Kronik Osteomiyelit Yönetimi için Tanı ve Tedaviyi Entegre Eden Akıllı Yapısal Renkli Hidrojel Yama

Özet

Bu çalışma, kronik osteomiyelitin (COM) tanı ve tedavisi için akıllı bir yapısal renkli hidrojel yaması (CPG) sunmaktadır. Yama, kontrollü ilaç salınımı, enfeksiyon izleme ve doku yenilenmesini teşvik etmek için sıcaklığa duyarlı bir GelMA hidrojeli, pH'a duyarlı bir CSMA-PBA iskelesi ve salisilik asidi entegre eder.

Özet

Kronik osteomiyelit (COM), ilaç direnci ve olumsuz yan etkiler gibi sorunlar nedeniyle geleneksel antibiyotiklerle tedavisi zor olan kalıcı bir kemik enfeksiyonudur. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, COM'un hem teşhisi hem de tedavisi için yeni bir akıllı yapısal renkli hidrojel yaması (CPG) geliştirdik. Yama, iskele olarak fenilboronik asit (CSMA-PBA) ile modifiye edilmiş metilakrillenmiş kitosanı, dolgu maddesi olarak sıcaklığa duyarlı GelMA hidrojeli ve ilaç dağıtımı için salisilik asidi (SA) birleştirir. Karakterizasyon mükemmel mekanik özellikler ve yapışma mukavemeti gösterdi. İlaç salım deneyleri, CPG'nin pH değişikliklerine etkili bir şekilde yanıt verdiğini ve kontrollü ilaç salınımını mümkün kıldığını doğruladı. CPG ayrıca enfeksiyon bölgesindeki pH ve sıcaklık değişikliklerini tespit ederek ameliyat sonrası iyileşmeye yardımcı olan bir tanı aracı olarak da hizmet eder. Antimikrobiyal testler, bakteri üremesinin önemli ölçüde inhibisyonunu gösterdi ve in vitro deneyler, CPG'nin inflamatuar belirteçleri azaltırken vasküler endotelyal büyüme faktörü ekspresyonunu destekleme yeteneğini gösterdi. Çalışma, hidrojel yamasının antimikrobiyal, antiinflamatuar ve provasküler etkiler de dahil olmak üzere çok işlevli yeteneklerini vurgulayarak onu kronik osteomiyelit için umut verici bir tedavi seçeneği olarak konumlandırıyor.

Giriş

Kronik osteomiyelit, zorlu ve uzun süren tedavi süreci, yüksek tedavi başarısızlığı riski ve nüks nedeniyle hastalar için büyük bir endişe kaynağı haline gelmiştir¹. Osteomiyelit için güncel tedavi stratejileri, nekrotik dokunun cerrahi debridmanını ve parenteral antibiyotikleri içerir. Bununla birlikte, etki bölgesinde terapötik seviyeler sağlamak için yüksek dozda antibiyotik ihtiyacı, hastalığın tedavisinde etkisiz kalmaktadır. Ayrıca, yüksek doz antibiyotik kullanımı nefrotoksisite, ototoksisite, antibiyotik direnci ve gastrointestinal yan etkiler gibi advers komplikasyonlarla ilişkilidir. Antibiyotiklerin lokal ilaç dağıtımı bu dezavantajların üstesinden gelmek için daha uygun bir strateji olabilir. Lokal antibiyotik uygulaması kemik enfeksiyonlarını minimum yan etki ile tedavi edebilirken, başarılı tedavi için kemik rejenerasyonunu indüklemek çok önemlidir². Bu nedenle, antibiyotiklerin ve kemik büyüme faktörlerinin aynı anda uygulanması umut verici bir tedavi stratejisi gibi görünmektedir. Son birkaç on yılda, biyolojik olarak parçalanamayan polimetilmetakrilat (PMMA), osteomiyelitte lokal antibiyotik tedavisinin temel dayanağı olmuştur. Bununla birlikte, PMMA'nın lokal bir antibiyotik dağıtım sistemi olarak kullanımı, boncuk çıkarılması için ikinci bir ameliyata ihtiyaç duyulması, yüzey kolonizasyonunu destekleyen bakteriyel biyofilm oluşumu, antibiyotik direncine yol açan subterapötik seviyelerde uzun süreli antibiyotik salınımı, rezidüel monomerlerin sistemik toksisitesi ve kemik endüktif özelliklerinin eksikliği gibi sınırlamalarla karşı karşıyadır³. Bu nedenle, biyouyumlu polimerler kullanan biyolojik olarak parçalanabilen yerel dağıtım sistemlerinin geliştirilmesi bu dezavantajların üstesinden gelebilir. Literatür, vankomisinin lokal olarak verilmesi için bir ipek iskelesine dahil edilen ipek fibroin nanopartiküllerinin (SFNP'ler) şiddetli osteomiyeliti tedavi etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, nanokompozit malzemede herhangi bir kemik endüktif biyoaktif molekülün bulunmaması, hazırlanan yapıların kemik rejenerasyonunu önemli ölçüde indüklememesine neden oldu. Bu nedenle, kronik osteomiyelit tedavisine uygun nanokompozit iskele malzemelerinin tasarımı zorlu bir endişe konusu olmuştur. Doğal polimer bazlı hidrojeller, hücre dışı matrise (ECM) yapısal benzerlikleri ve ilaç salınımını kontrol etme yetenekleri nedeniyle yaygın ilgi görmüştür⁴.

Hidrojellerin öne çıkan özelliklerinden biri sıcaklık ve pH gibi farklı faktörlere tepki verebilmeleridir. Kronik enfeksiyonlar, mikrobiyal yük, rejenerasyon-bozunma dengesinin düzensizliği ve parçalanma metabolik reaksiyonlarının artması nedeniyle pH'ı artırabilir. Ek olarak, nekrotik doku ve irin gibi debridman materyalinin cerrahi eksizyonu, pH'ın daha yüksek değerlere geçişini hızlandırabilir⁵. Bu nedenle, kronik enfeksiyon pH'ını algılayabilen pH'a duyarlı hidrojellerin kullanımı, kronik osteomiyelitin prognozu için çok önemlidir.

Bu çalışmada, Şekil 1'de gösterildiği gibi kronik osteomiyelit tedavisi için gerekli özelliklere sahip, akıllı bir yapısal renkli hidrojel yaması kullanarak entegre bir tanı ve tedavi yaklaşımı öneriyoruz. Supramoleküler polimer ağlarının bir araya getirilmesinden türetilen supramoleküler hidrojeller, doğal hücre dışı matrise (ECM) benzer çekici malzemelerdir. Uygun mekanik mukavemet, kendi kendini iyileştirme, antibakteriyel ve antienflamatuar özellikler dahil olmak üzere mükemmel özellikleri nedeniyle, supramoleküler hidrojeller biyomedikal alanda birçok uygulama bulmuştur⁶. Buna karşılık, ışığın kendine özgü periyodik nanoyapılarla benzersiz etkileşimleri sonucu üretilen bir renk türü olan yapısal renk, optik ekranlar, sahteciliğe karşı etiketler ve giyilebilir elektronik cihazlar gibi alanlarda büyük ilgi görmüştür. Özellikle yapısal renkli malzemeler duyarlı polimerlerden yapıldığında, renkleri bu polimerlerin genleşmesi veya büzülmesi yoluyla farklı uyaranlarla ayarlanabilir, bu da bu malzemelerin sensör olarak potansiyelini ortaya koyar. Bu nedenle, supramoleküler hidrojellerin yapısal renklerle birleştirilmesinin, kronik osteomiyelit^tedavisi için yeni hidrojel yamaları oluşturmak için benzersiz bir strateji sağlayacağı öngörülebilir ^7,8,9.

