4. WarpTools'un hangi filmlerin hangi eğim serisine ait olduğunu belirleyebilmesi için eğim serisi meta verilerini içe aktarın.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Tomostar klasörü doldurulduktan sonra, eğim serisi işleme için bir eğim serisi ayarları dosyası oluşturun
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Etomo GUI^24'ü kullanarak IMOD'un toplu çalışma programını kullanarak eğim yığınlarını yazın ve otomatik referans tabanlı eğim serisi hizalaması gerçekleştirin.
   1. Terminalde aşağıdaki komutu çalıştırın:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      NOT: Eğim serileri, hizalama süresini ve hesaplama kaynaklarını azaltmak için fiziksel piksel boyutunun 4 katı olarak dışa aktarıldı.
   2. Hizalama parametrelerini batch runtomo için şablon olarak uygulamadan önce ayarlamak için örnek bir veri kümesi seçin.
   3. batchruntomo kullanıyorsanız hizalama parametrelerini IMOD'dan içe aktarın.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      NOT: Bu veri kümesi için Etomo GUI'yi kullanmak, WarpTools içindeki sarmalayıcılardan daha iyi sonuçlar verdi.
   4. Alternatif olarak, WarpTools içindeki AreTomo²⁵ sarmalayıcıyı kullanarak otomatik referans noktası olmayan eğimsiz seri hizalama gerçekleştirin.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      NOT: AreTomo sarmalayıcı, AreTomo1.3.4 ile test edilmiştir.
7. Eğim serileri için CTF parametrelerini tahmin etmek için terminalde aşağıdaki komutu çalıştırın:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. WarpTools kullanarak tomogramları yeniden oluşturun.
   1. Ortam değişkenini ayarlayın:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      NOT: Bu adım, tomogramların bu protokolde kullanılan diğer yazılımlardaki görüntü işleme ve görselleştirmenin sonraki aşamalarıyla uyumlu olmasını sağlar.
   2. Tomogramları yeniden oluşturmak için bir terminalde yürütün: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Tüm veri kümeleri için 1.2 - 1.8.2 arasındaki adımları yineleyin.