Burada, anti-protein taş iskelesi olarak fenilboronik asit (CSMA-PBA) ile karıştırılmış modifiye metilakrillenmiş kitosan, dolgu maddesi olarak sıcaklığa duyarlı GelMA hidrojel ve salisilik asit (SA)¹⁰ ile yüklü. Ağ içindeki hidrojen bağının ve kovalent olmayan etkileşimlerin tersine çevrilebilirliği nedeniyle, ortaya çıkan hidrojel yaması yalnızca mükemmel mekanik özellikler sergilemekle kalmadı, aynı zamanda kendi kendini iyileştirme yeteneklerine de sahipti. Ayrıca, CSMA'nın varlığı nedeniyle, bu hidrojel yaması aynı zamanda güçlü antibakteriyel biyoaktivite de sergiledi. Ek olarak, GelMA polimerinin termal duyarlılığını kullanan hidrojel yaması, nispeten daha yüksek sıcaklıktaki iltihaplanma bölgesine yerleştirildiğinde aktif maddeleri serbest bırakabilir. Eş zamanlı olarak, CSMA-PBA'da boronat ester bağlarının varlığı nedeniyle, hidrojel çevresel pH^11'deki değişikliklere yanıt verdi. Bu avantajlara dayanarak, önerilen yapısal renkli supramoleküler hidrojel yamasının, inflamatuar faktörlerin ekspresyonunu, antibakteriyel aktiviteyi aşağı regüle ederek ve anjiyogenezi teşvik ederek kronik osteomiyeliti tedavi edebileceğini gösterdik. Özellikle, anti-protein taş iskelesinin benzersiz optik özelliklerinden yararlanan hidrojel yama, sıcaklık uyaranlarına yanıt olarak renk değiştirme yeteneği bile sergileyebilir ve kronik osteomiyelitin izlenmesi ve yönetilmesinde ve klinik tedavinin yönlendirilmesinde önemli bir potansiyel ortaya koyabilir.

Protokol

Tüm prosedürler Tıbbi Etik Kurul tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi (NIH yayın No. 80-23, revize 1978). Deneylerde erkek Sprague-Dawley sıçanları (8 haftalık) kullanıldı.

Silika kolloidal kristal şablonların (SCC'ler) hazırlanması
SCC'ler daha önce tarif edildiği gibi^hazırlandı 12,13,14. Temizlenmiş ve plazma ile muamele edilmiş cam slaytlar, deiyonize su içinde dağılmış% 5'lik bir monodispers silika nanopartikül (12 nm çapında) çözeltisine daldırıldı. Çözelti, silika nanopartiküllerinin düzgün dağılımını sağlamak için oda sıcaklığında (25 °C) 1 saat boyunca sürekli olarak karıştırıldı. Slaytlar çözeltiden çıkarıldı ve oda sıcaklığında 1 saat havayla kurutuldu. Nanopartiküllerin cam slaytların yüzeyine düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için kurutma işlemi kritik öneme sahipti. Havayla kurutmanın ardından slaytlar, kalan solventi buharlaştırmak ve kolloidal kristallerin oluşumunu kolaylaştırmak için 2 gün boyunca 60 °C'de havalandırılan bir fırına yerleştirildi. Bu buharlaşma sırasında, düzenli kolloidal kristal dizilerinin oluşumunu teşvik etmek için slaytlar 45°'lik bir açıyla konumlandırıldı. Sıralı kolloidal kristal dizileri, kendi kendine bir araya gelme ile karakterize edildi ve parçacıklar arası aralığa bağlı olarak farklı yapısal renkler sergiledi. Bu diziler daha sonra sonraki hidrojel yama üretimi için şablon olarak kullanıldı.

Entegre teşhis ve tedavi akıllı yapısal renkli hidrojel yamalarının (CPG) hazırlanması
Anti-protein taş iskeleleri, silika kolloidal kristal şablonların (SCC'ler) boşluklarından kopyalandı. Temizlenmiş cam slaytlar ilk önce deiyonize su içinde% 5'lik bir monodispers silika nanopartikül çözeltisine (12 nm çapında) daldırıldı ve nanopartiküllerin yüzey boyunca homojen dağılımını sağlamak için çözelti oda sıcaklığında (25 °C) 1 saat karıştırıldı. Karıştırma işlemi, agrega oluşumunu önlemek ve nanopartiküllerin homojen dağılımını sağlamak için çok önemliydi. Daldırmadan sonra, slaytlar oda sıcaklığında (RT) 1 saat havada kurutuldu, ardından çözücünün buharlaşmasını kolaylaştırmak ve silika nanopartiküllerinin iyi düzenlenmiş kolloidal kristal dizileri halinde kendi kendine birleşmesini teşvik etmek için 2 gün boyunca 60 °C'de fırında kurutuldu. Buharlaşma sırasında slaytlar, nanopartiküllerin hizalanmasını kolaylaştırmak için 45°'lik bir açıyla konumlandırıldı ve kontrollü parçacıklar arası mesafelere sahip periyodik bir dizinin oluşumunu teşvik etti. Bu sıralı dizi, kolloidal kristallerin karakteristik bir özelliği olan yapısal renk sergiledi ve sonraki hidrojel yapısı için şablon görevi gördü.

Hazırlanan SCC'ler daha sonra fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözünmüş %10 w/v konsantrasyonda GelMA'dan oluşan CPG ön jel çözeltisine batırıldı. Numuneler, GelMA'nın silika nanopartikülleri arasındaki boşluklara tam olarak sızmasını sağlamak ve şablon yapısı içinde düzgün bir dağılım sağlamak için oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletildi. Bu adım, hidrojel matrisinin şablona eşit şekilde dahil edilmesini ve nihai hidrojel yapısının SCC'lerin sıralı nanopartikül düzenlemesini kopyalamasını sağlamak için kritikti. Islatmanın ardından, ön jel çözeltisi UV ışığı (365 nm) altında 3 mW/^cm2 yoğunlukta 5 dakika polimerize edildi. Bu UV maruziyeti, hidrojel matrisini katılaştırarak GelMA'nın çapraz bağlanmasını başlattı. Maruz kalma süresi ve yoğunluğu, aşırı jelleşmeye veya şablon yapısının kaybına yol açabilecek hidrojeli aşırı maruz bırakmadan yeterli çapraz bağlanmayı sağlamak için dikkatlice optimize edildi.

CPG'nin karakterizasyonu
Hidrojelin kesit morfolojisi, numuneler (1 mm x 1 mm) altın¹⁵ ile kaplandıktan sonra 5 kV ivme gerilimi ile taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlemlendi. Bu, nano gözenekli yapıyı görselleştirmemize ve hidrojel ağının tekdüzeliğini doğrulamamıza olanak sağladı. Şişme davranışı, 10 mg hidrojel numunelerinin farklı zaman aralıklarında (0, 30, 60, 120 ve 180 dk) 10 mL PBS'ye daldırılmasıyla değerlendirildi. Şişme yüzdesi, hidrojelin farklı koşullar altında suyu emme kabiliyeti hakkında fikir veren, zaman içinde hidrojel hacmindeki artış ölçülerek hesaplandı. Reolojik analiz, depolama modülünü (G') ve kayıp modülünü (G'') ölçmek için 1 rad/s ile 100 rad/s arasında değişen açısal frekanslar uygulanarak %1 gerinimli bir reometre kullanılarak gerçekleştirildi. Bu adım, stres altındaki viskoelastik davranışı da dahil olmak üzere hidrojelin mekanik özelliklerini anlamak için gerekliydi. Kesme yapıştırıcısı özellikleri, hidrojelin biyolojik dokulara yapışma kabiliyetini değerlendirmek için ASTM F2255-05 (2015) uyarınca 10 mm/dak hızında ve 0,01 N'lik bir ön yükte üniversal bir çekme test cihazı (Instron) ile değerlendirildi. İlaç salınımı, hidrojelin 5 mL PBS'ye (pH 7.4) daldırılmasından sonra λ = 280 nm'de absorbans izlenerek bir UV spektrofotometresi kullanılarak değerlendirildi. Salınım, CPG hidrojelinin kontrollü salım yeteneklerini doğrulamak için standart bir salisilik asit konsantrasyonları eğrisi kullanılarak ölçüldü. Son olarak, hidrojeller, pH duyarlılığını değerlendirmek, farklı pH koşulları altında hacim ve görünümdeki değişiklikleri gözlemlemek için 30 dakika boyunca pH 4.5 ve 7.2'lik tampon çözeltilerine daldırıldı¹⁶.

CPG yamalarının sıcaklık ve pH duyarlılığı
CPG yamaları (yaklaşık 2 mm çapında), pH 7.2 olan 5 mL'lik bir tampon çözeltisine yerleştirildi ve fizyolojik koşulları taklit etmek için sıcaklık kontrollü bir su banyosu kullanılarak 30 dakika boyunca 37 °C'de tutuldu. Yansıma spektrumları, 400 nm ila 800 nm arasında değişen dalga boylarında bir UV-Vis spektrofotometre kullanılarak ölçüldü. İlk ölçümlerden sonra, yamalar farklı pH değerlerine (örneğin, pH 4.5, 7.2 ve 9.0) sahip tampon çözeltilere aktarıldı ve 30 dakika boyunca 37 °C'de tutuldu. Herhangi bir renk değişikliği de dahil olmak üzere mikro çevreye verilen tepki görsel olarak gözlemlendi ve renk kaymasını analiz etmek için yansıma spektrumları tekrar kaydedildi. Bu sıcaklık ve pH duyarlılığı, hidrojelin yara ortamındaki değişikliklere nasıl tepki verdiğine dair değerli bilgiler sağlar.

İn vitro antibakteriyel test
Antibakteriyel testler standart prosedürler kullanılarak yapıldı. CPG yamalarının antibakteriyel aktivitesini değerlendirmek için Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) ve Escherichia coli(E. coli, ATCC 53868) suşları kullanıldı. Bu standart referans suşlar, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) satın alındı ve antimikrobiyal test prosedürlerini doğrulamak için kalite kontrol (QC) suşları olarak kullanıldı. Antimikrobiyal duyarlılık testi, CLSI M100 kılavuzlarına göre et suyu mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak yapıldı. Bakteri süspansiyonları, antimikrobiyal testler için standart bir ortam olan Mueller-Hinton et suyunda hazırlandı. Bulanıklık, yaklaşık 1,5 × 10⁸ CFU/mL'ye eşdeğer olan 0,5 McFarland standardına ayarlandı. Süspansiyonlar daha sonra deiyonize su veya pH 6.0 2-(N-morfolino)etansülfonik asit (MES) tamponu (10 mM) ile hazırlanan CPG yamaları (2 mm çapında) ile aşılandı. Yamalar, bakteri süspansiyonlarına 1 mL kültür başına bir yama oranında eklendi. Süspansiyonlar 37 °C'de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, kültürlerin seri seyreltmelerinin besin agarı üzerine kaplanmasıyla bakteri üremesi değerlendirildi ve koloni oluşturan birimler (CFU'lar) 37 °C'de 24 saatlik bir inkübasyondan sonra sayıldı. Bu prosedür, antibakteriyel etkinliğin nicel bir ölçüsünü sağladı.

Biyouyumluluk değerlendirmesi
Deneyler daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi. CPG yamaları, 4 saat boyunca PBS'de (pH 7.4) diyaliz ile işlendi, ardından tüm biyolojik kirleticilerin uzaklaştırıldığından emin olmak için 10 dakika boyunca etanol sterilizasyonu (%70) ve 30 dakika boyunca UV dezenfeksiyonu (365 nm) uygulandı. L929 hücreleri (ATCC CCL-1), hücre canlılığını^{korumak için} 37 °C'de %5 CO 2 ile %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM ortamında kültürlendi. Hücreler, 2 × 10⁵ hücre/mL'de, CPG yamaları olsun veya olmasın, üç kopya halinde 24 oyuklu plakalara ekildi. Hücreler üç deney grubuna ayrıldı: boş kontrol, CPG grubu ve CPG (MES) grubu. 24 saat sonra, hücre canlılığı, hücre metabolik aktivitesini değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntem olan MTT testi kullanılarak değerlendirildi. MTT testi için, her bir kuyucuğa 20 μL MTT (5 mg/mL) ilave edildi ve ardından 37 °C'de 4 saat inkübasyon yapıldı. İnkübasyondan sonra ortam çıkarıldı ve canlı hücrelerin oluşturduğu formazan kristallerini çözmek için 150 μL DMSO ilave edildi. Absorbans, canlı hücrelerin sayısını ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 570 nm'de ölçüldü. Bu yaklaşım, hidrojel yamalarının sitotoksisitesinin ve biyouyumluluğunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlamıştır.

Anti-inflamatuar aktivite
CPG'nin antioksidan aktivitesi bir ROS test kiti kullanılarak değerlendirildi. L929 hücreleri (ATCC CCL-1), %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM ortamında kültürlendi ve hücre bağlanmasına ve ilk proliferasyona izin vermek için 37 °C'de %5_CO2 ile 24 saat inkübe edildi. Oksidatif stresi indüklemek için hücreler 12 saat boyunca 3 μg/mL hidrojen peroksit (H2O2) ile muamele edildi. Oksidatif stres indüksiyonundan sonra hücrelere hidrojel ekstraktı (1 mg CPG hidrojelin 1 mL DMEM ortamında çözülmesiyle hazırlanan) ilave edildi. Hücreler, CPG hidrojelinin potansiyel antioksidan etkilerine izin vermek için 12 saat daha inkübe edildi. Daha sonra hücreler 10 μM DCFH-DA çözeltisi (DMEM ortamında seyreltilmiş) ile boyandı ve 37 °C'de 20 dakika inkübe edildi. DCFH-DA, hücreler içindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için kullanılan bir floresan probdur. Boyamadan sonra hücreler PBS ile yıkandı ve floresan görüntüleri, 485 nm uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda bir floresan mikroskobu kullanılarak yakalandı. Yeşil floresansın yoğunluğu, hidrojelin antioksidan aktivitesi ile ters orantılıydı ve hidrojelin hücrelerdeki oksidatif stresi azaltma yeteneğinin görsel bir değerlendirmesini sağladı.

Sıçan osteomiyeliti hayvan modeli
Kronik bir osteomiyelit modeli oluşturuldu: Erkek Sprague-Dawley sıçanları (8 haftalık), ameliyat sırasında hareketsiz ve ağrısız kalmalarını sağlamak için izofluran (oksijende% 2-3) kullanılarak uyuşturuldu. Sol femurun lateral tarafında 2 cm'lik bir insizyon yapıldı ve steril bir 27-G iğne kullanılarak 1 10⁷ CFU S. aureus doğrudan femurun trabeküler bölgesine enjekte edildi. Enjeksiyon, osteomiyelitin birincil bölgesi olan kemik iliği boşluğunda enfeksiyonu indüklemek için femurun kemik iliği boşluğuna yapıldı. Bakteriler, kemik iliği içinde uygun şekilde birikmesini sağlamak için yavaşça verildi. 10 gün sonra, sıçanlara CO₂ inhalasyonu kullanılarak ötenazi yapıldı ve enfekte femurlar dikkatlice diseke edildi. Granülasyon dokusu enfeksiyon bölgesinden eksize edildi ve doku bütünlüğünü korumak için hemen 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içine daldırıldı. Fiksasyonu takiben, histolojik ve immünohistokimyasal analiz için uygun kesitlemeye izin vermek için kemik dokusu, kemiğin boyutuna bağlı olarak 48-72 saat boyunca bir dekalsifiye edici ajan (örneğin, EDTA) kullanılarak dekalsifiye edildi. Kireçten arındırılmış kemik örnekleri daha sonra histolojik inceleme, immünohistokimya (IHC) ve immünofloresan boyama için işlendi. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizi için, granülasyon dokusu daha sonraki RNA ekstraksiyonu için -80 °C'de saklandı ve inflamasyon, kemik rejenerasyonu ve bağışıklık tepkileri ile ilgili gen ekspresyon profillerinin analizine olanak sağladı