2. Tomogram ön işleme ve partikül toplama

1. Bir terminalde, IsoNet²⁶ yüklü bir conda ortamını etkinleştirin.
   conda activate isonet_env
2. Önce bir alt klasör oluşturup tüm tomogramları bu klasöre taşıyarak tomogramların işlenmesine hazırlanın.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Proje klasöründe bir yıldız dosyası oluşturun.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Bir metin düzenleyici kullanarak, oluşturulan yıldız dosyasını açın ve warp_tiltseries klasöründeki processed_items.json dosyasında bulunabilen her tomogram için dördüncü sütuna (_rlnDefocus) 0 derece eğik görüntüler için yaklaşık bulanıklaştırma değerini girin.
   NOT: Odak dışı değeri IsoNet için angstrom cinsinden olmalıdır. Çarpıtma, 10.000'lik bir çarpma faktörü gerektiren odak dışı değerleri μm cinsinden yazar.
5. Terminalde CTF deconvolve komutunu çalıştırın.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Ayrıştırmadan sonra, parçacık toplama için tomogramları ön işlemeye başlamak için EMAN2 GUI^27'yi başlatın.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. Tomografi altında, Ham Veri'nin yanındaki oka sol tıklayın ve açılır menüden Tomogramları İçe Aktar'ı seçin.
8. Segmentasyon'un yanındaki oka sol tıklayın ve Tomogramları önceden işle'yi seçin.
   NOT: Varsayılan parametreler büyük olasılıkla birçok veri kümesi için uygundur. Bu tomogramlar için 4 Å'de alçak geçiren filtre uygulandı ve eğim görüntüleri normalleştirildi. Ön işlemeden sonra, EMAN2 tarafından boş .json dosyalarıyla (önceden işlenmiş dosyalara benzer temel adlara sahip) otomatik olarak bir bilgi dizini oluşturulacaktır. Parçacık toplamadan önce angpix'in json dosyalarına eklenmesi gerekir.
9. HA glikoproteinini tanımak için evrişimli sinir ağını (CNN) eğitin.
   1. Çalışma dizinini CNN eğitimi ve parçacık toplama için kullanılacak tomogramların konumuna değiştirin:
      cd path/to/tomograms
   2. CNN eğitim penceresini açmak için terminali kullanın.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Dört pencerenin açık olduğunu onaylayın: biri dizindeki CNN parametreleri ve tomogramları hakkındaki bilgileri içerir, diğer üç pencere ise iyi referansların (Pozitif), kötü referansların (Negatif) ve CNN tarafından seçilen parçacıkların (Parçacıklar) görüntülerini içerir.
   4. Yeni bir CNN başlatmak için CNN GUI'deki Yeni düğmesine sol tıklayın. Varsayılan öğrenme oranını 0,0001 ve kutu boyutunu 8 olarak ayarlayın.
   5. FileName sütununun altında, yeni bir pencerede açmak için temsili bir tomograma sol tıklayın.
      NOT: Aynı anda yalnızca bir tomogram açılabilir.
      1. Bir tomogramın z ekseninde hareket etmek için, imleci açık tomogramın üzerine getirin ve yeni bir pencere açmak için bilgisayar faresinin kaydırma tekerleğine basın. N# etiketli kaydırıcı z eksenini değiştirir.
   6. Açık tomogramda, Pozitif panelde farenin sol düğmesini kullanarak HA'ya karşılık gelen 10-20 özelliği seçin.
      NOT: Daha sağlam bir ağ için iyi referanslar olarak, zarın üzerinde silindirler veya üçgenler olarak görünen HA'nın hem üstten hem de yandan görünümlerini seçin.
      1. Pozitif referansların görüntüleri Pozitif penceresinde görünecektir. Bir referansı kaldırmak için Shift tuşunu basılı tutun ve bir referans resmine sol tıklayın.
   7. Negatif panele geçin ve boş membran yamaları, vRNP yoğunluğu, referans işaretleyicileri ve döküntü gibi özelliklere karşılık gelen 10-20 referans seçin.
      NOT: Referanslar Negatif penceresinde görünecektir.
   8. Ana penceredeki Eğit düğmesine sol tıklayarak CNN eğitimini başlatın.
      NOT: Ana penceredeki yineleme sayısı (Niter), CNN'nin kaç eğitim yinelemesinden geçtiğini değiştirir. Parametreyi 50 olarak ayarlamanızı öneririz.
   9. CNN seçilen referanslar üzerinde eğitildikten sonra, açık tomogramdaki parçacıkları seçmek üzere CNN'yi kullanmak için Uygula'ya sol tıklayın.
      NOT: Seçilen parçacıkların görüntüleri Parçacıklar penceresinde görülebilir. Seçilen parçacıklar da tomogramda mavi daireler içinde görüntülenecektir.
   10. Uygulanan ağa göre pozitif ve negatif referansları seçmeye devam edin ve Kaydet düğmesi aracılığıyla ilerlemeyi periyodik olarak kaydedin.
   11. Tatmin edici olduğunda, CNN'nin dizindeki tüm tomogramlardaki parçacıkları seçmesini ve sonuçları birkaç tomogramda değerlendirmesini sağlamak için Tümünü Uygula'yı seçin; Gerektiğinde ek eğitim gerçekleştirin.
10. Her tomogram için koordinatları bir metin dosyasına kaydedin.
    1. komutunu kullanarak EMAN2 GUI'sini e2projectmanager.py açın.
    2. Subtomogram Ortalaması'nın yanındaki oka tıklayın ve Manuel Kutulama'ya tıklayın.
    3. Bir tomogramın adını girin ve Başlat'a tıklayın.
    4. Dosya > Kaydetme Kutusu Koordinasyonu > tomogram_ha.txt'yi seçerek koordinatları metin dosyasına kaydedin.
    5. nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf ve boxes3dref.hdf'yi yedeklemek için neuralnets alt klasörüne ve info alt klasörüne gidin.
11. Analizin yalnızca matris (M1) protein tabakasının ve viral ribonükleoprotein (vRNP) kompleksinin varlığının belirgin olduğu tamamen monte edilmiş viryonlar üzerinde yapıldığından emin olmak için, M1 proteinini tanımak için ikinci bir evrişimli sinir ağı eğitin.
    1. Eğitim kutusu boyutunu 8'den 14'e değiştirerek adım 2.9'da özetlenenle aynı protokolü izleyin.