İn vivo osteomiyelit tedavisinin değerlendirilmesi
Granülasyon dokusu parafine gömüldü ve bir mikrotom kullanılarak 5 μm'de kesitlendi. Kesitler, kollajen birikimini ve doku yeniden şekillenmesini değerlendirmek için Masson'un trikrom boyaması (hematoksilin ile 15 dakika, anilin mavisi ile 1 saat) ile boyandı. Genel doku morfolojisini ve enflamasyonu gözlemlemek için hematoksilen ve eozin (HE) boyama (hematoksilin ile 5 dakika, eozin ile 2 dakika) kullanıldı. Anti-CD31 (1:100) ve anti-EGF (1:200) ile immünohistokimya (IHC) 37 °C'de 1 saat süreyle gerçekleştirildi, ardından anjiyogenezi ve büyüme faktörü ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılan birincil antikora bağlı olarak anti-fare IgG veya anti-tavşan IgG (1:200 seyreltilmiş) kullanılarak oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca ikincil antikor inkübasyonu yapıldı. 37 °C'de 1 saat boyunca anti-VEGF (1:100) ve anti-bFGF (1:200) ile immünofloresan boyama yapıldı, ardından RT'de 30 dakika ikincil antikor inkübasyonu yapıldı. Bir floresan mikroskobu kullanılarak CD31, EGF, VEGF ve bFGF ekspresyonu için kesitler gözlendi. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizi için, proinflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-1β ve IL-6) mRNA ekspresyonu, RNAiso Plus ile RNA ekstraksiyonundan ve PrimeScript RT reaktif Kiti kullanılarak cDNA sentezinden sonra analiz edildi. PCR, moleküler düzeyde inflamatuar yanıtı kantitatif olarak değerlendirmek için SYBR Green PCR Master Mix kullanılarak gerçekleştirildi.

Kalite kontrol önlemleri
Deney sonuçlarının güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için tüm prosedürler standart protokollere göre gerçekleştirildi. Her deney, boş kontroller ( S. aureus ile enfekte olmuş ancak tedavi görmeyen sıçanlar), kontrol grupları (bakteriyel enfeksiyon olmadan ve tedavi görmeden cerrahi prosedürler uygulanan sıçanlar) ve karşılaştırmalı tedavi grupları (sıçanlar) gibi uygun kontrol gruplarını içeriyordu. Tutarlılığı sağlamak ve deneysel yanlılığı azaltmak için tüm testler üç kopya halinde gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılığı sağlamak için her grupta 6 sıçan vardı. UV-Vis spektrofotometresi, reometre ve çekme test cihazı da dahil olmak üzere cihazlar, üreticinin spesifikasyonlarına göre kullanımdan önce rutin olarak kalibre edildi. Bakteri ve hücre kültürleri, bir biyogüvenlik kabininde kontrollü çevre koşulları altında hazırlandı ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tutarlı protokoller kullanılarak boyama prosedürleri izlendi. Veri toplama, numuneler arası değişkenliği en aza indirmek ve doğru ölçüm sağlamak için birleşik mikroskop ayarlarıyla gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analiz GraphPad Prism (versiyon 8.0) kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Birden fazla grup arasında karşılaştırma yapmak için, mekanik özellikler, ısıya duyarlı davranış, antibakteriyel aktivite ve hücre canlılığındaki farklılıkları değerlendirmek için tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in post-hoc testi kullanıldı. Student'ın t-testi, farklı pH değerlerinde veya sıcaklık değişimlerinde CPG yamalarının yansıma tepe noktalarının karşılaştırılması durumunda olduğu gibi, yalnızca iki grup karşılaştırıldığında ikili karşılaştırmalar için kullanıldı. p < 0.05 tüm analizler için istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Sonuçların tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için tüm deneyler üç kopya halinde gerçekleştirildi.

Sonuçlar

CPG yamalarının üretimi ve karakterizasyonu (Şekil 1)
Tipik bir deneyde, monodispers silika nanopartikülleri, birbirine yakın paketlenmiş diziler oluşturmak için çözücü buharlaştırma yoluyla kendi kendine bir araya getirildi, bu da daha sonra Şekil 1'de gösterildiği gibi çok işlevli yapısal renkli hidrojel yamaları oluşturmak için kullanılan yapısal renk kaplamaları (SCC'ler) 17,18,19 ile sonuçlandı. İşlem, bir ön jel çözeltisinin kılcal etki yoluyla SCC'lerin nano ölçekli boşluklarına sızmasını içeriyordu. Daha sonra SCC'lerin ve hidrojelin hibrit filmini oluşturmak için UV polimerizasyonu kullanıldı. SCC'ler kazındıktan sonra, periyodik gözenekli bir yapıya sahip ters bir anti-protein taş iskele elde edildi. Son olarak, ısıya duyarlı GelMA hidrojeli, anti-protein taş iskelesinin nano ölçekli boşluklarına dolduruldu ve ardından bağımsız CPG yamaları oluşturmak için kürlendi.

Hidrojelin güçlü çapraz bağlanma ağı, CPG yamalarına mükemmel mekanik özellikler kazandırdı. Yamaların herhangi bir hasara yol açmadan esnemeye dayanacak kadar sağlam olduğu ve orijinal uzunluklarının 2,5 katına kadar esnetilebildiği gözlemlendi. Daha da önemlisi, CPG yamaları canlı yapısal renkler sergiledi ve esneme sırasında dinamik renk değişikliklerine uğradı, bu da yamalar içindeki yüksek dereceli nanoyapıların periyodik olarak düzenlenmesinden kaynaklanan benzersiz bir özellikti. Bu nanoyapılar, PBG içindeki belirli dalga boylarındaki ışığın iletilmek yerine seçici olarak yansıtıldığı fotonik bant boşlukları (PBG'ler) oluşturur ve CPG yamalarına karakteristik yapısal renkleri ve yansıma tepe noktaları kazandırır.

CPG yamasının tepe yansıma konumu denklem²⁰ ile tahmin edilebilir:

λ = 1.633dn_ortalama

burada d kırınım düzlemleri arasındaki mesafedir ve n_ortalama , GelMA hidrojel ve yamada kullanılan diğer malzemeler dahil olmak üzere bileşenlerin kırılma indislerinin ortalaması olarak hesaplanan malzemenin ortalama kırılma indisidir. Bu denklem, yama gerildikçe ve d azaldıkça yansıma dalga boyunun azaldığını ve bunun da yamanın yapısal renginde maviye kaymaya yol açtığını göstermektedir. Yamaların gerilme mukavemeti de test edildi ve anti-protein taş iskelenin nano ölçekli boşluklarına GelMA hidrojel dolgusu nedeniyle yamaların gerinim kapasitesinin azaldığı bulundu. CPG yamalarının esneme sırasında deformasyonu, gerinim tespiti için son derece hassas bir araç sunarak onları mekanik izleme gerektiren uygulamalar için uygun hale getirir.

CPG yamalarının ısıya duyarlı ve pH'a duyarlı davranışı (Şekil 2)
CPG yamaları, GelMA hidrojeli nedeniyle dikkate değer ısıya duyarlı özellikler sergiledi. Ortam sıcaklığının 37 °C'ye çıkarılmasının ardından hidrojel büzülmeye uğradı, su molekülleri açığa çıktı ve kargo yüklendi. Bu büzülme, CPG yamaları içindeki nanogözeneklerin boyutunda bir azalmaya neden oldu, PBG'lerini değiştirdi ve sonuç olarak yansıma spektrumunu değiştirdi. Şekil 2 , yamaların yapısal renginin sıcaklık ve pH'daki değişikliklere yanıt olarak nasıl değiştiğini gösteren bu davranışı göstermektedir.