3. Parçacık küratörlüğü

1. https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis'den not defterlerini indirin.
2. CNN_Particle_Cleaning.ipynb not defterini açın ve gerekli modülleri yükleyin.
   NOT: Komut dosyası, parçacık koordinatlarını 3B nokta bulutları olarak görselleştirmek için bir paket olarak Open3D^28'i kullanır.
3. HA ve M1 koordinatlarına karşılık gelen metin dosyalarını yükleyin ve Open3D paketini kullanarak 3D nokta bulutları olarak görüntüleyin.
4. Open3D'de uygulandığı gibi istatistiksel aykırı değer kaldırmayı kullanarak HA koordinat aykırı değerlerini filtreleyin.
   NOT: HA için önerilen başlangıç değerleri nb_neighbors = 50 (bir koordinat etrafındaki komşu koordinatların sayısı) ve std_ratio = 0,5'tir.
5. HA ve M1 nokta bulutları arasındaki mesafeyi hesaplayın. M1 nokta bulutundan 20 pikselden daha uzaktaki tüm HA koordinatları daha sonra bir aykırı değer olarak tanımlanacaktır. Aykırı değer olarak tanımlanmayan tüm parçacık koordinatları bir çıktı .txt dosyasına kaydedilecektir.
   NOT: 20 piksel, 8,35 Å/piksel piksel boyutuyla yaklaşık 16 nm mesafeye karşılık gelir. Tomogramlarımızda bir HA trimerinin M1 katmanına olan merkezi yaklaşık 15 nm'dir.
6. Tüm parçacıkları birleştirin ve pts2starfile.ipynb kullanarak yıldız dosyaları olarak kaydedin.

4. Yinelemeli subtomogram ortalaması ve sınıflandırması

1. WarpTools'u kullanarak, parçacıkları 4 gruplama faktöründe çıkarın ve RELION4^29'da ortalama subtomogramın ilk turlarını gerçekleştirin.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   NOT: Önerilen kutu boyutu 48 x 48 x 48 pikseldir ve 7-8 HA dizisini içerecek kadar büyük olacak ~360 ųkutuya karşılık gelir.
   1. Warp starfile'ı RELION 4 uyumlu dosyaya dönüştürün
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Parçacıkların bir alt kümesi üzerinde relion_refine_mpi kullanarak bir başlangıç referansı oluşturun.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Alt tomogramlar üzerinde 3B otomatik iyileştirme yapmak için relion_refine_mpi kullanın.
      1. Örnek komut: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         NOT: İlk küresel ve yerel örnekleme, 4'lük bir healpix sırasına ve 2'lik yerel healpix'e karşılık gelen 7,5 ve 1,8 dereceye ayarlanmıştır. İlk iyileştirmeler çoğunlukla zarın, M1 proteininin ve HA dizisinin güçlü yoğunluğundan yararlanır. Diziyi hizalarken oluşabilecek kaymaları kapsayacak şekilde çeviri ofset aralığının daha büyük olmasına izin verilir.
   4. İlk iyileştirme çalıştırması yakınsadıktan sonra iyileştirmeyi yineleyin, çeviriyi 8 ve adımı 2 olarak değiştirin.
2. relion_refine kullanarak çöp parçacıkları atmak için 2D sınıflandırmadan yararlanın.
   1. Örnek komut: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      NOT: Hesaplama açısından daha verimli olduğu için 3B sınıflandırma yerine 2B sınıflandırma kullanılmıştır. Alt tomogramlar, ek görüntü işlemeye gerek kalmadan doğrudan 2D sınıflandırma işine girdi olarak kullanılabilir.
   2. Silindirik HA, membran ve M1 yoğunluğu içeren tanımlanabilir bir HA dizisi içeren sınıfları relion_star_handler kullanarak birleştirin.
   3. İlk olarak, iyi sınıflar içeren yıldız dosyaları oluşturun.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Ardından, tek tek yıldız dosyalarını birleştirmek için aşağıdaki relion_star_handler komutunu kullanın.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Yinelemeli yerel arıtma için bin2'de ve gruplanmamış parçacıklarda yeniden ekstrakte edin.
   1. Bin2 iyileştirmesi için, 80'lik daha küçük bir kutu boyutu kullanarak parçacıkları çıkarın ve hem healpix hem de yerel healpix 4'e (1,8 derece yerel açısal örnekleme) ayarlanmış olarak yerel arama yapın.
   2. Bu aşamada, relion_star_handler kullanarak farklı veri kümelerinden parçacık kümelerini birleştirin.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. İlk iyileştirme turundan sonra, merkezi HA artı membranı ve M2 yoğunluğunu kapsayan EMAN1 ortamında e2filtertool.py kullanarak silindirik bir maske oluşturun.
      NOT: Silindirik maske için kullanılan parametreler: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; diğer tüm parametreler işaretli değildir.
   4. Maske uygulanmış haldeyken bir tur daha arıtma yapın.
   5. Merkezi HA ile hizalanmayan aykırı değerleri ve ek kalıntıları ortadan kaldırmak için başka bir 2D sınıflandırma turu gerçekleştirin.
   6. İşlemi kutu boyutu 120 olan gruplanmamış parçacıklarla tekrarlayın ve merkezi HA'yı kaplayan yumuşak bir maske oluşturun, referansı C3 simetrisine hizalayın ve bu iyileştirme aşamasında simetri uygulayın.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      NOT: RELION kullanılarak elde edilen nihai çözünürlük 6.1 şidi.
4. MTools^9'da son iyileştirme
   1. İyileştirme popülasyonu oluşturun (Warp conda ortamının etkinleştirilmesinden sonra).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Her veri kümesi için veri kaynakları ekleyin.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Önceki adımı ek veri kümeleriyle yineleyin.
   3. İyileştirme türlerini oluşturun.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Çok parçacıklı arıtma.
      1. İlk olarak, parçacık pozlarını şu komutla iyileştirin: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Daha sonra, şu komutla hem parçacık pozlarını hem de küresel sapmayı iyileştirin: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         NOT: Daha sonraki yinelemeler çözünürlüğü iyileştirmediği için iyileştirme burada durduruldu. Bununla birlikte, kapsamlı bir şekilde test edilmemiş farklı parametre kombinasyonları, sonuçları artırmaya devam edebilir.