Bu gözlemleri doğrulamak için, CPG yamaları 37 °C ve pH 7.2'de simüle edilmiş bir kronik enfeksiyon yarası ortamına yerleştirildi. Çözeltinin pH'ı arttıkça, CPG yamalarının yansıma zirvesinde mavi bir kayma gözlendi, bu da nanogözeneklerin boyutunun azaldığını gösteriyor. Tersine, pH düştüğünde, yamalar nanogözeneklerin genişlemesine karşılık gelen bir kırmızıya kayma sergiledi. Bu pH'a duyarlı davranış, asidik koşullar altında CSMA-PBA'daki boronat ester bağlarının hidrolizine atfedildi, bu da bağları kırdı ve yapısal rengin kırmızıya kaymasına neden oldu. Bununla birlikte, pH alkali olduğunda, yamaların temel koşullarda stabilitesini gösteren önemli bir renk değişikliği gözlenmedi. Bu bulgular, CPG yamalarının, etkili yara yönetimi için çok önemli olan yara ortamlarındaki hem sıcaklık hem de pH değişikliklerini izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

CPG yamalarının antibakteriyel aktivitesi (Şekil 3)
CPG yamalarının antibakteriyel özellikleri, S. aureus ve E. coli ile birlikte kültürlenerek değerlendirildi. Şekil 3A,B, CPG yamalarının bakteri üremesini önemli ölçüde azalttığını ve etkili antibakteriyel özelliklerini gösterdiğini göstermektedir. Bu antibakteriyel etkinlik, yamaların pozitif yüklü CMCSMA yüzeyi ile negatif yüklü bakteri hücre duvarları²¹ arasındaki elektrostatik etkileşime atfedildi. Bu etkileşim bakteri zar yapısını bozarak bakteri ölümüne yol açtı. CMCSMA'nın katyonik grupları, bakteri zarındaki anyonik bileşenlere bağlanarak zar depolarizasyonuna ve geçirgenliğin artmasına neden olabilir²². Ayrıca, nispeten küçük moleküler boyutu ve esnek polimerik zincirleri nedeniyle CMCSMA, lipit çift tabakasına daha etkili bir şekilde nüfuz edebilir, hücre içi maddelerin sızmasına neden olabilir ve metabolik aktiviteye müdahale edebilir. CMCSMA moleküllerinin küçük boyutu, temel biyomoleküllerle etkileşime girerek bakteri metabolizmasını ve enzim sistemlerini bozdukları bakteri hücre zarına nüfuz etmelerini daha da kolaylaştırdı²³. Ek olarak, S. aureus'un güçlü biyofilm oluşturma kapasitesi göz önüne alındığında, CMCSMA gibi kitosan bazlı malzemelerin, hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisine nüfuz ederek ve bütünlüğüne müdahale ederek bakteriyel biyofilmleri bozduğunun bildirildiğini belirtmekte fayda var. Bu, antibakteriyel ajanların, tipik olarak geleneksel antibiyotiklere dirençli olan biyofilmlerin içine gömülü bakterilere erişmesini ve onları öldürmesini sağlar^24,25. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, bakteri kolonilerinin görsel karşılaştırması, CPG yamaları ile tedaviyi takiben önemli bir azalmayı açıkça göstermekte, etkili bakterisidal aktivitelerini ve enfeksiyona eğilimli yara ortamlarında kullanım için umut verici potansiyellerini vurgulamaktadır.

CPG yamalarının biyolojik işlevselliği (Şekil 4)
CPG yamaları, antibakteriyel özelliklerine ek olarak önemli biyolojik işlevsellik gösterdi. Şekil 4C,D, CPG grubundaki azalmış yeşil floresan sinyali ile gösterildiği gibi, yamaların hücreler içindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) etkili bir şekilde temizlediğini göstermektedir. Aşırı ROS üretimi doku yenilenmesini bozabileceğinden, ROS temizleme yara iyileşmesinde çok önemlidir. CPG yamaları ile birlikte kültürlenen insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) canlılığı, Şekil 4A'da gösterildiği gibi canlılık boyaması kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, hücrelerin çoğunluğunun canlı olduğunu ve sadece küçük bir ölü hücre oranı olduğunu gösterdi, bu da CPG yamalarının hücre canlılığını desteklediğini ve hücre proliferasyonunu desteklediğini düşündürdü.

Şekil 4B , CPG yamalarının hücre proliferasyonunu önemli ölçüde desteklediğini gösteren bir MTT testinin sonuçlarını göstermektedir. Ayrıca, Şekil 4F,G, CPG yamalarının, endotel hücre proliferasyonu ve yeni kan damarı oluşumu için kritik olan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve bazik fibroblast büyüme faktörünün (bFGF) ekspresyonunu teşvik ederek anjiyogenezi arttırdığını göstermiştir. Bu sonuçlar, CPG yamalarının yalnızca enfeksiyonu önlemekle kalmayıp aynı zamanda doku yenilenmesini artırma ve yara iyileşmesini hızlandırma potansiyelini vurgulamaktadır.

CPG yamalarının in vivo değerlendirmesi (Şekil 5)
Kronik osteomiyelit modeli kullanılarak yürütülen in vivo deneyler, CPG yamalarının enfeksiyon ve inflamasyonu önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Şekil 5A, histolojik analizi (H&E boyama) gösterir, burada kontrol grubu karakteristik inflamasyon, kemik yıkımı, nekrotik doku ve savunma hücrelerinin yüksek infiltrasyonunu sergilerken, tedavi grubu enfeksiyon, inflamasyon ve savunma hücrelerinin infiltrasyonunda önemli bir azalma gösterdi. CPG grubunda, osteoblastların artan göçü, osteoblastların kemik hücrelerine dönüşümü, vasküler oluşum, yeni kemik oluşumu ve azalmış enfeksiyon gözlendi, bu da CPG yamalarının doku yenilenmesini desteklemedeki etkinliğini daha da doğruladı.

Ek olarak, Şekil 5B , CPG yamalarının doku onarımı için kritik olan yeni kan damarlarının oluşumunu desteklediğini doğrulayan anjiyogenez boyamasını göstermektedir. Bu bulgular, CPG yamalarının hem enfeksiyonu kontrol etmede hem de doku yenilenmesini desteklemede ikili bir rol oynadığını ve bu da onları kronik yara iyileşmesi ve kemik rejenerasyonu uygulamaları için oldukça uygun hale getirdiğini göstermektedir.