5. Model iyileştirme

1. ChimeraX^30'u kullanarak son haritayı ve HA'nın atomik modelini yükleyin.
2. HA ektodomainine karşılık gelen tüm segmentleri segment haritalayın ve birleştirin ve HA modeline yerleştirmek için Segmentlere Sığdır aracını kullanın.
   1. Modelin dönüştürülmüş koordinatlarını kaydedin.
3. Phenix GUI^31'i açın ve Gerçek Uzay İyileştirme aracını kullanın.
   1. Dosya eklemeniz istendiğinde, dönüştürülen HA modelini ve haritayı ekleyin ve son yeniden yapılandırmanın çözünürlüğünü doldurun.
   2. Beş tur küresel minimizasyon, yerel rotamer montajı, doluluk iyileştirmesi ve grup ADP iyileştirmesi gerçekleştirin.
4. ChimeraX kullanarak son rekonstrüksiyonu ve modeli görselleştirin.

Bu işleme protokolünün kullanımını göstermek için (Şekil 1), daha önce özetlenen iş akışı, bir H1N1 influenza A virüs suşundan (A/Porto Riko/8/1934) elde edilen, birleştirilmiş 25 tomogramdan oluşan iki veri kümesine uygulandı. Veri toplama parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Şekil 2 , temsili bir tomogramı ve pleomorfik influenza viryonlarının yakınlaştırılmış görünümlerini göstermektedir. Bu tomogramda çeşitli morfolojiler yakalanır, çünkü viryonlar küreselden oval/uzun şekle kadar değişir. Çoğu influenza partikülü iyi organize edilmiş M1 ve vRNP düzenekleri içerirken, bazı viryonlar daha düzensiz görünmektedir ve önemli yapısal bileşenlerden yoksundur.

Bu veri kümesinden, parçacık toplama ve kürasyondan sonra bin4 (8.35 Å/pix) rekonstrüksiyonu için 40.995 alt tomogramdan oluşan bir başlangıç seti kullanıldı. İki veri kümesi başlangıçta C1 simetrisi ve genel HA dizisini kapsayan geniş bir küresel maske ile RELION4 olarak bağımsız olarak işlendi. Bu alt tomogramlar için üç iyileştirme döngüsü gerçekleştirildi ve ardından 2D sınıflandırma yapıldı. Sınıflandırma sonrası, kötü çözülmüş alt tomogramlar ve önemsiz parçacıklar atıldı; kalan alt tomogramlar bin2'de (4.17 Å/pix) çıkarıldı ve iki veri seti birleştirildi. Bin2 alt tomogramları önce bir tur subtomogram ortalamasında birbirine hizalandı, ardından odak hizalaması için merkezi HA'nın etrafına silindirik bir maske uygulandı. Bu aşamada, HA rekonstrüksiyonu için trimerik simetri net bir şekilde görselleştirilebilir. Bin2'de ve 2.8 Å/pix'te ek arıtma turları gerçekleştirildi. Son bir 2D sınıflandırma turu, hizalanmış alt tomogramlarla sadece merkezi HA trimerini kaplayan küçük bir maske ile gerçekleştirildi. Kalan alt tomogramların ~%94'ünden oluşan ana sınıf, gruplanmamış parçacıklara ekstrakte edildi ve C3 simetrisi uygulanarak 3D iyileştirmeye tabi tutuldu. Son olarak, bu alt tomogramlar, parçacık pozlarının ve küresel sapma iyileştirme döngülerinin gerçekleştirildiği M'ye aktarıldı (Ek Şekil 1).