Şekil 1: Yapısal renkli hidrojel yamasının (CPG) hazırlanması ve karakterizasyonu. (A): CSMA ve PBA arasındaki reaksiyon; (B): Esneme üzerine renk değişimini gösteren CPG fotoğrafı; (C): CPG'nin SEM karakterizasyonu; (D): CPG'nin şişme davranışı; (E): CPG'nin bozunma profili; (F): CPG'den ilaç salım kinetiği. Ölçek çubuğu: 100 nm. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. Deney grubunda altı sıçan kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CPG yamasının akıllı algılanması. (A): CPG yamasının yapısal renginin ortam sıcaklığı ve pH'daki değişikliklerle değişmesi; (B): Farklı sıcaklıklarda CPG yamasının spektral analizi; (C): Farklı pH seviyelerinde CPG yamasının spektral analizi. Ölçek çubuğu: 1 mm. Veriler, Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CPG yamasının antibakteriyel aktivitesi. (A): S. aureus ve E. coli'nin CPG yaması ile ortak kültürünün temsili görüntüleri; (B): Optik yoğunluk (OD) değerlerinin analizi. Ölçek çubuğu: 5 mm. Hata çubukları SD'yi temsil eder. İstatistiksel anlamlılık, Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi. Grup başına altı kopya kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: CPG yamasının biyolojik fonksiyonel değerlendirmesi. (A): 48 saat boyunca CPG yaması ile birlikte kültürlenmiş HUVEC hücrelerinin canlı hücreler (yeşil) ve ölü hücreler (kırmızı) gösterilerek canlılık boyaması; (B): MTT testi ile ölçülen hücre proliferasyonu; (C): CPG yamasının ROS boyaması; (D): VEGF grubunda DPPH süpürme oranı; (E): inflamatuar faktörlerin q-PCR analizi; (F): CPG yaması ile anjiyogenezin teşvik edilmesi; (G): VEGF ve bFGF ekspresyonunun Western blot sonuçları; (H): VEGF ve bFGF'nin gri tonlama değerlerinin istatistiksel analizi. Ölçek çubuğu: 100 μm. Hata çubukları SD'yi temsil eder. Veriler, Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi. Her grupta altı sıçan kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: CPG yamasının in vivo deneyleri. (A): HE boyama; (B): Anjiyogenez boyama. Ölçek çubuğu: 100 μm. Veriler, Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile analiz edilen ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Her grupta 6 hayvan vardı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmanın bulguları, CPG hidrojel yamalarının özellikle yapısal renk değişiklikleri, sıcaklık hassasiyeti, pH duyarlılığı ve antimikrobiyal özellikleri açısından çok işlevliliğini göstermektedir. Bu hidrojel yamalar, mekanik deformasyona maruz kaldıklarında gözle görülür yapısal renk değişikliklerine uğrayabilir ve gerilimi izlemek için oldukça hassas bir mekanizma sunar. Bu özellik, bu tür renk kaymalarının gerinim veya basınç^{göstergeleri} olarak kullanıldığı sensör uygulamaları için malzemelerdeki yapısal rengi araştıran önceki çalışmalarla uyumludur ^26,27. Çalışmamız, bu renk değişikliklerini, yara iyileşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için gerekli olan yara stresini izlemenin invazif olmayan bir yolu olarak kullanarak bu bulguları genişletmektedir. Bu tür mekanik zorlanmaları izleme yeteneği, klinisyenler için kritik bilgiler sağlar ve potansiyel olarak sütür ayrılması gibi komplikasyonların erken belirtilerinin belirlenmesine yardımcı olur ve böylece daha hedefe yönelik ve zamanında müdahaleleri destekler. Daha da önemlisi, optik okuma, ek güce veya görüntüleme cihazlarına ihtiyaç duymadan doğrudan ve sezgisel bir algılama mekanizması sağlayarak, bakım noktası veya evde ameliyat sonrası bakım için ideal, merkezi olmayan bir izleme çözümü sunar.

CPG hidrojel yamalarının ısıya duyarlı ve pH'a duyarlı davranışları, klinik kullanım potansiyellerini artırır. Yaralar iyileştikçe, özellikle enfeksiyon veya iltihaplanma varlığında sıcaklık ve pH'daki dalgalanmalar yaygındır²⁸. Yara bölgesindeki yüksek sıcaklıkların ve değişen pH değerlerinin bu koşullarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, CPG yamaları bu tür değişikliklere karşı hassasiyet göstererek yerel yara koşullarının gerçek zamanlı izlenmesine olanak sağladı. Bu özellik, terapötik stratejileri optimize etmek için enfeksiyon veya inflamasyonun erken tespitinin gerekli olduğu klinik ortamlarda özellikle değerlidir. Sıcaklık ve pH değişimlerinin izlenmesi yara yönetiminde özellikle önemlidir çünkü bunlar yara durumunun erken, invaziv olmayan biyobelirteçleri olarak hizmet eder²⁹. Yüksek sıcaklık, klinik semptomlar ortaya çıkmadan önce enfeksiyonun başlangıcına işaret edebilirken, alkali pH'a doğru kaymalar sıklıkla kronikliği, mikrobiyal kolonizasyonu ve iyileşmenin bozulduğunu gösterir. Buna karşılık, asidik ortamlar akut yaralar ve daha iyi iyileşme potansiyeli ile ilişkilidir²⁴. Bu nedenle, sıcaklığa ve pH'a duyarlı unsurların yara pansumanlarına entegre edilmesi, zamanında müdahalelere ve iyileşme sürecinin sürekli değerlendirilmesine olanak tanır, bu da yaranın bozulmasını veya sistemik enfeksiyona ilerlemesini önleyebilir. Hidrojelin bu değişikliklere dinamik olarak uyum sağlama yeteneği, klinisyenlerin yara durumunu sürekli olarak izlemeleri için yeni bir araç sağlayarak iyileşme sürecini izlemede daha fazla doğruluk sunar. Dahası, bu tür dinamik yanıt verme yeteneği, terapötik salım üzerinde uzay-zamansal kontrole olanak tanıyarak, modern akıllı biyomateryallerin temel amacı olan ilaç dağıtımının patolojik ipuçlarıyla senkronize olmasını sağlar.

Ayrıca, CPG hidrojel yamalarının antimikrobiyal özellikleri, yara bölgesindeki bakteri yükünün azaltılmasında kritik öneme sahiptir. Hidrojelin yapısına dahil edilen kitosan, negatif yüklü bakteri hücre duvarları²⁹ ile elektrostatik etkileşimleri kolaylaştıran katyonik yapısı nedeniyle antimikrobiyal özellikleriyle uzun süredir tanınmaktadır. Ancak kitosan bazlı malzemelerin antibakteriyel mekanizması basit yük çekimiyle sınırlı değildir. Kitosan bakteri zarlarıyla temas ettiğinde zar geçirgenliğini artırarak potasyum iyonları, proteinler ve nükleik asitler gibi hücre içi içeriklerin sızmasına neden olabilir. Ek olarak kitosan, iki değerlikli metal iyonlarını (örneğin^Ca2+ ve^Mg2+) şelatlayarak enzim aktivitesini ve metabolik fonksiyonları bozabilir. Düşük moleküler ağırlıklı kitosan ayrıca bakteri hücre duvarına nüfuz edebilir ve DNA'ya bağlanarak mRNA transkripsiyonunu ve protein sentezini inhibe edebilir. Bu çok yönlü mekanizmalar kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir. Hidrojel iskelenin gözenekli yapısı, yüzey alanını ve bakteri temasını artırarak bu etkileri daha da güçlendirir ve sinerjistik antibakteriyel etkinlik sağlar. Bu özellik, biyofilm oluşumunun iyileşme sürecini zorlaştırdığı osteomiyelit gibi kronik enfeksiyonların tedavisinde özellikle önemlidir^25,30. Bu çalışmanın sonuçları, CPG hidrojel yamalarının bakteri üremesini engellemede, yara bölgesindeki bakteri yükünü azaltmada ve potansiyel olarak doku rejenerasyonu için daha uygun bir ortam yaratmada etkili olduğunu göstermektedir. Bu antimikrobiyal aktivite, hidrojelin diğer özellikleriyle birleştiğinde, yamaları genellikle bakteriyel kontaminasyon ve gecikmiş iyileşme ile boğuşan kronik yaraların tedavisinde umut verici bir aday olarak konumlandırıyor. Ek olarak, hidrojel, lokal bakteri kolonizasyonunu inhibe ederek, enfekte kronik yaralarda sıklıkla sürdürülen proinflamatuar sitokinlerin yukarı regülasyonunu dolaylı olarak önler ve böylece pro-rejeneratif bir mikro çevreyi teşvik eder.

ROS tipik olarak oksidatif stres ve doku hasarı ile ilişkili olsa da, kontrollü ROS üretiminin bakteriyel eradikasyonda çok önemli bir rol oynadığı yaygın olarak kabul edilmektedir. Hidroksil radikalleri ve süperoksit anyonları gibi ROS, bakteriyel proteinleri, lipitleri ve DNA'yı oksitleyebilir ve sonuçta membran yırtılmasına ve hücre ölümüne yol açabilir. Bu nedenle, orta seviyelerde ROS varlığı, doğuştan gelen antimikrobiyal savunma mekanizmalarının kritik bir bileşeni olarak hizmet eder. Bakteriyel kolonizasyonun ve biyofilm oluşumunun devam ettiği kronik osteomiyelit bağlamında, patojenlerin ortadan kaldırılması anlamlı doku rejenerasyonu için bir ön koşuldur. CPG hidrojeli, CMCSMA aracılı membran bozulması ve biyofilm penetrasyonu yoluyla etkili antibakteriyel aktiviteyi korurken aşırı ROS'u baskılayarak dengeli bir yaklaşım sunar. Bu ikili işlev, inflamasyonun kalıcı bakteri varlığı nedeniyle uzamamasını sağlayarak bağışıklık aktivasyonundan rejeneratif bir mikro çevreye geçişe izin verir. Bu nedenle, ROS'u ayrım gözetmeksizin temizlemek yerine, bu sistem hem bakteri klirensini hem de doku iyileşmesini desteklemek için oksidatif mikro ortamı modüle eder.

Antimikrobiyal aktiviteye ek olarak, CPG hidrojel yamaları, doku onarımı ve rejenerasyonu için çok önemli olan biyolojik işlevsellik sergiledi³¹. İn vitro deneyler, hidrojelin hücre canlılığını ve proliferasyonunu ve ayrıca anjiyogenezi desteklediğini göstermiştir. Bu bulgular, yara iyileşmesinde anjiyogenezin önemini vurgulayan önceki çalışmalarla tutarlıdır³². Anjiyogenez, yaralı dokuya yeterli oksijen ve besin tedariki sağlamak ve doku yenilenmesini kolaylaştırmak için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, hidrojelin pro-anjiyojenik etkileri, kronik yaraların tedavisi için özellikle önemlidir, çünkü bu yaralar genellikle iyileşme sürecini engelleyen zayıf vaskülarizasyondan muzdariptir^33,34. CPG hidrojeli, kan damarı oluşumunu teşvik ederek yalnızca doku yenilenmesine katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda yeni oluşan dokunun uzun süreli hayatta kalması için daha elverişli bir ortam yaratır. Ayrıca, hidrojelin osteoblast göçünü ve farklılaşmasını teşvik etme yeteneği, özellikle kronik kemik enfeksiyonları veya kemik kusurları olan hastalar için kemik iyileşmesi bağlamında önemli bir değer katmaktadır³⁵. Osteogenezin arttırılması, iyileşmenin sıklıkla tehlikeye girdiği osteomiyelit ve ilgili kemik rahatsızlıklarında sonuçların iyileştirilmesi için umut verici bir yoldur. Lokalize enfeksiyon kontrolüyle entegre edilen bu tür osteoindüktif işlevsellik, kas-iskelet sistemi doku mühendisliğindeki merkezi bir zorluğu ele alır: tek bir platformda hem antimikrobiyal savunmayı hem de doku yenilenmesini destekleyen yakınsak çözümlere duyulan ihtiyaç.

İn vivo sonuçlar, CPG hidrojel yamalarının terapötik potansiyelini daha da doğrulayarak doku onarımını destekleme, enfeksiyonu azaltma ve osteogenezi teşvik etme yeteneklerini göstermektedir. Kronik yara modellerinde, bu hidrojeller yara kapanmasını ve doku rejenerasyonunu etkili bir şekilde kolaylaştırdı. Kemik rejenerasyon modellerinde CPG hidrojeli, osteoblast göçünü ve farklılaşmasını teşvik ederek kemik iyileşmesini artırdı. Bu bulgular, hidrojel bazlı yara iyileşmesi ve kemik rejenerasyon stratejilerini araştıran diğer çalışmaların bulgularıyla uyumludur³⁶. CPG hidrojel yamalarının aynı anda enfeksiyonu ele alma, anjiyogenezi teşvik etme ve osteogenezi destekleme yeteneği, kapsamlı yara bakımı için güçlü bir platform sağlayarak onu klinik kullanım için umut verici bir aday haline getiriyor.

Bu umut verici sonuçlara rağmen, mevcut çalışmanın çeşitli sınırlamaları vardır. İlk olarak, in vitro ve in vivo modeller olumlu sonuçlar verirken, klinik öncesi çalışmalar öncelikle murin modellerinde yürütülmüştür. Fareler yara iyileşmesi çalışmaları için yaygın olarak kullanılsa da, insan yara iyileşmesinin karmaşıklığını tam olarak kopyalayamayabilirler. Bu nedenle, bu hidrojel yamalarının gerçek dünyadaki klinik ortamlarda güvenliğini ve etkinliğini doğrulamak için daha büyük hayvan modellerinde ve insan klinik deneylerinde daha fazla doğrulama gereklidir. İkincisi, CPG hidrojelleri kısa vadede iyi mekanik özellikler ve biyolojik işlevsellik sergilemesine rağmen, in vivo uzun vadeli stabiliteleri ve bozunma davranışları belirsizliğini korumaktadır. Hidrojeller zamanla bozulabilir ve bozunma ürünleri iyileşme sürecini etkileyebilir ve hatta olumsuz reaksiyonlara neden olabilir. Gelecekteki çalışmalar, zararlı yan ürünler salmadan kontrollü bir şekilde bozunmalarını sağlamak için bu hidrojellerin bozunma oranını optimize etmeye odaklanmalıdır. Ek olarak, hidrojel içerisine dahil edilen biyoaktif ajanların kontrollü salınımı, özellikle kronik yara tedavisinde zaman içinde sürekli terapötik etkiler sağlamak için daha da geliştirilmelidir.

Bu çalışma hidrojel bazlı supramoleküler bir iskeleye odaklanırken, aynı terapötik hipotezi ele almaya yönelik alternatif yaklaşımlar arasında elektrokimyasal biyosensörler, mikroakışkan çip üzerinde yara sistemleri ve çevresel algılama için elektronik bileşenler içeren akıllı bandajlar yer alıyor. Bununla birlikte, genellikle güç kaynakları ve karmaşık arayüzler gerektiren teknolojilerin aksine, burada geliştirilen hidrojel yaması, harici enstrümantasyon olmadan bağımsız, görsel olarak yorumlanabilir bir platform sağlar ve bu da onu özellikle kaynakların sınırlı olduğu ortamlar için çekici kılar.

Bu çalışmanın önemi, çeviri potansiyelinde yatmaktadır. CPG platformu, osteomiyelitin ötesinde, diyabetik ayak ülserleri, cerrahi alan enfeksiyonları ve tümör rezeksiyonu sonrası izleme gibi inflamasyonla ilgili diğer durumlar için özelleştirilebilir. Teşhis ve tedavi işlevlerinin tek bir hidrojel matrisine entegrasyonu, yeni nesil akıllı yara pansumanlarının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyor. Ek olarak, fotonik kristal bazlı yapısal renk sistemi, kişiselleştirilmiş tıpta uygulanabilir gerçek zamanlı, kolorimetrik biyoalgılama fırsatları sunar. Dahası, CPG tasarımının modülerliği, hassas rejeneratif tıptaki mevcut yörüngelere uyum sağlayarak rejeneratif yeteneklerini daha da genişletmek için kök hücreler, eksozomlar veya gen dağıtım vektörleri ile gelecekteki entegrasyon için adaptasyona izin verir.

İleriye baktığımızda, gelecekteki araştırmalar birkaç temel alana odaklanmalıdır. İlk olarak, CPG hidrojel yamalarının bileşimini ve yapısını optimize etmek, uzun vadeli stabilitelerini ve performanslarını arttırmak için çok önemli olacaktır. Çapraz bağlanma yoğunluğunun değiştirilmesi ve büyüme faktörleri veya sitokinler gibi diğer biyoaktif ajanların dahil edilmesi, hidrojelin spesifik klinik uygulamalar için terapötik potansiyelini artırabilir. İkincisi, bu hidrojellerin uygulama yelpazesinin kronik yaraların ötesinde sinir veya kıkırdak onarımı gibi diğer doku rejenerasyonu türlerine genişletilmesi, bunların çok yönlülüğünü daha da gösterebilir. CPG hidrojellerinin klinik uygulanabilirliğini genişletmek için diyabetik ülserler veya bası yaraları gibi belirli yara tiplerine nasıl uyarlanabileceğine dair araştırmalara ihtiyaç vardır. Üçüncüsü, kök hücre tedavisi veya gen terapisi gibi gelişmiş tedavilerin hidrojel yamalarla entegre edilmesi, bunların rejeneratif özelliklerini geliştirerek daha kapsamlı ve etkili tedavilere olanak sağlayabilir. Son olarak, CPG platformunun güvenliğini, üretilebilirliğini, kullanıcı uyumluluğunu ve mevzuata hazır olup olmadığını değerlendirmek ve böylece nihai klinik çevirisini desteklemek için büyük ölçekli, çok merkezli klinik araştırmalar ve gerçek dünya uygulama çalışmaları gerekli olacaktır.