15.970 HA parçacığından oluşan son subtomogram ortalaması (Şekil 3A), 6.0 Å'lik bir küresel çözünürlüğe ve 5-7 Å'lik bir yerel çözünürlük aralığına ulaştı (Şekil 4). Bir PR8 HA modeli, yoğunluğa esnek bir şekilde rafine edildi; FSC=0.5 ve FSC=0.143'te haritadan modele çözünürlük sırasıyla 8.1 şve 6.6 şidi. HA rekonstrüksiyonunun mimarisi, önceki kriyoEM ve kriyoET haritalarına büyük ölçüde benziyordu. Bu çözünürlükte, alfa sarmalları ve beta tabakaları ayırt edilebilir (Şekil 3B); ayrıca, glikanlar HA başı ve gövdesi üzerindeki dört glikosilasyon bölgesinde tanımlanmaya başlayabilir (Şekil 3C).

Sonuçlarımız, doğal influenza viryonlarından HA'nın rekonstrüksiyonunda kriyoET'in uygunluğunu göstermektedir. Protokol aracılığıyla, silindirik glikoprotein için viral membrana dik olarak net yoğunluk gözlendi ve çözünürlük her adımda iyileşti. Kişinin kendi verileri için, subtomogram ortalamasının gruplanmış bir parçacık yığınından başlaması ve sonuçların her arıtma döngüsünde yakından izlenmesi önerilmektedir. Glikoprotein yoğunluğu başlangıç aşamalarından itibaren belirgin değilse, doğru konumlandırmayı doğrulamak için subtomogram konumlarının tomograma geri eşlenmesi önerilir. Aksi takdirde, en iyi sonuçları elde etmek için hizalama parametrelerinde ince ayar yapılabilir veya ek sınıflandırma aşamaları uygulanabilir.

Şekil 1: İnfluenza virüsünün kriyoET'sinden HA'nın subtomogram ortalaması için genel boru hattı. Üst panel, protokolü göstermek için kullanılan iki veri kümesi için özet bir iş akışını temsil eder. İkinci panel protokolün 1. bölümüne, üçüncü panel 2-3. bölümlerine, dördüncü panel ise 4-5. bölümlerine karşılık gelmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PR8 influenza virüsünün temsili tomogramı. (A) Yeniden yapılandırılmış tomogramı dilimleyin. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. (B-D) (B) küresel, (C) silindirik, (D) M1'siz PR8 virion görünümünde yakınlaştırılmıştır. BD'deki tüm ölçek çubukları 50 nm'ye karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: PR8 HA'nın subtomogram ortalaması. (A) PR8 HA tek parçacıklı kriyoEM yapısı ile esnek bir şekilde donatılmış iki kontur seviyesinde HA rekonstrüksiyonunun üstten ve yandan görünümü. (B) HA rekonstrüksiyonu boyunca kırpılmış görünümler. Renkli oklar, renkli kutulara karşılık gelir. (C) Glikan yoğunluğunu ortaya çıkarmak için alt konturda gösterilen HA rekonstrüksiyonu. KriyoET haritasında çubuk temsilindeki glikanların yakından görünümleri de gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HA subtomogram ortalamasının çözünürlük tahmini. (A) Yeniden yapılandırmaya eşlenen HA subtomogram ortalamasının yerel çözünürlük tahmini. Renk çubuğu, mavi-beyaz-kırmızı paletinde 5-7 Å'yi gösterir. (B) Yarım haritaların ve haritadan modele çözünürlüğün FSC eğrileri. Mavi eğri maskesiz rekonstrüksiyona, kırmızı ise maskeliye aittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: PR8 influenza virüsünün kriyoET veri kümeleri için veri toplama parametreleri.

Ek Şekil 1: HA için subtomogram ortalama iş akışı. Yinelemeli hizalama, ortalama alma ve sınıflandırma, HA alt tomogramları için kademeli olarak ayırma yoluyla gerçekleştirilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.