Sonuç olarak, CPG hidrojel yamaları, gelişmiş yara bakımı ve doku rejenerasyonu için umut verici bir platformu temsil etmektedir. Yara stresini izleme, sıcaklık ve pH değişikliklerine yanıt verme, antimikrobiyal özellikler sergileme ve doku yenilenmesini destekleme yetenekleri, kronik yaraların tedavisinde çok yönlü bir yaklaşım sunar. Klinik öncesi çalışmalardan elde edilen sonuçlar cesaret verici olsa da, bu hidrojel yamalarının klinik ortamlardaki potansiyelini tam olarak gerçekleştirmek için daha fazla optimizasyon ve klinik doğrulama gereklidir. Gelecekteki araştırma yönelimleri, malzeme bileşimindeki iyileştirmeleri, daha geniş uygulamaları, gelişmiş terapötik stratejilerle entegrasyonu ve bunların insanlarda etkinliğini ve güvenliğini belirlemeye yönelik klinik deneyleri içermelidir.

Bu deneyde, ters opal iskele olarak metil CSMA-PBA, dolgu maddesi olarak sıcaklığa duyarlı GelMA hidrojelin bir kombinasyonunu kullandık ve CPG entegre teşhis ve tedavi amaçlı akıllı yapısal renkli hidrojel yaması oluşturmak için SA ile yükledik. Deneysel sonuçlar, bu hidrojel yamanın mükemmel mekanik özellikler ve yapışma mukavemeti sergilediğini göstermektedir. Bakteri üremesini inhibe edebilir, vasküler endotelyal büyüme faktörünün ekspresyonunu önemli ölçüde artırabilir ve inflamatuar faktörlerin seviyelerini aşağı regüle edebilir, böylece COM tedavisi için önemli klinik beklentiler sağlayabilir. Ayrıca, daha da önemlisi, CPG'nin enfeksiyon bölgesindeki sıcaklık ve pH değişikliklerini tespit etme yeteneğine dayanarak, kronik osteomiyelitin postoperatif iyileşmesinde bir izleme rolü oynar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Akrilamid (, %99)	Sigma-Aldrich	A8887 Serisi	Hidrojel polimerizasyonu için monomer
Akriloil Klorür (AC, %99)	TCI Kimyasallar	A0376	Kimyasal modifikasyon reaksiyonlarında kullanılır
Alkali Alümina (200-300 mesh)	Aladdin	A112336	Metil metakrilatı saflaştırmak için kullanılır
Anti-bFGF antikoru	Santa Cruz	SC-9084 Serisi	Büyüme faktörü tespiti için immünofloresan boyama
Anti-CD31 antikoru	Abcam	AB28364	Vasküler belirteç tespiti için immünohistokimya
Anti-EGF antikoru	Sigma-Aldrich	E9644 (İngilizce)	İmmünohistokimya boyama
Anti-VEGF antikoru	Santa Cruz	SC-7269 Serisi	Anjiyogenez için immünofloresan boyama
Bis-akrilamid (BIS, %97)	Sigma-Aldrich	M7279 Serisi	Hidrojel ağında çapraz bağlama maddesi
Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8)	Dojindo	CK04	Hücre canlılığının değerlendirilmesi
Kitosan, Metilakrilat (CSMA-PBA)	Sigma-Aldrich	C3641 (İngilizce)	Hidrojel yamalarında iskele oluşumu
DCFH-DA Probu	Beyotime	S0033	Reaktif oksijen türleri (ROS) tespiti
Dimetil Sülfoksit (DMSO)	Çin Ulusal İlaç Grubu Şirketi	DMSO-AR	Hidrojel formülasyonu için çözücü
Escherichia coli (E. coli)	ATCC	-	Antibakteriyel testlerde kullanılır
Floresan Mikroskobu	Olympus	BX53 Serisi	İmmünofloresan ve hücre görüntüleme
Jelatin Metakrilat (GelMA)	Sigma-Aldrich	G1894 Serisi	Sıcaklığa duyarlı hidrojel bileşeni
Hidroklorik Asit (HCl)	Chongqing Tianyun	HCl-AR	Sentezde pH ayarlaması
Hidrojen Peroksit (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009 Serisi	Hücrelerde oksidatif strese neden olur
Hidroflorik Asit (HF, %4)	Sinopharm	H814912	Silika kolloidal kristallerin aşındırılması
Instron Üniversal Çekme Test Cihazı	Instron	3345	Mekanik ve yapışma mukavemeti testi
L929 Hücreleri	ATCC	CCL-1	Sitotoksisite ve biyouyumluluk testleri için kullanılır
Leica Mikrotom	Leica	RM2235 Serisi	Dokuların parafin kesitinde kullanılır
Erkek Sprague-Dawley Sıçanları (8 hafta)	Reagan Biyoteknoloji	-	İn vivo kronik osteomiyelit modeli
Masson' s Trichrome Leke Kiti	Güneş Enerjisi	G1340 Serisi	Fibroz için histolojik boyama
Metil Metakrilat (MMA, %99)	Sigma-Aldrich	M27805 Serisi	İskele oluşumu için monomer
MTT Test Kiti	Beyotime	M5655 Serisi	Hücre proliferasyonu ve sitotoksisite değerlendirmesi
Paraformaldehit (%4)	Hizmet biyografisi	G1101 Serisi	Doku fiksasyonu
Parafin	Sigma-Aldrich	P1003	Histoloji için gömme ortamı
PBS Arabelleği	Gibco	10010023	Hücre ve hidrojel işlemede kullanılır
Fenilalanin (%99)	Sigma-Aldrich	P5482	Kimyasal modifikasyonda kullanılır
Fenilboronik Asit (PBA)	TCI Kimyasallar	P0157	hidrojelde pH'a duyarlı bileşen
Potasyum Persülfat (KPS)	Pekin Baolingwei	KPS-AR	Polimerizasyonda radikal başlatıcı
PrimeScript RT reaktif Kiti	Takara	RR047A	cDNA sentezi için kullanılır
Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Test Kiti	KeyGen Biyoteknoloji	KGAF019	Antioksidan aktivite değerlendirmesi
Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler	StepOnePlus	Gen ekspresyonu ölçümü
RNAiso Artı	Takara	9108	RNA ekstraksiyon reaktifi
Reometre (HR-1)	TA Enstrümanları	İK-1	Hidrojelin reolojik karakterizasyonu
Salisilik Asit (SA)	Sigma-Aldrich	S3254	Hidrojel içindeki ilaç molekülü
Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)	JEOL	JSM-7500F	Hidrojel yapısının morfolojik analizi
Silika Nanopartikülleri (12 nm)	Sigma-Aldrich	637246	Silika kolloidal kristal şablonlarının oluşumu
Sodyum Hidroksit (NaOH)	Çin Ulusal İlaç Grubu Şirketi	NaOH-AR	pH ayarı
Staphylococcus aureus (S. aureus)	ATCC	-	Antibakteriyel testlerde kullanılır
SYBR Yeşil PCR Ana Karışımı	Uygulamalı Biyosistemler	4367659	qPCR algılama reaktifi
UV Işık Kaynağı (365 nm, 3 mW/cm²)	Kahraman Laboratuvarı	UVT-28	UV polimerizasyonu için kullanılır
UV Spektrofotometresi	Şimadzu	UV-2600	İlaç salınımı ölçümü